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Methodenartikel

Untersuchung der rezidivierenden Verletzung eines ischämischen Schlaganfalls in einem sekundären Verschlussmodell der mittleren Hirnarterie bei der Maus

904 Ansichten

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DOI:

10.3791/68806

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16. September 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California, Davis, 2Department of Nutrition, China Medical University, 3Division of Neurosurgery, Department of Surgery, College of Medicine and Hospital, National Taiwan University, 4Institute of Toxicology, College of Medicine, National Taiwan University, 5Department of Medical Research, China Medical University Hospital, China Medical University, 6Department of Pediatrics, College of Medicine and Hospital, National Taiwan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zum sekundären Verschluss der mittleren Hirnarterie bei Mäusen vor, um das Fortschreiten des rezidivierenden ischämischen Schlaganfalls zu untersuchen. Es werden die chirurgischen Eingriffe, die postoperative Versorgung, die neuronalen pathologischen Veränderungen und die Überlebensrate beschrieben.

Zusammenfassung

Schlaganfälle sind die weltweit zweithäufigste Ursache für Mortalität und Behinderung, wobei wiederkehrende Schlaganfälle erheblich zu schlechten Ergebnissen und erhöhter neurologischer Belastung beitragen. Trotz Fortschritten im akuten klinischen Schlaganfallmanagement sind experimentelle Modelle für rezidivierende ischämische Schlaganfälle aufgrund ihrer verfahrenstechnischen Komplexität und hohen Mortalitätsraten nach wie vor begrenzt. In dieser Studie haben wir uns zum Ziel gesetzt, einen rezidivierenden ischämischen Schlaganfall in einem Mausmodell zu etablieren und die pathologischen Veränderungen und funktionellen Defizite des Gehirns mit Hilfe eines zweistufigen MCAO-Protokolls (Middle Cerebral Arteria Occlusion) zu bewerten. Erwachsene männliche C57BL/6J-Mäuse wurden einer transienten MCAO unter Laser-Doppler-Blutflussüberwachung unterzogen. 14 Tage nach der ersten Operation wurde eine zweite MCAO durchgeführt, um ein Wiederauftreten des Schlaganfalls zu simulieren. Zu den postoperativen Beurteilungen gehörten die Analyse der lokomotorischen Aktivität, die Bewertung neurobehavioraler Defizite unter Verwendung eines Sechs-Punkte-Bewertungssystems, Entzündungsmarker wie Hypoxie-induzierbarer Faktor-1α (HIF-1α) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) sowie histopathologische Bewertung mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E). Nach wiederholter MCAO-Verabreichung zeigten Mäuse im Vergleich zu Kontrollgruppen eine signifikant verminderte Bewegungsaktivität, eine verringerte Bewegungsgeschwindigkeit und verminderte neurobehaviorale Werte sowie erhöhte Entzündungsmarker. Der histopathologische Nachweis ergab eine mittelschwere bis schwere neuronale Zellnekrose, eine Neuropil-Vakuolation und lokalisierte Blutungen im Kortex und Hippocampus von rezidivierenden MCAO-Mäusen. Die Entzündungsmarker wurden auch bei diesem rezidivierenden MCAO-Verfahren induziert. Dieses zweistufige MCAO-Mausmodell stellt zum ersten Mal eine Methode dar, die einen rezidivierenden ischämischen Schlaganfall effektiv mit konsistenten neurologischen und pathologischen Ergebnissen simuliert und das postoperative Überleben verbessert. Dieses Modell könnte eine zuverlässige Plattform für mechanistische Studien bieten und könnte in der zukünftigen Evaluierung neuroprotektiver Therapien für rezidivierende Schlaganfälle angewendet werden.

Einleitung

Schlaganfälle sind nach wie vor eine der häufigsten Todesursachen und langfristigen Behinderungen weltweit und stellen eine erhebliche klinische und sozioökonomische Belastung dar. Weltweit sind mehr als 30 Millionen Menschen von einem Schlaganfall und seinen Folgen betroffen, darunter Mobilitätsverlust, kognitive Beeinträchtigungen und ein erhöhtes Risiko für Gefäßerkrankungen 1,2. Trotz Fortschritten in der Akutbehandlung wie Thrombolyse und endovaskulärer Thrombektomie haben viele Überlebende nach wie vor ein hohes Risiko für ein Wiederauftreten eines Schlaganfalls, das mit einer verschlechterten Prognose, einer größeren Behinderung und einer erhöhten Sterblichkeitsrate verbunden ist. Rezidivierende Schlaganfälle treten bei etwa 10-20 % der Patienten innerhalb von 90 Tagen nach einem primären Ereignis auf, wobei das höchste Risiko während eines Zeitraums mit transitorischer ischämischer Attacke oder leichtem Schlaganfallbesteht 3. Noch wichtiger ist, dass ein rezidivierender Schlaganfall häufig vaskuläre Territorien betrifft und zu ausgedehnteren Infarkten und schweren Verletzungen führt, wie z. B. hämodynamische Beeinträchtigung des Gehirns4, akute und chronische Immundysregulation und subkortikale neuronale Nekrose5, was darauf hindeutet, dass das Gehirn nach einem anfänglichen ischämischen Insult anfälliger werden und mehr Komplikationen verursachen kann.

In einigen neueren Studien wurden ischämische oder hämorrhagische Schlaganfallmodelle an Versuchstieren durchgeführt und regionenspezifische Verletzungsmuster, gestörte neurovaskuläre Reaktionen und unterschiedliche endogene Reparaturmechanismen aufgedeckt, die an die klinischen Bedingungen beim Menschen angepasst sind 6,7. Die Forschungsmodelle des rezidivierenden Schlaganfalls sind jedoch aufgrund ihrer komplizierten Verfahren und der hohen Sterblichkeitsrate weniger etabliert. In einigen früheren Studien wurde ein photothrombotisches Mausmodell etabliert, das sich als wertvolles Werkzeug für die Untersuchung rezidivierender ischämischer Schlaganfälle erwies 8,9,10. Sie zeigten die verschlimmerte neuronale Schädigung, die anhaltende Entzündungsreaktion und den kognitiven Verfall bei Mäusen mit rezidivierendem Schlaganfall und untersuchten die zugrunde liegenden Mechanismen, einschließlich Multiinfarkt-Demenz und inflammatorischem Priming 8,9,10.

Eine andere Studie hat ein neuartiges gealtertes Mausmodell für rezidivierende intrazerebrale Blutungen im bilateralen Striatum gezeigt, das zweimal mit Kollagenase injiziert wurde, was zu einer verzögerten Wiederherstellung der Bewegungsfunktion führte und bei den rezidivierenden Mäusen kognitiven Verlust und neurologische Schädigungen verursachte11. Es ist erwähnenswert, dass die photothrombotischen und hämorrhagischen Schlaganfall-Mausmodelle während eines rezidivierenden Schlaganfalls häufig Läsionen in unterschiedlichen anatomischen Regionen induzieren, was inhärente methodische Unterschiede widerspiegelt. Solche Variationen erzeugen heterogene Muster neuronaler Verletzungen, stören die Dynamik der Mikrozirkulation und üben unterschiedliche Auswirkungen auf die periphere Immunantwort aus11,12. Im Gegensatz dazu bietet das MCAO-Modell, das weithin als das repräsentativste Nagetierparadigma des ischämischen Schlaganfalls gilt, den Vorteil der Verfahrensstabilität und ermöglicht eine präzise Kontrolle sowohl der Lokalisation als auch der Dauer des zerebralen Verschlusses. Nichtsdestotrotz haben MCAO und rezidivierende MCAO auch ein erheblich hohes Mortalitätsrisiko gezeigt13,14, was ihre breitere Anwendbarkeit in der experimentellen Forschung erheblich einschränkt. In dieser Studie haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein stabiles und reproduzierbares zweistufiges MCAO-Mausmodell zu etablieren, das rezidivierende Schlaganfälle nachahmt. Wir untersuchten die damit verbundenen neuronalen Verletzungen, Funktionsbeeinträchtigungen und histopathologischen Veränderungen. Dieses Modell zeigte auch eine stabile Überlebensrate, was darauf hindeutet, dass es für zukünftige Forschungen zur Pathophysiologie und neuroprotektiven Therapiestrategien bei wiederkehrenden Schlaganfällen anwendbar ist.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der National Taiwan University (Study Plan ID20230335) geprüft und genehmigt und nach festgelegten ethischen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

  1. 8 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g unter kontrollierten Umgebungsbedingungen bei 22 ± 1 °C mit 55 % relativer Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Licht-/12-stündigen Dunkelzyklus unterbringen. Bieten Sie eine humane Pflege mit freiem Zugang zu Lebensmitteln und destilliertem Wasser.
  2. Ordnen Sie 28 männliche Mäuse nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen ein: Sham (n = 8), MCAO (n = 10) und rezidivierendes MCAO (n = 10). Tiere für 2 Wochen unter Quarantäne stellen (-d14); Akklimatisierung, Wiegen und Gruppieren bei -d7 durchführen; MCAO bei d0 verabreichen; Durchführung von Verhaltenstests bei D0, D2, D14 und D16; und führen Sie bei d14 wiederkehrende MCAO-Operationen durch.

2. Erste chirurgische MCAO-Verabreichung

  1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren, wiegen Sie jede Maus, verabreichen Sie Carprofen oral in einer Dosis von 5 mg/kg 1 h vor dem ersten Schnitt und leiten Sie eine Anästhesie mit 3 % Isofluran in einem sauerstoffgemischten Gas ein.
  2. Überwachen Sie die Atemfrequenz (100-120 Atemzüge/min, BPM) und beurteilen Sie die Narkosetiefe, indem Sie das Augenlid und den Schluckreflex überprüfen. Positionieren Sie das Motiv auf einer elektronischen Heizplatte, um die Körpertemperatur bei 37 °C zu halten.
  3. Rasieren Sie den Rücken und den Nacken in der Nähe des Kopfes und entfernen Sie das Fell und die Ablagerungen von Mäusen mit einem Vakuum. Tragen Sie eine Augensalbe auf, schrubben Sie die Haut und desinfizieren Sie sie durch aseptische Verfahren für die Überlebenschirurgie von Nagetieren.
  4. Verwenden Sie eine Schere und eine Hautzange, um den ersten 0,5 cm langen Schnitt zwischen den Ohren zu machen, um die linke Seite der zentralen Fusionslinie und hinter dem Bregma am Schädel freizulegen. Entferne das Weichgewebe auf der Oberseite des Schädels mit einer Pinzette.
  5. Zentrieren Sie den Laser-Doppler-Adapter im Gehirn der Maus und befestigen Sie ihn mit Gewebekleber an einer Position 3 mm lateral links und 2 mm kaudal zum Bregma, wobei Sie sicherstellen, dass die Adapterkante so vorgeschnitten ist, dass sie an die Schädelbasis passt, und befestigen Sie dann die Laser-Doppler-Kappe mit Klebstoff, um eine kontinuierliche Blutflussüberwachung zu ermöglichen.
    HINWEIS: Befestigen Sie in diesem Schritt die Laser-Doppler-Kappe mit Gewebekleber sicher am Bregma und positionieren Sie sie am Schnittpunkt der koronalen und sagittalen Nähte an der oberen Mittellinie der Schädeldecke, um eine stabile Überwachung des zerebralen Blutflusses zu gewährleisten.
  6. Wenn Sie mit dem geschnittenen Bereich vertraut sind, ziehen Sie mit der Mikropipette Gewebekleber heraus und tragen Sie den Kleber um die Basis des Adapters auf.
  7. Bereiten Sie Zahnzement vor und tragen Sie eine ausreichende Menge auf, um die Dopplerkappe zu umgeben, um ihre Stabilität während des gesamten Eingriffs zu gewährleisten.
  8. Drehen Sie das Tier in die Rückenlage und machen Sie einen 1 cm langen Hautschnitt vom Brusteinlass in Richtung Kinn entlang der Mittellinie des Halses.
  9. Fahren Sie mit der stumpfen Dissektion fort, um den hinteren Bauch der Musculus digastricus, des sternohyoiden und des sternomastoideus zu trennen, gefolgt von der Verwendung von Retraktoren, um die Muskeln vorsichtig wegzuziehen, um die Arteria carotis communis (CCA), die Arteria carotis communis (ECA) und die Arteria carotis internus (ICA) freizulegen, und platzieren Sie einen Abschnitt aus 6-0 Seide um die CCA.
    HINWEIS: In diesem Schritt sollten die Speicheldrüsen nach oben gedreht werden, um die Isolierung der Bifurkation von CCA und ECA zu erleichtern. Die ICA ist der CCA übergeordnet. Die stumpfe Dissektion mit einer Hautzange wird verwendet, um Gefäßrupturen zu verhindern und das umgebende Weichgewebe und die Nerven zu isolieren.
  10. Lokalisieren Sie einen kleinen Ast (Arteria thyreoidea superior, STA), der aus der ECA herausragt. Verwenden Sie den bipolaren Kauterisator, um diesen kleinen Ast zu verbrennen. Fahren Sie fort, das verbrannte Gefäß zu durchschneiden; Dadurch wird der EuRH weiter isoliert.
    HINWEIS: STA ist in der Regel der erste Ast der ECA, der unterhalb der Höhe des großen Horns des Zungenbeins austritt. Um Verletzungen zu vermeiden, verwenden Sie einen bipolaren Kauterisator, um den Gefäßast zu verbrennen und eine Blutstillung zu erreichen.
  11. Legen Sie zwei Abschnitte der 6-0 Silk-Naht um ECA. Machen Sie einen dauerhaften Knoten an der distalen Seite des ECA und einen losen Knoten an der Bifurkationsstelle.
  12. Setzen Sie die Laser-Doppler-Nadelsonde in den Sondenadapter am Schädel ein. Stellen Sie sicher, dass die Erfassungssoftware einen Messwert für den zerebralen Blutfluss (CBF) anzeigt. Notieren Sie den Ausgangswert.
    HINWEIS: Das standardisierte CBF-Maß, das durch den Laserdoppler erhalten wurde, wurde als Perfusionseinheiten (PU) dargestellt, wobei die Ausgangswerte typischerweise im Bereich von 350 bis 450 kalibriert wurden. Wenn reduzierte PU-Werte (Perfusionseinheit) beobachtet werden, passen Sie die Position des Laser-Doppler-Sondenadapters in der Maus an, um eine genaue Messung zu gewährleisten (siehe Schritt 2.5).
  13. Klemmen Sie den ICA mit der mikrovaskulären Gefäßklemme und verwenden Sie den 6-0-Seidenabschnitt um den CCA, um einen Schlupfknoten zu machen, um den CCA vorübergehend zu ligieren.
    HINWEIS: In diesem Schritt wird eine Verringerung des CBF auf dem Laser-Doppler-Monitor erkannt.
  14. Bereiten Sie das mit Silikonkautschuk beschichtete Nylon-Monofilament vor. Markieren Sie das Filament mit dem silbernen Edding in 9-10 mm Entfernung von der Spitze des Silikonkopfes und machen Sie mit einer mikrochirurgischen Schere einen kleinen Schnitt zwischen der engen Naht und der losen Naht auf der ECA.
    HINWEIS: Das Restblut an der Inzisionsstelle sollte gereinigt und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült werden, um die Gefäßintegrität zu erhalten.
  15. Führen Sie das Filament (Silikonkopf voran vorsichtig) über den kleinen Schnitt in den ECA ein.
    HINWEIS: Dieser Schritt des Einsetzens von Filamenten entfällt bei den Scheintieren.
  16. Wenn etwa die Hälfte des Silikonkopfes eingeführt wurde, ziehen Sie die lose Naht um die Arterie und das Filament leicht fest und entfernen Sie die Klemme am ICA.
  17. Schneide das ECA unterhalb des ersten festen Knotens durch, drehe das ECA-Gefäß und das Filament vorsichtig nach unten (gegen den Uhrzeigersinn), so dass der Silikonkopf nach oben zeigt, und schiebe die Spitze des Filaments nach oben in Richtung ICA.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist kritisch und muss langsam gegen den Uhrzeigersinn durchgeführt werden, um Gefäßstörungen zu minimieren und das Risiko einer Verschränkung oder eines Risses zu verringern.
  18. Sobald sich der gesamte Silikonteil im Blutgefäß befindet, ziehen Sie die Haltenaht leicht fest, lösen Sie den Gleitknoten am CCA und schieben Sie das Filament weiter hinein, wobei Sie die silberne Markierung auf dem Filament zur Positionsorientierung verwenden.
  19. Überwachen Sie kontinuierlich die Laser-Doppler-Software, und wenn der Widerstand ein weiteres Vorschieben des Filaments unter entsprechender Kraft verhindert, während ein starker Rückgang der CBF beobachtet wird, beenden Sie die Einführung in die distale mittlere Hirnarterie.
    HINWEIS: Die Reduzierung von CBF auf weniger als 30 % des preischemischen Zustands ist ein Standardverfahren, das als Longa-Methode15 bekannt ist.
  20. Halten Sie das Filament 40 Minuten lang in MCA, um eine ischämische Schädigung des Gehirns zu induzieren.
  21. Entfernen Sie das Filament nach der vorgesehenen ischämischen Periode von 40 Minuten, um die CBF wiederherzustellen, tragen Sie Gewebekleber auf, um eine Blutstillung zu erreichen, zeichnen Sie die entsprechende wiederhergestellte CBF-Messung auf, lösen Sie alle Retraktoren und entfernen Sie den am Schädel montierten Adapter.
  22. Verschließen Sie den Hautschnitt in der Nähe des Gefäßes mit einem Wundclip, überwachen Sie kontinuierlich die Körpertemperatur bei 37 °C und beurteilen Sie die Atemfrequenz. Nachdem Sie einen stabilen Blutdruck und eine stabile Atmung von 160-200 BPM bestätigt haben, brechen Sie die Anästhesie ab und lassen Sie die Genesung zu.

3. Zweite MCAO-Verabreichung

  1. Entfernen Sie die Wundclips 14 Tage nach der ersten MCAO-Operation und wiederholen Sie dann die Schritte 2.1 bis 2.9, um die Schädelvorbereitung durchzuführen, die Platzierung der Laserdopplersonde zu sichern und die CCA freizulegen.
  2. Isolieren Sie CCA aus dem umgebenden Gewebe und platzieren Sie drei Segmente der 6-0-Seidennaht um CCA.
  3. Setzen Sie die Laser-Doppler-Sonde in den Adapter ein und zeichnen Sie den CBF-Ausgangswert auf.
  4. Machen Sie einen Kettknoten an der distalen Seite von CCA, einen dauerhaften Knoten am proximalen Ende und einen losen Knoten dazwischen.
  5. Bereiten Sie das mit Silikonkautschuk ummantelte Nylon des Okklusionsfilaments für die MCAO-Verabreichung gemäß dem beschriebenen Schritt 2.14 vor.
  6. Machen Sie einen kleinen Schnitt am CCA in der Nähe des Permanent und führen Sie das Filament in den CCA ein.
    HINWEIS: Das Restblut an der Inzisionsstelle sollte ebenfalls gereinigt und mit PBS gespült werden, um die Gefäßintegrität zu erhalten. Das ist sehr wichtig.
  7. Ziehen Sie den losen Knoten leicht fest und lösen Sie den Kettknoten. Schieben Sie das Filament in den ICA vor, bis das Filament unter entsprechender Kraft steht und eine deutliche Verringerung des CBF festgestellt wird.
    HINWEIS: Die Reduzierung des CBF auf weniger als 30% des preischemischen Zustands gilt ebenfalls als Standardverfahren.
  8. Halten Sie das Filament 40 Minuten lang in Position, um eine ischämische Verletzung zu induzieren, wie in Schritt 2.20 beschrieben.
  9. Nach Ablauf des festgelegten ischämischen Intervalls ziehen Sie das Filament zurück und schließen den Hautschnitt gemäß den in den Schritten 2.21 und 2.22 der anfänglichen MCAO-Operation beschriebenen Verfahren.

4. Pflege nach der Operation

  1. Verabreichen Sie warme normale Kochsalzlösung subkutan in einer Dosierung von 10 ml μkg-1 Tag-1 zweimal täglich an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, um eine Dehydration nach einer MCAO-Operation zu verhindern. Tragen Sie 10% ige Povidon-Jod-Lösung auf die Operationsstelle auf und verabreichen Sie Amoxicillin (10 mg/kg), um eine Infektion zu verhindern. Carprofen (5 mg/kg) 3 Tage lang oral verabreichen, um postoperativen Stress zu lindern und die Genesung unter tierärztlicher Aufsicht nach dem ersten und zweiten MCAO-Verfahren zu erleichtern.
  2. Führen Sie tägliche Bewertungen des Gesundheitszustands von Mäusen durch. Erfassen Sie Veränderungen des Aussehens sowie des Nahrungs- und Wasserverbrauchs während des ersten und zweiten Eingriffs.

5. Beurteilung der Fortbewegungsaktivität von Tieren und der Beurteilung neurobiologischer Verletzungen

  1. Bewerten Sie die Bewegungsaktivität, indem Sie die Bewegungsbahn, die Entfernung und die Geschwindigkeit bewerten. Positionieren Sie die Mäuse in Testboxen (10 x 20 x 15 cm) und konfigurieren Sie sie bei geringer Leuchtkraft.
  2. Gewöhnen Sie die Maus durch eine 30-minütige Stabilisierungsphase an die Testumgebung, gefolgt von einer 10-minütigen formalen Bewertung. Zeichnen Sie alle Parameter auf und analysieren Sie sie, einschließlich zurückgelegter Strecke (cm), Geschwindigkeit (cm/s), Bewegungsdauer (s), Gesamtdauer (s) in der Zone, Latenz des ersten Auftretens (s) und Kopfgrad (Zeiten), um die lokomotorische Aktivität zu bestimmen.
  3. Beurteilung neurobiologischer Verletzungen unter Verwendung eines modifizierten Bewertungssystems für die motorische Funktion (0-6 Punkte)16 und unter Bezugnahme auf mNSS-Werte (im Rahmen der Bewertung der motorischen Funktion, 6 Punkte)17.
  4. Definieren Sie die Verletzungsgrade wie folgt: Punktzahl 0 für das Fehlen eines neurologischen Defizits, Punktzahl 1 für die Beugung der Vordergliedmaßen, die das Handgelenk oder die Schulter betrifft, Punktzahl 2 für die Beugung der Vordergliedmaßen, begleitet von einem verminderten Widerstand gegen seitlichen Druck, Punktzahl 3 für das unidirektionale Kreisen zur Defizitseite, Punktzahl 4 für Längsdrehung zur Defizitseite, Punktzahl 5 für Längsdrehung mit Anfallsaktivität, und Punktzahl 6 für vollständigen Bewegungsverlust.

6. Protokoll zur Hämatoxylin- und Eosin-Färbung

  1. Fixieren Sie MCAO- und rezidivierendes MCAO-Hirngewebe in 10 % Formaldehydpuffer und zerlegen Sie die Probe mit einem 1 mm koronalen Maushirnschneider in vier gleiche Teile. Verarbeiten Sie den dritten vorderen Teil für die pathologische Beurteilung.
  2. Rehydrierung von in Paraffin eingebetteten Proben: Xylol für 10 Minuten, 95 % Ethanol für 10 Minuten, 75 % Ethanol für 10 Minuten, 50 % Ethanol für 10 Minuten, destilliertes Wasser (ddH2O) für 10 Minuten und PBS für 10 Minuten.
  3. Färben der Proben: Hämatoxylin-Färbung für 45 s und Spülen in warmem ddH2O bei 30 °C für 1 min; Eosin-Färbung für 30 s und in kaltem ddH2O für 45 s.
  4. Die Proben werden in 75 %, 95 %, 100 % Ethanol und in Xylol jeweils 45 s dehydriert und getrocknet und 60 s lang an der Luft getrocknet.
  5. Montieren Sie die Objektträger und bewahren Sie sie in einer dunklen Kammer auf.
  6. Beurteilen Sie den Schweregrad der Läsion anhand eines festgelegten Kriteriums auf einer Fünf-Punkte-Skala: 1 = minimal (<1%); 2 = leicht (1-25%); 3 = mäßig (26-50%); 4 = mittelschwer bis schwer (51-75%); 5 = schwer (76-100%). Führen Sie eine pathologische Untersuchung des Hirngewebes unter verblindeter Beurteilung durch einen Veterinärpathologen durch.

7. Westliches Blotting-Protokoll

  1. Homogenisieren Sie Hirngewebe aus MCAO und rezidivierenden Mäusen in RIPA-Puffer, ergänzt mit Protease und Phosphatase-Inhibitor (Natriumfluorid 30 mM, Natriumorthovanadat 30 mM und Natriumpyrophosphat 30 mM).
  2. Zentrifugieren Sie die Lysate bei 10.000 x g und fangen Sie den Überstand auf. Quantifizieren Sie die Konzentration des überstehenden Proteins mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay.
  3. Western Blotting wie zuvor beschriebendurchführen 18: 20 μg denaturiertes Gesamtprotein, hergestellt durch Kochen in 100 °C kochendem Wasser, in 8-12% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gele (SDS-PAGE) geben.
  4. Transfer mit 100 V für 90 min, um Proteine auf PVDF-Membranen im Kühlraum zu trennen und Membranen mit 3 % Rinderserumalbumin für 60 min zu blockieren.
  5. Über Nacht bei 4 °C mit Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α, 1:1000 Verdünnungen), Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH, 1:2.000 Verdünnungen) und Hypoxie-induzierbarem Faktor 1 alpha (HIF-1α, 1:1.000 Verdünnungen) inkubieren. Inkubieren Sie die Membranen mit geeigneten Sekundärantikörpern für 1 h.
  6. Erkennen Sie die Proteinexpression mit einem erweiterten Chemilumineszenz-Substrat-Kit (ECL) und visualisieren Sie sie mit einem digitalen Photo-Imaging-System.

8. Statistische Auswertung

  1. Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) und führen Sie eine statistische Analyse mit einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) durch, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test, um Unterschiede zwischen mehreren Gruppen zu bestimmen. Interpretieren Sie die Ergebnisse als statistisch signifikant, wenn p 0,05 <.

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Ergebnisse

Beurteilung der lokomotorischen Aktivität und neuronaler Schädigung bei ersten und rezidivierenden MCAO-Mäusen
In den ersten MCAO-Verfahren wurde ein mit Silikonkautschuk beschichtetes Nylon-Monofilament für 40 min von ECA, ICA auf MCA eingebracht. Der zerebrale Blutfluss (CBF) konnte mit dem Laser-Doppler-Gerät deutlich abfallen (Abfall <30 % des Ausgangswertes), wenn das Filament im MCA-Bereich verblieb. Bei diesem Verfahren erreichten alle Mäuse stabil diese Schwel...

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Diskussion

Schlaganfälle sind nach wie vor die zweithäufigste Ursache für Tod und Behinderung weltweit, mit einem hohen Risiko für wiederkehrende Schlaganfälle. Trotz Fortschritten in der Entwicklung von Medizintechnik und -strategien ist die Prävention von Schlaganfällen und seinem Wiederauftreten derzeit noch unzureichend, um sich zu verbessern. In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Studienmodelle des Schlaganfalls in großem Umfang bei der Erforschung von ischämischen Schlaganfallverletz...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den Teams des National Laboratory Animal Center technisch unterstützt und finanziell durch Zuschüsse der National Taiwan University Hospital Foundation, Taiwan (112-S0074), des China Medical University Hospital, Taiwan (CMU113-S-06) und des National Science and Technology Council, Taipei, Taiwan (112-2314-B-002 -219) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-0 Seidennaht Shin-Teh Inc. TW.ST1N-ST6
1-mm-koronaler Mäuse-GehirnslicerThermo Fisher Scientific Inc., USAV11335
TierhaarschneiderURBANER. Inc. TWMB033
Koronaler Maus-GehirnslicerZivic-Instrument. Inc USA BSMAS001-1
Digitales FotobildsystemAzure Biosystem, Inc., Dublin, CA, USAAzure -300
Elektronischer bipolarer KauterisatorIndiamartAARON 940
Elektronische WärmeplatteReptizooAHM23
AugensalbeLodi Veterinary Care. UNS17033-21-38
Laser-Doppler-DetektorMoor instruments UK moorVMS-LDF1-HP
Laser-Doppler-SondenadapterThermo Fisher Scientific Inc.05-700-76
Lokomotorischer Aktivitätsdetektor Orchid scientific Inc.Alles Labyrinth-Tracking-Software.
(Alle Labyrinth-Systeme)Orchid scientific Inc.Trackezi. Ver 7.39
Mikrovaskuläre GefäßklemmeShin-Teh Inc. TW.ST-M104
Mikrochirurgische GefäßscherenShin-Teh Inc. TW.ST-V108
AtemfrequenzmonitorSDR scientific Ltd. USSAR-830/AP
Silikongummibeschichtetes NylonmonofilamentFisher ScientificNC1773962
HautpinzetteShin-Teh Inc. TW.ST-H212
HautschereShin-Teh Inc. TW.ST-S014PK
Steriler WattestäbchenGewinner: Medizinisch401 003
TransfersystemHalbtrockenes System. Bio-Rad Labor, USA)1703940
Chemikalien
10% Povidon– JodlösungYoshida Pharmaceutical Co., Ltd JAPPVP– I  10%
75 % Ethanol-Lösung Sigma-Aldrich. USA111727
AmoxicillinSigma-Aldrich, USA A5955
RinderserumalbuminSigma-Aldrich, USA.A2153
CarprofenPlexx Inc. UKMD150-2
GAPDH-AntikörperSanta Cruz Biotechnology, CA, USASC-32233
H& E-LösungBioPioneer Tech. CO. TWG1005
Hypoxie-induzierbarer Faktor-1-Alpha-AntikörperZell-Signaltechnik, MA, USA#36169
Isofluran (Anästhetikum)BiowissenschaftR510-22-10
Sterile normale KochsalzlösungNova-Tech Inc. USA1760RX
Tumornekrosefaktor AlphaZell-Signaltechnik, MA, USA#3707

Referenzen

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Investigating Ischemic Stroke Recurrent Injury in a Secondary Middle Cerebral Artery Occlusion Model in Mouse
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68806

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Rezidivierender SchlaganfallMCAO MausmodellSchlaganfallrezidivneurobehaviorale Defizitelokomotorische Aktivit tEntz ndungsmarkerhistopathologische Auswertungneuroprotektive Therapien

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