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Methodenartikel

Verfeinerung von OnePot PURE und Roh-Ribosomen-Produktion für reproduzierbare zellfreie Proteinsynthese

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DOI:

10.3791/68826

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22. August 2025

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1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein aktualisiertes Protokoll für die Herstellung des OnePot-Systems "Protein synthesis Using Recombinant Elements" (PURE) und roher Ribosomen für die zellfreie Proteinsynthese, wobei der Schwerpunkt auf der Kontrolle des Zellwachstums liegt, um Variationen von Charge zu Charge zu minimieren.

Zusammenfassung

Jüngste Fortschritte haben es ermöglicht, das zellfreie System der Proteinsynthese mit rekombinanten Elementen (PURE) in einzelnen Labors kostengünstig und mit reduziertem Arbeitsaufwand herzustellen. Die Herstellung der 36 Proteinkomponenten und des Ribosoms, aus denen PURE besteht, ist jedoch immer noch ein komplexes Unterfangen mit viel Spielraum für Variation und Fehler. Wir stellen ein detailliertes und aktualisiertes Verfahren zur Herstellung von PURE vor, das auf dem kürzlich veröffentlichten OnePot-Protokoll basiert, das die Regulierung einer Reihe von Schlüsselschritten umfasst, insbesondere die Inokulation von Kulturen mit optischer Dichte (OD)-normalisierten Glycerinbeständen, die sorgfältige Überwachung des Zellwachstums und die Kontrolle der endgültigen Glycerinkonzentrationen. Mit diesem Ansatz berichten wir über reproduzierbare Präparate von PURE von mehreren biologischen Replikaten und Anwendern. Dieses Protokoll dient als Referenz und Ausgangspunkt für andere Laboratorien, um ihre eigenen PURE-Systeme herzustellen und Fehler zu beheben, wodurch die Demokratisierung der vielen Anwendungen, die PURE ermöglicht, wie z. B. der Bottom-up-Aufbau biomolekularer Systeme und die Entwicklung synthetischer Zellen, erhöht wird.

Einleitung

Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) hat sich als Technologie für eine Vielzahl von Anwendungen entwickelt, darunter Biomanufacturing, Biosensorik und Diagnostik, Prototyping von genetischen und metabolischen Teilen und Signalwegen, schnelles Protein-Engineering und Bildung 1,2. CFPS-Systeme mit gereinigten Komponenten, die ursprünglich als "Protein synthesis Using Recombinant Elements" (PURE) System3 entwickelt wurden, bieten eine Reihe von Vorteilen gegenüber ihren lysatbasierten Alternativen. PURE-Systeme haben eine definierte Zusammensetzung, bestehend aus 36 Proteinfaktoren, dem 70S E. coli-Ribosom und einer definierten Mischung aus chemischen Substraten wie Nukleosidtriphosphaten (NTPs), Aminosäuren und tRNAs, die nach Belieben auf die gewünschte Anwendung zugeschnitten werden können. Sie eignen sich daher hervorragend für Studien wie den nicht-kanonischen Aminosäureeinbau, die mechanistische Modellierung und die Bottom-up-Konstruktion von biomolekularen Systemen und synthetischen Zellen1. Obwohl PURE von kommerziellen Anbietern erhältlich ist, sind seine Kosten (0,34 bis 1,63 US-Dollar pro 1 μl Reaktion) für groß angelegte Experimente unerschwinglich. und die alternative Strategie, PURE im eigenen Haus herzustellen, wurde bisher durch arbeitsintensive Protokolle mit paralleler Aufreinigung von 36 Proteinen und Ribosomenbehindert 4, die insbesondere für unerfahrene Anwender eine Herausforderung darstellen, robust und reproduzierbar durchzuführen.

Jüngste Entwicklungen haben die hausgemachte Herstellung von PURE begünstigt. Zum Beispiel haben Wang et al. Stämme von E. coli so verändert, dass sie genomisch integrierte Hexa-Histidin-Tags auf der Translationsmaschine enthalten, was eine einstufige Reinigung ermöglicht5. Gene, die für alle PURE-Proteine kodieren, wurden zu einer kleinen Anzahl von Plasmiden zusammengesetzt, die in ähnlicher Weise zur Reduzierung des Reinigungsaufwands verwendet wurden6. Villareal et al. haben elegante Konsortien von PURE-Stämmen entwickelt, die die Expression ausgleichen, um Proteine im richtigen Verhältnis zu produzieren, während sie gleichzeitig eine einstufige Reinigung ermöglichen7.

Das innovative OnePot PURE-System, das von Lavickova et al. entwickelt wurde, verspricht eine einfache Handhabung 8,9. In diesem System werden die ursprünglichen PURE-Stämme in einem einzigen Chromatographieschritt co-kultiviert und aufgereinigt. Obwohl es nicht möglich ist, die Zusammensetzung des resultierenden PURE-Systems genau zu definieren, zeigten die Autoren, dass mehrere Chargen des Systems weitgehend reproduzierbar sind und ein grobes Maß an Kontrolle erreicht werden kann, indem das Impfvolumen jedes Stammes variiert wird. Der Kompromiss zwischen präziser Kontrolle der Zusammensetzung und einfacher Produktion ist einer, der für viele Anwender akzeptabel sein wird, da die Gesamtausbeute der Proteinsynthese aus dem OnePot-System ähnlich ist wie die kommerziell erzielte. Obwohl es detaillierte Protokolle für das OnePot-System gibt, war es eine Herausforderung, die Ergebnisse von Lavickova et al. in anderen Labors vollständig zu reproduzieren. Zum Beispiel wurden Instabilität der Expressionsvektoren, langsam wachsende Stämme und Proteolyse beobachtet10.

In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes und verfeinertes OnePot PURE-Protokoll vor, das das Zellwachstum unter Verwendung standardisierter Glycerinbestände und Medienanpassungen steuert, eine Anleitung zur Überwachung des Wachstums und der Ernte-OD gibt und die Menge an Glycerin in der Endreinigung normalisiert. Zweitens stellen wir ein optimiertes rohes Ribosomenreinigungsverfahren vor, das ausschließlich differentielle Ultrazentrifugation verwendet und den Kompromiss zwischen Ribosomenaktivität und den Kosten und der Komplexität anspruchsvollerer Methoden ausgleicht.

Obwohl dies mehr Schritte in das OnePot-Protokoll einführt, bieten sie dem Benutzer mehr Möglichkeiten, das Verfahren bei Bedarf gründlicher zu beheben und es an seine Bedürfnisse anzupassen. Wir demonstrieren die Reproduzierbarkeit des Prozesses, indem wir mehrere biologische Replikate zeigen, die von mehreren Anwendern im selben Labor durchgeführt wurden. Wir stellen fest, dass die Kontrolle sowohl über die PURE-Komponenten als auch über die Ribosomenpräparation entscheidend ist, um eine hohe CFPS-Leistung des Systems zu gewährleisten.

Die PURE- und Ribosomenpräparation dauert jeweils 4 bzw. 5 Tage und kann entweder nacheinander von einem Benutzer oder gleichzeitig von zwei Benutzern durchgeführt werden. Das PURE-Präparat umfasst 4x500 mL Flüssigkultur, die jeweils ~2 g Zellpellet und ~1 mL PURE-Proteine in einer Konzentration von ~15 mg/ml ergeben. Die Ribosomenzubereitung umfasst 4 × 500 mL = 2 L Flüssigkultur, was zu insgesamt ~3 g Zellpellet führt und ~1 mL rohe Ribosomen bei einer Konzentration von ~17 μM ergibt. Das aktuelle Protokoll produziert PURE-Systeme mit Syntheseausbeuten von bis zu ~100 μg/mL GFP oder ~130 μg/mL mCherry über 2 h Batch-Reaktion11, was im Vergleich zum ursprünglichen OnePot sowie zu kommerziellen Systemen (~140-160 μg/mL)8,12 günstig ist. Daher ist es ein geeigneter Ausgangspunkt für eine weitere Optimierung durch Supplementierung oder Modulation empfindlicher Komponenten wie Salze, Crowding-Agenten und einzelner Proteinfaktoren.

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Protokoll

Das Protokoll gliedert sich in drei Teile. Um der Prägnanz und Klarheit willen betonen wir die wichtigen Änderungen, die für diese Arbeit spezifisch sind, und verweisen daher auf Details, die mit denen in anderen Publikationen übereinstimmen.

Vorarbeiten müssen nur einmal durchgeführt werden. In den vier Abschnitten geht es um die Vorbereitung von Glycerin-Brühen und Starterplatten für die PURE-Proteine sowie um die Verifizierung und Messung der Expressionszeiten der Stämme. Durch die Verwendung von Starterplatten wird die Variabilität beseitigt, die mit der direkten Inokulation aus geschabten Glycerinbeständen verbunden ist. Es ist wichtig, dass diese Arbeit gründlich durchgeführt wird, bevor mit der Herstellungsphase fortgefahren wird. Aufgrund der großen Anzahl verschiedener Glycerinstämme, die an der Herstellung von PURE beteiligt sind, ist es wichtig, die Plasmidintegrität und -expression jedes Stammes zu überprüfen, bevor versucht wird, das System herzustellen.

Ein Schema des Arbeitsablaufs ist in Abbildung 1 und ein empfohlener Zeitplan in Tabelle 1 dargestellt. Die erforderlichen Materialien und die Schritte, in denen sie verwendet werden, sind in der Materialtabelle angegeben, und die Übersicht über die in den einzelnen Phasen erforderlichen Puffer und Medien ist in der ergänzenden Abbildung S1 zusammengefasst.

1. Vorarbeiten

  1. Generierung von Glycerinaktien
    HINWEIS: Alle Plasmide sind bei Addgene erhältlich.
    1. 25 % w/v Glycerinbestände aller in Tabelle 2 aufgeführten Stämme gemäß den Standardverfahren9 erzeugen und in Kryoröhrchen bei -80 °C lagern.
  2. Zubereitung der PURE Starterplatten (über Nacht)
    1. Bereiten Sie 20 mL LB-Medien vor, die mit 100 μg/ml Ampicillin (LB+AMP) ergänzt werden.
    2. Beschriften Sie 36x sterile 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen von #1-#36.
    3. Geben Sie 500 μl LB+AMP in jedes Röhrchen. Beimpfen Sie jedes Röhrchen mit dem entsprechenden Stamm, indem Sie mit einer Pipettenspitze eine kleine Menge aus dem ursprünglichen Glycerinvorrat abkratzen. Stellen Sie sicher, dass die Glycerinvorräte nicht auftauen. Vortex, um gründlich zu mischen.
    4. Aliquotieren Sie 300 μl aus jedem inokulierten Röhrchen in die entsprechende Vertiefung einer sterilen 1 mL 96 Deep-Well-Platte gemäß dem in Abbildung 2 gezeigten Layout.
      HINWEIS: Bei allen nachfolgenden Schritten, die Platten betreffen, ist das Plattenlayout beizubehalten.
    5. Inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem Plattenschüttler bei 37 °C und 1.000 U/min für 15 Stunden.
    6. Bereiten Sie am nächsten Tag 25 ml LB-Medien vor, die mit 100 μg/ml Ampicillin (LB+AMP) und 15 ml sterilem 50%igem (v/v) Glycerin ergänzt werden.
    7. Übertragen Sie 30 μl jeder Kultur mit einer Mehrkanalpipette von der Deep-Well-Platte in den Boden einer optischen 96-Well-Platte. Geben Sie 270 μl LB+AMP-Medien in jede Vertiefung mit Kulturen, um eine 10-fache Verdünnung jeder Kultur zu erreichen.
    8. Messen Sie den OD600 jeder Kultur mit einem Plattenlesegerät. Berechnen Sie das Volumen jeder Kultur, das benötigt wird, um 650 μl frisches LB+AMP auf einen Anfangs-OD600 von 0,2 zu impfen. Eine Tabelle zur Unterstützung der Berechnungen wird als ergänzende Tabelle S1 bereitgestellt.
    9. Bereiten Sie drei neue sterile 1 mL 96 Deep-Well-Platten vor. Geben Sie in einer Platte 650 μl LB+AMP in 36 Vertiefungen und beimpfen Sie jede Vertiefung mit dem berechneten Volumen der Übernachtkultur, um OD600 = 0,2 zu erhalten.
    10. Übertragen Sie 300 μl der inokulierten Kultur in jede der beiden anderen Platten. Eine Platte wird die Kultur sein, und die andere wird zur Überwachung der OD verwendet. Inkubieren Sie die beiden Platten in einem Plattenschüttler bei 37 °C und 1000 U/min, bis die Kulturen OD600 ~ 1 (~1,5-2 h) erreichen. Überwachen Sie den Außendurchmesser nach 1 h und dann bei Bedarf erneut, indem Sie 30 μl Proben aus der zweiten Platte entnehmen und 270 μl LB+AMP für eine 10-fache Verdünnung hinzufügen.
    11. Wenn die einzelnen Vertiefungen einen Außendurchmesservon 600 ~ 1 erreichen, nehmen Sie sie aus dem Shaker. Geben Sie ein gleiches Volumen an sterilem 50 % (v/v) Glycerin zu jeder Kultur, um eine Endkonzentration von OD600 = 0,5 in 25 % Glycerin zu erreichen. Mischen Sie diese Röhrchen gründlich und lagern Sie sie auf Eis. Dies sind die Hauptarbeitsbestände.
    12. Aliquotieren Sie maximal 40 μl jedes Mastermaterials in 96-Well-PCR-Platten, wobei das ursprüngliche Well-Muster beibehalten wird. Verteilen Sie es je nach Lagerkapazität auf so viele Teller wie möglich. Verschließen Sie mit Folienplattendichtungen und lagern Sie diese PURE-Starterplatten bei -80 °C.
      HINWEIS: Diese Starterplatten sollten maximal 3x aufgetaut werden. Bei Überschreitung dieses Grenzwerts durch frische Platten ersetzen, um die Integrität und Reproduzierbarkeit der Dehnung zu erhalten.
  3. Bestimmung der Wachstumszeiten der Starterkultur (über Nacht)
    1. Tauen Sie einen PURE-Vorspeisenteller auf Eis auf.
    2. 50 μl 100 mg/ml Ampicillin zu 50 ml sterilem LB-Medium in einem sterilen konischen Röhrchen (LB+AMP) geben.
    3. Beschriften Sie 36 x 1,5 mL sterile Mikrozentrifugenröhrchen von #1-#36 und geben Sie 1 mL LB+AMP in jedes Röhrchen.
    4. Geben Sie jeweils 10 μl der Glycerinbrühen in das entsprechende beschriftete Röhrchen und mischen Sie es gut durch Vortexen.
    5. Geben Sie 300 μl der inokulierten Kultur aus jedem Röhrchen in die entsprechende Vertiefung einer sterilen 1 mL 96 Deep-Well-Platte. Verschließen Sie die Platten mit einem atmungsaktiven Plattenverschluss und inkubieren Sie die Kulturplatte in einem Plattenschüttler bei 1000 U/min, 37 °C. Bestimmen und notieren Sie die Zeit, die es dauert, bis Kulturen OD600 ~2-3 erreichen, ohne OD600 = 3 zu überschreiten. Legen Sie diesen Parameter fest, bevor Sie fortfahren.
      HINWEIS: In unserem Labor dauert dies 15 h.
  4. Expressionsversuch mit PURE-Stämmen
    1. Bereiten Sie 38 ml LB-Medien vor, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin (LB+AMP), 10 mM IPTG-Stamm und 1x Proteinextraktionsreagenz.
    2. Tauen Sie einen PURE-Vorspeisenteller auf Eis auf.
    3. Geben Sie 1 ml LB+AMP in jede der 36 Vertiefungen einer sterilen 2 mL 96 Deep-Well-Platte. Beimpfen Sie jede Vertiefung mit 20 μl der entsprechenden Starterkultur. Die Platte wird in einem Plattenschüttler bei 1000 U/min und 37 °C ca. 1 h lang inkubiert oder bis ein Außendurchmesservon 600 = 2 erreicht ist.
    4. Induzieren Sie die Proteinexpression, indem Sie 10 μl 10 mM IPTG in jede Vertiefung geben, um eine endgültige IPTG-Konzentration von 0,1 mM zu erreichen. Die Inkubation wird 3 Stunden lang bei 1000 U/min und 37 °C fortgesetzt.
    5. Am Ende der 3-stündigen Expressionsphase werden 700 μl jeder Kultur in sterile Mikrozentrifugenröhrchen von 36 x 1,5 ml überführt. Zentrifugieren Sie bei 20.000 × g für 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
    6. Jedes Pellet in 70 μl 1x Proteinextraktionsreagenz resuspendieren. 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren, um eine Zelllyse zu ermöglichen.
    7. Zentrifugieren Sie die Lysate bei 20.000 × g für 10 min bei 4 °C, um die unlösliche Fraktion zu pelletieren.
    8. Führen Sie eine kleine His-Tag-Aufreinigung jedes Proteins mit Ni-NTA-Magnetbeads gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
    9. Analysieren Sie gereinigte Proteine mit SDS-PAGE, um die Expression jedes Proteins und/oder Kreuzkontaminationen zwischen den Stämmenzu bestätigen 9.
      HINWEIS: Stämme, die ein Protein exprimieren, weisen auf SDS-PAGE unterschiedliche Banden auf, die dem erwarteten Molekulargewicht des Zielproteins entsprechen. Wenn keine Banden nachgewiesen werden, exprimiert der Stamm das Protein möglicherweise nicht. In solchen Fällen wird das Plasmid isoliert und sequenziert, um die Identität und Integrität der Sequenz zu bestätigen, und das Plasmid erforderlichenfalls ersetzt.

2. OnePot PURE Proteinreinigung (4 Tage)

HINWEIS: Eine einzige Vorbereitung des PURE-Systems erfordert die Verarbeitung von 500 ml Flüssigkultur. Es ist ratsam, 4 x 500 mL Preps gleichzeitig herzustellen, um vier unabhängige PURE-Chargen in einem einzigen Lauf herzustellen. Diese Chargen können dann unabhängig voneinander quantifiziert oder gegebenenfalls kombiniert werden. Das 4-Tage-Protokoll kann auf 3 Tage verkürzt werden, indem der Harzinkubationsschritt über Nacht durchgeführt wird, aber dies erfordert einen langen dritten Tag. Beide Optionen werden im Folgenden beschrieben.

  1. Tag 1: Vorbereitung der Materialien und Züchtung der Starterkulturen
    1. Bereiten Sie Stammlösungen und Puffer für die PURE-Zubereitung vor, wie in der ergänzenden Tabelle S2 und der ergänzenden Abbildung S1 beschrieben.
      HINWEIS: Bereiten Sie die erforderlichen Medien und Puffer unmittelbar vor der Ausführung jedes Teils des Protokolls vor und lagern Sie sie nur so lange wie angegeben für die maximale Anzahl von Tagen, bevor Sie sie verwenden.
    2. Tauen Sie einen PURE-Vorspeisenteller auf Eis auf.
    3. 50 μl 100 mg/ml Ampicillin zu 50 ml sterilem LB-Medium in einem sterilen konischen 50-ml-Röhrchen (LB+AMP) geben.
    4. Etikettieren Sie 36 x 1,5 mL sterile Mikrozentrifugenröhrchen von #1-#36 und geben Sie 1 mL LB+AMP in jedes Röhrchen.
    5. Geben Sie jeweils 10 μl der Glycerinbrühen in das entsprechende markierte Röhrchen und mischen Sie es gut durch Vortexen.
      HINWEIS: Um die Inokulation jedes Stammes leicht verfolgen zu können, werfen Sie die Pipettenspitze nach dem Hinzufügen des Stammes zu jedem Röhrchen in die entsprechende Vertiefung der PURE-Starterplatte aus. Wiederhole diesen Vorgang für alle Stämme. Entfernen Sie nach Abschluss des Abschlusses vorsichtig die Pipettenspitzen von der Platte, bevor Sie sie wieder mit Folie und Autoklavenband verschließen und bei -80 °C lagern.
    6. Geben Sie 300 μl der inokulierten Kultur aus jedem Röhrchen in die entsprechende Vertiefung einer sterilen 1 mL 96 Deep-Well-Platte, außer Stamm #25 (EF-Tu). Versiegeln Sie Platten mit einer atmungsaktiven Plattendichtung. Die Kulturplatte wird in einem Plattenschüttler bei 1.000 U/min, 37 °C, 14 Stunden lang inkubiert.
    7. Geben Sie 1 ml inokulierte Kultur aus dem Röhrchen #25 zu 10 mL LB in ein konisches 50-ml-Röhrchen, um die EF-Tu-Starterkultur vorzubereiten. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem Inkubator bei 260 U/min und 37 °C für 14 Stunden.
      HINWEIS: Der Stamm #25, EF-Tu, wird in einer viel höheren Konzentration als die anderen Komponenten benötigt und wird daher separat verarbeitet, wie im ursprünglichen Protokoll8 beschrieben.
    8. Geben Sie 2 l sterile 2x YTP-Medien in eine 2-Liter-Glasflasche und stellen Sie sie in den statischen Inkubator bei 37 °C, um sie über Nacht vorzuwärmen.
  2. Tag 2: Wachstum und Pelletierung
    1. Bereiten Sie die erforderlichen Reagenzien vor:
      1. 2 L steril vorgewärmtes 2x YTP-Medium (ab Tag 1)
      2. 2 ml 100 mg/ml Ampicillin
      3. 100 mM IPTG, steril
      4. 100 mL PBS, steril, eiskalt
      5. 10 mL LB Medien
    2. Übertragen Sie 30 μl jeder Starterkultur mit einer Mehrkanalpipette von der Starter-Deep-Well-Platte und dem EF-Tu-Starterröhrchen in den Boden einer optischen 96-Well-Platte.
    3. Geben Sie 270 μl LB-Medien in jede Vertiefung mit Kulturen, um eine 10-fache Verdünnung jeder Kultur zu erreichen.
    4. Messen Sie den OD600 jeder Kultur mit einem Plattenlesegerät. Alle Stämme sollten bei OD600 = 2-3 liegen.
      HINWEIS: Wenn eine Kultur über OD600 = 3 gewachsen ist, verdünnen Sie sie mit 2x YTP+AMP auf OD600 = 3 (Ergänzende Tabelle S1). Die Verdünnung von überwucherten Startern kann zeitaufwändig und fehleranfällig sein. Daher ist es ratsam, die genaue Inkubationszeit festzulegen, die erforderlich ist, um OD600 2-3 zu erreichen, wie in Abschnitt 1.3 unter Vorarbeiten beschrieben.
    5. 500 mL vorgewärmtes 2x YTP-Medium und 500 μL 100 mg/mL Ampicillin in einen sterilen 2,5 l Kolben mit Blende (2x YTP+AMP) überführen.
    6. In ein einzelnes steriles konisches 15-ml-Röhrchen geben Sie 55 μl jeder Kultur aus der Starterkulturplatte und 1675 μl der EF-Tu-Kultur. Durch Vortexen gut vermischen.
      HINWEIS: Dies ist die OnePot-Kultur, die alle PURE-Stämme miteinander kombiniert. In diesem Stadium können Knockout-Systeme (ΔPURE) hergestellt werden, indem einige Stämme weggelassen werden, oder es können andere Komponenten hinzugefügt werden, die eine Co-Reinigung erfordern.
    7. Den Inhalt dieses Röhrchens in den 2,5-Liter-Isolierkolben mit 500 ml 2x YTP+AMP geben. Die Schritte 5-7 wiederholen, um 4x unabhängige Kulturen zu erhalten.
    8. Die Kolben werden bei 260 U/min und 37 °C 1,5-2 h lang inkubiert, bis OD600 = 0,2-0,3 ist.
    9. Sobald OD600 = 0,2-0,3 erreicht ist, wird jeder Kolben mit 500 μl 100 mM IPTG beimpft, um eine Induktionsendkonzentration von 0,1 mM IPTG zu erreichen.
    10. Die Kulturen werden weitere 3 Stunden bei 260 U/min und 37 °C inkubiert.
    11. Während der Inkubation werden vier sterile konische 50-ml-Röhrchen gewogen und etikettiert.
    12. Kühle die Zentrifugen je nach Bedarf auf 4 °C vor und etikettiere und kühle vier Zentrifugenflaschen aus Polypropylen-Copolymer.
    13. Stellen Sie vier beschriftete 500-ml-Glasflaschen in ein Eiswasserbad.
    14. Am Ende der 3-stündigen Inkubation wird jede Kultur vorsichtig in eine Glasflasche auf Eis umgefüllt, um das Wachstum zu beenden.
      HINWEIS: Der Transfer von Kulturen in gekühlte Flaschen ist unerlässlich, um das Wachstum schnell zu stoppen: Das direkte Platzieren von heißen Kolben in das Eiswasserbad führt nicht zu einer effizienten Beendigung des Wachstums. Alle folgenden Schritte werden, sofern nicht anders angegeben, auf Eis durchgeführt.
    15. Geben Sie 250 mL jeder Kultur in die entsprechenden Zentrifugenflaschen und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 3.220 × g, 4 °C, während die anderen 250 mL im Eiswasserbad aufbewahrt werden.
    16. Den Überstand vorsichtig dekantieren und auf Küchenpapier trocken tupfen.
    17. Geben Sie die restlichen 250 ml jeder Kultur in die entsprechenden Zentrifugenflaschen und zentrifugieren Sie erneut bei 3.220 × g, 4 °C, für 10 Minuten.
    18. Den Überstand vorsichtig dekantieren und auf Küchenpapier trocken tupfen.
    19. Geben Sie 20 mL steriles, eiskaltes PBS in jede Zentrifugenflasche und resuspendieren Sie das Zellpellet gründlich.
    20. Jede Resuspension wird in die vorbereiteten konischen 50-ml-Röhrchen überführt.
    21. Die Röhrchen bei 2.000 × g, 4 °C, 8 min zentrifugieren.
    22. Entfernen Sie den Überstand durch vorsichtiges Dekantieren.
    23. Zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut bei 2.000 × g, 4 °C, für 2 min.
    24. Entfernen Sie den restlichen Überstand durch Pipettieren und halten Sie die Zellpellets auf Eis.
    25. Jedes Röhrchen enthält nun das Zellpellet aus einer einzigen 500-ml-Kultur. Wiegen Sie jedes Röhrchen, berechnen Sie die Pelletmasse der Zelle (typischerweise ~2 g), indem Sie das Leergewicht jedes Röhrchens subtrahieren, und notieren Sie.
    26. Pellets der Schnappzellen einfrieren und bis zur Lyse bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Optional kann das Protokoll in 3 Tagen abgeschlossen werden, indem Sie an dieser Stelle direkt mit dem Lyseschritt fortfahren.
  3. Tag 3: Lyse, Reinigung und Dialyse
    1. Bereiten Sie die erforderlichen Reagenzien vor:
      1. Bereiten Sie 50 ml Resuspensionspuffer vor.
      2. Bereiten Sie 0,5 M TCEP vor.
    2. Tauen Sie die Zellpellets auf Eis auf.
    3. Aliquotieren Sie 50 mL Resuspensionspuffer in ein konisches 50-ml-Röhrchen und fügen Sie 100 μl 0,5 M TCEP hinzu. Durch Vortexen gut vermischen.
    4. Resuspendieren Sie Zellpellets in Resuspensionspuffer + TCEP in einem Verhältnis von 2 ml pro 1 g Zellpellet. Gründlich vortexen, um wieder zu suspendieren.
    5. Verteilen Sie die Zellresuspension auf konische 50-ml-Röhrchen, so dass jedes Röhrchen 5 mL Suspension enthält. Beschriften Sie die Röhrchen nach Bedarf, um den Überblick über die 4 unabhängigen Kulturen zu behalten. Auf Eis lagern.
    6. Lysieren Sie die Zellen durch Beschallung bei 30 % Amplitude, 20 s an, 20 s aus, für 10 Zyklen in einem Eiswasserbad mit einer gekühlten Beschallungssonde (Abbildung 3A, B).
      HINWEIS: Während der Beschallung sollten ca. 1000 J Energie in jedes Rohr übertragen werden. Verwenden Sie einen gesicherten Ständer, um das Rohr während der Beschallung an Ort und Stelle zu halten, um eine konsistente Energieübertragung zu gewährleisten.
    7. Verteilen Sie das Lysat in sterile 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, so dass jedes Röhrchen 1 ml Lysat enthält. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.6 und 2.3.7, um alle vier Kulturen zu lysieren. Die folgenden Schritte werden für 4 Lysate parallel durchgeführt.
    8. Zentrifugieren bei 15.923 × g, 4 °C, für 20 min.
    9. Während der Zentrifugation 5 ml Proteinreinigungsharz waschen und äquilibrieren (vier Säulen für die vier Lysate vorbereiten):
      1. Geben Sie 2 ml frisches Proteinreinigungsharz in eine Schwerkraft-Durchflusschromatographie-Säule.
      2. Waschen Sie die Säule zweimal mit 30 ml sterilem destilliertem Wasser, um das Lagerethanol zu entfernen.
      3. 30 mL Resuspensionspuffer mit 60 μl 0,5 M TCEP bis zu einer Endkonzentration von 1 mM ergänzen.
      4. Da die Säule ein Volumen von 30 mL hat, gießen Sie Puffer direkt in die Säule, um sie zu füllen. Stellen Sie sicher, dass das Ventil geschlossen ist, und äquilibrieren Sie die Säule durch Zugabe von 30 ml Resuspensionspuffer + TCEP.
      5. Öffnen Sie das Ventil, um ~25 mL Puffer durchfließen zu lassen, bevor Sie das Säulenventil schließen und ~5 mL Puffer über dem Harzbett lassen, um ein Austrocknen zu verhindern. Die Säule ist nun einsatzbereit.
    10. Nach der Zentrifugation werden alle geklärten, pelletfreien Überstände aus jeder Kultur in 4x frische konische 50-ml-Röhrchen auf Eis gemischt.
    11. Resuspendieren Sie das Harz in den verbleibenden 5 ml Resuspensionspuffer + TCEP in jeder Säule und geben Sie Puffer und Harz in jedes der konischen Röhrchen, die den Lysatüberstand enthalten.
    12. Den Deckel verschließen, mit Parafilm verschließen und in einem Drehspießschüttler bei 4 °C 5 Stunden inkubieren.
      HINWEIS: Wenn die Lyse unmittelbar nach dem Wachstum durchgeführt wurde, kann dieses Lysat über Nacht mit Harz inkubiert werden.
    13. Bereiten Sie die erforderlichen Reagenzien vor:
      1. TCEP in einer Endkonzentration von 1 mM zu Wasch- und Elutionspuffern geben und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
      2. Halten Sie 20 % (v/v) Ethanol bereit.
    14. Nach der Inkubation die Röhrchen in einer Zentrifuge kurz pulsieren, um das Harz am Boden des Röhrchens zu sammeln.
    15. Resuspendieren Sie das Harz mit einer Pipette und geben Sie das Harz wieder in die Proteinreinigungssäule.
    16. Sobald sich das Harz in einem Bett am unteren Ende der Säule abgesetzt hat, lassen Sie den Puffer durchlaufen.
      HINWEIS: Optionales Sammeln von Durchfluss und Waschungen während der Proteinaufreinigung für die Analyse über SDS-PAGE zur Fehlerbehebung des Aufreinigungsverfahrens
    17. Waschsäule mit einem Säulenvolumen Wash Buffer + TCEP.
    18. Geben Sie 5 mL Elutionspuffer + TCEP in die Säule, resuspendieren Sie das Harz einige Male mit einer Pipette und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.
    19. Nach der Inkubation die Elution in ein beschriftetes 5-ml-Bijoux-Röhrchen auffangen und auf Eis lagern.
    20. Reinigen und lagern Sie das Proteinreinigungsharz:
      1. Waschen Sie die Säule nach Abschluss der Elution mit 30 ml Elutionspuffer, um alle verbleibenden gebundenen Proteine zu entfernen.
      2. Spülen Sie das Harz mit 30 mL sterilem destilliertem Wasser 3x wiederholt.
      3. 30 ml 20 % (v/v) Ethanol einmal durch die Säule leiten.
      4. Füllen Sie die Säule mit 20% Ethanol und verschließen Sie sie mit einem Deckel oder Parafilm. Bis zur nächsten Verwendung bei 4 °C lagern.
        HINWEIS: Es ist nur eine Reinigung erforderlich - versuchen Sie nicht, das Nickel vom Harz zu entfernen. Das gereinigte Harz ist für die Wiederverwendung in Standardpräparaten des PURE-Systems geeignet. Verwenden Sie bei ΔPURE-Systemvarianten jedoch immer frisches Harz, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
    21. Eine 15 mL 2 kDa Dialysekassette 10 Minuten lang in Buffer HT (ohne TCEP) einweichen.
    22. Geben Sie 5 ml eluierte Proteinlösung in die Dialysekassette.
    23. Entfernen Sie so viel Luft wie möglich aus der Kassette, bevor Sie den Deckel wieder aufsetzen.
    24. 5 ml eluiertes Protein gegen 1 l Puffer HT (ohne TCEP) für 2 h dialysieren, gefolgt von weiteren 1 l frischem Puffer HT über Nacht bei 4 °C unter leichtem Rühren.
      HINWEIS: Bei der Kombination von Elutionen aus mehreren Aufreinigungen können bis zu 10 ml Elution gegen 2 l Puffer HT für 2 h dialysiert werden, gefolgt von weiteren 2 l Puffer HT über Nacht bei 4 °C. Wenn die Harzinkubation über Nacht durchgeführt wurde, kann die Dialyse tagsüber nach einem Protokoll von 2 Stunden, gefolgt von 4 Stunden, durchgeführt werden, gefolgt von den folgenden Schritten zur Proteinkonzentration.
  4. Tag 4: Konzentration und Lagerung
    1. Vorbereitung der erforderlichen Reagenzien:
      1. Bereiten Sie Buffer HT Refresh + TCEP vor.
      2. Bereiten Sie Stock-60 + TCEP vor.
    2. Nach Beendigung der Dialyse werden 5 ml der dialysierten Probe aus der Kassette entnommen und 500 μl Aliquots in sterile Mikrozentrifugenröhrchen von 5 x 2 ml verteilt.
    3. Schleudern, um alle gefällten Proteine bei 14.000 × g, 4 °C, 10 Minuten lang zu pelletieren.
    4. Kombinieren Sie den pelletfreien Überstand neu, geben Sie ihn in eine 3 kDa MWCO-Zentrifugalfiltereinheit und füllen Sie das Volumen mit 10 mL Buffer HT Refresh + TCEP auf.
    5. Zentrifugieren Sie bei 3.220 × g, 4 °C für 30 min ODER bis das Probenvolumen auf 1,5 mL reduziert ist.
      HINWEIS: Die Proteinfällung während der Konzentrationsschritte kann die Gesamtleistung des CFPS erheblich verringern. Verwenden Sie nach jedem 30-minütigen Zentrifugationszyklus eine 1-ml-Pipette, um die Probe im Zentrifugalfilterröhrchen zu resuspendieren, um alle ausgefällten Proteine vom Boden des Filters zu entfernen.
    6. Die Probe aus der Zentrifugaleinheit entnehmen und 500 μl Aliquots in sterile 3 x 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen verteilen.
    7. Schleudern, um alle gefällten Proteine bei 14.000 × g, 4 °C, 10 Minuten lang zu pelletieren.
    8. Kombinieren Sie den pelletfreien Überstand in ein frisches, steriles Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
    9. Bestimmen Sie die Konzentration von Proteinen in Lösung mit einem Bradford-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    10. Konzentrieren Sie die Proteinlösung, indem Sie sie in einen frischen 3-kDa-MWCO-Filter geben und 15 Minuten lang bei 14.862 × g, 4 °C zentrifugieren, bis das Probenvolumen erreicht ist, um eine Endkonzentration von 25-30 mg/ml zu erhalten.
    11. Die Probe aus der Zentrifugaleinheit entnehmen und 500 μl Aliquots in sterile 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen verteilen.
    12. Schleudern, um alle gefällten Proteine bei 14.000 × g, 4 °C, 10 Minuten lang zu pelletieren.
    13. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bradford-Assay. Fahren Sie nur dann mit dem nächsten Schritt fort, wenn die Konzentration zwischen 25 und 30 mg/ml liegt.
    14. Kombinieren Sie den pelletfreien Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
    15. Geben Sie ein gleiches Volumen von Stock-60 + TCEP in die konzentrierte Proteinlösung und mischen Sie sie durch vorsichtiges Pipettieren.
    16. Bestimmen Sie die endgültige Proteinkonzentration mit einem Bradford-Assay.
      HINWEIS: Das Protein befindet sich jetzt in Puffer HT + 30% Glycerin, und eine zusätzliche Verdünnung mit Stock-30 ändert die Glycerinkonzentration nicht.
    17. Falls erforderlich, verdünnen Sie die Probe mit Stock-30 + TCEP, um eine Endkonzentration von ca. 12,5 mg/ml zu erreichen.
    18. Aliquot PURE Proteinlösung in PCR-Röhrchen mit 20 μl Aliquoten, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Proteinkonzentration vor der Zugabe von Stock-60 genau zu bestimmen, da die Konzentration von Proteinlösungen, die Glycerin enthalten, aufgrund variabler Mengen an Glycerin in der abschließenden CFPS-Reaktion zu einer inkonsistenten CFPS-Leistung führen kann. Stock-60 sollte daher erst hinzugefügt werden, nachdem bestätigt wurde, dass die Proteinkonzentration im optimalen Bereich von 25-30 mg/ml liegt.

3. Rohe Ribosomenzubereitung (5 Tage)

HINWEIS: Das Ribosomenreinigungsprotokoll wurde für die Verarbeitung von 2 l (4 x 500 mL Kolben) Flüssigkultur optimiert, was zu einer Gesamtmenge von ~3 g Zellpellet und ~1 ml rohen Ribosomen bei einer Konzentration von 15-24 μM führt.

  1. Tag 1: Vorbereitung und Züchtung von Starterkulturen
    1. Bereiten Sie Stammlösungen und Puffer für die Ribosomenzubereitung vor, wie in der ergänzenden Tabelle S2 und der ergänzenden Abbildung S1 beschrieben.
      HINWEIS: Bereiten Sie die erforderlichen Medien und Puffer unmittelbar vor der Ausführung jedes Teils des Protokolls vor und lagern Sie sie nur so lange wie angegeben für die maximale Anzahl von Tagen, bevor Sie sie verwenden.
    2. Bereiten Sie zwei konische 50-ml-Röhrchen vor: Geben Sie 10 mL LB-Medium in ein Röhrchen und 5 mL LB-Medium in das andere.
    3. Nehmen Sie die Glycerinbrühe von BL21(DE3) aus dem -80 °C Gefrierschrank und legen Sie sie auf Eis, um sicherzustellen, dass die nächsten Schritte abgeschlossen sind, bevor die Brühe auftaut.
    4. Beimpfen Sie die 10 ml des LB-Mediums mit einem Abkratzen der Zellen aus dem Glycerinbestand, um eine LB-"Minikultur" zu erstellen. Inkubieren Sie bei 37 °C, 220 U/min, zusammen mit dem anderen (nicht inokulierten) Röhrchen, um auf Medienkontamination zu prüfen, da alle Wucherungen ohne Antibiotikum durchgeführt werden.
    5. Ersetzen Sie die Glycerinbrühe in den -80 °C heißen Gefrierschrank.
    6. 2,2 l sterile Terrific Broth (TB) in sterile Glasflaschen geben und in einem statischen Inkubator bei 37 °C aufbewahren, um sie über Nacht vorzuwärmen.
  2. Tag 2: Wachstum und Pelletierung
    1. Nehmen Sie die Kulturen aus dem Inkubator und stellen Sie sicher, dass sich keine Verunreinigungen im nicht inokulierten Röhrchen oder in der vorgewärmten Medienflasche befinden, bevor Sie fortfahren.
    2. Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnung vor, indem Sie 100 μl der Minikulturkultur zu 900 μl LB in einer 1-cm-Küvette hinzufügen und den OD600 mit einem Spektralphotometer messen (überprüfen Sie, ob er ~4-6 beträgt).
    3. Geben Sie 200 ml der vorgewärmten TB in einen sterilen 500-ml-Konuskolben und inokulieren Sie mit einem geeigneten Volumen der Minikultur, um einen Anfangs-OD600 = 0,05 zu erhalten (Ergänzende Tabelle S1). Das ist die "Midi-Kultur".
    4. Inkubieren Sie die Midi-Kultur bei 37 °C, 220 U/min bis OD600 = 1, was ca. 1,5-2 h dauern sollte.
    5. Geben Sie 500 ml TB in jeden von 4 sterilen 2,5-l-Kolben mit Blende. Beimpfen Sie jede einzelne mit einem geeigneten Volumen Midikultur, um einen Anfangs-OD600 = 0,05 zu erhalten (Ergänzende Tabelle S1). Dies sind die 4 "Maxi-Kulturen".
    6. Inkubieren Sie die Maxi-Kulturen bei 37 °C, 220 U/min bis OD600 = 0,7-0,8, was ca. 1,5-2 h dauern sollte.
    7. In der Zwischenzeit vier saubere Zentrifugenflaschen aus Polypropylen-Copolymer beschriften und 4 saubere 500-ml-Glasflaschen zum Abkühlen auf Eis legen.
      HINWEIS: Messen Sie die Maxi-Kulturdichte alle 15 Minuten nach 1 h Wachstum, um ein Überschießen von OD600 = 0,7 zu vermeiden.
    8. Sobald OD600 = 0,7 erreicht ist, die Kulturen schnell in abgekühlte Glasflaschen umfüllen und 20 Minuten lang in ein Eiswasserbad stellen, um das Wachstum zu beenden.
      HINWEIS: Der Transfer von Kulturen in gekühlte Flaschen ist unerlässlich, um das Wachstum schnell zu stoppen: Das direkte Platzieren von Kolben in das Eiswasserbad führt nicht zu einer effizienten Beendigung des Wachstums. Alle folgenden Schritte werden, sofern nicht anders angegeben, auf Eis durchgeführt.
    9. Während die Kulturen im Eiswasserbad abkühlen, kühlen Sie die Zentrifuge für die Zellpelletierung vor und geben Sie 500 ml PBS-Lösung zum Abkühlen auf Eis.
    10. Nach 20 Minuten werden 250 ml jeder Kultur in die entsprechende vorgekühlte Zentrifugenflasche umgefüllt und 10 Minuten lang bei 3.220 × g, 4 °C, zentrifugiert, während die anderen 250 ml auf Eis gehalten werden.
    11. Den Überstand vorsichtig dekantieren und auf Küchenpapier trocken tupfen.
    12. Geben Sie die restlichen 250 mL jeder Kultur in die entsprechende Zentrifugenflasche und zentrifugieren Sie erneut bei 3.220 × g, 4 °C, für 10 Minuten.
    13. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren und tupfen Sie die Flaschen auf Küchenpapier trocken, bevor Sie die Zellpellets wieder auf Eis legen.
    14. Geben Sie 30 mL steriles eiskaltes PBS in jede Zentrifugenflasche und resuspendieren Sie das Zellpellet gründlich.
    15. Wiegen und etikettieren Sie 4x saubere konische 50-ml-Röhrchen.
    16. Übertragen Sie die Zellsuspension in die konischen Röhrchen von 4 x 50 mL.
    17. Erneut bei 3.220 × g, 4 °C, 10 min zentrifugieren.
    18. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren und tupfen Sie die Röhrchen auf Papiertüchern trocken, bevor Sie die Zellpellets wieder auf Eis legen.
    19. Geben Sie 30 mL steriles, eiskaltes PBS in jedes konische Röhrchen und resuspendieren Sie das Zellpellet gründlich durch Vortexen.
    20. Erneut bei 3.220 × g, 4 °C, 10 min zentrifugieren.
    21. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren und tupfen Sie die Röhrchen auf Papiertüchern trocken, bevor Sie die Zellpellets wieder auf Eis legen.
    22. Geben Sie 30 mL steriles, eiskaltes PBS in jedes konische Röhrchen und resuspendieren Sie das Zellpellet gründlich durch Vortexen.
    23. Erneut bei 3.220 × g, 4 °C, 10 min zentrifugieren.
    24. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren und tupfen Sie die Flaschen auf Küchenpapier trocken, bevor Sie die Zellpellets wieder auf Eis legen.
    25. Ein letztes Mal bei 3.220 × g, 4 °C, 2 Min. zentrifugieren.
    26. Entfernen Sie überschüssigen Überstand durch Pipettieren.
    27. Wiegen und notieren Sie die Masse jedes konischen Rohrs. Die Zellenpelletmasse ist die Differenz zwischen diesen Werten und dem Leergewicht der Röhren (sollte ~1 g betragen).
    28. Kühlen Sie die Pellets der Zellen mit flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei -80 °C.
  3. Tag 3: Lyse, Ultrazentrifugation und Einweichen von Puffer B
    1. Tauen Sie die Zellpellets auf Eis auf.
    2. Geben Sie 50 mL Ribosomenpuffer A in ein sauberes konisches Röhrchen.
    3. Entnehmen Sie 100 μl Ribosomenpuffer A aus dem konischen Röhrchen und geben Sie es in ein DVB-T-Fläschchen ohne Gewicht. Lösen Sie das DVB-T-Pellet vollständig auf, um einen 0,5 M DVB-T-Vorrat zu erhalten.
      HINWEIS: Bereiten Sie die nachfolgenden 0,5-M-DVB-Bestände wie hier beschrieben vor, jedoch unter Verwendung des entsprechenden Puffers für jeden Schritt.
    4. Geben Sie 100 μl 0,5 M DTT zurück in das konische 50-ml-Röhrchen, um eine Endkonzentration von 1 mM DTT in 50 mL Ribosomenpuffer A zu erhalten. Halten Sie die Lösung auf Eis.
    5. Jedes Zellpellet wird in Ribosomenpuffer A + DTT in einem Verhältnis von 2 ml pro 1 g Zellpellet resuspendiert, indem es gründlich vortext. Kombinieren Sie alle resuspendierten Zellen in einem konischen Röhrchen, um das gesamte Volumen der resuspendierten Aufschlämmung zu überprüfen, das 10 ml aus 2 l Kultur betragen sollte. Füllen Sie das Volumen bei Bedarf auf 10 mL mit zusätzlichem Ribosomenpuffer A + DTT auf.
    6. Die Aufschlämmung wird in 2 x 5 mL Proben in getrennten konischen Röhrchen aufgeteilt.
    7. Lysieren Sie die Zellen in jedem Röhrchen durch Beschallung bei 30 % Amplitude, 20 s an, 20 s aus für 10 Zyklen (3 min 20 s Gesamtprogrammlänge) in einem Eiswasserbad unter Verwendung einer gekühlten Beschallungssonde (Abbildung 3A, 3C).
      HINWEIS: Während der Beschallung sollten ca. 1.000 J Energie pro Röhre übertragen werden. Verwenden Sie einen gesicherten Ständer, um das Rohr während der Beschallung an Ort und Stelle zu halten, um eine konsistente Energieübertragung zu gewährleisten.
    8. Füllen Sie das Volumen jeder lysierten Probe auf 25 mL mit Ribosomenpuffer A + DTT auf und wirbeln Sie es kurz vortexen, um es zu mischen.
    9. Inhalt auf 2x gekühlte S30 Zentrifugationsröhrchen umfüllen.
    10. Zentrifugieren Sie bei 30.000 × g für 1 h bei 4 °C (Abbildung 3E).
    11. Gewinnen Sie maximal 75 % des pelletfreien Überstands (um eine Membrankontamination durch das Pellet zu vermeiden) aus jedem S30-Rohr in zwei saubere, vorgekühlte S30-Rohre zurück.
    12. Bei 30.000 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren.
    13. Gewinnen Sie maximal 75 % des pelletfreien Überstands in zwei saubere konische 50-ml-Röhrchen zurück und füllen Sie das Volumen auf jeweils 25 mL mit Ribosomenpuffer A + DTT auf.
    14. Übertragen Sie die Probe in zwei saubere, vorgekühlte S100-Röhrchen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Röhrchen vor der Ultrazentrifugation genau ausbalanciert sind (max. 0,01 g Differenz zwischen gegenüberliegenden Röhrchen) und auf ein Volumen von 25 ml gefüllt sind (maximale Kapazität des S100-Röhrchens).
    15. Zentrifugieren Sie bei 100.000 × g für 4 h bei 4 °C (Abbildung 3F).
    16. Dreißig Minuten vor dem Ende des S100-Laufs wird ein 0,5-M-DVB-T-Material unter Verwendung von eiskaltem Ribosomenpuffer B gemäß den obigen Anweisungen vorbereitet und eine endgültige Lösung von 1 mM DTT in 50 mL Ribosomenpuffer B erzeugt.
    17. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren aus den Ultrazentrifugenröhrchen. Geben Sie 5 ml eiskalten Ribosomenpuffer B + DTT in jedes S100-Röhrchen, das das ribosomale Pellet enthält. Lagern Sie den restlichen Ribosomenpuffer B + DVB-T bei 4 °C für die Verwendung am nächsten Tag.
    18. Inkubieren Sie die Röhrchen auf Eis in einem kalten Raum, um das Ribosomenpellet über Nacht in Ribosomenpuffer B + DTT einweichen zu lassen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Ribosomenpellet vollständig in Ribosomenpuffer B + DTT eingetaucht ist. Dies kann erreicht werden, indem man die Röhren schräg in das Eis legt (Abbildung 3D).
  4. Tag 4: Ultrazentrifugation und Puffer C Einweichen
    1. Geben Sie am nächsten Tag weitere 5 ml eiskalten Ribosomenpuffer B + DTT in jedes S100-Röhrchen, das das über Nacht eingeweichte Ribosomenpellet enthält.
    2. Versuchen Sie vorsichtig, das Pellet durch Pipettieren wieder aufzuwirbeln. Kratzen Sie das Pellet mit der Pipettenspitze von der Röhrchenwand ab und resuspendieren Sie es auf diese Weise. Füllen Sie den Inhalt in zwei saubere, vorgekühlte S30-Röhrchen um.
    3. Geben Sie weitere 10 ml eiskalten Ribosomenpuffer B + DTT in jedes S100-Röhrchen, das das Ribosomenpellet enthält, und wiederholen Sie die Resuspensionsschritte wie oben.
    4. Sammeln Sie die Resuspension in die gleiche S30-Röhre wie zuvor.
    5. Zentrifugieren Sie bei 30.000 × g für 1 h bei 4 °C (Abbildung 3G).
    6. Gewinnen Sie maximal 75 % des pelletfreien Überstands in zwei saubere konische 50-ml-Röhrchen zurück und füllen Sie das Volumen auf 25 mL mit Ribosomenpuffer B + DTT auf.
    7. Diese Probe wird in zwei saubere, vorgekühlte S100-Röhrchen überführt.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Röhrchen vor der Ultrazentrifugation genau ausbalanciert und auf ein Volumen von 25 ml gefüllt sind (maximale Kapazität des S100-Röhrchens).
    8. Zentrifugieren Sie bei 100.000 × g für 4 h bei 4 °C (Abbildung 3H).
    9. Dreißig Minuten vor dem Ende des S100-Laufs bereiten Sie eine 0,5 M DTT-Brühe unter Verwendung von eiskaltem Ribosomenpuffer C gemäß den obigen Anweisungen vor und erzeugen Sie eine endgültige Lösung von 1 mM DTT in 5 mL Ribosomenpuffer C. Halten Sie diesen Puffer auf Eis.
    10. Nach der Ultrazentrifugation ist der Überstand zu entsorgen und der restliche Puffer durch Pipettieren zu entfernen. Arbeiten Sie schnell, um zu vermeiden, dass das Pellet zu lange nicht vom Puffer bedeckt bleibt.
    11. Geben Sie 400 μl eiskalten Ribosomenpuffer C + DTT in jedes Ultrazentrifugenröhrchen, das das ribosomale Pellet enthält.
    12. Inkubieren Sie die Röhrchen auf Eis in einem Kühlraum, um das Ribosomenpellet über Nacht in Ribosomenpuffer C + DTT einweichen zu lassen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Ribosomenpellet vollständig in Ribosomenpuffer C + DTT eingetaucht ist. Dies kann erreicht werden, indem man die Röhren schräg in das Eis legt.
  5. Tag 5: Abholung
    1. Am nächsten Tag resuspendieren Sie das Ribosomen-Pellet vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette und durch leichtes Schwenken, um das klare Halo-Ribosomen-Pellet vollständig aufzulösen.
      HINWEIS: Das Ribosomenpellet sollte sich zu diesem Zeitpunkt vollständig im Puffer auflösen: Zu diesem Zeitpunkt sollte kein unlösliches Pellet vorhanden sein, aber wenn ein gelbes unlösliches Pellet übrig bleibt, versuchen Sie nicht, es wieder zu suspendieren: resuspendieren Sie nur das klare Halo-Ribosomen-Pellet.
    2. Übertragen Sie die Ribosomenlösung in zwei sterile 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 4 °C bei 20.000 × g , um das verbleibende unlösliche Material zu pelletieren.
    3. Den pelletfreien Überstand in ein sauberes Röhrchen füllen und auf Eis lagern (Abbildung 3I).
    4. Erzeugen Sie eine 100-fache Verdünnung der Ribosomenlösung, indem Sie 2 μl bis 198 μl Ribosomenpuffer C in dreifacher Ausfertigung hinzufügen.
    5. Messung der RNA-Konzentration bei 260 nm; 10 Absorptionseinheiten der verdünnten Probe entsprechen 24 μM Ribosomen13.
    6. Aliquote Ribosomenlösungen (z. B. in 50 μl Aliquoten, je nach Bedarf des Benutzers), in flüssigem Stickstoff bei einer maximalen Konzentration von 24 μM einfrieren und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Das Protokoll sollte zu etwa 1 ml Ribosomen bei einer Konzentration von 12-18 μM führen. Wenn die Ribosomen zu verdünnt sind, kann die Konzentration mit einem 3 kDa MWCO-Filter8 erreicht werden.

4. Einrichten von CFPS-Experimenten

  1. Vorarbeiten
    1. Bereiten Sie die DNA-Vorlage (linear oder Plasmid) gemäß den festgelegten Protokollenvor 9.
      HINWEIS: In unserem Labor verwenden wir DNA-Templates, die auf dem T7p14-Expressionssystem basieren, das für die zellfreie Expressionoptimiert ist 14. Aufgereinigte PCR-Produkte können als lineare Templates verwendet werden. Es ist wichtig zu beachten, dass Plasmide nach der Miniprep gereinigt werden müssen und dass verschiedene kommerzielle Kits unterschiedliche Ergebnisse liefern15.
    2. Bereiten Sie die 5-fache Energielösung vor, wie in Tabelle 3 beschrieben.
    3. Bereiten Sie die 6x-Matrixlösung vor, wie in Tabelle 4 beschrieben.
  2. Einrichten und Überwachen einer PURE-Reaktion
    HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau einer dreifachen Messung mit Hilfe eines Mastermixes. Die Anzahl der Reaktionen kann je nach Bedarf nach oben oder unten skaliert werden, wobei die Tabelle in der ergänzenden Tabelle S3 verwendet wird, aber wir empfehlen ein Minimum an dreifachen Wiederholungen für eine einzelne experimentelle Bedingung.
    1. Zum Auftauen wurden Aliquots von PURE, Ribosomen, Energielösung und Matrixlösung auf Eis benötigt.
    2. Bereiten Sie einen Mastermix für einen einzelnen Satz dreifacher Reaktionen in einem PCR-Röhrchen mit insgesamt 17 μl vor, wie in Tabelle 5 gezeigt, indem Sie die Komponenten in der folgenden Reihenfolge zusammenfügen: Energielösung, PURE Proteine, Ribosomen, Matrixlösung, nukleasefreies Wasser auf 17 μl.
    3. Stellen Sie die Pipette auf 5,1 μl ein und saugen Sie die Lösung 5-6 Mal vorsichtig an, um sie zu mischen, um die Homogenität zu gewährleisten.
    4. Laden Sie den Mastermix mit der gleichen Pipetteneinstellung (5,1 μl) in drei einzelne Wells einer optischen 384-Well-Platte. Vermeiden Sie es, die Pipette über den ersten Anschlag hinaus zu schieben, um Blasenbildung zu vermeiden. Lassen Sie einen Well-Abstand zwischen jedem Replikat, um Fluoreszenz-Übersprechen zu minimieren.
    5. Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeplatte.
    6. Fahren Sie je nach Bedarf mit der nachgeschalteten Inkubation oder den Messungen mit dem Plattenleser fort.
      HINWEIS: Bei der Aufnahme zusätzlicher Komponenten, die Glycerin enthalten (z. B. Enhancerproteine), stellen Sie sicher, dass das Endvolumen dieser Komponenten 10 % des Reaktionsvolumens nicht überschreitet. So sollte beispielsweise eine Komponente mit 30 % Glycerin auf 1,7 μL pro 17 μL Mastermix begrenzt werden.
      Zentrifugieren Sie die 384-Well-Platte nach dem Laden nicht. Die Zentrifugation kann zu einer Trennung von glycerinreichen Komponenten (z. B. dem PURE-System) führen, was zu inkonsistenten Expressionsniveaus führt. Das Plattendesign unterstützt Reaktionen mit kleinen Volumina, und sorgfältiges Pipettieren gewährleistet ein angemessenes Absetzen ohne Zentrifugation.

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Ergebnisse

Der Arbeitsablauf für die PURE- und Ribosomenpräparate ist in Abbildung 1 dargestellt, und ein empfohlener Zeitplan für die Arbeit ist in Tabelle 1 dargestellt. In der Regel werden Reaktionen durch die Produktion von fluoreszierenden Proteinen wie GFP oder mCherry überwacht, und RFU-Messwerte können durch Kalibrierung11 in Konzentrationen umgewandelt werden. Die CFPS-Ausbeute hängt jed...

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Diskussion

Wir haben ein detailliertes Verfahren vorgestellt, das es uns ermöglicht hat, reproduzierbare PURE-Systeme über mehrere Chargen und Benutzer im selben Labor zu erhalten. Um dies zu erreichen, sind eine Reihe kritischer Schritte erforderlich.

Der erste wichtige Schritt besteht darin, die Integrität der 36 PURE-Stämme sicherzustellen: Neben der Sequenzierung aller Plasmide ist es wichtig, einen Expressionsversuch durchzuführen, um zu überprüfen, ob alle Stämme k...

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Offenlegungen

SL ist Mitbegründer und CTO von Biophoundry Inc., einem Unternehmen, das zellfreie Technologie für das Phagen-Engineering entwickelt.

Danksagungen

NL, SL, AB und NZ werden durch das UKRI Future Leaders Fellowship (MR/V027107/1) der NL unterstützt. SL wird zusätzlich von Biophoundry Inc. unterstützt. SY wird durch ein Darwin Trust PhD-Stipendium der University of Edinburgh unterstützt. CW wird durch ein BBSRC Eastbio PhD-Stipendium unterstützt. Die Autoren danken A. Pompa für die Unterstützung bei der Verwendung der Ultrazentrifuge, die mit Mitteln der Wellcome Discovery Research Platform for Hidden Cell Biology [226791] unterstützt wurde. Darüber hinaus danken wir B. Lavickova und S. J. Maerkl für die Unterstützung bei der Einrichtung des ursprünglichen OnePot-Protokolls. Zum Zwecke des Open Access hat der Autor eine Creative Commons Attribution (CC BY)-Lizenz auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt. Abbildung 1 wurde teilweise in BioRender erstellt. Laohakunakorn, N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2x YTSigmaY2377-250G
AminosäurenSigmaLAA21-1KT
Ammoniumacetat RNAse-freiThermowissenschaftlichAM9070G
AmmoniumchloridSigma09718-1KG
ampicillinSigmaA8351-5G
BL21(DE3) kompetente E. coliSCHNABELC2527H
Flasche, Zentrifuge (Nalgene)Thermowissenschaftlich3120-9500Polypropylen-Copolymer-Flasche
Flasche, Glas (Duran) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 LVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
Bradford-Test, Quick Start 1x FarbstoffreagenzBio-Rad5000205
ZentrifugeThermowissenschaftlichHeraeus Megafuge 16R
Zentrifuge, MikroEppendorf5424R 
ChromatographiesäuleBio-Rad7321010
KreatinphosphatSigma27920
Cuvetten, semi-mikro 1,6 mLFisherbrandFB55147
Di-Natriumwasserstoff-OrthophophosphatdihydratFisher ChemicalS/4450/60
Dialysekassette, Slide-A-Lyzer G3, 2 kDa MWCO, 15 mLThermowissenschaftlichA52962
Dikaliumwasserstoff-Orthophosphat wasserfreiFisher ChemicalP/5240/60
DTT No-WeighingThermowissenschaftlichA39255
Filtereinheit, zentrifugale 3kDa MWCO Amicon Ultra 15EMD MilliporeUFC900324
Flasche, 500 mLVWR214-1133
Flasche, mit Baffle 2,5 L oon;TunairSS-5013
FolinsäureSigmaF7878-100MG
GlycerinSigmaG5516-1L
HclFisherbrandH/1200/PB17
HEPES-Puffer, 1-M-Lösung pH 7,3ThermowissenschaftlichBP299
ImidazolSigmaI2399-500G
BrutkastenEppendorfNew Brunswick Innova® 42
IPTGThermowissenschaftlichR0392
KOH-PelletsThermowissenschaftlichP1767-500G
L-Glutaminsäure-Hemimagnesiumsalz-TetrahydratSigma49605-250G
L-Glutaminsäure-Monokaliumsalz-MonohydratSigma49601-500G
MagnesiumacetattetrahydratSigmaM5661-50G
MagnesiumchloridFluka63020-1L
Magnetisches RührsystemStuartUS152
NanodropThermowissenschaftlichNanodrop 2000
NEBExpress Ni-NTA Mag-PerlenSCHNABELS1423S
ParafilmSigmaP7543-1EA
Pipette, Mehrkanal-Eppendorf Research Plus 30-300 & Mikro; LEppendorf3125000052
Plattenklebedichtung für PlattenleserExcelScientificSTR-SEAL-PLT (Steril)
PlattenatmungsdichtungStarlabE2796-3005
PlattenfoliendichtungExcelScientificFCS-25
KennzeichenleserBioTekSynergie H1
PlattenschüttlerAllshengMBI100-4A
Plattenzeichen, 384 BrunnenThermowissenschaftlich242764
Platte, 96 tiefe Bohrung 1 mLThermowissenschaftlich736-0601
Platten, 96 tiefe Brunnen 2 mlSarstedt82.1972.002
Platte 96 Brunnen PCRSarstedt721,978
Platten, optisches 96-BohrlochThermowissenschaftlich10057581
KaliumchloridSigmaP5405-500G
Kaliumdihydrogen-OrthophosphatFisher ChemicalP/4800/53
Proteinextraktionsreagenz (BugBuster)EMD Millipore70584-3
Proteinreinigungsharz (cOmplete)Roche5893682001
Rotisserie-ShakerStarlabRM-Multi 1
NatriumchloridFisher ChemicalS/3105/70
Sonikationssonde, FisherBrand 15-50 mLThermowissenschaftlich12931181
SonicatorFisher ScientificFB120
SpektralphotometerJenwayGenova Plus
SpermidinSigmaS2626-1G
TCEP 0,5 MSupelco646547
Thermo Fisher NTP, Tris gepuffertThermowissenschaftlichR1481
tRNA von E. coli MRE600Roche10109541001
TryptonFormediumTRP02
Röhre, 0,2 mL PCR-QualitätSarstedt72,737,002
Röhre, Bioux Sterilin 7 mL PolystyrolThermowissenschaftlich129A
Röhre, konisch (Falcon) 15 mLSarstedt62.554.502
Röhre, konisch (Falcon) 50 mLSarstedt62.547.254
Röhre, Mikrozentrifuge (Eppendorf) 1,5 mLSarstedt72.690.001
Röhre, Mikrozentrifuge (Eppendorf) 2 mLSarstedt72.695.700
Röhre, S100-Zentrifugation Beckman-Coulter355619
Röhren, S30-Zentrifugation Thermowissenschaftlich3118-0050
UltrazentrifugeBeckman-CoulterOptima XPN-100
UltrazentrifugenrotorBeckman-Coulter70Ti Rotor mit festem Winkel
UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes WasserThermowissenschaftlich10977049
VortexerVWR444-2791
HefeextraktOxoidLP0021T

Referenzen

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