Methodenartikel

Stimulation von vaskulären Endothelzellen mit Hilfe von extrazellulären Fallen für Neutrophile in Gegenwart von Lipoproteinen niedriger Dichte

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DOI:

10.3791/68830

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12. August 2025

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1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird eine Reihe von Verfahren beschrieben, darunter die Isolierung von Low-Density-Lipoprotein (LDL) aus menschlichem Plasma, die Differenzierung von HL-60-Zellen in neutrophilenähnliche Zellen, die Herstellung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) in Gegenwart von LDL und die Stimulation menschlicher Aorten-Endothelzellen mit einer Mischung aus NETs und LDL.

Zusammenfassung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) haben sich als ursächliche Faktoren für verschiedene nicht-infektiöse Krankheiten herausgestellt und wurden mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Atherosklerose und Thrombose in Verbindung gebracht. Die NET-Bildung wird in der Gefäßwand beobachtet, und es gibt überzeugende Hinweise darauf, dass die Plasmamarker für die NET-Bildung mit dem Schweregrad der Erkrankung zunehmen. Aus Neutrophilen gewonnene NET-Komponenten, einschließlich Myeloperoxidasen und Proteasen, beeinflussen Plasma-Lipoproteine und die vaskuläre Homöostase. Hier wird eine Reihe von Verfahren zur Stimulation von Gefäßzellen mit NETs beschrieben, die in Gegenwart von Low-Density-Lipoprotein (LDL) gebildet werden. LDL wurde aus humanem Plasma durch Ultrazentrifugation fraktioniert. HL-60-Zellen wurden mit all-trans-Retinsäure behandelt, um sie zu neutrophilenähnlichen Zellen zu differenzieren, und dann mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) stimuliert, um die NET-Bildung zu induzieren. Nach der Entfernung und Auswaschung von PMA wurden die Zellen weiter mit LDL inkubiert. Die gesammelten Überstände, die NETs und LDL enthielten, wurden sofort zur Stimulation humaner Aorten-Endothelzellen (HAECs) verwendet. Als repräsentatives Ansprechen wurde die durch die NET-Behandlung induzierte morphologische Veränderung von HAECs durch das Vorhandensein von LDL verstärkt, was darauf hindeutet, dass die NET-Bildung in Kombination mit LDL das Ansprechen von HAECs verstärkt. Diese Methoden sind nützlich, um die Auswirkungen von LDL auf Endothelzellen unter Neutrophilenaktivierung und NET-assoziierter Entzündung zu erforschen und so neue Einblicke in die Mechanismen zu liefern, die kardiovaskulären Erkrankungen zugrunde liegen, die mit erhöhtem LDL im Plasma verbunden sind.

Einleitung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs), die von aktivierten Neutrophilen bei einer bakteriellen Infektion sowie unter nicht-infektiösen, physiologisch plausiblen Bedingungen produziert werden, setzen dekondensierte DNA und Proteine wie Histone, Myeloperoxidase (MPO) und neutrophile Elastase1 frei. Da diese Komponenten marginale Zellen und Gewebe abbauen und anhaltende Entzündungen verursachen können, hat sich die NET-Bildung als ursächlicher Faktor für die Entstehung und das Fortschreiten verschiedener akuter und chronischer Krankheiten herausgestellt, darunter rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Diabetes, Alzheimer, Krebsmetastasen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen2. Histologische Analysen von humanen vaskulären Läsionen der Atherosklerose3 und des abdominalen Aortenaneurysmas4 zeigten, dass die Neutrophileninfiltration und die NET-Bildung kolokalisiert waren. Im zirkulierenden Blut steigen die Spiegel von NETs-Markern wie citrullinierten Histonen, NET-DNA und MPO mit dem Schweregrad der koronaren Herzkrankheitan 5. In den frühen Stadien der Atherosklerose geht die NET-Bildung oft der Lipidakkumulation voraus, die über die Makrophagen-getriebene Schaumzellbildung erfolgt 6,7. Diese Phänomene deuten stark darauf hin, dass MPO und proteolytische Enzyme, die während der NET-Bildung extrazellulär freigesetzt werden, nicht nur auf Gefäßgewebe, sondern auch auf Blutbestandteile wie Lipoproteine wirken können. Lipoproteine sind fragile Lipid-Protein-Komplexe, die durch NET-abgeleitete Proteine wie MPO8 geschädigt werden können. Daher kann die NET-Bildung strukturelle und biochemische Veränderungen in Lipoproteinen verursachen und dadurch die vaskuläre Homöostase beeinflussen. Die synergistischen Effekte der NET-Bildung und der Lipoproteine auf die durch Gefäßzellen induzierte Dysregulation und Entzündungsreaktionen sind jedoch noch unklar.

Hier stellt dieses Manuskript eine Methode zur Untersuchung der zellulären Reaktionen menschlicher vaskulärer Endothelzellen vor, die durch die Behandlung mit NETs induziert werden, die aus HL-60-abgeleiteten neutrophilenähnlichen Zellen und aus menschlichem Plasma fraktionierten Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL) hergestellt wurden. Repräsentative Ergebnisse zeigen die Fraktionierung von LDL aus humanem Plasma durch Ultrazentrifugation und die zellulären Reaktionen von humanen Aortenendothelzellen (HAECs), die nach Co-Inkubation mit LDL mit NETs stimuliert wurden. Diese Methode ist breit anwendbar für die Untersuchung von Gefäßzellen, an denen andere Lipoproteine beteiligt sind.

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Protokoll

Das Protokoll für die LDL-Zubereitung wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät für Pharmazie der Medizinischen Universität Showa genehmigt (Nr. 231). In Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt, und alle Teilnehmer haben freiwillig ihre Unterschriften für die Teilnahme an dieser Studie geleistet. Die Zellen wurden aseptisch mit Hilfe einer Laminar-Flow-Haube manipuliert. Das Einschlusskriterium war eine Altersspanne von 22 bis 65 Jahren. Zu den Ausschlusskriterien gehörten Rauchgewohnheiten, bereits bestehende Herz-Kreislauf-Erkrankungen (wie koronare Herzkrankheiten, Schlaganfall und periphere arterielle Erkrankungen), schwere Leberfunktionsstörungen und unkontrollierte chronische Erkrankungen wie Diabetes, Bluthochdruck, Dyslipidämie, schwere entzündliche Erkrankungen und Krebs. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung von LDL aus menschlichem Plasma

  1. Entnehmen Sie Vollblut von einem gesunden menschlichen Freiwilligen in Gegenwart von Antikoagulans Heparin (10 Einheiten/ml).
  2. Zentrifugieren Sie 45-50 ml humanes Vollblut, das in einem Heparinröhrchen gewonnen wurde (700 × g für 15 min bei 4 °C). Stellen Sie sicher, dass die Geschwindigkeit der Zentrifuge langsam reduziert wird. Die obere Schicht, die die Plasmafraktion umfasst, wird gesammelt.
  3. Die Zentrifugation zweimal (700 × g, 15 min bei 4 °C) bei der gleichen Verzögerungseinstellung wie in Schritt 1.2 durchführen, um Blutzellen zu eliminieren. Fügen Sie ein Volumen von 1:1.000 mit 250 mM EDTA (pH 7,4) hinzu, um eine durch zweiwertige Metallionen vermittelte Oxidation von Lipoproteinen zu verhindern.
  4. Geben Sie 2,7 ml Plasma in ein 4-ml-Polycarbonat (4PC)-Röhrchen, überlagern Sie 900 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 250 μM EDTA (PBS/EDTA) und eine Ultrazentrifuge (600.000 × g, 7 min bei 4 °C).
  5. Entsorgen Sie 900 μl der obersten Schicht, um Chylomikron zu eliminieren. 900 μl PBS/EDTA auf Plasma und Ultrazentrifuge stapeln (600.000 × g, 2,5 h bei 4 °C).
  6. 900 μl der obersten Schicht werden verworfen, um das Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte (VLDL) zu eliminieren. Dieser Schritt ist wichtig, um eine Kontamination von LDL mit anderen Lipoproteinfraktionen zu verhindern.
  7. Geben Sie 540 μl 0,5 mg/ml KBr-Lösung hinzu, um die Dichte auf d = 1,063 einzustellen, gefolgt von einem sanften Mischen mit einer Pipette und anschließender Ultrazentrifuge (600.000 x g, 2,5 h bei 4 °C).
  8. Sammeln Sie 540 μl der oberen Schicht, die LDL enthält. Eine gelb-orange Schicht zeigt eine erfolgreiche LDL-Trennungan 9. Transfer in eine Dialysemembran.
  9. Dialysieren Sie die LDL-Fraktion dreimal gegen 2 l PBS/EDTA bei 4 °C im Dunkeln, um KBr zu eliminieren.
  10. Lagern Sie LDL vor Gebrauch bei 4 °C im Dunkeln.

2. Vorbereitung von mit Poly-L-Lysin oder Gelatine beschichteten Vertiefungen

  1. Eine 0,01%ige Poly-L-Lysin-Lösung10 wird hergestellt, indem 0,1%ige Poly-L-Lysin-Lösung mit sterilem Wasser verdünnt wird, gefolgt von einer Filtration mit einem 0,2-μm-Sterilfilter. Vor Gebrauch bei 4 °C lagern.
  2. Geben Sie 152 μl/Vertiefung 0,01%ige Poly-L-Lysin-Lösung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und inkubieren Sie sie mindestens 5 Minuten lang.
  3. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie sie einmal mit 200 μl/Vertiefung sterilem Wasser und trocknen Sie sie mindestens 2 Stunden lang.
  4. Vor der Verwendung bei Raumtemperatur zur Zubereitung von NETs lagern.

3. Vorbereitung von gelatinebeschichteten Vertiefungen

  1. Bereiten Sie vor Gebrauch eine 0,1%ige Gelatinelösung vor, indem Sie die 2%ige Gelatinelösung mit sterilem Wasser verdünnen.
  2. 152 μl/Vertiefung der 0,1 %igen Gelatinelösung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte geben und mindestens 5 min inkubieren11.
  3. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie sie einmal mit 200 μl/Vertiefung sterilem Wasser und trocknen Sie sie mindestens 2 Stunden lang.
  4. Vor Gebrauch bei Raumtemperatur lagern.

4. Erhaltung und Aufbereitung humaner Aorten-Endothelzellen (HAECs)

  1. Kultivieren Sie primäre HAECs in einem unbeschichteten Kulturkolben unter Verwendung eines vollständigen Mediums, das 2 % fötales Kälberserum (FCS), 5 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor, 10 ng/ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 20 ng/ml insulinähnlicher Wachstumsfaktor, 0,5 ng/ml vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor, 1 μg/ml Ascorbinsäure, 22,5 μg/ml Heparin und 0,2 μg/ml Hydrocortison, wie in der Anleitung des Herstellers angegeben. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis die Zellen zu 70 % bis 80 % zusammenfließen.
  2. Zur Stimulation säen Sie HAECs in gelatinebeschichteten 12-Well-Platten. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis die Konfluenz erreicht ist. Führen Sie das Experiment zwischen den Passagen 4 und 7 durch.

5. Präparation von HL-60-abgeleiteten neutrophilenähnlichen Zellen, gefolgt von NETs

  1. HL-60-Zellen werden mit RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin, unter Verwendung von unbehandelten Schalen aufbewahrt.
  2. Zur Herstellung von HL-60-abgeleiteten neutrophilenähnlichen Zellen werden 2 × 106 Zellen pro 10 ml HL-60-Zellen für 4 Tage in einem RPMI-1640-Medium kultiviert, das 2 μM all-trans-Retinsäure (AtRA) enthält.

6. Vorbereitung von NETs mit LDL

  1. Entnahme von HL-60-Zellen 4 Tage nach der Behandlung mit 2 μM AtRA. Nach der Differenzierung von HL-60-Zellen zu neutrophilenähnlichen Zellen werden die Zellen kleiner.
  2. Zentrifugenzellen (220 × g, 4 min bei 18-22 °C). Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit dem gleichen Volumen serumfreiem RPMI-1640.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellen (220 × g, 4 min bei 18-22 °C) und resuspendieren Sie die Zellen anschließend mit serumfreiem RPMI-1640.
  4. Zählen Sie die Zellen, resuspendieren Sie die Zellen dann auf 2 × 106 Zellen/ml in serumfreiem RPMI-1640 und säen Sie 0,5 ml Zellsuspension in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte, die mit Poly-L-Lysin vorbeschichtet ist. Kultur für mindestens 30 min.
  5. Geben Sie 100 μl serumfreies RPMI-1640 mit oder ohne 300 nM Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) bis zur Endkonzentration von 0 oder 50 nM PMA. Kultur für 30 min.
  6. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit serumfreiem RPMI-1640. Ersetzen Sie das Medium durch serumfreies RPMI-1640 mit oder ohne 20 μg/ml LDL und kultivieren Sie es dann 2 Stunden lang.
  7. Nährmedium auffangen und zentrifugieren (700 × g, 3 min bei 18-22 °C), um Zellreste zu entfernen.

7. Stimulation von HAECs mit NETs und LDL

  1. Ersetzen Sie das Medium durch 0,5 ml frisches Kulturmedium. Vor der Stimulation mindestens 30 Minuten lang kultivieren.
  2. 167 μl des Kulturmediums, das NETs und LDL (Schritt 6.7) und LDL enthält, werden in HAEC-Schalen gegeben. Überprüfen Sie die morphologischen Veränderungen der HAECs, die nach einer Stimulation von 12 h oder länger induziert wurden.

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Ergebnisse

Nach Entfernung der Chylomikronen, gefolgt von VLDL-Fraktionen aus menschlichem Plasma durch sequentielle Ultrazentrifugation, wurde humanes Plasma mit einer KBr-Lösung gemischt, um die Dichte auf d = 1,063 einzustellen. In diesem Schritt wurde das restliche Fällungsmittel nicht vollständig in der Lösung gelöst, und eine starke Durchmischung, bei der Gasblasen entstanden, wurden vermieden, um das LDL intakt zu halten. Nach der Ultrazentrifugation wurde LDL auf der obersten Schicht visuell durch seine gelb-orange...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von NETs aus dHL-60-Zellen, die durch die Koexistenz von LDL induziert werden und anschließend zur Analyse von HAEC-Reaktionen verwendet werden. Die Bedeutung dieses Protokolls ist die Verwendung von frischem Medium, das NETs und LDL enthält, für die Stimulation der Zellen, auch wenn viele andere Studien eine Stammlösung von NETs verwenden, die bei -20 °C eingefroren wurden. Da es sich bei Lipoproteinen um Lipid-Protein-Komplexe handelt, gehen...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde teilweise von der Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI, unterstützt (Fördernummern 23K10897 und 19K07069). Wir danken Editage (www.editage.jp) für die Bearbeitung der englischen Sprache.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,1 % Poly-L-LysinSigmaAldrichNr. P8920-100ML
10 cm SchaleCorning430591
12-Well-GewebekulturplattenFalke353043
2% GelatineSigmaAldrichNr. G1393-20ML
4-teiliges RohrHimacS404332A
all-trans-RetinsäureWako188-01113Kann durch jeden Lieferanten ersetzt werden
Cellurose-DialyseschlauchMISUMI Group Inc.Tel.: 0327-23-37-07 (UC18-32-100)Kann durch jeden Lieferanten ersetzt werden
EDTADojindo345-01865Kann durch jeden Lieferanten ersetzt werden
Wachstumsmedium für Endothelzellen 2 KitPromoCellNr. C-22111
Fötales RinderserumGibco10270-106Kann durch jeden Lieferanten ersetzt werden
Heparin-Natrium (5.000 Einheiten/5 ml)Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.Kann durch jeden Lieferanten ersetzt werden
Gekühlte HochgeschwindigkeitszentrifugeTOMYSRX-201Beschleunigung: 9, Verzögerung: 7
humane Aorten-EndothelzellenLonzaCC-2535
KBrWako168-03475Kann durch jeden Lieferanten ersetzt werden
KEYENCE Mikroskopie-SoftwareKEYENCEBZ-II Analysator
Mikro-UltrazentrifugeHimacCS150GX
MikroskopieOLYMPCK40
MikroskopieKEYENCEBZ-9000Für Zeitrafferaufnahmen (Option)
Mikroskopie-KameraNikonDS-Fi3
Software für Mikroskopie-KamerasNikonDS-L4
Penicillin/StreptomycinGibcoArtikel-Nr.: 15140-122 100MLKann durch jeden Lieferanten ersetzt werden
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (&mal; 10)2,6 g NaH2PO4· 2H2O, 29 g Na2HPO4· 12H2O, 80 g NaCl und 2,0 g KCl in destilliertem Wasser und auf das Volumen von 1 l einstellen. (Kann durch jeden Anbieter ersetzt werden)
PMA (Phorbol 12-Myristat 13-acetat)Wako162-23591Kann durch jeden Lieferanten ersetzt werden
Reagenzien-PaketLonzaNr. CC-5034(CC-5022: HEPES gepufferte Kochsalzlösung, CC-5012: Trypsin/EDTA, CC-5002: Trypsin-neutralisierende Lösung) 
RotorHimacS100AT6-0242
RPMI-1640 (mit Phenolrot)Wako189-02025Kann durch jeden Lieferanten ersetzt werden
RPMI-1640 (ohne Phenolrot)Wako186-02155Kann durch jeden Lieferanten ersetzt werden
T-25 KolbenCorning3275

Referenzen

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Schlagwörter

NET BildungHL 60 ZellenUltrazentrifugationFraktionierung von HumanplasmaPhorbolmyristatacetatmorphologische Ver nderungMechanismen von Herz Kreislauf Erkrankungen

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