In diesem Protokoll wird ein kombinierter Rekombinase-Polymerase-Amplifikations-CRISPR/Cas12a-Assay für den Nachweis des invasiven Pflanzenpathogens Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 dargestellt.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Kombinierte Rekombinase-Polymerase-Amplifikation CRISPR/Cas12a-Assay zum Nachweis von Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine regelmäßige und genaue Überwachung ist für die effiziente Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten von zentraler Bedeutung. Es kann angeben, welche Vorgehensweise am besten geeignet ist und ob Prävention, Beseitigung oder keine Maßnahmen erforderlich sind. Eine Überwachung, die allein auf der Symptomatik der Wirtspflanzen basiert, ist aufgrund von Ähnlichkeiten in den Symptomen, die durch biotischen und abiotischen Stress verursacht werden, oft nicht zuverlässig. Laborbasierte molekulare Methoden wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die quantitative (q)PCR werden am häufigsten und zuverlässigsten zum Nachweis von Pflanzenpathogenen eingesetzt, sind aber auf teure Geräte und erfahrene Bediener angewiesen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine vereinfachte DNA-Extraktion, Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas12a (RPA-Cas12a) für den Nachweis des invasiven Erregers Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 (Foc TR4) kombiniert. Die Technik bietet eine einfache Alternative zum Nachweis in einem Röhrchen, die analytisch robust ist und die Spezifität im Vergleich zu verfügbaren molekularen Nachweisassays verbessert und den Bedarf an teuren und hochentwickelten Laborgeräten überflüssig macht.
Einleitung
Die Fusarium-Welke, verursacht durch den bodenbürtigen Pilzerreger Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), gilt weltweit als einer der verheerendsten grenzüberschreitenden Pflanzenpathogene der Geschichte1. Einmal in ein neues Gebiet eingeschleppt, bleibt Foc unsichtbar, bis infizierte Pflanzen Symptome entwickeln. Dies kann Monate dauern, so dass sich der Pilz unwissentlich etablieren und ausbreiten kann. Einmal etabliert, ist es aufgrund der Produktion widerstandsfähiger Chlamydosporen und der mehrjährigen Bananenproduktion fast unmöglich, sie wirtschaftlich auszurotten. Die Bedeutung von P....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Vereinfachte DNA-Extraktion aus Pflanzenmaterial
HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für einen Überblick.
- Führen Sie eine DNA-Extraktion durch.
- Übertragen Sie 250 mg jedes Stücks des symptomatischen Pseudostamms in einen separaten Extraktionsbeutel (siehe Materialtabelle).
- Geben Sie 2 mL 0,5 M NaOH-PVP (Table of Materials) in Beutel mit Pflanzenmaterial. Mahlen Sie infizierte Gefäße in einem Extraktionsbeutel mit einer manuellen Mühle wie einem Stößel.
HINWEIS: Fügen Sie bei Bedarf 1-2 mL zusätzlic....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Der erfolgreiche Nachweis von Foc TR4 aus infiziertem Pflanzenmaterial mittels vereinfachter DNA-Extraktion, gefolgt von dem kombinierten RPA-Cas12a-Assay, wenn er mit dem tragbaren Fluorometer Genie III durchgeführt wurde, ist in Abbildung 4A dargestellt. Positive Proben zeigen eine sichtbare Fluoreszenz (Spur 6-8), während negative Proben eine niedrige Endpunktfluoreszenz aufweisen (Spur 1-5). Wenn die Probenröhrchen unter blauem LED-Licht betrachtet wurde.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Regelmäßige Überwachung ist eine wichtige Strategie für eine wirksame Prävention und Eindämmung von Foc TR4 und anderen wichtigen invasiven Schädlingen. Nachweisprotokolle, die vor Ort angewendet werden können und Krankheitserreger schnell und genau identifizieren, können die Entscheidungsfindung beschleunigen und die mit Überwachungsbemühungen verbundenen Kosten begrenzen. Zu diesem Zweck kombinierte das hier vorgestellte Protokoll eine vereinfachte DNA-Extraktion, die direkt an beprobt.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen oder intellektuellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir danken für die Finanzierung durch die National Research Foundation of South Africa, Fördernummer: 138109, im Rahmen des Programms "Competitive Support for Unrated Researchers". Wir würdigen auch die Finanzierung des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen des Marie-Skłodowska-Curie-Stipendiums unter der INDICANTS-Projektfördernummer: 890856.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| EnGen Lba Cas12a (Cfp1) Protein | New England Biolabs | M0653T | |
| EnGen Lba Cas12a Verdünner | New England Biolabs | B0653A | |
| Eppendorf PCR-Röhren | Merck | EP0030124332 | |
| Eppendorf Safe-Lock Mikro-Reagenzgläser | Merck | EP0030121708 | |
| Universelle Extraktionsbeutel | BIOREBA | 430100 | |
| GeneRuler 100 bp DNA-Leiter | Thermo Fischer Scientific | SM0241 / SM0242 | |
| Genie Zentrifuge Mini-6KO | OptiGene | OP-FUGE | |
| Dschinn III | OptiGene | https://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ | |
| Genie-Strip-Halter | OptiGene | GBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03 | |
| Genie-Strips | OptiGene | OP-0008-50 / OP-0008-500 | |
| HiScribe T7 Hochleistungs-RNA-Synthese-Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| NanoDrop ND-1000 UV/Vis-Spektrophotometer | Thermo Fischer Scientific | https://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253 | |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | |
| NEBuffer r2.1 | New England Biolabs | B6002S | |
| Polyvinylpyrrolidon (PVP) Pulver | Sigma-Aldrich | 9003-39-8 | |
| RNA-Reinigung und Konzentrator-5-Kit | Zymo-Forschung | R1013 | |
| RNA-Ladefarbe | Thermo Fischer Scientific | R0641 | |
| SmartBlue Blue Light Transilluminator | Accuris-Instrumente | E4000-E | |
| Natriumhydroxid-(NaOH)-Pellets | Merck, EMPARTA | K277 | |
| Tris (Hydroxylmethyl) Aminomethan | Merck | 77-86-1 | |
| TwistAmp Liquid Basic Kit | TwistDx | TALQBAS01 |
Referenzen
- Viljoen, A., Ma, L. J., Molina, A. B. Fusarium Wilt (Panama Disease) and Monoculture in Banana Production: Resurgence of a Century-Old Disease. Emerging Plant Diseases and Global Food Security. , The American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (2020).
- Viljoen, A., et al. Banana Diseases and Pests: Field Guide for ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
