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Methodenartikel

Kombinierte Rekombinase-Polymerase-Amplifikation CRISPR/Cas12a-Assay zum Nachweis von Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

678 Ansichten

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DOI:

10.3791/68841

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14. November 2025

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1Department of Plant Pathology, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University, 2CIRAD, UMR PVBMT, 3Department of Genetics, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Protokoll wird ein kombinierter Rekombinase-Polymerase-Amplifikations-CRISPR/Cas12a-Assay für den Nachweis des invasiven Pflanzenpathogens Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 dargestellt.

Zusammenfassung

Eine regelmäßige und genaue Überwachung ist für die effiziente Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten von zentraler Bedeutung. Es kann angeben, welche Vorgehensweise am besten geeignet ist und ob Prävention, Beseitigung oder keine Maßnahmen erforderlich sind. Eine Überwachung, die allein auf der Symptomatik der Wirtspflanzen basiert, ist aufgrund von Ähnlichkeiten in den Symptomen, die durch biotischen und abiotischen Stress verursacht werden, oft nicht zuverlässig. Laborbasierte molekulare Methoden wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die quantitative (q)PCR werden am häufigsten und zuverlässigsten zum Nachweis von Pflanzenpathogenen eingesetzt, sind aber auf teure Geräte und erfahrene Bediener angewiesen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine vereinfachte DNA-Extraktion, Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas12a (RPA-Cas12a) für den Nachweis des invasiven Erregers Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 (Foc TR4) kombiniert. Die Technik bietet eine einfache Alternative zum Nachweis in einem Röhrchen, die analytisch robust ist und die Spezifität im Vergleich zu verfügbaren molekularen Nachweisassays verbessert und den Bedarf an teuren und hochentwickelten Laborgeräten überflüssig macht.

Einleitung

Die Fusarium-Welke, verursacht durch den bodenbürtigen Pilzerreger Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), gilt weltweit als einer der verheerendsten grenzüberschreitenden Pflanzenpathogene der Geschichte1. Einmal in ein neues Gebiet eingeschleppt, bleibt Foc unsichtbar, bis infizierte Pflanzen Symptome entwickeln. Dies kann Monate dauern, so dass sich der Pilz unwissentlich etablieren und ausbreiten kann. Einmal etabliert, ist es aufgrund der Produktion widerstandsfähiger Chlamydosporen und der mehrjährigen Bananenproduktion fast unmöglich, sie wirtschaftlich auszurotten. Die Bedeutung von Prävention und Früherkennung ist daher für den Schutz gefährdeter Erzeuger von größter Bedeutung1. Die derzeitige Epidemie der Krankheit, die durch Foc tropical race 4 (TR4) verursacht wird, erfordert die Erkennung durch regelmäßige Überwachung, um symptomatische Bananenpflanzen in Hochrisikogebieten zu identifizieren. Abiotische Einschränkungen wie Wasserstress und bestimmte Nährstoffmängel führen zu einer externen Gelbfärbung, die den Symptomen einer Foc TR4-Infektion ähnelt. Darüber hinaus können Symptome, die aus einer Infektion mit verschiedenen Foc-Rassen resultieren, nicht unterschieden werden. Eine laborbasierte Aufreinigung und ein anschließender phänotypischer und molekularer Nachweis sind daher für einen zuverlässigen Foc TR4-Nachweis erforderlich2. Für den Foc TR4-Nachweis stehen verschiedene molekulare Assays zur Verfügung, darunter PCR, quantitative (q) PCR und schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) Assays 3,4,5,6,7. Die meisten dieser Protokolle erfordern jedoch immer noch teure und spezialisierte Fähigkeiten und Geräte, die in Laborumgebungen durchgeführt werden müssen. Die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) kann isotherm durchgeführt werden und macht daher solche Geräte überflüssig und kann für In-Field-Nachweisprotokolle in Betracht gezogen werden8.

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas-Systeme werden zunehmend für eine verbesserte molekulare Diagnostik eingesetzt9. Diese Systeme werden eingesetzt, da sie kostengünstig und einfach sind und keine speziellen Instrumente erfordern und daher für die Detektion vor Ort in Betracht gezogen werden können. Die CRISPR-basierte Diagnostik umfasst typischerweise die isotherme Amplifikation einer Zielsequenz, gefolgt von der Zielerkennung über CRISPR-Cas-Proteine und der kollateralen Spaltung eines DNA- oder RNA-Fluoreszenz-Reporterfarbstoffs, um das Vorhandensein des Ziels anzuzeigen10,11. Insbesondere in CRISPR-Cas12a-Systemen leitet die CRISPR-RNA (crRNA) Cas12a an, Nukleinsäureziele zu erkennen und zu spalten. Diese crRNA kann so gestaltet werden, dass sie durch Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz auf eine bestimmte DNA- oder RNA-Region von Interesse abzielt. Sobald es gebunden ist, führt es dazu, dass Cas12a das Ziel mit Einzelnukleotidspezifität spaltet, gefolgt von einer kollateralen Spaltung der Reportermoleküle12. In jüngster Zeit werden CRISPR-Cas12a-Systeme eingesetzt, um verschiedene wirtschaftlich wichtige pilzliche Pflanzenpathogenenachzuweisen 13,14,15,16,17,18,19,20.

In diesem Protokoll wird die Entwicklung einer Einröhrchen-Detektionstechnik beschrieben, die eine vereinfachte DNA-Extraktion, Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) und CRISPR/Cas12a-Technologie (RPA-Cas12a) für die Detektion von Foc TR4 kombiniert, die sowohl auf einem tragbaren Fluorometer als auch mit bloßem Auge unter einem kostengünstigen Blaulichttransilluminator mit Leuchtdiode (LED) sichtbar gemacht wurde21. Die Methode kann für die In-Field-Detektion weiter optimiert werden, um Präventions- und Eindämmungsstrategien zu verbessern. Ein ähnlicher Ansatz kann auch verwendet werden, um Cas12a-basierte Nachweisassays für andere Pflanzenpathogene zu entwickeln.

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Protokoll

1. Vereinfachte DNA-Extraktion aus Pflanzenmaterial

HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für einen Überblick.

  1. Führen Sie eine DNA-Extraktion durch.
    1. Übertragen Sie 250 mg jedes Stücks des symptomatischen Pseudostamms in einen separaten Extraktionsbeutel (siehe Materialtabelle).
    2. Geben Sie 2 mL 0,5 M NaOH-PVP (Table of Materials) in Beutel mit Pflanzenmaterial. Mahlen Sie infizierte Gefäße in einem Extraktionsbeutel mit einer manuellen Mühle wie einem Stößel.
      HINWEIS: Fügen Sie bei Bedarf 1-2 mL zusätzlich 0,5 M NaOH-PVP hinzu, um genügend flüssigen Extrakt aus dem Beutel zu erhalten.
    3. 195 μl 100 mM Tris-HCL (pH 8,0) (Materialtabelle) in 1,5 ml-Röhrchen geben.
    4. Pipettieren Sie 5 μl Extrakt aus dem Beutel in das 1,5 ml-Röhrchen mit 195 μl 100 mM Tris-HCL (pH 8,0) und verdünnen Sie den Extrakt um das 40-fache.
    5. Die Röhren 15-30 s vortexen und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.

2. crRNA-Synthese und Qualitätskontrolle

  1. Führen Sie eine Transkription durch.
    1. Geben Sie unter Verwendung des RNA-Transkriptionskits (Table of Materials) Folgendes in ein 0,2-ml-PCR-Röhrchen: 1,5 μl 10x T7-Reaktionspuffer, 1,5 μl jedes dNTP, 1,5 μl T7-DNA-Polymerase-Mix, 1 μl nukleasefreies Wasser und 10 μl 100 μM T7-Template-DNA für ein Gesamtvolumen von 20 μl.
    2. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C in einem Wasserbad oder einer PCR-Maschine für mindestens 4 Stunden.
    3. Verwenden Sie ein Spektralphotometer (Table of Materials), um die Menge der transkribierten RNA zu bestimmen. Verdünnen Sie die RNA auf 250 ng/μl (10 μg) in einem Volumen von 40 μl mit nukleasefreiem Wasser oder TE-Puffer (Ergänzende Datei 1).
      HINWEIS: Die transkribierte RNA kann bei -80 °C gelagert werden, bis mit den DNase-Behandlungen und Reinigungsschritten fortgefahren wird.
  2. Führen Sie eine DNase-Behandlung und eine crRNA-Reinigung durch.
    HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur durch. Halten Sie RNA und DNase I Enzym auf Eis.
    1. Behandeln Sie die RNA-Probe mit DNase I, die im RNA-Reinigungskit (Table of Materials) enthalten ist, gemäß den Anweisungen des Herstellers22.
    2. Reinigen Sie die RNA-Probe mit dem RNA-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers gemäß Protokoll II22.
    3. Lassen Sie die gereinigte crRNA mit Nanotropfen fallen, um die vorhandene Menge und Qualität zu bestimmen. Die RNA mit nukleasefreiem Wasser auf 100 ng/μl verdünnen und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.
    4. Erhitzen Sie die crRNA mit RNA-Ladefarbstoff (Table of Materials) 10 Minuten lang in einem Wasserbad auf 70 °C und unterziehen Sie die crRNA einer Elektrophorese auf einem 1,5%igen Agarosegel, um die synthetisierte crRNA sichtbar zu machen (Abbildung 2).

3. Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA)-Cas12a Ein-Röhrchen-Reaktion für den in vitro Foc TR4-Nachweis

HINWEIS: Eine Übersicht finden Sie in Abbildung 3 .

  1. Bereiten Sie die Reaktionsgemische RPA und Cas12a vor.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass diese Schritte in einem DNA-freien Raum auf Eis durchgeführt werden, wobei die Reagenzien und Materialien vorgekühlt sind. Wischen Sie die Arbeitsfläche und die Pipetten vor dem Experiment mit Bleichmittel und 70% Ethanol ab. In Tabelle 1 finden Sie Informationen zu allen in dieser Studie verwendeten Oligonukleotiden.
    1. Bereiten Sie ein 20 μl Cas12a-Reaktionsgemisch in einem separaten 0,5-ml-Röhrchen (Materialtabelle) mit den folgenden Reagenzvolumina her: 2 μl 10x NEBuffer r2.1 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/ml rekombinantes Albumin, pH 7,9), 0,4 μl 10 μM LbCas12a-Protein, 0,6 μl 100 ng/μl crRNA, 0,4 μl 10 μM Reporter und 16,6 μl deionisiertes Wasser.
      HINWEIS: Die endgültigen Konzentrationen des LbCas12a-Proteins, der crRNA und des Reporters betragen jeweils 200 nM.
    2. Bereiten Sie ein 9,5 μL RPA-Reaktionsgemisch in einem separaten 0,5 mL Röhrchen mit folgenden Reagenzvolumina vor: 5 μL 2x Reaktionspuffer (Endkonzentration 1x gemäß Herstellerrichtlinien), 1,6 μL dNTP Mix (Endkonzentration 1,6 mM), 1 μL 10x Basic E-Mix (Endkonzentration 1x gemäß Herstellerrichtlinien), 0,5 μL jedes RPA-Primers bei 10 μM (Endkonzentration je 0,5 μM), 0,5 μl 20x Kernreaktionsmischung (Endkonzentration 1x gemäß Herstellerrichtlinie) und 0,4 μl deionisiertes Wasser.
    3. Legen Sie einen 8-Rohr-Streifen in ein Rohrgestell (Materialtabelle) auf Eis.
    4. Übertragen Sie das 20 μL Cas12a-Reaktionsgemisch in den Röhrchenboden.
    5. Übertragen Sie das 9,5 μl RPA-Reaktionsgemisch in den Deckel des Röhrchenstreifens. 0,5 μl 280 nM MgOAc (Endkonzentration 14 nM) zum RPA-Reaktionsgemisch im Deckel des Röhrchenstreifens geben und durch Auf- und Abpipettieren mischen.
    6. Geben Sie 0,5 μl deionisiertes Wasser in den Deckel des NTC-Röhrchens (Non-Template Control) und verschließen Sie es vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Reaktionsgemische RPA und Cas12a nicht kombiniert werden.
      HINWEIS: Eine Nicht-Vorlagensteuerung (NTC) ist enthalten, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.
  2. Fügen Sie Template-DNA hinzu und starten Sie die Reaktion.
    1. 0,5 μl Matrizen-DNA zu dem 10 μl RPA-Reaktionsgemisch mit MgOAc im Deckel des Röhrchenstreifens, mit Ausnahme des NTC, mit deionisiertem Wasser anstelle der DNA geben. Fügen Sie immer eine bekannte Foc TR4-DNA der Positivkontrolle in einer Vertiefung hinzu, um sicherzustellen, dass der Assay wie vorgesehen funktioniert. Mischen Sie, indem Sie auf und ab pipettieren.
    2. Schließen Sie die Deckel der Röhrchenstreifen vorsichtig, um sicherzustellen, dass sich die RPA- und Cas12a-Reaktion nicht vermischt.
    3. Schalten Sie das tragbare Fluorometer ein (Table of Materials) und erstellen Sie ein Run-Profil für den RPA-Cas12a-Assay (Ergänzungsdatei 2). Öffnen Sie das gespeicherte Laufprofil und legen Sie den Röhrenstreifen in das tragbare Fluorometer, um ihn 30 Minuten lang bei 37 °C zu inkubieren.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, den Boden der Rohre nicht zu berühren, wenn Sie den Rohrstreifen anfassen. Halten Sie stattdessen die Außenkanten am oberen linken und rechten Ende fest.
    4. Entfernen Sie den Röhrenstreifen nach 30 Minuten vom tragbaren Fluorometer. Drehen Sie die Röhrchen sechsmal um, um die RPA- und Cas12a-Reaktionen zu mischen, und schleudern Sie sie in einer Minizentrifuge (siehe Materialtabelle) für 5 s nach unten.
    5. Legen Sie den Röhrenstreifen wieder in das tragbare Fluorometer und inkubieren Sie weitere 30 Minuten bei 37 °C mit dem gespeicherten Laufprofil.
  3. Visualisieren Sie die Ergebnisse.
    1. Interpretieren Sie die durchschnittlichen relativen Fluoreszenzeinheiten (RFUs), die auf dem tragbaren Fluorometer gemessen wurden (Zusatzdatei 2 und Benutzerhandbuch23).
    2. Visualisieren Sie die Röhren unter blauem LED-Licht bei einer Anregungswellenlänge von 465 nm mit einem Blaulicht-Transilluminator (Ergänzungsdatei 3). Nehmen Sie Bilder mit einer Telefonkamera auf.

   

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Ergebnisse

Der erfolgreiche Nachweis von Foc TR4 aus infiziertem Pflanzenmaterial mittels vereinfachter DNA-Extraktion, gefolgt von dem kombinierten RPA-Cas12a-Assay, wenn er mit dem tragbaren Fluorometer Genie III durchgeführt wurde, ist in Abbildung 4A dargestellt. Positive Proben zeigen eine sichtbare Fluoreszenz (Spur 6-8), während negative Proben eine niedrige Endpunktfluoreszenz aufweisen (Spur 1-5). Wenn die Probenröhrchen unter blauem LED-Licht betrachtet wurde...

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Diskussion

Regelmäßige Überwachung ist eine wichtige Strategie für eine wirksame Prävention und Eindämmung von Foc TR4 und anderen wichtigen invasiven Schädlingen. Nachweisprotokolle, die vor Ort angewendet werden können und Krankheitserreger schnell und genau identifizieren, können die Entscheidungsfindung beschleunigen und die mit Überwachungsbemühungen verbundenen Kosten begrenzen. Zu diesem Zweck kombinierte das hier vorgestellte Protokoll eine vereinfachte DNA-Extraktion, die direkt an beprobt...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen oder intellektuellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken für die Finanzierung durch die National Research Foundation of South Africa, Fördernummer: 138109, im Rahmen des Programms "Competitive Support for Unrated Researchers". Wir würdigen auch die Finanzierung des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen des Marie-Skłodowska-Curie-Stipendiums unter der INDICANTS-Projektfördernummer: 890856.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EnGen Lba Cas12a (Cfp1) ProteinNew England BiolabsM0653T
EnGen Lba Cas12a VerdünnerNew England BiolabsB0653A
Eppendorf PCR-RöhrenMerckEP0030124332
Eppendorf Safe-Lock Mikro-ReagenzgläserMerckEP0030121708
Universelle ExtraktionsbeutelBIOREBA430100
GeneRuler 100 bp DNA-LeiterThermo Fischer ScientificSM0241 / SM0242
Genie Zentrifuge Mini-6KOOptiGeneOP-FUGE
Dschinn IIIOptiGenehttps://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ 
Genie-Strip-HalterOptiGeneGBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03
Genie-StripsOptiGeneOP-0008-50 / OP-0008-500
HiScribe T7 Hochleistungs-RNA-Synthese-KitNew England BiolabsE2040S
NanoDrop ND-1000 UV/Vis-SpektrophotometerThermo Fischer Scientifichttps://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253
NEBuffer 3New England BiolabsB7003S
NEBuffer r2.1New England BiolabsB6002S
Polyvinylpyrrolidon (PVP) PulverSigma-Aldrich9003-39-8
RNA-Reinigung und Konzentrator-5-KitZymo-ForschungR1013
RNA-LadefarbeThermo Fischer ScientificR0641
SmartBlue Blue Light TransilluminatorAccuris-InstrumenteE4000-E
Natriumhydroxid-(NaOH)-PelletsMerck, EMPARTAK277
Tris (Hydroxylmethyl) AminomethanMerck77-86-1
TwistAmp Liquid Basic KitTwistDxTALQBAS01

Referenzen

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