Etablierung und Bewertung eines Schafmodells für volldicken osteochondralen Defekt

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein integriertes Protokoll zur Erzeugung kontrollierter osteochondraler Läsionen in Schafsknien vor, um ein experimentelles Modell zu etablieren, das für Knochen- und Knorpelgeweberegenerationsstudien geeignet ist. Das Protokoll beschreibt eine Methode, um einen vollwertigen osteochondralen Defekt im Oberschenkelkondylus zu induzieren, wobei Techniken verwendet werden, die Auswirkungen auf das Tierwohl und die Variabilität der Ergebnisse minimieren.

Zusammenfassung

Altern, Traumata, genetische Veranlagung und Lebensstil beeinflussen den Knorpelabbau des menschlichen Körpers. Nach einer Verletzung können kontinuierliche Verletzungen durch tägliche Aktivitäten pathologische Erkrankungen wie Arthrose auslösen, die Hauptursache für Behinderung und sozioökonomischen Verlust weltweit. Das Hauptziel aller orthopädischen Chirurgen, die Knorpelverletzungen behandeln, war es, das Ausmaß der Läsion anatomisch zu verringern, die Knorpeloberfläche zu reparieren und die Gelenkstabilität wiederherzustellen. Tiermodelle sind für die Entwicklung therapeutischer Medikamente unerlässlich, aber aktuelle Modelle für Knorpeldefekte sind unbefriedigend. Osteochondrale Läsionen bei Schafen sind ein wertvolles Modell zur Erprobung neuer Therapien und Biomaterialien, die die Wiederherstellung von Knorpel und Knochen in menschlichen Gelenkumgebungen unterstützen können. Diese Studie etablierte ein effizientes Protokoll zur Induzierung akuter osteochondraler Defekte bei großen Tieren. In beiden medialen Femurkondylen wurde eine standardisierte Läsion erzeugt. Ein Knie wurde zufällig der Gelatine-Methacryloyl-Behandlung zugewiesen, während das kontralaterale Knie als Kontrollknie diente. Sechs Monate nach dem chirurgischen Eingriff wurde der Bereich des Oberschenkelknochens entfernt, die dissektionierten Kniegelenke entkalkt, in Paraffin eingebettet und in Abschnitte geschnitten, die mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt wurden. Zur Bewertung der Läsion wurden Scores verwendet. Diese Methodik ermöglicht eine sofortige makroskopische Beobachtung nach der Verletzungsinduktion. Darüber hinaus repliziert dieses Modell klinische Knorpeldefekte effektiv und bietet ein wertvolles Modell zur Untersuchung ihrer Pathologie und zur Entwicklung innovativer therapeutischer Ansätze.

Einleitung

Knorpel ist entscheidend, um die mechanische Kompetenz des Skelettsystems zu erhalten, indem er eine reibungsfreie Oberfläche zwischen den Knochen in Durchfallgelenken bietet und so die Erosion der Gelenkflächen^{verhindert 1}. Die Fähigkeit des Knorpels, diese anspruchsvollen mechanischen Funktionen zu erfüllen, hängt stark von der einzigartigen Zusammensetzung und Organisation seiner extrazellulären Matrix ab – insbesondere von seinem außergewöhnlich hohen Wassergehalt. Wasser spielt eine entscheidende Rolle in der Struktur und Funktion des Gelenkknorpels und macht etwa 70–80 % seiner Zusammensetzung aus. Wasser ist das Hauptelement, das während der Kompression für die Tragfähigkeit verantwortlich ist. Die Fähigkeit des Gewebes, Druckkräften zu widerstehen, hängt davon ab, wie das Wasser innerhalb der Matrix strukturiert und eingeschränkt ist. Diese Organisation ist durch die Wechselwirkung von Wasser mit den wichtigsten Makromolekülen des Knorpels möglich, wie Kollagen und Proteoglykanen, insbesondere mit Hyaluronsäure gebundenen Aggregaten¹. Diese wirken als Eindämmungsstrukturen, die die Wasserbewegung ordnen und begrenzen. Diese Interaktion verleiht dem Gewebe nicht nur Steifigkeit, sondern auch Resilienz und die Fähigkeit zur Erholung nach der Verformung. Die Wechselwirkung zwischen freiem Wasser, gebundenem Wasser und der makromolekularen Matrix bildet den Kern des biomechanischen Verhaltens des Knorpels².

Trotz seiner bemerkenswerten Fähigkeit, physische und mechanische Lasten, die die Gelenke erreichen, zu unterstützen und zu verteilen, hat Gelenkknorpel (AC) nach einer Verletzung aufgrund geringer mitotischer Aktivität der Chondrozyten und schlechter Gewebevaskularisation nur begrenztes Potenzial für spontane Reparatur². Gelenkschäden sind üblicherweise mit dem fortschreitenden Verlust von extrazellulären Matrixmolekülen und Proteinen (ECM) verbunden, die 95 % des Gewebes ausmachen und dem AC³ biomechanische Eigenschaften verleihen. Ein Ungleichgewicht zwischen Synthese und Abbau der ECM-Komponenten, das sich hin zu katabolen Prozessen entwickelt, kann zu Arthrose (OA) führen, der weltweit am häufigsten verbreiteten degenerativen Gelenkerkrankung. Arthrose betrifft etwa 10–12 % der erwachsenen Bevölkerung, verursacht Schmerzen, schränkt die Mobilität ein und verringert die Autonomie der Patienten deutlich⁴. Arthrose tritt bei alternden Bevölkerungen häufiger auf, da sich über ein ganzes Leben hinweg das Gelenk belastet; Allerdings wurden verschiedene Risikofaktoren mit dem Auftreten der klinischen Erkrankung in Verbindung gebracht, wie Geschlecht, genetische Veranlagung, Fettleibigkeit und Alltagsgewohnheiten⁴. Bislang bestanden therapeutische Ansätze zur Behandlung von OA aus klinischer Symptombehandlung und vollständigem Gelenkersatz in den schwersten Fällen⁵. Ohne eine robuste, reproduzierbare und zuverlässige therapeutische Strategie zur effektiven Behandlung von OA werden innovative Ansätze zur Verständnis und Behandlung der Probleme im Zusammenhang mit Gelenkknorpelverletzungen untersucht.

Um die Gelenkbewegung in arthritischen Gelenken zu reparieren, zu regenerieren und zu verbessern, hat sich der Fortschritt in der regenerativen Medizin als neue Hoffnung zur Wiederherstellung beschädigter AC ^6,7 etabliert. Der Einsatz autologer Chondrozyten in Kombination mit ECM-Implantation und intraartikulärer Injektion von Stammzellen stellt den aktuellen Stand der Technik in diesem Bereich^{dar 8,9,10}. Die Hauptherausforderung bei diesen Ansätzen besteht darin, eine angemessene Differenzierung und funktionelle ECM-Synthese durch implantierte Zellen sicherzustellen. Autologe Chondrozyten neigen dazu, Fibrikknorpel zu bilden oder in einen hypertrophen Zustand zu gelangen, wodurch neues dysfunktionales Gewebe entsteht, das die physiologischen Merkmale der AC nicht wiederholt, was zu einer unvollständigen Genesung und oft zu späten Verschlechterungen führt. Biomaterialien können verwendet werden, um das Zellverhalten während der Geweberegeneration zu steuern und so ein temporäres Gerüst zu bieten, damit Zellen anhaften und neue, natürliche und funktionelle extrazelluläre Matrix 12,13,14 synthetisieren können. Das ideale Biomaterial für die Knorpeltechnik muss eine starke Integration mit dem umliegenden Gewebe, insbesondere dem subchondralen Knochen, gewährleisten, da ein Versagen an dieser Grenzfläche die langfristige Reparatur beeinträchtigt. Allerdings bleiben schwache Bindungen zwischen Knorpel- und Knochenschichten der osteochondralen Gerüste sowie eine schlechte Integration mit dem Wirtsgewebe große Herausforderungen¹⁵. Obwohl Gerüste versuchen, die native osteochondrale Architektur nachzuahmen, ist die Reproduktion der komplexen Grenzflächenmikrostruktur weiterhin schwierig. Dies unterstreicht die Bedeutung der Forschung und Entwicklung von Gerüsten mit biologischen Eigenschaften, die gleichzeitig Knorpel- und Knochenregeneration unterstützen und gleichzeitig die Stabilität der Grenzfläche^{erhalten können}. Gelatine, gewonnen aus Kollagen – einem Schlüsselbestandteil des Knorpelgewebes – besitzt Eigenschaften wie zellbindende Motive und biologische Abbaubarkeit, was auf ihr Potenzial als unterstützendes Biomaterial hindeutet, wenn es mit regenerativen Faktoren zur Behandlung osteochondraler Läsionen kombiniert wird. Wenn es chemisch mit Methacrylanhydrid zu Gelatine-Methacryloyl (GelMA) modifiziert wird, wird es photovernetzbar, was eine Injektion und In-situ-Photopolymerisation ermöglicht, was die mechanische Stabilität für Anwendungen in der regenerativen Medizin erhöht¹⁷.

Osteochondrale Läsionen haben eine begrenzte regenerative Kapazität, was eine klinische Herausforderung darstellt. Präklinische Untersuchungen, die Großtiermodelle von Kniegelenksverletzungen verwenden, sind für die translationale Forschung unerlässlich, da sie eine systematische Bewertung von Variablen ermöglichen, die Krankheitsmechanismen und therapeutische Ergebnisse beeinflussen. Häufig verwendete Arten sind Schweine, Ziegen, Hunde, Pferde und Schafe, die jeweils spezifische Vorteile und Einschränkungen aufweisen, die im experimentellen Design berücksichtigt werden müssen. Darüber hinaus zeigen all diese Arten eine begrenzte endogene Reparatur von chondralen und osteochondralen Defekten, wie beim Menschen beobachtet¹⁸. Um sicherzustellen, dass diese Modelle die menschlichen Ergebnisse vorhersagen, müssen sie relevante Parameter wie Anatomie, Physiologie und biomechanische Eigenschaften reproduzieren¹⁸. Zum Vergleich: Die Dicke des menschlichen Gelenkknorpels in den Oberschenkelkondylen reicht von 1,8 bis 2 mm¹⁹, und der Durchmesser der Knorpelläsionen, die typischerweise behandelt werden müssen, beträgt 10 mm oder mehr²⁰ mm.

Das Schweinemodell bietet Vorteile für Knorpel- und osteochondrale Regenerationsstudien, da Gelenkgröße, Knorpeldicke und Belastungsanforderungen denen beim Menschen sehr ähnlich^sind. Einige Miniaturschweinerassen, wie das Göttinger Minischwein, sind leicht zu handhaben und erreichen die skelettale Reife zwischen 18 und 22 Monaten mit²¹ Jahren. Ihre Knorpeldicke reicht von 1 bis 2 mm, und bei¹⁸ mm können Defekte von 6 bis 8 mm entstehen. Knochenmerkmale, einschließlich Trabekulardicke, Knochenablagerungsrate und Organisation der Kollagenfasern, sind vergleichbar mit denen des Menschen²². Das Schweinemodell hat jedoch auch Einschränkungen: Selbst bei Miniaturrassen ist das Kniegelenk kleiner als beim Menschen, was die Entstehung großer experimenteller Defekte einschränkt. Außerdem verwenden die meisten Studien skelettartig unreife Tiere aufgrund der damit verbundenen Pflegekosten, die das Reparaturpotenzial^{möglicherweise überschätzen}.

Ziegen zeigen Gelenkanatomie, Biomechanik und Knorpeldicke wie die des Menschen²⁴. Sie benötigen keine speziellen Einrichtungen, sind einfach zu bedienen und^{relativ günstig.} Die Dicke des Knorpels bei Ziegen liegt zwischen 0,8 und 2,0 mm, und die am häufigsten berichtete kritische Defektgröße beträgt 6 mm²⁶. Allerdings gibt es erhebliche Unterschiede in der Knorpeldicke zwischen Rassen, Größen und Geschlechtern, was zu inkonsistenten Ergebnissen führen^{kann 27}. Das Verhältnis von Knorpel zu subchondralem Knochen und die trabekuläre Knochenstruktur sind ebenfalls vergleichbar mit denen des Menschen²⁸. Die skelettale Reife erfolgt relativ spät, zwischen 24 und 36 Monaten im^{Alter von 29} Jahren. Aus biomechanischer Sicht erfährt das Ziegenknie Gelenkdruck und zyklische Belastungen wie bei Menschen²⁵, wobei die Kniebeugung während des Gangs größer ist (50°-70° bei Ziegen gegenüber <30° beim Menschen), was zu deutlichen Kontaktflächen³⁰ führt. Dieser Unterschied, kombiniert mit höheren Spitzendrücken, kann zu einer weniger effizienten Knorpelreparatur^beitragen.

Unter den großen Tiermodellen stechen Hunde durch ihre Fähigkeit hervor, Rehabilitationsregime, Gelenkimmobilisierung und Training für Laufbandgehen, Schwimmen und kontrollierte Tragübungen zu tolerieren¹⁸. Die Dicke des Gelenkknorpels liegt zwischen 0,9 und 1,3 mm, und die kritische Defektgröße beträgt etwa 4 mm, was den direkten Vergleich zum menschlichen Modell²⁵ einschränkt. Die skelettale Reife liegt zwischen 8,5 und 13,7 Monaten im^{Alter von 31} Jahren. Anatomisch unterscheidet sich das Hundeknie vom menschlichen Knie, und Unterschiede in Biomechanik, Belastungsmustern und Reife zwischen Rassen erschweren die Extrapolation der Ergebnisse³². Trotz dieser anatomischen Unterschiede und der kleinen Defektgröße bleibt das Hundemodell für Studien mit Rehabilitationsprotokollen oder spontanen Knorpelpathologien, ähnlich wie beim Menschen, wertvoll. Seine experimentelle Anwendung ist jedoch durch ethische Überlegungen eingeschränkt²⁹.

Das Pferdemodell ist das größte verfügbare Tiermodell für Knorpelreparaturforschung und entwickelt auf natürliche Weise altersbedingte oder traumabedingte Chondralläsionen sowie Arthrose, ähnlich wie beim Menschen³³. Pferde weisen anatomische und biomechanische Merkmale auf, die mit Menschen vergleichbar sind, wie ein aufrechtes Kniegelenk, große Gelenkgröße, eine Knorpeldicke zwischen 2 und 3 mm – näher an menschlichen Knorpel – eine knorpelvolle Streckung beim Gang und eine vergleichbare Knochendichte^{von 34}. Die skelettale Reife liegt zwischen 24 und 48 Monaten, und die häufig untersuchten Defektgrößen reichen von 6 bis 20 mm^32,33. Einschränkungen umfassen die hohe vertikale Belastung des Pferde-Stifle-Gelenks während der Fortbewegung, die Implantate stärkeren Kräften aussetzt als beim Menschen und die langfristige Heilung behindert³⁵. Zudem sind die Anschaffungs- und Wartungskosten hoch, und spezialisierte Einrichtungen^{sind erforderlich}.

Schafe werden aufgrund ihrer Verfügbarkeit, ihres sanften Temperaments, ihrer guten Toleranz gegenüber Gelenkoperationen und ihrer einfachen Handhabung^häufig als Modell in Knorpelreparaturstudien verwendet. Die skelettale Reife bei Schafen wird typischerweise etwa im Alter von 2–3 Jahren im Alter von²⁵ Jahren erreicht. Darüber hinaus weist das Schafenknie anatomische und biomechanische Ähnlichkeiten mit dem menschlichen Kniegelenk³⁸ auf. Die Knorpeldicke im medialen Femurkondylus liegt zwischen 0,7 und 1,7 mm, und auch Knochenmineraldichte und Kontaktdruck sind vergleichbar, wobei der Knochenvolumenanteil bei^{Schafen 39} höher ist. Aufgrund der verringerten Knorpeldicke dehnen sich induzierte Defekte oft bis in das subchondrale Knochen aus, was dieses Modell für osteochondrale Defektstudien besser geeignet macht³². Läsionen mit einem Durchmesser von 6 bis 8 mm entstehen typischerweise an Stellen wie den Femurkondylen und Trochlea³². Darüber hinaus bietet das Schafmodell Vorteile für bilaterale Studien, da es den Vergleich behandelter und kontrollierter Stellen innerhalb desselben Tieres ermöglicht, wodurch die wirtsbezogene Variabilität reduziert, die Konsistenz und Reproduzierbarkeit verbessert und die Anzahl der benötigten^{Tiere um 40} minimiert wird. Jedes Modell weist unterschiedliche Ähnlichkeiten mit der menschlichen Physiologie und Biomechanik auf. Daher sollte die Modellauswahl biologische Relevanz, praktische Machbarkeit und ethische Überlegungen abwägen. In der vorliegenden Studie wurden nullipare weibliche Schafe im Alter von 12 Monaten, die während der saisonalen Anestrusperiode bewertet wurden, eingeschlossen.

Diese Studie zielte darauf ab, ein wirksames Protokoll zur Erzeugung akuter osteochondraler Defekte bei Großtieren zu entwickeln. Das Protokoll beinhaltet die Erstellung einer vollwertigen osteochondralen Läsion, um ein Modell zu entwickeln, das für regenerative Studien geeignet ist. Darüber hinaus wird die Anwendung des GelMA-Hydrogels als Leitfaden für die Gewebeheilung und als prospektive Methode zur Abgabe regenerativer Moleküle und Zellen untersucht. Das Protokoll beschreibt das chirurgische Verfahren zur Entstehung osteochondraler Läsionen im Gelenkknorpel des Schafsknies. Sie ist an verschiedene Anwendungen der Gewebetechnik anpassbar, einschließlich der Induktion ähnlicher Verletzungen in anderen Großtiermodellen für die regenerative Medizin.

Protokoll

Die Studie erhielt die Genehmigung des Ethikausschusses für Forschung und wurde mit einem Certificate of Ethical Presentation mit der Nummer 6092250823/2023 zertifiziert. In der vorliegenden Studie wurden neun weibliche Schafe aus White Suffolk im Alter von 12 Monaten ausgewählt. Der Defekt entstand in beiden medialen Femurkondylen jedes Tieres. Leere Defekte wurden als Steuerung verwendet. Jedes Tier hatte ein Knie, das randomisiert mit GelMA behandelt wurde, und das andere als Kontrollknie. Diese Strategie ermöglichte es uns, die natürliche Regenerationskapazität zu bewerten und die Auswirkungen individueller Variationen wie genetische Faktoren und Skelettreife zu verringern. Die Tiere wurden sechs Monate lang verfolgt, um die Bildung des hyalinen Knorpels zu untersuchen.

1. Anästhesieverfahren

1. Entziehen Sie die Tiere etwa 24 Stunden vor dem chirurgischen Eingriff von Nahrung und Wasser.
2. Vormedikamentieren Sie die Tiere mit intramuskulärem Meperidin 4 mg/kg kombiniert mit Midazolam 0,3 mg/kg.
3. Befüllen Sie den Betäubungsverdampfer einen Tag vor der Einnahme, wenn der Raum leer ist, und tragen Sie Schutzhandschuhe, um das Risiko einer beruflichen Exposition zu minimieren.
4. Überprüfen Sie vor jedem Eingriff den Anästhetikumkreis auf Lecks und führen Sie alle Manipulationen in einem gut belüfteten Bereich unter Einhaltung der institutionellen Biosicherheitsrichtlinien durch.
5. Nach 15 Minuten werden die Tiere mit einem 18-G-Katheter gekanüllt und Lactated Ringer's solution mit einer Menge von 10 mL∙^kg-1∙^h-1 verabreicht.
6. Verabreichen Sie intravenöse Anästhesie mit 1 % Propofol in einer Dosis von 4 mg/kg.
7. Intubieren Sie die Tiere mit einem 7,5–8,0 mm großen, gebetteten Endotrachealrohr und halten Sie sie unter spontaner Beatmung mit einem halbgeschlossenen, kreisförmigen Atemsystem, das Sauerstoff mit einem FiO₂ von 1,0 und einer Durchflussrate von 50 mL/kg liefert.
8. Verwenden Sie die partielle intravenöse Anästhesie (PIVA)-Technik, halten Sie Propofol als kontinuierliche Infusion bei 0,1 mg^{∙kg-1 Min-1} und passen Sie nur die Isoflurankonzentration an, um eine ausreichende chirurgische Narkoseebene zu erreichen. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie während des gesamten Eingriffs.
9. Führe perineurale Blockaden der Oberschenkel- und Ischiasnerven durch, gesteuert von einem Neurolokalisator. Verabreichen Sie 0,2 ml/kg 2% Lidocain pro Blockade.
   HINWEIS: Die Operation sollte erst beginnen, wenn bestätigt ist, dass das Tier unter operativer Narkose steht (keine Reaktion auf einen festen Hufkniff und kein Kiefertonus).

2. Chirurgischer Eingriff in vivo

1. Desinfizieren Sie das rasierte Knie mit topischem antiseptischem Chlorhexidinglukonat und legen Sie das Tier in die dorsale Dekubitis-Position im Operationssaal.
2. Lokalisieren Sie die Gelenkhöhle, indem Sie das Knie des Tieres berühren, um die genaue Schnittstelle zu bestimmen. Machen Sie einen doppelt gebogenen Hautschnitt (beginnend distal vom lateralen Femoralepikondyl und endend medial auf Höhe der Tibia-Tuberositis).
3. Identifizieren Sie die Patellasehne, die Knieschnee, das Patellarband und den medialen Teil der Gelenkkapsel. Schneiden Sie die Kapsel ein, um den medialen Femurkondyl freizulegen. Hyperflexibilieren Sie das Knie, um den am weitesten entfernten Bereich des Gelenkknorpels des Kondyls sichtbar zu machen.
4. Machen Sie einen chirurgischen Schnitt von etwa 3–5 cm im Bereich des Kondylus des Tieres. Entfernen Sie die Gewebeschichten unter der Haut, um Zugang zum Kondylus zu erhalten, und halten Sie den Schnittbereich sauber, um eine Kontamination zu vermeiden.
5. Nehmen Sie die Synovialflüssigkeit mit einer Spritze und einer Nadel auf. Einen Teil der Probe in ein EDTA-Röhrchen zur Analyse überführen und das verbleibende Material zur Herstellung von Abstrichobjekten verwenden.
6. Positioniere die Retraktoren so, dass die Kondylärfläche vollständig freigelegt wird. Je mehr der Kondylus exponiert ist, desto leichter wird es sein, im nächsten Schritt eine Verletzung herbeizuführen.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollten Sie auf die Pfote des Tieres achten. Eine Beugung oder Streckung des Knies kann helfen, den Kondylus freizulegen.
7. Bohren Sie einen Defekt mit 8 mm Durchmesser und 5 mm Tiefe im Zentrum des medialen Femurkondylus mit einem orthopädischen Bohrer mit einem 8-mm-Trephinbohrer, um eine korrekte Ausrichtung zu gewährleisten, um unbeabsichtigte Maße oder Formen zu vermeiden, und halten Sie einen 0°-Winkel relativ zum distalsten Bereich des Gelenkknorpels bei.
   HINWEIS: Führen Sie die Trepanation bei der niedrigstmöglichen Geschwindigkeit durch, führen Sie die Bohrsteuerung sanft und verwenden Sie nur genug Drehung, um Knorpel und Subchondralknochen zu durchtrennen, sowie lokale Kühlung mit 0,9 % NaCl bei Raumtemperatur, selbst bei niedriger Geschwindigkeit.
8. Führen Sie die chirurgische Extraktion des osteochondralen Plugs mit dem orthopädischen Hammer und Osteotom durch.
9. Reinigen Sie die Wundverlängerung mit steriler Mullbinde und stellen Sie sicher, dass das Innere der Läsion frei von Blut und Geweberesten ist.
10. Tragen Sie 200 μL der flüssigen 20% (w/v) GelMA-Formulierung, die 0,25 % (w/v) Lithiumphenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinat (LAP) als Photoinitiator enthält, auf die Innenseite der Verletzung auf, bis sie die Oberfläche erreicht.
11. Photocrosslinke das GelMA-Hydrogel unter einer 395–405 nm LED (9 W Gesamtleistung), die etwa 5 cm von der Probe entfernt für 180 Sekunden positioniert ist. Unter diesen Bedingungen beträgt die geschätzte Bestrahlung an der Oberfläche ~10 mW/cm², was zu einer Gesamtbelichtungsenergie von etwa 1,8 J/cm² führt.
    HINWEIS: Verwenden Sie Schutzbrillen bei ultraviolettem Licht.
12. Entfernen Sie die Retraktoren vorsichtig.
13. Schließen Sie die Läsion mit unabhängigen Nähten in den verschiedenen Gewebeschichten, um die Bildung von Seromen zu verhindern. Die Anzahl der benötigten Nähte hängt vom Ausmaß des chirurgischen Schnitts ab.
14. Legen Sie einen sterilen Verband auf die Nähte, um Infektionen vorzubeugen.

3. Postoperative Versorgung

1. Überwachen Sie die Tiere während der Anästhesie-Erholung, einschließlich der Vitalwerte wie Herzfrequenz (70–90 Schläge/min), Atemfrequenz (12–20 Atemzüge/min), Körpertemperatur (39 °C bis 40,5 °C) und normaler Schleimhäute mit einer Kapillarnachfüllungszeit von 1–2 Sekunden. Palpieren Sie regelmäßig die Gesichts- und Oberschenkelarterien, um zu prüfen, ob der Puls gut wahrnehmbar ist.
   HINWEIS: Die Anästhesie-Erholung sollte in einer ruhigen, sauberen, warmen und gepolsterten Umgebung erfolgen, mit minimaler Beleuchtung und niedrigem Lärmpegel.
2. Führen Sie chirurgische Verbände mit topischem Penicillin (Benzathinpenicillin G: 1.250.000 IU; Procain-Penicillin G: 1.250.000 IU; Dihydrostreptomycinsulfat: 1,25 g; Harnstoff: 2,50 g) einmal täglich für 10 Tage durch.
3. Stellen Sie sicher, dass die Tiere unmittelbar nach dem Erwachen aus der Narkose in vierbeiniger Position bleiben, Gewicht auf das operierte Glied legen und keine Anzeichen von Unwohlsein zeigen.
4. Die postoperative Analgesie bestand aus Meloxicam (0,4 mg/kg alle 24 Stunden) und Tramadol (2 mg/kg alle 12 Stunden) für 5 Tage. Eine zusätzliche Notfalldosis Tramadol wurde verabreicht, wenn schmerzbedingte Gesichtsausdrücke mit der Sheep Grimace^{Scale 41} identifiziert wurden, einem validierten Werkzeug, das auf spezifischen Gesichtsaktionseinheiten basiert (einschließlich Orbitalverengung, Flehmen-Reaktion, Ohrstellung und Kopfposition) zur Beurteilung von postoperativen Schmerzen und Belastungen bei Schafen.

4. Histologische Analyse

1. Sechs Monate nach dem operativen Eingriff führen Sie eine Euthanasie durch. Um eine tiefe Sedierung vor der Verabreichung des Euthanasiemittels zu erreichen, sollten die Tiere intravenös mit Ketamin (10 mg/kg) und Xylazin (1 mg/kg) vormedikamentiert werden, wobei absichtlich höhere Dosen verwendet werden als die üblicherweise für klinische Verfahren empfohlenen Dosen, um einen schnellen Einsetzen der tiefgreifenden Sedierung zu gewährleisten, wie es durch anerkannte Euthanasieprotokolle unterstützt wird. Anschließend wird Propofol verabreicht, um ein anästhetisches Koma herbeizuführen. Anschließend wird Kaliumchlorid mit 2 mEq/kg intravenös verabreicht, bis ein Atem- und Herz-Kreislauf-Stillstand eintritt und alle Schutzreflexe fehlen.
2. Schneiden Sie die distale femorale Epiphyse durch, um den Bereich der Kondyle zu entfernen. Fixieren Sie die dissektionierten Kniegelenke mit 10 % neutral-gepuffertem Formalin und entkalken Sie sie mit 5 % EDTA (Ethylendiaminetetraessigsäure) bei 34 °C, wobei die EDTA-Lösung alle 3 Tage gewechselt wird.
3. Das Material wird in Paraffin eingebettet und in 4-μm-Abschnitte geschnitten. Entferne Paraffin von den Objektträgern, indem du sie 3 x 5 Minuten in Xylen bei 65 °C einweichst. Hydratieren Sie mit 10-20-fachen Immersionen in Ethanol (99 %, 95 %, 70 %), gefolgt von deionisiertem Wasser für 5 Minuten^{und 42} Minuten.
4. Für die Färbung von Hämatoxylin und Eosin (H&E) färben Sie die Schnitte mit Harris-Hämatoxylin und Gegenfärbung mit Eosin, scannen Sie mit 20× Vergrößerung mit einem automatisierten Objektträger-Scan-Mikroskop und analysieren Sie sie mit der verlinkten Software.
5. Bewertung der Läsion gemäß der histopathologischen Initiative⁴³ der Osteoarthritis Research Society International (OARSI): Ein Wert von 0 zeigt normalen Knorpel an; Ein Wert von 1 spiegelt oberflächliche Fibrillation ohne Knorpelverlust wider; ein Wert von 2 entspricht vertikalen Spalten, die die Schicht unmittelbar unter der oberflächlichen Zone erreichen, begleitet von einem teilweisen Verlust der Oberflächenlamina; Ein Wert von 3 zeigt vertikale Spalten oder Erosion an, die in den verkalkten Knorpel hineinragen und weniger als 25 % der Gelenkfläche betreffen; Die Werte 4, 5 und 6 stehen für vertikale Spalten oder Erosion, die den verkalkten Knorpel erreichen und jeweils 25–50 %, 50–75 % und mehr als 75 % der Gelenkfläche betreffen.
   HINWEIS: Für diese Studie wurden Läsionen mit vertikalen Spalten oder Erosisionen, die in den verkalkten Knorpel reichen und mehr als 25 % der Gelenkoberfläche betreffen, eine Punktzahl von 4 vergeben.

Ergebnisse

Osteochondrale Defektinduktion

Diese Studie zielte darauf ab, ein effizientes Protokoll zur Induzierung akuter osteochondraler Defekte bei großen Tieren zu entwickeln. Die Verletzungen wurden mechanisch während eines chirurgischen Eingriffs verursacht, was zu einer Läsion von etwa 8 mm Durchmesser und 5 mm Tiefe führte (Abbildung 1). Nach den von der International Cartilage Regeneration & Joint Preservation Societ...

Diskussion

Um Herausforderungen in der Knorpeltherapie, wie etwa die Unzulänglichkeit der chondrogenen Differenzierung und ECM-Reifung, zu überwinden, bleiben nicht-klinische Studien für die Bewertung therapeutischer Strategien unerlässlich. Methoden für nicht-klinische Modelle verletzter Knorpelgewebe wurden bereits zuvor mit verschiedenen Techniken berichtet⁴⁵. Allerdings fehlen der Literatur weiterhin detaillierte Berichte und standardisierte Verfahren zur Auslösung akute...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
25 Poliglecapron-Nahtfaden, Nr. 2-0	Ethicon		Nahtfaden für den allgemeinen Weichteilverschluss wurden zum Nähen der Gelenkkapsel und des subkutanen Zellgewebes verwendet.
Antikörper-Anti-Β-Tubulin	Invitrogen	PA516863	Antikörper gegen β-Tubulin, zwei Untereinheiten (α/β), die die Mikrotubuli des Zytoskeletts bilden
Anästhesiegerät	HB Hospitalar		Inhalationsanästhesiegeräte
Axio Scan Z1	Zeiss, München, Deutschland		Mikroskop
Benzathin-Penicillin G	Ourofino		Antibiotika
Katheter 18 G	Solidor		Intravenöser Katheter
Cephalexin	Virbac		Antimikrobielle Therapie
Chlorhexidindiglukonat-wässrige Lösung	RIOQUÍ MICA		Antiseptikum zur Haut-Antisepsis verwendet
Cuffed-Endotrachealtube 7,5 & Dash; 8,0 mm	Solidor		Cuffed Endotrachealtube
DAPI	Sigma	D9542	Fluoreszierende Farbstoff
Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium	Gibco	12100-046	Zellkulturmedium
Dihydrostreptomycinsulfat	Ourofino		Antibiotika
EDTA-Röhre	Becton Dickinson	362788	Sammelröhre
Eosin	Neon	1795	Ein Farbstoff, der zur Visualisierung von Zellmorphologie und Färbung verwendet wird; Zytoplasma.
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma	E5134	Fördert die allmähliche Demineralisierung des Knochengewebes
Fetales Rinderserum	Gibco	12657-029	Nahrungsergänzung für Zellkultur mit Wachstumsfaktoren
Formalin	Sigma-Aldrich	47608	Gewebemorphologie erhalten
GelMA lyophilisiert	TissueLabs	GLMA-LYO-1	Photocrosslinkables Hydrogel
Harris Hämatoxylin	Laborclin	620503	Ein Farbstoff, der verwendet wird, um die Zellmorphologie zu visualisieren und Kerne zu färben.
Isoflurano	Cristá Lia		Anästhesie-Wartung
Ketamin 10 %	VETNIL		Euthanasieverfahren
Lactated Ringers Lösung	Fresenius Kabi		Flüssigkeitstherapie
L-Glutamin 200 mM	Gibco	25030-081	Essentielle Aminosäure für die Zellkultur
Lidocain-Hydrochlorid	Cristá Lia		Lokalanästhesie
LIVE/DEAD Viabilität/Citotoxitäts-Kit	Invitrogen	L3224	Fluoreszierend Assay-Kit zur Bewertung der Zelllebensfähigkeit
Meloxicam	Ouro fino		Entzündungshemmende und schmerzlindernde Mittel für die postoperative Phase
Midazolam-Hydrochlorid	Cristá Lia		Präanästhetikum
Mononylon-Nahtfaden, Nr. 3-0	Ethicon		Naht zum Hautverschluss verwendet
NaCl 0,9 %	Cristalia		Kochsalzlösung
Neurolokalisator	Neurolocalizador DL 250 DeltaLife		Lokalanästhesie, die von einem Neurolokalisator und einem peripheren Nervenelektrostimulator geleitet wird.
Orthopädischer Drill	Kanülierter Mini Orthopädischer Bohrer (Delikat) – Verchromter Mandrel – Marke Makita		Wird für orthopädische Operationen verwendet.
Orthopädischer Hammer	Edlo	Hammer Neufield (10-3155)	Allgemeine Eigenschaften: 20 cm Länge und 560 gr Gewicht; Material: hochwertiger Edelstahl; Einsatz: Empfohlen für traumatologische und orthopädische Eingriffe, die kontrollierte Belastung erfordern. Zertifizierungen: Die Produkte verfügen über Qualitätszertifikate wie ISO (International Organization for Standardization): 13485:2016, mit europäischen Standards für Einhaltung und bewährte Fertigungspraktiken.
Lambotte-Osteotom	Edlo	Lambotte-Osteotom (10-0749)	Das Lambotte-Osteotom (6 mm x 17 cm / 6 3/4") ist ein hochpräzises chirurgisches Instrument, das hauptsächlich bei orthopädischen Operationen und neurochirurgischen Eingriffen mit Knochenmanipulation eingesetzt wird. Mit einer 6 mm breiten Spitze eignet es sich ideal für feine Schnitte, Umformung und Entfernung kompakten Knorpels und subchondralen Knochens.
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Breitband-Antibiotikum, das weit verbreitet in der Zellkultur verwendet wird
Pethidinhydrochlorid	Cristá Lia		Präanästhetikum
Kaliumchlorid 19,1 %	Samtec		Euthanasieverfahren
Prokain-Penicillin G	Ourofino		Antibiotika
Propofol	Cristá Lia		Anästhesie-Einleitung und -erhaltung
Ringerlaktat	Cristá Lia		Flüssigkeitstherapie
Halbgeschlossenes, kreisförmiges Atemsystem	HB Hospitalar		Atemkreislauf zur Anästhesie
Steriler Crêpe-Verband	Cremer		Steriler Kreppverband, der verwendet wird, um die distalen Enden der operierten Gliedmaßen zu bedecken.
Stimuplex D, 22 Ga. x 2 Zoll. (50 mm) Isolierte Nadel mit Verlängerungsset, 30 °F; Fasen (STIMD2250/30)	BBRAUN		Perineurale Lokalanästhesie
Tramadolhydrochlorid	Cristá Lia		Postoperative Analgesie
Trephine Drill	Knochen-Trephine-Bohrer, mm-Durchmesser & Strich; Modell: Gegenwinkel, Marke: chirurgisches WF		Knochensammel-Trephine-Bohrer 8,0 mm; hergestellt in chirurgischem Stahl; bei Knochentransplantationen eingesetzt; dient dazu, den Knochenblock für die histologische Analyse oder Autografting zu entfernen.
Xylazin 10 %	VETNIL		Euthanasieverfahren