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MTT-basierte Normalisierung der Glycerinfreisetzung zur genauen Quantifizierung der Lipolyse in primären Nebenhodenadipozyten der Ratte

DOI:

10.3791/68853

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September 9th, 2025

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1College of Bee Science and Biomedicine, Fujian Agriculture and Forestry University, 2School of Pharmacy and Medical Technology, Putian University, 3School of Medicine, Huaqiao University, 4Department of Pharmacy, Taining County General Hospital, 5School of Pharmacy, Fujian Medical University

In This Article

Summary

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Experimentelle Artefakte, einschließlich Schwankungen der Zellviabilität und Assay-Interferenzen, behindern eine genaue Quantifizierung der Glycerinfreisetzung in lipidreichen primären Adipozyten. Um diese Herausforderungen zu mildern, wird eine MTT-basierte Normalisierungsstrategie verwendet, um die Glycerinmessungen an die Stoffwechselaktivität der Zellen anzupassen und so die Zuverlässigkeit der Lipolyse-Quantifizierung zu erhöhen.

Abstract

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Bei der Lipolyse, einem kritischen Stoffwechselweg, werden gespeicherte Triglyceride in freie Fettsäuren und Glycerin hydrolysiert. Die genaue Quantifizierung der Glycerinproduktion in lipidreichen primären Adipozyten wird jedoch oft durch experimentelle Artefakte wie Variabilität der Zellviabilität und Assay-Interferenz verfälscht. Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde eine einfache Methode zur Normalisierung der Glycerinfreisetzungsmessungen mit dem auf 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) basierenden Zellviabilitätsassay entwickelt. Dieses Protokoll nutzt den Unterschied im spezifischen Gewicht zwischen Adipozyten und wässrigen Lösungen und ermöglicht so die gleichzeitige Quantifizierung der lipolytischen Ausstoßung und der Zellviabilität. In Wirkstoffscreening-Experimenten erhöhten Pravastatin und Simvastatin die Glycerinfreisetzung aus abdominalen Adipozyten signifikant, während Atorvastatin und Lovastatin die Glycerinproduktion nicht signifikant veränderten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die MTT-basierte Normalisierung einen robusten und bequemen Ansatz für die genaue Quantifizierung der Lipolyse bietet, mit potenziellen Anwendungen in der Wirkstoffforschung, die auf Fettleibigkeit und metabolisches Syndrom abzielen. Diese Studie unterstreicht die Notwendigkeit, konventionelle Lipolyse-Assays neu zu bewerten, um echte Stoffwechselreaktionen von unspezifischen Membranleckagen zu unterscheiden.

Introduction

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Fettgewebe kann in weißes Fettgewebe (WAT) und braunes Fettgewebe (BAT) unterteilt werden1. WAT erfüllt die Funktion der überschüssigen Energiespeicherung in Form von Triglyceriden, während BAT die Funktion der Wärmeerzeugung zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur hat, die chemische Energie unter der Stimulation durch Kälte in Wärmeenergie umwandelt1. Fettgewebe hat auch eine endokrine Funktion2. Es kann eine Vielzahl von Hormonen, Zytokinen und Metaboliten (zusammenfassend als Adipokine bezeichnet) ausschütten und den Energiehaushalt des Körpers steuern, inde....

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Protocol

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Dieses Protokoll nutzt den Unterschied im spezifischen Gewicht zwischen Adipozyten und wässrigen Lösungen, um die gleichzeitige Messung der Glycerinfreisetzung (als Indikator für die Lipolyse) und der Lebensfähigkeit von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Zellen in denselben Wells einer 96-Well-Platte zu ermöglichen, wodurch der experimentelle Arbeitsablauf rationalisiert und die Effizienz gesteigert wird.

Alle Tierversuche entsprachen den ANARRIVE-Richtlinien und wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (N....

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Results

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Nach einem vorläufigen Wirkstoffscreening wurden die antihyperlipidämischen Wirkstoffe Statine verwendet, um die lipolytische Wirkung in Adipozyten mit der normalisierten Glycerinfreisetzungsmethodezu untersuchen 9.

Der Einfluss von Statinen auf die Glycerinfreisetzung aus primären abdominalen Adipozyten der Ratte
Die Wirkung von Statinen auf die Lipolyse in primären abdominalen Adipozyten der Ratte wurde untersucht, indem die Zellen 4 h lang mit 50 .......

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Discussion

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Diese Studie bietet eine genauere Methode zur Messung der Lipolyse in lipidbeladenen primären Adipozyten. Es wurde festgestellt, dass Pravastatin und Simvastatin bei nebenhoden Adipozyten von Ratten die Glycerinfreisetzung induzieren und die Lebensfähigkeit verringern, während Atorvastatin und Lovastatin keine signifikanten Wirkungen zeigten. Die Verabreichung von Simvastatin führte zu einem minimalen Anstieg der Glycerinfreisetzung aus den Adipozyten. Um dieses Problem zu lösen, wurde d.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen oder persönlichen Interessen bestehen, die die in dieser Studie berichtete Arbeit beeinflussen könnten.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde von der Fujian Agriculture and Forestry University und der Putian University (beide von Leo Tsui) unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22-&Mikro; m FilterSangon Biotech Co. Ltd.F513165-0001Spritzenvorsatzfilter, Aquo-System, steril
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid Sangon Biotech Co. Ltd.A600799-00011 g
96-Well-Zellkulturplatten Sangon Biotech Co. Ltd.F603204-0001keimfrei
Atorvastatin-CalciumsalzKaiman-Chemie10493-55 mg
Sieb für Zellen Sangon Biotech Co. Ltd.F513450-000180 Siebgewebe
ChloralhydratSangon Biotech Co. Ltd.A500288-0250ca. 250 g
DimethylsulfoxidSangon Biotech Co. Ltd.A460700-0100100 mL
Dulbecco's Modified Eagle MediumSangon Biotech Co. Ltd.E600003500 mL, hoher Glukosegehalt, steril
Fötales RinderserumSangon Biotech Co. Ltd.E600001100 ml, steril
Kolorimetrisches Glycerin-Assay-KitKaiman-Chemie10010755-9696 Brunnen
LovastatinKaiman-Chemie10010338-55 mg
Männliche erwachsene Ratten Universität PutianWistarca. 10-12 Wochen
Penicillin-Streptomycin-Lösung Sangon Biotech Co. Ltd.B540732-001010 mL, steril
Phosphatgepufferte KochsalzlösungSangon Biotech Co. Ltd.E607009-0500500 mL, steril, kein Calcium oder Magnesium
Pravastatin-NatriumsalzKaiman-Chemie10010343-55 mg
Simvastatin Kaiman-Chemie10010344-55 mg
Trypsin-Lösung Sangon Biotech Co. Ltd.E607003-0100100 mL, ohne EDTA und Phenolrot, steril
Kollagenase Typ II Sangon Biotech Co. Ltd.A004174-0100100 mg

References

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  1. Saely, C. H., Geiger, K., Drexel, H. Brown versus white adipose tissue: A mini-review. Gerontology. 58 (1), 15-23 (2012).
  2. Ahima, R. S., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. Trends Endocrinol Metab. 11 (8), 327-332 (2000).
  3. Lass, A., Zimmermann, R., Oberer, M., Zechner,....

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Lipolysis QuantificationGlycerol ReleaseMTT AssayCell ViabilityPrimary AdipocytesRat Epididymal AdipocytesTriglyceride HydrolysisDrug ScreeningStatin EffectsMetabolic Syndrome

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