MTT-basierte Normalisierung der Glycerinfreisetzung zur genauen Quantifizierung der Lipolyse in primären Nebenhodenadipozyten der Ratte

Summary

Experimentelle Artefakte, einschließlich Schwankungen der Zellviabilität und Assay-Interferenzen, behindern eine genaue Quantifizierung der Glycerinfreisetzung in lipidreichen primären Adipozyten. Um diese Herausforderungen zu mildern, wird eine MTT-basierte Normalisierungsstrategie verwendet, um die Glycerinmessungen an die Stoffwechselaktivität der Zellen anzupassen und so die Zuverlässigkeit der Lipolyse-Quantifizierung zu erhöhen.

Abstract

Bei der Lipolyse, einem kritischen Stoffwechselweg, werden gespeicherte Triglyceride in freie Fettsäuren und Glycerin hydrolysiert. Die genaue Quantifizierung der Glycerinproduktion in lipidreichen primären Adipozyten wird jedoch oft durch experimentelle Artefakte wie Variabilität der Zellviabilität und Assay-Interferenz verfälscht. Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde eine einfache Methode zur Normalisierung der Glycerinfreisetzungsmessungen mit dem auf 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) basierenden Zellviabilitätsassay entwickelt. Dieses Protokoll nutzt den Unterschied im spezifischen Gewicht zwischen Adipozyten und wässrigen Lösungen und ermöglicht so die gleichzeitige Quantifizierung der lipolytischen Ausstoßung und der Zellviabilität. In Wirkstoffscreening-Experimenten erhöhten Pravastatin und Simvastatin die Glycerinfreisetzung aus abdominalen Adipozyten signifikant, während Atorvastatin und Lovastatin die Glycerinproduktion nicht signifikant veränderten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die MTT-basierte Normalisierung einen robusten und bequemen Ansatz für die genaue Quantifizierung der Lipolyse bietet, mit potenziellen Anwendungen in der Wirkstoffforschung, die auf Fettleibigkeit und metabolisches Syndrom abzielen. Diese Studie unterstreicht die Notwendigkeit, konventionelle Lipolyse-Assays neu zu bewerten, um echte Stoffwechselreaktionen von unspezifischen Membranleckagen zu unterscheiden.

Introduction

Fettgewebe kann in weißes Fettgewebe (WAT) und braunes Fettgewebe (BAT) unterteilt ^werden1. WAT erfüllt die Funktion der überschüssigen Energiespeicherung in Form von Triglyceriden, während BAT die Funktion der Wärmeerzeugung zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur hat, die chemische Energie unter der Stimulation durch Kälte in Wärmeenergie umwandelt¹. Fettgewebe hat auch eine endokrine Funktion². Es kann eine Vielzahl von Hormonen, Zytokinen und Metaboliten (zusammenfassend als Adipokine bezeichnet) ausschütten und den Energiehaushalt des Körpers steuern, indem es das Verhalten bei der Nahrungssuche aus dem Zentralnervensystem und die Stoffwechselaktivität des umgebenden Gewebes reguliert².

Die Lipolyse ist ein schrittweiser Hydrolyseprozess von intrazellulären Lipiden unter der Wirkung einer Reihe von lipolytischen Enzymen ^3,4. In Adipozyten werden Lipide hauptsächlich in Lipidtröpfchen in Form von Triglyceriden^{gespeichert 5}. Die Lipidtröpfchen sind mit der Lipidtröpfchen-assoziierten Proteinfamilie Perilipin bedeckt, die die Hydrolyse von Triglyceriden durch lipolytische Enzyme verhindert ^6,7. Wenn jedoch das Lipolysesignal verstärkt wird, werden die Expressionsniveaus der Perilipin-Familie in Adipozyten verringert, und lipolytische Enzyme gelangen in die Lipidtröpfchen ^3,4. Folglich werden Triglyceride in Glycerin und freie Fettsäuren ^3,4,5 abgebaut.

Die Lipolyse, der Abbau von gespeicherten Triglyceriden in Glycerin und freie Fettsäuren, ist ein grundlegender Prozess im Adipozytenstoffwechsel⁸. Während die direkte Messung von Lipolyseprodukten wie Glycerin wertvolle Erkenntnisse liefert, war eine genaue Quantifizierung eine Herausforderung, insbesondere bei suspendierten primären Adipozyten aufgrund von Bedienungsfehlern, die auf Unterschiede in der Zellzahl zwischen den Versuchsgruppen zurückzuführen sind. Diese Studie zielte darauf ab, diese Herausforderung anzugehen, indem ein Zellviabilitätsassay eingesetzt wurde, um die Quantifizierung der Glycerinfreisetzung aus primären abdominalen Adipozyten von Ratten zu normalisieren. Durch die Standardisierung der Messmethode wurde der normalisierte Glycerinfreisetzungsassay als potenzielles Werkzeug für die Wirkstoffforschung zur Behandlung von Fettleibigkeit und metabolischem Syndrom in Adipozyten eingesetzt.

Protocol

Dieses Protokoll nutzt den Unterschied im spezifischen Gewicht zwischen Adipozyten und wässrigen Lösungen, um die gleichzeitige Messung der Glycerinfreisetzung (als Indikator für die Lipolyse) und der Lebensfähigkeit von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Zellen in denselben Wells einer 96-Well-Platte zu ermöglichen, wodurch der experimentelle Arbeitsablauf rationalisiert und die Effizienz gesteigert wird.

Alle Tierversuche entsprachen den ANARRIVE-Richtlinien und wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publication No. 8023, revised 1978) durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt (Zulassungsnummer 202112, genehmigt am 5. Mai 2021). Die männlichen Wistar-Ratten, die in dieser Studie verwendet wurden, waren mindestens 8 Wochen alt und hatten unter Standardhaltungsbedingungen ein Körpergewicht von ≥200 g. Es wurde nebenhodes weißes Fettgewebe mit typischen Ausbeuten von 0,6-0,8 g pro Ratte gesammelt. Bemerkenswert ist, dass ältere Ratten oder Ratten, die mit fettreichem Futter gefüttert wurden, eine signifikant erhöhte weiße Fettgewebsmasse (oft 1,5-3 g) aufwiesen, was eine proportionale Anpassung der Konzentrationen von Verdauungsenzymen (z. B. Kollagenase) erforderte, um eine konsistente Dissoziationseffizienz des Gewebes aufrechtzuerhalten. Die ausschließliche Verwendung männlicher Ratten vermied mögliche Störeffekte durch hormonelle Schwankungen des weiblichen Östruszyklus. Die Stammselektion (z. B. Sprague-Dawley, Wistar oder Long-Evans) wurde in den Experimenten konsistent beibehalten, um die genetische Einheitlichkeit der Fettgewebsreaktionen zu gewährleisten. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung primärer abdominaler Adipozyten der Ratte

1. Betäuben Sie eine männliche erwachsene Wistar-Ratte mit einer intraperitonealen Injektion von 7% Chloralhydrat (gelöst in destilliertem H₂O) (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).
2. Bestätigen Sie die vollständige Anästhesie, indem Sie überprüfen, ob keine Reflexreaktionen vorliegen, und führen Sie dann mit einer sterilen chirurgischen Schere einen Bauchschnitt in der Mittellinie durch.
3. Entfernen Sie vorsichtig viszerales Fettgewebe von der linken und rechten Seite des Nebenhodenfettpolsters.
   HINWEIS: Nebenhoden-Adipozyten sind relativ groß und schwimmfähig, was die Trennung und Analyse erleichtert.
4. Übertragen Sie das gesammelte Gewebe in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; Abbildung 1A).
5. Waschen Sie das Taschentuch zweimal mit PBS, um Verunreinigungen zu entfernen, einschließlich anhaftender Blutgefäße und Blutgerinnsel.
6. Schneiden Sie das gewaschene Taschentuch in kleine Stücke.

2. Reinigung der primären abdominalen Adipozyten der Ratte

1. Inkubieren Sie das präparierte Fettgewebe mit Trypsin und Kollagenase Typ II (10 mg in 10 ml Trypsinlösung) bei 37 °C für 2 h unter Schütteln.
2. Filtrieren Sie das verdaute Fettgewebe durch ein Zellsieb (Abbildung 1A).
3. Das Filtrat wird bei 120 × g 3 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die restliche enzymatische Aktivität zu entfernen.
4. Übertragen Sie die suspendierten Adipozyten (die obere weiße Schicht) in ein sauberes Röhrchen und waschen Sie sie mit PBS.
5. Das Filtrat wird bei 120 × g 3 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, um PBS zu entfernen.
6. Inkubieren Sie die filtrierten Adipozyten (die obere weiße Schicht) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung für nicht länger als 30 Minuten ergänzt wird.

3. Analyse der Glycerinfreisetzung

1. Die filtrierten Adipozyten (10,^4-10,⁵ Zellen pro Well; 200 μl) werden in eine 96-Well-Zellkulturplatte ausgesät.
   HINWEIS: Die Adipozyten wurden mit einem Standard-Hämozytometer quantifiziert. Aufgrund der großen Variation in der Adipozytengröße konnten einige größere Zellen nicht genau gezählt werden. Daher kann es sein, dass die Zellzahl nicht genau die tatsächliche Anzahl der Adipozyten widerspiegelt. Das Hauptziel bestand darin, eine gleichmäßige Verteilung der Zellen über die Vertiefungen zu erreichen, anstatt eine exakte Quantifizierung vorzunehmen.
2. Behandeln Sie die Adipozyten mit 0,05 % Dimethylsulfoxid (DMSO; als Kontrollgruppe) und 50 μM Atorvastatin, Pravastatin, Lovastatin und Simvastatin für 4 h bei 37 °C unter leichtem Schütteln.
   HINWEIS: Diese Behandlungsbedingungen werden als Referenz angegeben und können je nach Bedarf auf der Grundlage der spezifischen Ziele und des Designs des Versuchs angepasst werden.
3. Sammeln Sie das Zellkulturmedium (die untere rote Schicht), um die Glycerinfreisetzung zu analysieren, die auf den Beginn der Lipolyse hinweist (Abbildung 1B).
4. Verwenden Sie ein kommerzielles Glycerol-Release-Assay-Kit, um die Adipozyten-Lipolyse als Reaktion auf verschiedene Behandlungen zu beurteilen.
5. Messen Sie die Extinktion bei 570 nm mit einem Mikroplatten-Reader.

4. Analyse der Zellviabilität

1. MTT-Pulver in einer Konzentration von 5 mg/ml in destilliertem H₂O auflösen und vor der Verwendung durch einen 0,22-μm-Filter sterilisieren.
2. Nach der Analyse der Glycerinfreisetzung geben Sie MTT-Lösung (bis zu einem Endwert von 0,5 mg/ml) in die Zellen und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei 37 °C.
3. Die suspendierten Adipozyten (die obere violette Schicht) werden zur Analyse der Zellviabilität in ein sauberes Röhrchen mit DMSO überführt (Abbildung 1B).
4. Zur Solubilisierung bildeten sich kurz violette Formazankristalle.
5. Messen Sie die Extinktion bei 570 nm mit einem Mikroplatten-Reader.

5. Berechnung der Normalisierung

1. Führen Sie alle Versuche in dreifacher Ausfertigung durch und wiederholen Sie dies viermal (n = 4).
   HINWEIS: Für jedes unabhängige Experiment (n = 4) wurden Adipozyten von drei Ratten isoliert, und jede Behandlungsbedingung wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
2. Teilen Sie für jede Behandlungsgruppe den Glycerinfreisetzungs-Absorptionswert durch den entsprechenden Absorptionswert der Zellviabilität.
3. Stellen Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar.
   HINWEIS: Mittelwert und SD wurden mit Microsoft Excel mit den Funktionen =MITTELWERT(Bereich) und =STDEV berechnet. S(Bereich). Für Gruppenvergleiche wurden ungepaarte zweiseitige t-Tests unter Verwendung von GraphPad Prism 6 mit der Funktion t-Test von Mittelwerte vergleichen durchgeführt.
4. Bestimmen Sie die statistische Signifikanz von Unterschieden zwischen Gruppen mit dem Student's t-Test, wobei ein P-Wert von weniger als 0,05 als statistisch signifikant angesehen wird.

Results

Nach einem vorläufigen Wirkstoffscreening wurden die antihyperlipidämischen Wirkstoffe Statine verwendet, um die lipolytische Wirkung in Adipozyten mit der normalisierten Glycerinfreisetzungsmethode^{zu untersuchen 9}.

Der Einfluss von Statinen auf die Glycerinfreisetzung aus primären abdominalen Adipozyten der Ratte
Die Wirkung von Statinen auf die Lipolyse in primären abdominalen Adipozyten der Ratte wurde untersucht, indem die Zellen 4 h lang mit 50 ...

Discussion

Diese Studie bietet eine genauere Methode zur Messung der Lipolyse in lipidbeladenen primären Adipozyten. Es wurde festgestellt, dass Pravastatin und Simvastatin bei nebenhoden Adipozyten von Ratten die Glycerinfreisetzung induzieren und die Lebensfähigkeit verringern, während Atorvastatin und Lovastatin keine signifikanten Wirkungen zeigten. Die Verabreichung von Simvastatin führte zu einem minimalen Anstieg der Glycerinfreisetzung aus den Adipozyten. Um dieses Problem zu lösen, wurde d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22-&Mikro; m Filter	Sangon Biotech Co. Ltd.	F513165-0001	Spritzenvorsatzfilter, Aquo-System, steril
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid	Sangon Biotech Co. Ltd.	A600799-0001	1 g
96-Well-Zellkulturplatten	Sangon Biotech Co. Ltd.	F603204-0001	keimfrei
Atorvastatin-Calciumsalz	Kaiman-Chemie	10493-5	5 mg
Sieb für Zellen	Sangon Biotech Co. Ltd.	F513450-0001	80 Siebgewebe
Chloralhydrat	Sangon Biotech Co. Ltd.	A500288-0250	ca. 250 g
Dimethylsulfoxid	Sangon Biotech Co. Ltd.	A460700-0100	100 mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Sangon Biotech Co. Ltd.	E600003	500 mL, hoher Glukosegehalt, steril
Fötales Rinderserum	Sangon Biotech Co. Ltd.	E600001	100 ml, steril
Kolorimetrisches Glycerin-Assay-Kit	Kaiman-Chemie	10010755-96	96 Brunnen
Lovastatin	Kaiman-Chemie	10010338-5	5 mg
Männliche erwachsene Ratten	Universität Putian	Wistar	ca. 10-12 Wochen
Penicillin-Streptomycin-Lösung	Sangon Biotech Co. Ltd.	B540732-0010	10 mL, steril
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sangon Biotech Co. Ltd.	E607009-0500	500 mL, steril, kein Calcium oder Magnesium
Pravastatin-Natriumsalz	Kaiman-Chemie	10010343-5	5 mg
Simvastatin	Kaiman-Chemie	10010344-5	5 mg
Trypsin-Lösung	Sangon Biotech Co. Ltd.	E607003-0100	100 mL, ohne EDTA und Phenolrot, steril
Kollagenase Typ II	Sangon Biotech Co. Ltd.	A004174-0100	100 mg