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Methodenartikel

Messung der Durchlässigkeit der Darmbarriere durch Nachweis des Flusses von fluoreszierenden Tracern in humanen Kolonoid-Monoschichten

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DOI:

10.3791/68857

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17. Oktober 2025

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Technik zur Messung der Integrität der Darmbarriere, bei der die Translokationsrate eines fluoreszenzmarkierten Zuckers bekannter Größe die Permeabilität von aus Gewebe gewonnenen menschlichen Darmkolonoiden widerspiegelt.

Zusammenfassung

Die Darmbarriere ist ein kritischer Ort der Regulation zwischen luminalen Antigenen und dem Immunsystem des Wirts, und ihre Fehlregulation ist an mehreren Magen-Darm-Erkrankungen beteiligt. Darmorganoide können ein nützliches Werkzeug sein, um Unterschiede in der Integrität der Darmbarriere zu verstehen und zu modellieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das humane Kolnoide verwendet, um Unterschiede in der funktionellen Darmbarriere zu quantifizieren, indem der Fluss von fluoreszierenden Tracern über Organoid-Monoschichten gemessen wird. Nachdem wir Monoschichten zur Konfluenz gezüchtet haben, fügen wir der apikalen Kammer einen fluoreszierenden Tracer wie FITC-Dextran hinzu und detektieren dessen Translokation in die basolaterale Kammer im Laufe der Zeit. Eine erhöhte Translokation des fluoreszierenden Tracers spiegelt eine durchlässigere oder schwächere Epithelbarriere wider. Dieses Protokoll ist eine anpassungsfähige Plattform, die es ermöglicht, funktionelle Unterschiede in der Darmbarriere über mehrere Erkrankungen hinweg parallel zu bewerten. Mit Hilfe von Variationen dieses Protokolls kann man die transepitheliale Permeabilität für Moleküle unterschiedlicher Größe, Form und chemischer Struktur sowie Permeabilitätsunterschiede im Rahmen isolierter Behandlungen oder Mikroumgebungsveränderungen an der apikalen oder basolateralen Seite von Epithelzellen beurteilen. Dies ermöglicht ein tieferes Verständnis des Mechanismus und der Behandlung von Barrierestörungen bei Krankheitszuständen.

Einleitung

Die Darmschleimhaut ist eine komplexe Struktur, die eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Kontakts zwischen den Metaboliten, Antigenen und Mikroben im Darmlumen sowie dem Immunsystem und dem enterischen Kreislauf spielt. Darmepithelzellen sind eine Schlüsselkomponente dieses Systems und bilden unter gesunden Bedingungen eine hochselektive Barriere. Der Transport durch das Epithel kann durch mehrere Mechanismen erfolgen: transzellulärer aktiver oder passiver Transport, parazelluläre Poren- oder Leckwege, die durch Tight Junctions und Adhärensverbindungen reguliert werden. Ob einer dieser Wege von einem Molekül genutzt werden kann, um das Epithel zu translozieren, wird durch die Hydrophobizität, die Größe und die chemische Struktur bestimmt. Sobald diese Moleküle das Epithel passiert haben, können sie leichter mit Immunzellen der Schleimhaut interagieren und in das Blut oder den Lymphkreislauf des Darms gelangen 1,2 Eine Störung der Darmbarriere ist ein Kennzeichen mehrerer entzündlicher Magen-Darm-Erkrankungen wie entzündliche Darmerkrankungen und Zöliakie 1,3,4,5,6,7. Es wird angenommen, dass diese geschwächte Darmbarriere eine Rolle in der Pathophysiologie dieser Krankheitsprozesse spielt, indem sie krankmachende Antigene fehlreguliert transloziert, die dann eine lokale oder systemische Entzündungsreaktion hervorrufen können.

Es gibt mehrere etablierte Protokolle zur Messung der Darmbarriere. In vitro-Studien werden traditionell Krebszelllinien wie T84- oder Caco-2-Zellen verwendet, um den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) zu messen und die Komponenten der Tight Junction und der Adherens-Verbindungzu quantifizieren 8. Ex vivo können Messungen des transepithelialen Stroms unter Verwendung von Ussing-Kammern an Biopsien oder resezierten Darmprobendurchgeführt werden 9. In-vivo-Studien beinhalten in der Regel die orale Verabreichung inerter Tracer und die anschließende Messung der Blut- oder Urinabsorption dieser Tracer10,11. Obwohl sich diese Techniken bei der Untersuchung der Darmbarriere als nützlich erwiesen haben, weisen sie mehrere Einschränkungen auf: Transformierte unsterbliche Zelllinien weisen von Natur aus Veränderungen des Stoffwechsels und des Zytoskeletts auf, die die Darmbarriere auf schlecht definierte Weise beeinflussen; der Zugang zu Patienten, Patientenproben oder Modellorganismen kann eingeschränkt sein; In-vivo-Studien sind schwer auf Störfaktoren zu kontrollieren oder Schlussfolgerungen auf molekularer Ebene zu ziehen. Obwohl in mehreren Krankheitsmodellen über Hinweise auf diese Barrierestörung berichtet wurde, ist das Verständnis des Mechanismus dieser Darmbarrieredefekte nach wie vor begrenzt, und unsere Fähigkeit, diesen Aspekt der Magen-Darm-Erkrankung gezielt zu behandeln, ist schwer fassbar.

Humane Darmorganoide bieten eine einzigartige und aufregende Fähigkeit, die Ursache und Behandlung von Defekten der Darmbarriere aufzuklären. Aus Gewebe gewonnene menschliche Darmorganoide sind primäre Zellkulturen, die aus adulten Stammzellen gewonnen werden, die sich an der Basis von Darmkryptenbefinden 12. Diese Zellen können aus Biopsien oder chirurgischen Proben isoliert und kultiviert werden, um genetische und epigenetische Veränderungen zu erhalten, die bei den Patienten beobachtet wurden, von denen sie abgeleitet wurden 13,14,15. Sie dienen als physiologisch relevanteres Modell als herkömmliche unsterbliche Zelllinien, da sie nicht die metabolischen Veränderungen von Krebszelllinien aufweisen und in die verschiedenen Zelltypen unterschieden werden können, die im reifen Darmepithel vorhanden sind 16,17,18. Da sie in vitro erweitert werden können, sind sie außerdem leichter zugänglich und nützlich für kontrollierte Studien der zellulären Wirkung verschiedener Behandlungen und paralleler Wachstumsbedingungen. Obwohl es auch Einschränkungen gibt, die den Darmorganoidmodellen inhärent sind, vor allem das Fehlen der anderen nicht-epithelialen Zelltypen und der Kontext des Ganzkörpersystems, wurde gezeigt, dass menschliche Darmorganoide ein zuverlässiges Modell für mehrere Aspekte von Magen-Darm-Erkrankungen darstellen13.

Unter diesen wurde gezeigt, dass Darmorganoide die Defekte der Darmbarriere genau modellieren, was die erwarteten Veränderungen in der Organisation der Tight Junctions und der TEER im Rahmen von Barriereinsulten zeigt 19,20,21. Hier adaptieren wir eine Technik zur Bewertung der Barriereintegrität in menschlichen Kolonoiden, bei der der Fluss von fluoreszenzmarkierten Molekülen über Organoid-Monoschichten nachgewiesen wird22. In diesem Protokoll werden Organoide gezüchtet und zu polarisierten zweidimensionalen Monoschichten auf semipermeablen Membranen gereift. Der Assay beinhaltet die Zugabe eines fluoreszierenden Tracers an die apikale Oberfläche der epithelialen Monoschicht, und sein Vorhandensein auf der gegenüberliegenden Seite wird im Laufe der Zeit quantifiziert. Ein erhöhter Fluss des Tracers spiegelt ein undichteres oder durchlässigeres Epithel wider. Dieser Assay bietet eine funktionelle Barriereauslesung, die als Ergänzung zur Bewertung der Struktur von engen und adhärenten Verbindungen verwendet werden kann. Obwohl TEER-Messungen häufig verwendet werden, um eine grundlegende Bewertung der Barriereintegrität zu liefern, kann der hier beschriebene Flussassay angepasst werden, um die Permeabilität von Molekülen verschiedener Klassen, Ladungen und Größen zu erkennen und dadurch die Barriere viel detaillierter zu charakterisieren. Hierfür können mehrere kommerziell erhältliche Fluoreszenztracer verwendet werden. Darüber hinaus kann durch die Verwendung von nicht überlappenden Fluoreszenzspektren die Permeabilität für mehrere Tracer gleichzeitig bewertet werden. Darüber hinaus ermöglicht die Monolayer-Konfiguration dieses Assays die Beurteilung der Barrierereaktion auf Wachstumsbedingungen, die spezifisch auf die apikale oder basolaterale Oberfläche von Zellen angewendet werden. Damit ist eine kontrollierte Beurteilung der Wirkung von Therapeutika, Mikroumgebungsveränderungen und Co-Kulturbedingungen möglich.

Es ist bekannt, dass Defekte der Darmbarriere eine wichtige pathogene Rolle bei der Entwicklung verschiedener Magen-Darm-Erkrankungen spielen, aber der Begriff "Leaky Gut" wird in den populären Medien zunehmend ohne Präzision verwendet23, und die Bemühungen, die defekte Darmbarriere zu bekämpfen, waren nur begrenzt erfolgreich. Dies unterstreicht den Bedarf an verbesserten Modellen zur Bewertung und Charakterisierung der Darmbarriere. Das beschriebene System verwendet physiologische, aus menschlichem Gewebe gewonnene Darm-Organoid-Monoschichten, um die Integrität der funktionellen Barriere unter kontrollierten Bedingungen zu bewerten.

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Protokoll

Alle Proben wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll entnommen und verwendet, das vom Institutional Review Board (IRB) der University of Colorado unter der Protokollnummer 14-2012 genehmigt wurde.

HINWEIS: Alle Eingriffe in den Schritten 1-3 sollten in einer sterilen Biosicherheitswerkbank mit steriler Technik durchgeführt werden. Ein Schema des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Etablierung von humanen Kolonoiden aus Tiefkühlkulturen

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Materialien vor dem Auftauen der Zellen in der Biosicherheitswerkbank bereitliegen, um die Exposition aufgetauter Organoide gegenüber Gefriermedium zu minimieren. Das Protokoll beginnt mit kryokonservierten humanen Kolonoiden aus Gewebe. Protokolle zur Ableitung und Kryokonservierung humaner Kolonoide wurden bereits beschrieben24.

  1. Herstellung von humanem Darmorganoid-Stammmedium
    1. Bereiten Sie Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3 konditionierte Medien (L-WRN) gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen25,26 vor.
    2. Ergänzen Sie das L-WRN-Medium mit den folgenden Wachstumsfaktoren: Epidermaler Wachstumsfaktor [50 ng/mL], Nicotinamid [10 mM], A83-01 [500 nM], SB202190 [10 μM], CHIR99021 [3 μM], Thiazovivin [4 μM], SB431542 [4 μM], Gastrin I [10 nM].
    3. Mischen Sie die supplementierten L-WRN-Medien 1:1 mit handelsüblichen Darmorganoid-Medien.
    4. Kurz vor der Anwendung mit Y-27632 [10 μM] ergänzen.
      HINWEIS: Die optimale Zusammensetzung des Mediums des Darmorganoid-Stammes kann je nach Labor und Kolonoidlinie variieren. Die alleinige Verwendung von supplementierten L-WRN-Medien oder die alleinige Verwendung von kommerziellen Darmorganoidmedien kann ebenfalls möglich sein. Die Verwendung von L-WRN-konditionierten Medien und kommerziellen Medien in diesem Protokoll ist im Vergleich zur alleinigen Verwendung von konditionierten Medien widerstandsfähiger gegenüber Schwankungen von Charge zu Charge und kostengünstiger im Vergleich zur alleinigen Verwendung kommerzieller Medien.
  2. Herstellung des Differenzierungsmediums
    1. Ergänzen Sie DMEM/F12 mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin und 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid.
    2. Mischen Sie ergänztes DMEM/F12 1:1 mit Darmorganoid-Stammmedium aus Schritt 1.1
  3. Präparation der extrazellulären Matrix (ECM)
    1. Tauen Sie die ECM über Nacht auf Eis auf und bereiten Sie dann 100 μl Aliquots vor.
      HINWEIS: Aliquots können bei -20 °C wieder eingefroren werden. Weitere Informationen finden Sie in den Anweisungen des Herstellers.
    2. Inkubieren Sie Aliquots auf Eis bis zum Zeitpunkt der Plattierung der Zellen.
  4. Auftauen und Plattieren von Organoiden
    1. Tauen Sie den Inhalt des Kryofläschchens in einem 37 °C warmen Wasserbad auf, wobei Sie darauf achten, dass das Fläschchen untergetaucht bleibt, die Kappe jedoch über dem Wasser liegt, bis es gerade aufgetaut ist.
    2. Den Inhalt der Durchstechflasche in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 13 ml eiskaltem, zugesetztem DMEM/F12-Medium (aus Schritt 1.2.1) umfüllen.
    3. Bei 200 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    4. Saugen Sie den Überstand an, wobei ca. 1 ml Restvolumen über dem Zellpellet verbleibt.
    5. Lege das Rohr auf Eis. Fügen Sie 1 ml eiskaltes zugesetztes DMEM/F12 (aus Schritt 1.2.1) hinzu und pipettieren Sie die Suspension 10-15 Mal, um das Pellet wieder zu suspendieren.
    6. Bei 200 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    7. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und lassen Sie so wenig Restwaschmittel wie möglich auf dem Zellpellet zurück.
    8. Geben Sie 100 μl aufgetautes ECM zum Pellet. Resuspendieren Sie gründlich und stellen Sie sicher, dass die Organoide gleichmäßig und ohne Klumpen verteilt sind. Pipettieren Sie langsam, um Luftblasen zu vermeiden.
    9. Platten-ECM durch Pipettieren von etwa 10 Domen oder dreidimensionalen ECM-Tröpfchen von jeweils etwa 10 μl in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte.
    10. Die Platte schnell umdrehen und bei 37 °C 5-10 min inkubieren oder bis die Kuppeln erstarrt sind.
    11. Sobald die Kuppeln ausgehärtet sind, geben Sie 2 ml Organoid-Stammmedien des Darms (aus Schritt 1.1) in die Vertiefung.
    12. Inkubieren bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Tauschen Sie das Medium alle 2 Tage aus.
    13. Fahren Sie mit Schritt 2 fort, sobald Organoide entweder mehr als etwa 75 % der Fläche der EZM-Kuppel einnehmen oder zentrale Trümmer ansammeln.

2. Passieren und Vermehren von menschlichen Kolonoiden

  1. Saugen Sie für jede Vertiefung das Wachstumsmedium aus den Vertiefungen an, ohne die ECM-Kuppeln zu stören.
  2. Waschen Sie die Kuppeln vorsichtig mit 1 ml eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entfernen Sie dann PBS.
  3. Geben Sie 1 ml eiskaltes Trypsin in jede Vertiefung. Verwenden Sie eine Pipette, um die EZM-Dome aufzubrechen, indem Sie auf und ab pipettieren. Pipettieren Sie die Mischung 10-15 Mal, um die ECM vollständig zu dissoziieren.
  4. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 3-5 min.
  5. Geben Sie 1 ml eiskalt ergänztes DMEM/F12 (aus Schritt 1.2.1) in die Vertiefung, um Trypsin zu neutralisieren. Pipettieren Sie die Mischung 20-30 Mal kräftig, bis die Zellen in Cluster von jeweils 2-3 Zellen dissoziiert sind.
  6. Übertragen Sie die Zellsuspension in einen konischen 15-ml-Behälter.
  7. Verwenden Sie zusätzlich 1 ml supplementiertes DMEM/F12 (aus Schritt 1.2.1), um die Vertiefung zu waschen, und geben Sie die Waschlösung in den konischen 15-ml-Behälter.
  8. Fügen Sie ergänztes DMEM/F12 (aus Schritt 1.2.1) hinzu, um ein Gesamtvolumen von 13 mL im 15 mL Konisch zu erreichen.
  9. Fahren Sie mit den Schritten 1.4.3 bis 1.4.12 von Schritt 1 fort und verwenden Sie eine geeignete Menge ECM, um sie in zusätzliche Vertiefungen zu erweitern.
    HINWEIS: Eine konfluente Vertiefung von Organoiden in 100 μl EZM kann in der Regel in 2-3 Vertiefungen (200-300 μl EZM) überführt werden. Eine konfluente Vertiefung von Organoiden ist ausreichend für etwa 3-6 Monoschichten in Schritt 3.

3. Erzeugung humaner Kolonoid-Monoschichten

  1. Zellkultureinsätze mit Kollagenbeschichtung
    1. Legen Sie Polystyrol-Zellkultureinsätze (0,4 μm Porengröße) in eine 24-Well-Platte und geben Sie 100 μl Kollagenbeschichtungslösung in die apikale Kammer jedes Einsatzes.
    2. Verschließen Sie die Platte mit Siegelfolie, um eine Verdunstung zu verhindern.
    3. Bei 4 °C 4-24 h inkubieren.
      HINWEIS: Es gibt keinen Unterschied in den Ergebnissen innerhalb dieser Inkubationszeit, aber eine kürzere oder längere Inkubationszeit kann gewählt werden, um einen geeigneten Pausenpunkt zu erreichen.
  2. Beschichtung von Organoid-Monoschichten
    1. Befolgen Sie die Schritte 2.1-2.5, um die Organoide zu dissoziieren.
    2. Geben Sie die Zellsuspension durch ein 70-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
    3. Spülen Sie die Vertiefungen mit je 1 mL supplementiertem DMEM/F12 (aus Schritt 1.2.1). Sammeln Sie dieses Waschmedium und führen Sie es durch das Zellsieb.
    4. Waschen Sie das Zellsieb mit zugesetztem DMEM/F12 (aus Schritt 1.2.1), bis das Gesamtvolumen im konischen 50-ml-Röhrchen 15 mL erreicht.
    5. Übertragen Sie das Filtrat in einen konischen 15-ml-Filtrat.
    6. Bei 200 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    7. Aspirieren Sie den Überstand und lassen Sie 1 ml über dem Pellet.
    8. Fügen Sie zusätzlich 1 ml supplementiertes DMEM/F12-Medium (aus Schritt 1.2.1) hinzu und resuspendieren Sie es.
    9. Untersuchen Sie die Suspension unter einem Mikroskop, um die vollständige Dissoziation zu bestätigen. Pipettieren Sie die Zellen bei Bedarf kräftig, bis sie hauptsächlich einzelne Zellen sind.
    10. Bei 200 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und lassen Sie so wenig Restwaschmittel wie möglich auf dem Zellpellet zurück.
    11. Resuspendieren Sie in einem kleinen Volumen (200-1000 μl) des Darmorganoid-Stammmediums (aus Schritt 1.1). Bleiben Sie auf Eis.
    12. Nehmen Sie ein Aliquot der Zellsuspension, um lebensfähige Zellen mit der bevorzugten Methode zu zählen. Verwenden Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen, um das Volumen der Zellsuspension zu bestimmen, das für die Platte von 100.000 lebensfähigen Zellen pro Einsatz benötigt wird.
    13. Saugen Sie die Kollagenbeschichtungslösung von jedem Einsatz ab, ohne die Einlagemembran zu berühren.
    14. Geben Sie das entsprechende Volumen des Darmorganoid-Stammmediums (aus Schritt 1.1) in die apikale Kammer jedes Einsatzes, um das endgültige Volumen auf 200 μl zu bringen, sobald die Zellsuspension hinzugefügt wird.
      HINWEIS: Falls gewünscht, kann die Zellsuspension in Schritt 3.2.12 auf eine Endkonzentration von 100.000 Zellen/200 μl eingestellt werden, dann können 200 μl in die apikale Kammer plattiert werden. Wird jedoch nicht die gesamte Zellsuspension für die Monolayer-Beschichtung verwendet, kann dies zu einer übermäßigen Medienverschwendung führen.
    15. Geben Sie das entsprechende Volumen der Zellsuspension in die apikale Kammer.
    16. Geben Sie 500-1000 μl Darmorganoid-Stammmedien in die basolaterale Kammer.
      HINWEIS: 500 μl sind für typische Kolnoide ausreichend. Wenn Zellen metabolisch aktiver oder anderweitig empfindlicher gegenüber Abfallproduktablagerungen sind, kann die Verwendung eines größeren Volumens in der basolateralen Kammer hilfreich sein, um das Wachstum aufrechtzuerhalten.
    17. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Einsätze/Vertiefungen.
    18. Inkubieren bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2.
    19. Tauschen Sie das Medium einmal pro Woche aus.
      HINWEIS: Interessante Behandlungen können jederzeit vor oder nach der Beschichtung auf die apikalen und/oder basolateralen Kammern von Inserts angewendet werden.

4. Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) und der Monolagenreifung

  1. Widerstand messen
    1. Verwenden Sie ein Epithel-Volt/Ohm-Messgerät auf der Ohm-Einstellung. Reinigen Sie die Sonde, indem Sie sie mit einem mit 70 % Ethanol getränkten Arbeitstuch abwischen. Platzieren Sie den längeren Arm der Elektrode in das basolaterale Kompartiment und den kürzeren Arm in das apikale Kompartiment des Einsatzes. Messung aufzeichnen.
      HINWEIS: Wenn auch TEER-Messungen ein Endpunkt von Interesse sind, nehmen Sie auch Widerstandsmessungen an einem kollagenbeschichteten Einsatz ohne Zellen als Hintergrund vor. Dann wird TEER berechnet als (Widerstand - Widerstand der Einfügung im Hintergrund) x Oberfläche der Einlage. Die Oberfläche des Einsatzes in diesem Protokoll beträgt 0,33 cm2. Diese Berechnung ergibt TEER in Ohm·cm2. Wenn Sie ein anderes Epithel-Volt/Ohm-Messgerät als das in der Materialtabelle aufgeführte verwenden, verwenden Sie zur Widerstandsmessung die Gebrauchsanweisung des Herstellers für das Messgerät.
    2. Wiederholen Sie dies täglich, bis die Messungen ein Plateau erreichen.
      HINWEIS: Das Plateau tritt typischerweise nach 2 bis 3 Wochen mit einem TEER von mehr als 200 Ohm cm2 auf, variiert jedoch je nach Kolonoidlinie und Wachstumsbedingungen.
  2. Sobald die Resistenz ein Plateau erreicht hat, leiten Sie die Organoidreifung ein, indem Sie die Stammmedien durch Differenzierungsmedien ersetzen (aus Schritt 1.2).
  3. Setzen Sie die täglichen TEER-Messungen fort. Erwarten Sie einen Anstieg der TEER und ein zweites Plateau.
    HINWEIS: Das zweite Plateau tritt typischerweise nach etwa 7 Tagen mit einem TEER von 1500-2500 ohm·cm2 auf, dies variiert jedoch je nach Kolonoidlinie und Wachstumsbedingungen.
  4. Sobald die TEER-Messungen ein zweites Mal ein Plateau erreicht haben, fahren Sie mit Schritt 5 fort.

5. FITC-Dextran-Flussmittel-Assay

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet FITC-Dextran 4 kDa (Stokes Radius 14 Å). Abhängig von den experimentellen Anforderungen können jedoch fluoreszierende Tracer unterschiedlicher Größe, Ladung und Fluorophore verwendet werden22. Es können auch mehrere Tracer gleichzeitig verwendet werden, wobei in diesem Fall nicht überlappende Anregungs- und Emissionsfluoreszenzspektren bestätigt werden sollten. Es wird empfohlen, die Schritte 5.1-5.3 in einem Wärmeschrank (nicht befeuchteter, nicht CO2 -Inkubator) durchzuführen, der auf 37 °C eingestellt ist. Wenn dies nicht verfügbar ist, sollten die Reagenzien vor der Verwendung auf 37 °C erwärmt werden, und Zellen, Puffer und entnommene Proben sollten während der Inkubationszeit bei 37 °C aufbewahrt werden.

  1. Vorbereitung der Reagenzien
    1. Bereiten Sie Hanks gepufferte Kochsalzlösung (HBSS) mit 10 mM HEPES vor und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Warm auf 37 °C.
      HINWEIS: Bereiten Sie bei Bedarf HBSS+HEPES mit Behandlungen von Interesse vor. Bereiten Sie genug für 80 μl/Vertiefung in der apikalen Kammer und 1 ml/Vertiefung in der basolateralen Kammer vor.
    2. Gießen Sie ca. 50 mL des warmen HBSS+HEPES in ein kleines Becherglas, um die Einsätze zu spülen. Halten Sie einen größeren Becher für flüssige Abfälle in der Nähe.
    3. FITC-Dextran 4 kDa vollständig auftauen. Bereiten Sie eine 1,25 mg/ml-Lösung in HBSS mit HEPES vor. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen der FITC-Dextran-Lösung vor, um 80 μl pro Vertiefung und 1 μl für die Standardkurve zuzuteilen.
      HINWEIS: Die Ausgangskonzentration kann je nach Größe und erwarteter Permeabilität des Tracers angepasst werden. Zum Beispiel können kleinere oder perminiertere Tracer in einer niedrigeren Konzentration hinzugefügt werden, um Reagenzien zu sparen. Wenn Behandlungen in der apikalen Kammer durchgeführt werden müssen, bereiten Sie FITC-Dextran-Lösung in entsprechend behandeltem HBSS+HEPES vor.
  2. Anwendung von FITC-Dextran auf Monolagen
    1. Bereiten Sie eine frische 24-Well-Platte vor, indem Sie 1 ml HBSS+HEPES (auf Wunsch mit Behandlung) in die entsprechenden Wells geben.
    2. Waschen Sie die organoiden Monoschichten, indem Sie den Einsatz mit einer Pinzette greifen, ihn aus der Vertiefung heben, in das Becherglas mit warmem HBSS+HEPES (aus Schritt 5.1.2) tauchen, um die apikale Kammer zu füllen, und es dann über das Abfallbecherglas umkehren, um die Waschlösung zu entleeren.
    3. Wiederholen Sie diese Wäsche 2 weitere Male.
    4. Legen Sie den Einsatz in die entsprechende Vertiefung der in Schritt 5.2.1 vorbereiteten frischen Platte.
    5. 80 μl FITC-Dextran-Lösung vorsichtig in die apikale Kammer pipettieren. Piptieren Sie an die Seite des Einsatzes, um die Monoschicht nicht zu stören.
    6. Wiederholen Sie Schritt 5.2.5 für alle Monolayer.
    7. Geben Sie HBSS oder PBS in alle leeren Vertiefungen, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
  3. Sammeln von Flussmittelproben
    1. Unmittelbar nach Schritt 5.2.7 werden 70 μl aus der basolateralen Kammer jeder Vertiefung in eine Vertiefung einer flachen, schwarzen 96-Well-Platte mit klarem Boden aufgefangen und bei 37 °C lichtgeschützt aufbewahrt. Dies ist der Zeitpunkt 0.
    2. Die Platte vor Licht geschützt bei 37 °C inkubieren.
    3. Mischen Sie den Puffer 2 h lang alle 30 min in der basolateralen Vertiefung und sammeln Sie dann weitere 70 μl in leere Vertiefungen der 96-Well-Platte mit klarem Boden aus Schritt 5.3.1.
  4. Erstellung der Normkurve
    1. 1 μl der reservierten FITC-Dextran-Lösung (1,25 mg/ml; Schritt 5.1.3) in 999 μl HBSS+HEPES geben. Dies ist die Verdünnung von 1:1000 oder 1,25 μg/ml für die Standardkurve.
    2. Verdünnen Sie diese Lösung seriell 1:1, indem Sie 150 μl der Lösung nehmen und sie zu 150 μl HBSS+HEPES hinzufügen und dann gut mischen. Wiederholen Sie dies weitere zehn Mal in Serie, um eine Verdünnung in 12 Schritten zu erhalten.
      HINWEIS: Dadurch wird eine Standardkurve erstellt von: 1250, 625, 312,5, 156,25, 78,13, 39,06, 19,53, 9,77, 4,88, 2,44, 1,22 und 0,61 ng/ml. Abhängig von der Permeabilität der Zelllinien muss die Standardkurve möglicherweise mehr oder weniger konzentriert werden. Wenn das Experiment zum ersten Mal durchgeführt wird, reservieren Sie eine zusätzliche FITC-Dextran-Lösung 1,25 mg/ml für den Fall, dass die Standardkurve in einer anderen Konzentration neu erstellt werden muss.
    3. 70 μl jeder Verdünnung der Standardkurve werden in leere Vertiefungen der 96-Well-Bodenplatte aus den Schritten 5.3.1 und 5.3.3 pipettiert. Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Wiederholung.
  5. Messen Sie die Fluoreszenz auf einem Fluoreszenzplatten-Reader mit den folgenden Einstellungen: Anregung 490 nm, Emission bis 520 nm, Ablesung von der Unterseite der Platte, mit einer Verstärkung von 100 und einer Lesehöhe von 7 mm.
    HINWEIS: Passen Sie die Anregungs-/Emissionswellenlängen entsprechend dem Fluorophor Ihrer Wahl an.
  6. Datenanalyse
    1. Zeichnen Sie die Standardkurve mit der Konzentration auf der x-Achse und der Fluoreszenz auf der y-Achse. Verwenden Sie dies, um die lineare Regressionsgleichung zu bestimmen.
    2. Verwenden Sie diese lineare Regressionsgleichung und die Fluoreszenzmesswerte der Proben, um die FITC-Dextran-Konzentration zu jedem Zeitpunkt für jede Probe zu berechnen.
    3. Stellen Sie die Konzentration im Zeitverlauf für jede Probe dar und berechnen Sie die Steigung einer linearen Regressionsgleichung, die Mikrogramm/min (μg/min) darstellt. Teilen Sie diese durch die Oberfläche des Zellkultureinsatzes (0,33 cm), um die Flussrate in Mikrogramm pro Minute pro Quadratzentimeter (μg/min/cm 2) zu bestimmen.

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Ergebnisse

Unter Verwendung dieses Protokolls wurde die Durchlässigkeit gesunder humaner Kolonoide in Gegenwart und Abwesenheit von Entzündungssignalen analysiert. Die Zugabe einer Mischung aus inflammatorischen Zytokinen, die als Cytomix bezeichnet wird und IFNγ, TNFα und IL-1β (jeweils bei 10 ng/ml) umfasst, hat zuvor gezeigt, dass sie eine Dysfunktion der Darmbarriere induziert, gemessen mit TEER in Darmepithelzellmodellen20,27. Unser Ziel war es, festzustellen, ob diese...

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Diskussion

Hierbei handelt es sich um ein Protokoll zur Beurteilung der Darmbarriere im physiologisch repräsentativen Modell der humanen Kolonoid-Monoschichten. Der hier beschriebene Fluoreszenz-Tracer-Fluss-Assay liefert Informationen über die funktionelle Integrität der Barriere, die über das hinausgehen, was mit anderen Arten von Barriere-Assays gewonnen wird, wie z. B. TEER, Ussing-Kammer-Messungen oder der Bewertung der Tight-Junction-Proteinexpression. Darüber hinaus bietet die Verwendung von...

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Offenlegungen

Es gibt keine Offenlegungen oder Interessenkonflikte.

Danksagungen

Dr. Sean Colgan wird durch NIH-Zuschüsse DK1047893, DK50189, DK095491, DK103639 und VA Merit BX002182 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL konische ZentrifugenröhrchenCelltreat229411
2 mL Kryo-Fläschchen mit InnengewindeCorning430488
50 mL konische ZentrifugenröhrchenCelltreat229421
6-Well-Platte, Gewebekultur behandeltCelltreat229106
70 μ M Cell SiebFalke352350
96-Well-Bodenplatte schwarz/klarThermo Scientific165305
A83-01 Forschung & Forschung D2939
BioTek Synergy Platten-LesegerätAgilentSynergie H1
Cellometer Auto T4 Hellfeld-ZellenzählerNexcelcomCMT-AT4P
Zählkammern für CellometerzellenNexcelcomNC1531583
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046-5MG
Kollagen-Beschichtungslösung Zell-Anwendungen125-50
DMEM/F-12Gibco11330057
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
Ethanol 100%Fisher ScientificNr. A4094
EVOM2 Voltohm Messgerät mit Stx2 ElektrodeWelt PräzisionsinstrumenteNC9792051
Fötales Rinderserum (FBS)CytivaSH30396.03HI
Pipettenspitzen filternFisher Scientific02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Dextran, 4kDaSigma-Aldrich46944
Gastrin I (Mensch)Forschung & Forschung D3006
GlutaMAX Fisher Scientific35050061200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid
Hanks gepufferte Kochsalzlösung 10xThermo Scientific14065056
HEPES 1MThermo Scientific15630080
Interferon gamma rekombinant MenschBioLegende575308
Interleukin 1 beta rekombinant menschlichThermowissenschaftlich200-01B-500UG
IntestiCult Darm Organoid Wachstumsmedium (Mensch)STEMCELL-Technologien06010 Kommerzielle Organoid-Medien für den Darm
Inverses Live-MikroskopOlympIX85
MatrigelCorning354234Extrazelluläre Matrix (ECM)
Mikrobiologischer InkubatorFisher Scientific151030515
Multiwell-Platte für Suspensionskultur, 24 WellGreiner Bio-one662102
NicotinamidForschung & Forschung D4106
ParafilmMillipore SigmaHS234526BSiegelfolie
Pasteurpipetten (Borosilikatglas)Fisher ScientificTel.: 13-678-20B
PBS Gibco10010-023
Penicillin Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco15140122
Rekombinanter moouse epidermaler WachstumsfaktorForschung & Forschung DNr. 2028-EG
Gekühlte ZentrifugeBeckman CoulterBE-AX15R
SB202190 Forschung & Forschung D1264
ThiazovivinForschung & Forschung D3845
ThinCert Zellkultureinsatz für 24-Well-Platte, 0,4 μ mGreiner Bio-one662641
Trypsin-EDTA (0,25 %)Fisher Scientific25200114
Tumornekrosefaktor, alpha-rekombinanter MenschForschung & Forschung DArtikel-Nr.: 10291-TA-100
Y-27632 Dihydrochlorid TocrisTB1254-GMP

Referenzen

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