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Methodenartikel

Herstellung und Verwendung von anpassbaren Agaroseformen für die gerüstfreie Ovarialfollikelkultur von Mäusen

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DOI:

10.3791/68871

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24. Oktober 2025

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1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben Methoden zur Kultivierung von Ovarialfollikeln in einer neuartigen gerüstfreien Agaroseform, die die in vitro Gametogenese ergänzen.

Zusammenfassung

Der Eierstockfollikel ist die funktionelle Einheit des Eierstocks, die Hormone und Gameten produziert, die für die Aufrechterhaltung der weiblichen Fortpflanzungsfunktion und Gesundheit benötigt werden. Die Fähigkeit, Follikulogenese, Eisprung und Luteinisierung in vitro zu rekapitulieren, hat einen breiten grundlegenden, translationalen und klinischen Nutzen. Die fortschrittlichsten In-vitro-Follikelwachstumssysteme behalten die dreidimensionale (3D) Architektur des Follikels bei, die für die Entwicklung meiotisch kompetenter Metaphase-II-Eizellen beim Menschen von entscheidender Bedeutung ist. Kürzlich wurde eine gerüstfreie Methode für das in vitro Follikelwachstum von mehrschichtigen Sekundärfollikeln der Maus entwickelt und validiert. Zu diesem Zweck wurden kundenspezifische 3D-gedruckte Formen verwendet, um Agarose mit Mikrovertiefungen zu mikrostrukturieren, die die volumetrische Ausdehnung der Follikel ermöglichen. Follikel, die in dieser gerüstfreien Umgebung gezüchtet wurden, zeigten eine vergleichbare Hormonproduktion und Lebensfähigkeit im Vergleich zu etablierten Alginat-basierten verkapselten In-vitro-Follikelwachstumssystemen (eIVFG). Wichtig ist, dass Agarose-Mikrovertiefungen eine skalierbare Methode sind, technisch weniger anspruchsvoll sind und im Vergleich zu eIVFG ein verbessertes Follikelwachstum und eine verbesserte Ovulationsrate aufweisen. Diese Methode erzeugt anpassbare Schimmelpilze, die mit der Eizelle biokompatibel sind, einer Zelle, die sehr empfindlich auf materialspezifische Sickerwässer und andere Umweltschadstoffe reagiert. Darüber hinaus werden Follikel in diesem System in derselben Fokusebene kultiviert, was eine Echtzeit-Zeitraffer-Bildgebung und -Analyse ermöglicht. Um die Zugänglichkeit dieses neuen Ansatzes zu verbessern, werden in diesem Artikel die Methoden beschrieben, die zum Entwerfen und 3D-Drucken von Masterformen, zur Herstellung von Silikonformen für 24- oder 96-Well-Platten und zur Kultivierung isolierter mehrschichtiger sekundärer Ovarialfollikel in den Agaroseformen erforderlich sind. Dieses Setup kann auch in ein kostengünstiges Zeitraffer-Bildgebungssystem integriert werden, das eine morphokinetische Analyse ermöglicht. Darüber hinaus können Schimmelpilze für nachgelagerte histologische Analysen paraffineingebettet werden. Insgesamt ist diese benutzerfreundliche Methode ein vielseitiges Werkzeug für die Follikelkultur und kann weiter angepasst werden, um die Differenzierung und Reifung von Keimzellen im Kontext des Follikels zu fördern und eine vollständige In-vitro-Gametogenese aufrechtzuerhalten.

Einleitung

Die Eizelle oder weibliche Gamete trägt den Großteil des Zytoplasmas und die Hälfte des genetischen Materials zum Embryo bei der Befruchtung bei, was für die Entwicklung der nächsten Generation unerlässlich ist. Die Oogenese beginnt während der Embryonalentwicklung, wenn die primordialen Keimzellen in die Meiose eintreten und in der Prophase I verharren. Diese Eizellen befinden sich in den primordialen Follikeln und bilden die ovarielle Reserve, einen endlichen und nicht erneuerbaren Pool, aus dem sie nach und nach rekrutiert werden. Follikel entwickeln sich in einem Prozess, der als Follikulogenese bekannt ist, mit dem Ziel, letztendlich eine reife Keimzelle zu produzieren, die befruchtet werdenkann 1,2,3,4,5. Die Follikelentwicklung beginnt mit einer frühen, Gonadotropin-unabhängigen Phase, in der die parakrine Signalgebung für das Überleben und das Wachstum des Follikels unerlässlich ist. Wenn Follikel zum sekundären Stadium heranreifen, werden sie auf Gonadotropine angewiesen, was eine Verschiebung hin zur endokrinen Signalübertragung bedeutet. Ein wesentliches Merkmal von Sekundärfollikeln ist eine Eizelle, die von mindestens zwei vollständigen Schichten quaderförmiger Granulosazellen umgeben ist, zusammen mit der neu entwickelten Thekaschicht. Thekazellen bilden die äußerste Schicht des Follikels und liefern Androgene und strukturelle Unterstützung 6,7. Schließlich bildet sich eine flüssigkeitsgefüllte Antralhöhle und reißt als Reaktion auf einen Anstieg des luteinisierenden Hormons (LH) während des Eisprungs, wodurch ein befruchtungsfähiger Gamet freigesetzt wird, der bei Meiose II 2,8,9 gestoppt wurde.

Die Eizelle erlangt während der Oogenese und Follikulogenese Entwicklungskompetenz für die Befruchtung und die Fähigkeit, die frühe präimplantationsbedingte Embryonalentwicklung, die als nukleare und zytoplasmatische Reifung bezeichnet wird, zu unterstützen 10,11,12. Die zytoplasmatische Reifung ist morphologisch offensichtlich, da sich die Eizellen während der Follikulogenese ausdehnen. Infolge der Proliferation somatischer Zellen, einschließlich Theka-, Granulosa- und Kumuluszellen, erfahren die Follikel selbst eine signifikante volumetrische Expansion. Bei Mäusen nimmt der Durchmesser des Follikels von den frühen sekundären zu den präovulatorischen Follikeln um das Fünffache zu. Die bidirektionale Kommunikation zwischen der Eizelle und den umgebenden Körperzellen ist für die Oogenese unerlässlich. In primären Follikeln bildet sich die Zona pellucida aus Proteinen, die von der Eizelle sezerniert werden, und die Kommunikation zwischen diesen Follikelkompartimenten wird teilweise durch transzonale Projektionen vermittelt, die einen physischen Kontakt zwischen diesen beiden Follikelkompartimenten herstellen13,14. Daher ist die follikuläre Mikroumgebung von entscheidender Bedeutung, um das Wachstum sowie die nukleare und zytoplasmatische Reifung der Eizelle korrekt zu orchestrieren 2,5. Um die einzelnen Mechanismen, die diese Prozesse unterstützen, besser zu verstehen, besteht ein Bedarf an fortschrittlichen und physiologisch relevanten In-vitro-Kulturtechniken. Die Fähigkeit, Follikel in vitro zu kultivieren, hat breite Anwendungen, darunter assistierte Reproduktionstechnologien und Fruchtbarkeitserhaltung 15,16,17,18, Artenschutz 19,20, Arzneimittelentwicklung21 und toxikologisches Screening22,23.

In-vitro-Follikelkultursysteme sind auch ein wesentlicher Zwischenschritt für die Fähigkeit, Gameten aus pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, die auch als In-vitro-Gametogenese (IVG) bezeichnet werden24. Forscher haben embryonale Stammzellen, mesenchymale Stammzellen und induzierte pluripotente Stammzellen verwendet, um Gameten in einer Vielzahl von Spezies zu entwickeln, wobei sie sich oft auf somatische Zellen stützten, um die native Follikelmikroumgebung nachzubilden 25,26,27,28,29,30. Obwohl mit diesen Methoden wichtige Meilensteine beim Wirksamkeitsnachweis erreicht wurden, gibt es immer noch eine Herausforderung durch minderwertige Eizellen, die sich in einer geringen Embryonalentwicklung und einer geringen Rate an lebenden Nachkommen nach der In-vitro-Fertilisation bei Mäusen widerspiegelt31,32. Bei anderen Tierarten wurden bisher keine Lebendgeburten erzielt, was die Notwendigkeit einer kontinuierlichen Verfeinerung der Protokolle unterstreicht, um die Oogenese und Follikulogenese vollständig zu unterstützen.

Derzeit werden verschiedene Strategien für die Follikelkultur eingesetzt. Die technisch am wenigsten anspruchsvollen und durchsatzhöchsten Ansätze sind gerüstfreie Verfahren, bei denen die Follikel in eine Kunststoffschale oder einen Membraneinsatz 33,34 eingebracht werden. Hier haften Granulosazellen an der Kulturoberfläche und verlieren den Kontakt mit der Eizelle33,34. Der Zusammenbruch der follikulären Architektur schränkt die Nutzbarkeit und biologische Relevanz dieser Techniken ein. Die gerüstfreie Kultur in niedrigen Anhaftungsplatten oder umgekehrten Tropfen ermöglicht es dem Follikel jedoch, die strukturelle Integrität bei mehreren Säugetierarten zu erhalten 35,36,37. Leider ist es mit diesen Techniken schwierig, die Interaktion zwischen den Follikeln und die Menge an mechanischer Unterstützung, die sie erhalten, zu kontrollieren. Um die In-vivo-Physiologie besser rekapitulieren zu können, wurden daher Kulturmethoden entwickelt, bei denen Follikel in Hydrogele mit definierten, einstellbaren chemischen Zusammensetzungen und/oder mechanischen Eigenschaften eingekapselt werden 33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53. So kann beispielsweise das in vitro Alginat-verkapselte Follikelwachstumssystem wichtige transkriptomische Signaturen rekapitulieren, die in vivo beobachtet wurden 21.

Trotz des Erfolgs und des Wertes von verkapselten Kulturprotokollen gibt es mehrere Nachteile. Sie können technisch anspruchsvoll sein, aufwendig, haben einen geringen Durchsatz und sind nicht mit automatischen bildgebenden Verfahren kompatibel. Darüber hinaus erfordern verkapselte Kulturmethoden aufgrund der höheren volumetrischen Expansion des Follikels mehrstufige Ansätze für größere Säugetierarten37. Darüber hinaus üben verkapselte Techniken eine gleichmäßige Unterstützung in alle Richtungen aus, und die Follikel müssen vor dem Eisprung aus dem Hydrogel gelöst werden. Dies geschieht nicht in vivo, wo der Follikel mit der umgebenden ovariellen Mikroumgebung interagiert, die eine dynamische biomechanische Unterstützung bietet54. Zum Beispiel hält die steife Ovarialrinde die Ruhe der primordialen Follikel aufrecht, während große wachsende Follikel typischerweise im weicheren Markkompartiment zu finden sind55,56. Sobald ein Follikel mit einer kompetenten Eizelle seine terminale Größe erreicht hat, ermöglichen Modifikationen der Follikelwand und des Epithels der Eierstöcke den Eisprung. Daher könnten Kulturtechniken, bei denen die Follikel in eine einzige Richtung mit geringem Widerstand wachsen können, die In-vivo-Physiologie besser nachahmen.

In einem neuartigen Ansatz wurde eine reproduzierbare, skalierbare, technisch weniger anspruchsvolle und kostengünstige Kulturmethode für mehrschichtige Sekundärfollikel der Maus entwickelt57. Hier werden Agarose-Mikrowells mit extrem geringer Adhäsion mit präzise steuerbarer Geometrie (Form, Abmessungen) und räumlicher Anordnung (Anzahl, Nähe) mit kostengünstigen Verfahren hergestellt. Die Follikel in den Agaroseformen erfahren mechanische Unterstützung in alle bis auf eine Richtung und werden in derselben Fokusebene kultiviert, was eine Zeitrafferbildgebung für eine fortschrittliche morphokinetische Analyse ermöglicht. Der Stereolithographie (SLA)-3D-Druck wurde als zugängliche Methode zur Herstellung einer Urform eingesetzt, gefolgt von Formschritten, die sickerwasserfreie Silikonformen zum Gießen der Agarose erzeugen. Mit dem neuen System wurden im Vergleich zu herkömmlicher eIVFG verbesserte Follikelwachstums- und Ovulationsergebnisse erzielt, ohne das Gesamtüberleben, die Reifung oder die Luteinisierung der Follikel zu beeinträchtigen57. Dieses Protokollpapier beschreibt die Schritte, die zum Anpassen und Herstellen von Agaroseformen erforderlich sind, wie mehrschichtige Sekundärfollikel gesät und kultiviert, verarbeitet und schließlich eine Zeitrafferanalyse durchgeführt werden (Abbildung 1).

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Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren im Zusammenhang mit diesem Protokoll wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Northwestern University genehmigt und in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt.

1. Passen Sie das Design der Masterform an

In diesem Abschnitt werden die ersten Schritte beschrieben, die während der Designphase durchgeführt werden (Abbildung 1), in der kundenspezifische Mikrowells in ein computergestütztes Design (CAD) einer Masterform für 24-Well-Kulturplatten eingeführt werden, das als 24-Well-Master-Mold-Base-Design bezeichnet wird (Supplemental File 1). Die Abmessungen der Mikrovertiefungen bestimmen die Menge der Unterstützung und die maximale Wachstumsgröße der Follikel, während die Anzahl der Vertiefungen die maximale Anzahl von Follikeln pro Agaroseform bestimmt. Das angepasste Urformdesign wird dann im nächsten Abschnitt verwendet, um biokompatible Silikonformen für den Agaroseguss zu erstellen.

  1. Öffnen Sie die . step-Datei für das Design der 24-Well-Master-Formbasis mit der CAD-Software (Abbildung 2A).
  2. Wählen Sie die innere Oberfläche des Objekts aus, navigieren Sie dann zur Registerkarte Volumenkörper im Arbeitsbereich Konstruktion und wählen Sie Skizze erstellen , um das gewünschte Mikrospritzmuster-Design einzufügen (Abbildung 2Bi).
  3. Geben Sie die gewünschten XY-Abmessungen und die Anzahl der Mikrowellen ein und wählen Sie in der Symbolleiste die Option Fertigskizze aus (Abbildung 2Bii).
    HINWEIS: Für mehrschichtige Sekundärfollikel wurde zuvor eine geometrische Stadionform von 500 x 700 μm verwendet57. Die Druckauflösung kann je nach verwendetem Harz und SLA-Drucker variieren. ermöglichen einen minimalen Abstand von 400 μm zwischen den Mikrovertiefungen.
  4. Erstellen Sie die 800 μm tiefen Mikrovertiefungen mit der Extrusionsfunktion (klicken Sie auf Festkörper | Erstellen | Extrudieren). Stellen Sie sicher, dass Sie den Schnittvorgang auswählen, um den Mikrotiter-Hohlraum zu erstellen (Abbildung 2Biii).
  5. Wählen Sie eine Verrundung mit einem Radius von 0,100 mm aus (klicken Sie auf Design | Festkörper | Ändern | Verrundung) für die Oberseite der Mikrovertiefungen
    HINWEIS: Um eine Mikrovertiefung mit rundem Boden zu erstellen, verwenden Sie den Abrundungsvorgang erneut für den Boden der Kulturvertiefung, und lassen Sie den Radiuswert gleich dem Radius des Mikrotiterdesigns festlegen. Wenn Sie z. B. Wells mit einer Größe von 500 μm x 700 μm entwerfen, wählen Sie einen Radiuswert von 0,250 mm (Abbildung 2Biv).
  6. Exportieren Sie eine Kopie der neuen Master-Formkonstruktion im .step-Format (klicken Sie auf Datei | Exportieren).

2. Herstellung von Silikonformbehältern

HINWEIS: Um das Auslaugen von zytotoxischen Verbindungen aus den 3D-gedruckten Teilen zu verhindern, werden zwei biokompatible Silikonformen hergestellt. Dieser Abschnitt beschreibt die letzten Schritte in der Designphase (Abbildung 1) und führt zu den beiden Behältern, die für die Silikonformung verwendet werden. Dabei werden drei verschiedene CAD-Dateien verwendet, nämlich das neue Master-Mold-Design, das aus Sektion 1 erstellt wurde, und die 24-Well-Silikongussbehälter 1 und 2 (Abbildung 2Ci-ii bzw. Ergänzungsdatei 2, Ergänzungsdatei 3).

  1. Öffnen Sie die 1.step-Datei des 24-Well-Silikongießbehälters und fügen Sie das neue Master-Formdesign als externe Komponente ein (navigieren Sie zu Solid | Einfügen | Komponente einfügen).
    1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Komponente, und wählen Sie Verknüpfung aufheben , um die verknüpfte Referenz auf die neue Master-Formkonstruktion zu entfernen.
  2. Zentrieren Sie das neue Master-Mold-Design mit der Oberfläche des 24-Well-Silikongussbehälters 1 und stellen Sie sicher, dass es nach innen zeigt.
    1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das neue Master-Formdesign-Objekt im Browser und wählen Sie die Option Verschieben/Kopieren .
    2. Wählen Sie im Abschnitt Verschiebetyp die Operation Frei verschieben und drehen Sie das Objekt bei Bedarf um 180° um die x-Achse.
    3. Wählen Sie im Abschnitt Typ verschieben die Punkt-zu-Punkt-Operation aus, wobei die Mitte des neuen Designobjekts der Hauptform als Ursprungspunkt und die Mitte der Oberfläche des 24-Well-Silikongussbehälters 1 als Zielpunkt verwendet wird.
    4. Wählen Sie OK aus, um die Objekte auszurichten.
  3. Wählen Sie die Schnittoperation mit dem Behälter als Zielkörper und der Urform als Werkzeugkörperkonstruktion aus (Abbildung 2Ciii). Damit entsteht der Behälter für den ersten Schritt des Silikonformens (Abbildung 2Civ).
    HINWEIS: Bei den Mikromulden, die im ersten Abschnitt entworfen wurden, handelt es sich nun um Mikrosäulen, die wie in Abschnitt 3 beschrieben in 3D gedruckt werden. Der SLA-Druck ist ein additives Fertigungsverfahren; Daher verbessert das Drucken von Mikrosäulen die Druckauflösung im Vergleich zum Drucken von Mikrovertiefungen.
  4. Speichern und exportieren Sie die resultierende neue 24-Well-Silikonform 1 als .stl- und .step-Datei.

3. 3D Bedrucken von Silikonbehältern

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die ersten Schritte beschrieben, die während der Herstellungsphase (Abbildung 1) durchgeführt werden, in der die neuen CAD-Entwürfe mit den gewünschten Mikrotiter-Designmerkmalen in 3D gedruckt werden.

  1. Öffnen Sie die . stl-Dateien der neuen 24-Well-Silikonform 1 und des 24-Well-Silikongussbehälters 2 mit der 3D-Druckvorbereitungssoftware.
  2. Richten Sie den Druck mit den Mikrosäulen nach oben aus und verwenden Sie die Bohrlochfunktion, um eine 1 mm breite Öffnung zu erzeugen (Abbildung 2D). Stellen Sie sicher, dass dieser Kanal zur Seite des Drucks hin offen ist.
    HINWEIS: Das Bohrloch, das Schröpfeffekte während des Drucks vermeidet und nach dem Druck gefüllt werden kann, oder das überschüssige Silikonmaterial kann nach dem ersten Silikonabdruck entfernt werden.
  3. Drucken Sie die beiden Behälterdesigns mit einer Schichtdicke von 25 μm (Abbildung 3A).
    HINWEIS: Drucken Sie jedes Modell in dreifacher Ausfertigung, um Druckfehler oder Beschädigungen während der Verarbeitung zu berücksichtigen.
  4. Entferne die Formen von der Druckplattform und wasche 95% Isopropanol nach Herstellerangaben ein. Besprühen Sie den Mikrosäulenabschnitt ausgiebig mit 95 % Isopropanol (Abbildung 3B). Entfernen Sie restliches Ethanol mit Druckluft.
  5. Lassen Sie das restliche Ethanol mindestens 30 min verdampfen.
    HINWEIS: In diesem Stadium kann der 1 mm breite Bohrkanal abgedichtet werden. Dies kann durch Auftragen eines kleinen Tropfens unpolymerisiertem Harz mit einer p200-Pipettenspitze auf die Außenseite des Drucks erfolgen. Kapillarkräfte füllen den Kanal.
  6. Härten Sie die 3D-Drucke bei 60 °C mit ultraviolettem Licht für 15 Minuten aus.
  7. Untersuchen Sie jeden Druck mit einem Stereomikroskop und verwerfen Sie alle 3D-Drucke mit Unvollkommenheiten (Abbildung 3C-F). Überprüfen Sie jeden Druck gründlich visuell und stellen Sie sicher, dass alle Mikrosäulen getrennt und in Größe und Aussehen einheitlich sind (Abbildung 3D). Entsorgen Sie fehlerhafte Master-Formen mit verschmolzenen Mikrosäulen (Abbildung 3E).
    HINWEIS: Häufige Probleme sind beschädigte Mikrosäulen oder Brücken durch ungewaschenes Harz (Abbildung 3Fi,ii).
  8. Decken Sie die Außenseite des Drucks mit Parafilm ab, wenn der Bohrkanal nicht gefüllt ist, und lagern Sie ihn bis zur weiteren Verwendung.

4. Herstellung von Silikonformen

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die letzten Schritte der Herstellungsphase (Abbildung 1) beschrieben, in der zwei Silikonformschritte stattfinden. Dies ist notwendig, um die Freisetzung von giftigen Sickerwässern durch 3D-gedruckte Teile zu verhindern.

  1. Bereiten Sie das Silikon gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, zusammenfassend:
    1. Mischen Sie den Inhalt der Behälter der Teile A und B gründlich, stellen Sie ein Becherglas auf eine Waage und gießen Sie es in einem Verhältnis von 1A:1B in den Behälter. Stellen Sie sicher, dass überschüssiges Material vorhanden ist.
    2. 3 Minuten lang gründlich mischen und dabei darauf achten, die Seiten und den Boden abzukratzen.
    3. Legen Sie das Material in einen Vakuumexsikkator und lassen Sie es 5 Minuten einwirken, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen. Wiederholen Sie die Entgasung bis zu 2x, wenn Luftblasen zurückbleiben.
  2. Gießen Sie die Mischung mit gleichmäßigem Durchfluss in den Silikonformbehälter 1. Stellen Sie sicher, dass der Mischungsgehalt auf dem gleichen Niveau wie beim 3D-Druck oder leicht darunter liegt, um die Ebenheit der Silikonform sicherzustellen (Abbildung 4Ai,ii).
    1. Entfernen Sie eingeschlossene Luft mit einer Pipettenspitze p200 und verwenden Sie bei Bedarf eine Vakuumentgasung.
  3. Härten Sie das Silikon mindestens 5 h und vorzugsweise über Nacht bei Raumtemperatur aus, bevor Sie es entformen.
  4. Entfernen Sie das Silikon aus der 3D-gedruckten Form und bestätigen Sie die Unversehrtheit der Mikroformen visuell mit einem Stereomikroskop (Abbildung 4Aiii,B). Entfernen Sie bei Bedarf überschüssiges Material aus dem Bohrkanal (Abbildung 4Aiv). Entsorgen Sie Formen mit Überbrückung oder kompromittierten Mikrovertiefungen (Abbildung 4C).
  5. Legen Sie die Silikonform für den zweiten Silikonformschritt in den Silikonformbehälter 2 (Abbildung 4Av). Der Silikonbehälter 2 hat eine 1 mm breite Öffnung in der Seitenwand, die nach dem Aufsetzen der Silikonform abgedeckt wird.
  6. Besprühen Sie die Silikonform leicht mit embryo-sicherem Mineralöl und entfernen Sie überschüssiges Öl aus den Mikrowells. Dies dient als Trennmittel, um beide Silikonteile nach dem Aushärten zu trennen.
  7. Wiederholen Sie die in Schritt 4.1 beschriebenen Mischschritte und gießen Sie die Mischung in den Silikonformbehälter 2. Stellen Sie sicher, dass der Füllstand der Mischung unter oder auf der gleichen Höhe wie der 3D-Druck liegt, um die Ebenheit der Silikonform sicherzustellen (Abbildung 4Avi).
  8. Lassen Sie das Silikon mindestens 5 Stunden, vorzugsweise über Nacht, bei Raumtemperatur aushärten, bevor Sie es entformen.
  9. Entfernen Sie das Silikon aus der 3D-gedruckten Form und trennen Sie die Silikonformen 1 und 2 voneinander (Abbildung 4Avii). Bestätigen Sie die Integrität der Mikrosäulen visuell mit einem Stereomikroskop (Abbildung 4D). Entsorgen Sie die Form, wenn Blasen oder überschüssiges Öl in den Mikrovertiefungen vorhanden waren (Abbildung 4E).
  10. Waschen Sie die Silikonform mit 70% Ethanol und lassen Sie sie 30 Minuten lang in einer Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen.
  11. Legen Sie es in einen Sterilisationsbeutel und autoklavieren Sie es in einem Trockenzyklus zum Sterilisieren (Manteldruck: 20 psi, Kammertemperatur: 250 °F, Sterilisationszeit: 15 min).

5. Vorbereitung der Nährmedien

HINWEIS: Für die Verdauung von Eierstockgewebe zur Isolierung und Kultivierung von Follikeln, für die In-vitro-Reifung von Eizellen und die Luteinisierung sind sechs Arten von Medien erforderlich: Dissektionsmedien (DM), Enzymatische Medien (EM), Erhaltungsmedien (MM), Wachstumsmedien (GM), Reifungsmedien (IVM) und Luteinisierungsmedien (LM). Die Aufbereitung dieser Medien findet sich, wie zuvor von Converse et al.38 beschrieben, mit einer Erläuterung der Bedeutung verschiedener Medienkomponenten, die von Simon et al.33 analysiert wurden, und ihr Zweck wird in Tabelle 1 kurz erwähnt.

  1. Bereiten Sie die Medien bis zu 1 Woche im Voraus vor und lagern Sie sie bei 4 °C.

6. Gießen und Lagern von kundenspezifischen Agaroseformen und Follikelkulturen

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie aus den in Abschnitt 4 erzeugten Silikonformen kundenspezifische Agaroseformen für die Follikelkultur gegossen werden. Agaroseformen können hergestellt und bei 4 °C bis zu 2 Wochen vor der Follikelkultur gelagert werden.

  1. Die Formen werden in einen Sterilisationsbeutel gegeben und im Trockengang wie in Abschnitt 4.11 beschrieben autoklaviert. Lassen Sie die Förmchen vor der Verwendung abkühlen.
  2. Stellen Sie Agaroselösung her, indem Sie eine sterile 1,5%ige Agaroselösung (w/v) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Mikrowelle oder auf einer Heizplatte auflösen. Verwenden Sie ein steriles konisches Röhrchen, das in ein Becherglas mit Wasser gegeben wird, um eine gleichmäßigere Erwärmung der Agarose zu ermöglichen und die Verfestigung der flüssigen Agaroselösung zu verlangsamen.
  3. Pipettieren Sie die sterile Agaroselösung in Silikongussteile in einer Laminar-Flow-Haube. Pipettieren Sie langsam und gleichmäßig, um die Bildung von Blasen zu minimieren und sicherzustellen, dass die Oberseite der Form flach und nicht konvex oder konkav ist. Die Oberseite beim Gießen ist beim Kultivieren die Unterseite der Form und sollte flach aufliegen. Verwenden Sie ca. 600 μl Agarose für eine 24-Well-Platte und 85 μl für eine Mikromold, die in eine 96-Well-Platte passt.
  4. Lassen Sie die Mikroformen ~3 Minuten abkühlen, bis sie fest sind. Invertieren Sie den Silikonguss, um Mikroformen auf eine 100-mm-Petrischale auszustoßen.
  5. Untersuchen Sie die Mikroformen unter einem Mikroskop auf Verformungen, einschließlich Risse, Verschmelzung von Mikrovertiefungen oder unvollständige Ränder. Legen Sie die Mikroformen in steriles PBS + 1% Penicillin-Streptomycin und lagern Sie sie bis zu 2 Wochen vor der Verwendung bei 4 °C.
    HINWEIS: Stellen Sie mehr Formen als nötig her, um die Verschlechterung im Laufe der Zeit oder Schäden an Mikroformen beim Übertragen zwischen Platten zu berücksichtigen.
  6. Äquilibrieren Sie die Mikroformen in 750 μl Erhaltungsmedium 2x für mindestens 1 h (insgesamt zwei Inkubationen) am Tag der Follikelisolierung.
  7. Entfernen Sie alle Pflegemedien, fügen Sie 750 μl Wachstumsmedium hinzu und stellen Sie es für 1 h in den Inkubator.
  8. Vor der Aussaat durch frische und ausgeglichene Wachstumssubstrate ersetzen.

7. Isolierung und Kultur der späten Sekundärfollikel

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird erläutert, wie Follikel in den Agarose-Mikroformen für die Follikelkultur isoliert und ausgesät werden. Mehrschichtige Sekundärzellen werden 8 Tage lang kultiviert, müssen eine Lebensfähigkeit von über 80 % aufweisen und reife Eizellen produzieren. Die Isolierung und Kultur von Sekundärfollikeln wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben38. Die Isolierung und Selektion der Follikel für die etablierte Alginatverkapselung und für die Aussaat in Agaroseformen sind konsistent.

  1. Präparieren Sie Eierstöcke von Mäusen und entfernen Sie sie aus periovariellem Fettgewebe und Schleimbeuteln. Legen Sie die Eierstöcke in 2,5 mL enzymatisches Medium und inkubieren Sie in einem Orbitalschüttler bei 37 °C für 20 Minuten, wie zuvor beschrieben57.
  2. Pipettieren Sie 2 ml Erhaltungsmedium in eine IVF-Schale und legen Sie es vor der Follikelisolierung in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO2).
  3. Quench-Reaktion mit 250 μl FBS. Selektieren Sie für späte Sekundärfollikel nach enzymatischer Isolierung und übertragen Sie sie in eine IVF-Schale mit DM.
  4. Übertragen Sie die Follikel in eine IVF-Schale mit voräquilibriertem Erhaltungsmedium und legen Sie sie für 1 h in einen Inkubator (37 °C, 5% CO2).
    HINWEIS: Die Ausgangsgröße der späten Sekundärfollikel beträgt 150-180 μm mit mehr als zwei Schichten von Granulosazellen.
  5. Geben Sie 750 μl frischen GM in Agarose-Mikroformen und lagern Sie sie im Inkubator, um die Aussaat vorzubereiten. Geben Sie steriles PBS in benachbarte Vertiefungen, die Agarose-Mikroformen umgeben, um die Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten und die Verdunstung von Medien während des gesamten Kulturzeitraums zu minimieren.
  6. Samenfollikel werden in Agaroseformen gebracht, die voräquilibriert und in GM getaucht wurden. Übertragen Sie hochwertige mehrschichtige Sekundärfollikel unter dem Mikroskop mit einer 200 μm großen Stripperspitze auf Agarose-Mikroformen. Stellen Sie sicher, dass 10 Follikel in einer 24-Well-Platte auf jede Mikroform übertragen werden und dass sich jeder Follikel in einer separaten, aber angrenzenden Mikrovertiefung befindet.
    1. Biegen Sie die Stripperspitze, um eine präzisere Manipulation und den Transfer der Follikel in die Mikrowells zu ermöglichen.
    2. Schneller Transfer von Follikeln, um Temperatur- und pH-Änderungen zu minimieren, da MM und GM CO2 -gepuffert sind.
    3. Stellen Sie sicher, dass die Follikel in einer Mikroform eine ähnliche Ausgangsgröße haben, sobald alle 10 Follikel übertragen wurden.
  7. Legen Sie die ausgesäten Mikroformen für mindestens 1 Stunde zurück in den Inkubator, damit sich die Follikel vor der Bildgebung erholen können.
  8. Bilden Sie Follikel jeden zweiten Tag mit 4- und 10-facher Vergrößerung ab, um das Überleben und die Wachstumsergebnisse der Follikel zu quantifizieren.
    HINWEIS: Zeitrafferaufnahmen können auch für morphokinetische Messungen eingerichtet werden und werden in Abschnitt 9 ausführlicher beschrieben.
  9. Wechseln Sie 50 % der Nährmedien jeden zweiten Tag.
  10. Verbrauchte Medien mit Trockeneis einfrieren und dann bei -80 °C lagern. Verwenden Sie dieses konditionierte Medium, um die Hormonproduktion durch Östradiol-ELISAs zu beurteilen.
    HINWEIS: Wenn die Gentechnik am Tag der Aussaat (Beginn der Kulturperiode) hergestellt wird, können die Medien bei 4 °C gelagert und während der gesamten Kulturperiode verwendet werden.
  11. Entfernen Sie alle Wachstumsmedien (750 μl) und frieren Sie sie am Tag 8 der Kultur ein.
  12. Ersetzen Sie Wachstumsmedien durch IVM-Medien, um den In-vitro-Eisprung zu ermöglichen.
    HINWEIS: Der Eisprung kann auch im Zeitraffer auftreten, um das Timing und die Rupturmerkmale zu beurteilen.
  13. Entfernen Sie Cumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) 14-16 Stunden nach der Zugabe von IVM-Medien und bewerten Sie den Reifungsstatus.
    1. Definieren Sie den Reifungsstatus wie folgt: Identifizieren Sie MII durch Extrusion des ersten Polkörpers (erwartetes Ergebnis für gesunde Eizellen), GVBD/MI durch das Fehlen eines Polkörpers oder eines Keimvesikels (verzögerte Reifung), GV durch den kugelförmigen Kern, der in der Mitte der Eizelle sichtbar ist (fehlende meiotische Progression) oder degenerierte abgeflachte und/oder abgedunkelte Eizelle.
  14. Optional: Da die Spindelparameter von MII-Eizellen, einschließlich chromosomaler Ausrichtung, Form und Volumen, eng mit der Eizellqualität und den Embryoergebnissen korrelieren58,59, verwenden Sie sie, um den Erfolg der In-vitro-Oogenese zu beurteilen. Um die Spindelmorphologie zu beurteilen, fixieren und färben Sie MII-Eier durch Ganzmount-Immunzytochemie.
    1. Fixierung: Die Eier in 3,8 % PFA mit 0,1 % Triton X-100 bei 37 °C für 20 min fixieren. Waschen Sie die Eier 3x in Blocking-Puffer (PBS mit Calcium und Magnesium (PBS +/+) mit 10% Tween-20 und 0,3% BSA).
    2. Fleckenbildung der Spindel:
      1. Inkubieren Sie die Eier in Permeabilisierungspuffer (PBS +/+ mit 0,1 % Triton X-100 und 0,3 % BSA) für 15 min bei Raumtemperatur
      2. 2x in Blockierpuffer spülen.
      3. Inkubieren Sie die Eier in Alexa Fluor 488-konjugiertem Anti-Alpha-Tubulin in einer Konzentration von 1 μg/ml auf einer in Folie eingewickelten Wippe für 2 h bei Raumtemperatur.
      4. Waschen Sie die Eier 3 x 20 min in Blockpuffer, bevor Sie sie auf Objektträger mit DAPI-haltigem Eindeckmedium aufsetzen.
      5. Um das Zytoskelett der Eizelle zu beobachten, nehmen Sie während der Färbung 1:50 Rhodamin-Phalloidin auf.
    3. Nehmen Sie Proben an einem konfokalen Mikroskop mit einem 63x-Objektiv mit einem Z-Stack bei einer Breite von 1,0 μm über die gesamte Spindel ab.

8. Nachgelagerte Anwendungen von kundenspezifischen Agarose-Formen

HINWEIS: Agarose-Mikroformen können für die histologische Analyse verwendet werden und ermöglichen die Quantifizierung und Lokalisierung verschiedener Gene oder Proteine von Interesse. Die Mikroformen erzeugen einen Follikel-Microarray, der es ermöglicht, mehrere Follikel parallel zu färben. Auch die optische Kohärenztomographie (OCT) kann ohne Follikeltransfer durchgeführt werden (Abbildung 1, Anwendung). Die optische Kohärenztomographie ist ein bildgebendes Verfahren, das die 3D-Rekonstruktion von Proben ermöglicht und im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie eine höhere Eindringtiefe und Auflösung aufweist, was eine verbesserte Bildgebung von 3D-Proben wie in vitro kultivierten Follikeln ermöglicht 60.

  1. Für histologische Anwendungen stellen Sie eine Agaroselösung (1,5 % w/v) her, wie in Schritt 6.2 beschrieben.
    1. Entfernen Sie alle Medien, die die Agarose-Mikroformen in der Vertiefung umgeben, und entfernen Sie vorsichtig das Medium in der Mikromold-Kavität mit einer p200-Pipette an den Ecken der Kavität.
    2. Pipettieren Sie vorsichtig 100 μl flüssige Agaroselösung, um die Mikrovertiefungen und den Hohlraum zu füllen und zu verschließen, ohne die Follikel zu bewegen. Achten Sie darauf, dass die Oberseite flach ist. Entfernen Sie alle Blasen mit einer sterilen P10-Pipettenspitze.
    3. Die Agarose bei Raumtemperatur 2 min fest werden lassen. Stellen Sie unter dem Mikroskop sicher, dass die Mikroform vollständig versiegelt ist.
    4. Fixieren Sie die Mikroformen über Nacht bei 4 °C unter leichtem Wiegen in 750 μl Fixiermittel (modifizierte Davidson-Lösung oder 3,8 % Paraformaldehyd).
    5. Aspirieren Sie das Fixiermittel und waschen Sie die versiegelten Mikroformen in aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol, beginnend mit 50 % und schließlich 70 % EtOH.
    6. Verarbeiten Sie mit einem automatisierten Tissue-Prozessor unter Verwendung von Standardverarbeitungsprotokollen (Tabelle 2) und betten Sie ihn in Paraffinwachs ein. Achten Sie beim Einbetten auf die Ausrichtung der Mikroformen. Stellen Sie sicher, dass sich während des Einbettungsprozesses vor und nach der Probe Wachs befindet, um den Gewebeverlust während des Schnitts zu minimieren.
    7. Eingebettete Proben mit einer Dicke von 5 μm seriell schneiden und auf geladene Objektträger legen.
    8. Führen Sie die H&E-Färbung mit einem automatischen Färbegerät durch und versiegeln Sie sie vor der Bildgebung mit Eindeckmedium.
  2. Wenn Sie eine OCT durchführen, legen Sie die Mikroform mit den Follikeln in eine 50-mm-Schale, die IVM-Medien enthält.
    1. Um dem Verfahren zu folgen, das zur Erzeugung der repräsentativen OCT-Bilder verwendet wurde, wird ein speziell angefertigtes OCT-System verwendet, das im Spektralbereich des sichtbaren Lichts mit einer axialen Auflösung von 1,3 μm und einer lateralen Auflösung von 9,4 μm arbeitet61,62.
    2. Scannen Sie Follikel in einem 1,58 x 1,58 mm2 Sichtfeld, bestehend aus 512 A-Linien und 512 B-Scans, wiederholt 2x pro B-Bild und 3x pro Volumen.
    3. Verarbeiten Sie OCT-Bilder mit ImageJ, um die 3D-Struktur von Follikeln zu visualisieren und Volumen zu quantifizieren.
      1. Laden Sie Bilder als Z-Stapel in ImageJ hoch, indem Sie Dateien in die geöffnete Anwendung ziehen.
      2. Visualisieren Sie den Z-Stack als 3D-Bild, indem Sie zu Plugins|3D|Lautstärke-Viewer. Drehen Sie das 3D-Bild, um verschiedene Blickwinkel zu verschiedenen Zeitpunkten anzuzeigen.
      3. Navigieren Sie zu Datei| Speichern unter |Tiff , um das Bild an der gewünschten Stelle zu speichern.

9. Zeitrafferanalyse der Follikelkultur

HINWEIS: Follikel, die im gerüstfreien Kultursystem gezüchtet werden, befinden sich in derselben Brennebene und sind mit der Zeitrafferbildgebung im Inkubator kompatibel. Die Zeitraffer-Bildgebung kann nach der Aussaat der Follikel in Schritt 7.7 gestartet werden (Abbildung 1, Anwendung).

Stellen Sie sicher, dass alle Änderungen im gesamten Zeitraffer korrekt sind. Durchlaufen Sie daher nach jedem Schritt den gesamten Stapel, um sicherzustellen, dass es keine Diskrepanzen bei den Messungen gibt.

  1. Zeitraffer-Einrichtung:
    1. Setzen Sie eine Kappe für den Lichtfokussierer/-konzentrator auf das Handmikroskop.
    2. Stellen Sie das Handmikroskop mit Montierungshalterung in den Inkubator und schließen Sie es an einen Laptop an, auf dem die Software installiert ist.
    3. Platzieren und richten Sie die Kultur gut unter dem Mikroskop aus und stellen Sie die Höhe und den Fokus des Mikroskops so ein, dass alle Follikel scharf sind. Wählen Sie mit dem automatischen Weißabgleich (AWB) mit der LED-Steuerung die optimalen Lichtverhältnisse aus, deaktivieren Sie die Belichtungsautomatik ( AE) und wählen Sie die optimale Belichtungszeit.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung der Form vor und nach jedem Medienwechsel gleich ist. Andernfalls muss die Analyse separat für alle 2 Tage Kultur durchgeführt werden.
    4. Starten Sie die Zeitrafferbildgebung und wählen Sie eine Dauer von 8 Tagen und ein Intervall von 30 Minuten. Wählen Sie das Foto aus und schalten Sie die LED aus, wenn Sie keine Bilder aufnehmen.
  2. Legen Sie fest, welche Messungen vor der ImageJ-Analyse im Dialogfeld "Messwerte einstellen" aufgezeichnet werden sollen (klicken Sie auf "Analysieren | Messwerte einstellen").
    HINWEIS: Weitere Informationen zu möglichen Messungen, die in die ImageJ-Software integriert sind, finden Sie im Benutzerhandbuch unter Abschnitt 30.763.
  3. Platzieren Sie alle Bilder in einem separaten Analyseordner, um die Analyse zu starten.
  5. Verwenden Sie das rechteckige Auswahlwerkzeug, um einen Bereich auszuwählen, in dem alle Follikel im gesamten Zeitraffer vorhanden sind. Verwenden Sie dazu zuerst das letzte Bild und scrollen Sie durch den Stapel, um sicherzustellen, dass keiner der Follikel abgeschnitten wird. Schneiden Sie dann die Auswahl zu (navigieren Sie zu Bild | Zuschneiden oder Strg+Umschalt+X, Abbildung 5Ai,ii).
  6. Legen Sie die Maßstabsleiste für den Zeitraffer-Stack fest (Analysieren | Maßstab einstellen). Verwenden Sie das mit dem Imager erstellte Tag-0-Bild und messen Sie drei identifizierbare Merkmale wie Follikel oder Mikrovertiefungen. Verwenden Sie das gleiche Bild von Tag 0 aus dem Zeitraffer-Stack und definieren Sie den Maßstab für eine der Messungen. Verwenden Sie die beiden anderen Messungen, um zu bestätigen, dass die genaue Skala eingestellt ist.
  7. Richten Sie alle Bilder mit dem SIFT-Plugin aus (navigieren Sie zu Plugins | Anmeldung | Lineare Stapelausrichtung mit SIFT (Abbildung 5Bi,ii). Verwenden Sie die folgenden Standardeinstellungen, die pro Fall angepasst werden können: Lineare Stapelausrichtung mit SIFT, initial_gaussian_blur = 1,60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 nächste/next_closest_ratio = 0,92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0,05 expected_transformation=Starre Interpolation.
  8. Konvertieren Sie den Stapel in 8-Bit-Graustufen (Bild | Typ | 8 Bit).
  9. Entfernen Sie den Hintergrund mit der Subtraktion des rollenden Balls (klicken Sie auf Prozess | Subtrahieren Sie den Hintergrund, Abbildung 5Ci,ii) mit den folgenden Einstellungen, die pro Fall angepasst werden können: Rollballradius = 70,0 Pixel; Wählen Sie Glättung deaktivieren aus.
  10. Schwellenwert für das Bild festlegen (navigieren Sie zu Bild | Anpassen | Threshold), um die Zeitrafferbilder in zwei Klassen von Pixeln zu unterteilen, indem die folgenden Einstellungen verwendet werden: setThreshold(35, 255, "raw"); run("Apply LUT", "stack"); setOption("BlackBackground", true); run("In Maske konvertieren", "method=Intermodes background=Dark calculate black").
  11. Messen Sie jeden Follikel einzeln, indem Sie die Rechteckauswahl verwenden, und wählen Sie dann die Partikelanalysefunktion aus (klicken Sie auf Analysieren | Partikel analysieren). Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Partikel analysieren...", "size= 8000-Infinity display exclude include summarize overlay add composite stack (Abbildung 5Di, ii).
    1. Vergewissern Sie sich vor dem Speichern der Ergebnisse, dass der ROI für jedes Bild korrekt ist (Abbildung 5Ei,ii). Speichern Sie die Zusammenfassung und die Ergebnisse in . CSV-Format.
    2. Wiederholen Sie dies für alle anderen Follikel.

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Ergebnisse

Um festzustellen, ob das Überleben und das Wachstum der Follikel mit dieser neuartigen Technologie, wie in Protokollabschnitt 7 beschrieben, unterstützt wurde, wurden Follikel von denselben Mäusen isoliert und parallel in Agarose-Mikroformen kultiviert oder in 0,5 % Alginat eingekapselt. Repräsentative Bilder von Follikeln von jedem zweiten Kulturtag zeigten die normale Entwicklung, das Wachstum und die Bildung einer Antralhöhle während der gesamten Kulturperiode (Ab...

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Diskussion

In-vitro-Gametogenese und -Reifung sind Schlüsseltechnologien für ein grundlegendes Verständnis der Biologie von Eizellen, mit potenziellen Anwendungen in der assistierten Reproduktionstechnologie, der Fruchtbarkeitserhaltung und der Artenerhaltung. Die Methoden zur Unterstützung der IVG beruhen häufig auf der Co-Kultur mit somatischen Zellen, um rekonstruierte Eierstöcke zu erzeugen30. Die Bedeutung dieser Stützzellen ist in vivo gut bekannt, wo...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Child Health and Human Development (R01HD105752 bis F.E.D und T32HD094699 bis E.J.Z) und dem SenNet-Programm des NIH Common Fund (U54AG075932 und UH3CA268105 bis F.E.D.) und dem Bill & Melinda Gates Foundation Grant (INV-003385 bis F.E.D.) finanziert. Unter den Förderbedingungen der Bill & Melinda Gates Foundation wurde der Author Accepted Manuscript Version, die sich aus dieser Einreichung ergeben könnte, bereits eine Creative Commons Attribution 4.0 Generic License zugewiesen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Materialien und Chemikalien
  50-mL Polystyrol-ZentrifugenröhrenGlobe Scientific941-11017-CS
1,5 mL MikrozentrifugenröhrenFisher ScientificMCT-150Um die Medien mit einem schnellen Einfrieren einzufrieren und zu speichern
100 mm Schüssel, unbehandeltFisher Scientific08-757-100D Um Agarose-Mikroformen herzustellen und zu lagern
100 % EthanolMercedes Scientific1200Gewebeverarbeitung
1000 & Mikro; L  Pipettenspitzen, geringe BindungMIDSCIPR-1000BKKulturtipps 
200 & Mikro; L  Pipettenspitzen, geringe BindungMIDSCIPR-200BKKulturtipps 
24-Well-PlatteCorning353047Kultur
35-mm-SchüsselnFalke351008Um Eierstöcke zu isolieren und in enyzmatischen Medien zu inkubieren
95 % EthanolMercedes Scientific1210Gewebeverarbeitung
AgaroseHoeferGR140Mikroformen
BioXtra Mineralöl, Lichtöl, Geeignet für die Zellkultur von MausembryonenSigma-AldrichM5310-500MLVerwendung als biokompatibles Entformungsmittel
Rinderserum Albumin MP Biomedizin103700Wachstumsmedien
Reinigungsstaubwedel, 10 Unzen, Packung mit 6Office Depot 110284Druckluft
Clear V4 Resin 1 LFormlabs, IncRS-F2-GPCL-043D-Druckharz
Corning Wiederverwendbarer Kunststoff Low Form 100 mL Becher, Polypropylen, graduiertCorning1000P-100Becher zum Mischen von Silikonkomponenten 
DNAse IQiagen79254Enzymatische Medien
Ecoflex 00-45 fast freiSmooth-On, IncB09M8Y9PTVSilikonmaterial
F-12 + GlutaMAXGibco31765-035Wachstumsmedien
Fetales Rinder-FetuinSigmaF-3385Wachstumsmedien
Fetales Rinderserum (FBS)Peak SerumPS-FB2Dissektionsmedien, enzymatische Medien; Wartungsmedien & Reifemedien
Fisherbrand  SterilisationsbeutelFisher Scientific01-812-50 Sterilisationsbeutel
Follikelstimulierendes Hormon (FSH)EMD Serono, Inc.Nur Gonal-F Rx & nbsp;Growth Media & Reifemedien
Gibco  DPBS, Kalzium, MagnesiumFisher Scientific14-040-182 Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Humanes Choriongonadotropin (hCG)Sigma AldrichC1063-1VLReifemedien
Insulin-transferrin-selenium (ITS)ThermoFisher41400045Wachstumsmedien
Invitrogen Molekulare Sonden Rhodamin PhalloidinFisher ScientificR415Ei-Zytoskelett-Färbung
IVF-SchalenThermowissenschaftlich150260Follikel zu isolieren, auszuwählen und vorauszugleichen.
Leibovit'z 15 (L15)Gibco11415-064Dissektionsmedien & Enzymatische Medien
LiberaseSigma Aldrich5401119001Enzymatische Medien
MEM? + GlutaMAXGibco32561-037Maintenance Media,  Growth Media & Reifemedien
Maus-Epidermalwachstumsfaktor (EGF)BD Biosciences354010Reifemedien
Nalgene Transparentes Polycarbonat Classic Design DesiccatorThermowissenschaftlich5311-0250Vakuum-Austrockner 
ParaffinFisher Scientific83-30Gewebeverarbeitung & Einbettung
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122Dissektionsmedien, enzymatische Medien & Wartungsmedien
-SpitzenOrigioMXL3-200Kultur
VECTASHIELD PLUS Antifade-Montagemedium mit DAPIVektorlaboreH-2000Färbung des Eikerns
XylenMercedes Scientific9840Gewebeverarbeitung
α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)Zell-Signaltechnik5063SEi-Tubulin-Fleck
Ausrüstung
Bauplattform 2Formlabs, IncBP-F3-02-01 3D-Druckerkomponente
Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0Dino-LiteAF4915ZTLImager für Zeitraffer-Einrichtung
Form 3 Harztank V2.1 & NBSP;Formlabs, IncRT-F3-02-013D-Druckerkomponente
Form 3B+ 3D-DruckerFormlabs, IncF3B-P-PRINTERFormlabs Stereolithographie (SLA) 3D-Drucker
Form Cure Formlabs, IncFH-CU-01Härteplattform 
FormwashFormlabs, IncFH-WA-01Waschplattform
Sprühflasche mit Pumpen-VerdampferVWR0309-3005Auftragen von Entformungsmittel
Lichtfokussierer/Konzentratorkappe für die Edge-Serie (ausgenommen T5- und T8-Modelle)Dino-LiteN3C-RImager-Komponente für Zeitraffer-Einrichtung
Mount Holder-Bündel, das das RK-10 Rack und die RK-10-EX Arm Extension kombiniertDino-LiteRK-10AImager-Komponente für Zeitraffer-Einrichtung
Gewebe-EmbedderLeicaHistoCore ArcadiaMikroformen einzubetten
GewebeprozessorLeicaTP1020Zur Herstellung von Mikroformen
211DS Schüttelinkubator (Orbitalshaker)Labnet InternationalI-5211-DSInkubation von Eierstöcken in enzymatischen Medien zur Freisetzung von Follikeln
Software 
Autodesk FusionAutodesk, IncComputergestützte Designsoftware (CAD). Autodesk bietet kostenlosen Bildungszugang über das Autodesk Education-Programm an.
DinoCapture 3.0 Version 1.1.1.3 Dino-Lite
ImageJNationale GesundheitsinstituteOCT-Bilder analysieren und Follikel messen
PreFormFormlabs, IncKostenlose Druckvorbereitungssoftware, die für die Stereolithographie (SLA)-Drucker von Formlabs entwickelt wurde. 

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