Methodenartikel

Umfassende Bewertung von Genotyp-Imputationswerkzeugen für ultra-niedrige Tiefen-Ganzgenomsequenzierungsdaten

DOI:

10.3791/68879

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12. Dezember 2025

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1College of Life Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 2Shenzhen Key Laboratory of Transomics Biotechnologies, BGI Research, 3State Key Laboratory of Genome and Multi-omics Technologies, BGI Research, 4The Innovation Centre of Ministry of Education for Development and Diseases, School of Medicine, South China University of Technology, 5Shanxi Medical University-BGI Collaborative Center for Future Medicine, Shanxi Medical University, 6State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University Health Science Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Drei Imputationswerkzeuge – STITCH, QUILT2 und GLIMPSE2 – wurden über unterschiedliche Sequenzierungstiefen und Stichprobengrößen hinweg unter Verwendung von CCB- und EAS-Referenzpanels getestet. Die Ergebnisse bieten einen praktischen Rahmen zur Auswahl geeigneter Imputationsstrategien in ultra-niedrig-tiefen Sequenzierungsdaten und ermöglichen so groß angelegte Populationsgenomik- und komplexe Merkmalsstudien.

Zusammenfassung

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Ultra-Low-Depth-Sequencing (ULDS) ist eine kosteneffektive Strategie für groß angelegte genomische Studien, doch ihre Nützlichkeit hängt von der genauen Genotypimputation ab. Diese Studie bewertet drei Imputationswerkzeuge – STITCH, QUILT2 und GLIMPSE2 – über unterschiedliche Sequenzierungstiefen und Stichprobengrößen hinweg unter Verwendung der China Kadoorie Biobank (CKB) und The 1000 Genomes Project (1KGP) East Asian (EAS) Referenzpanels. Kritische Leistungsdivergenzen werden nachgewiesen: Stichprobengrößensensitivität: Die Genauigkeit von STITCH verbesserte sich bei größeren Stichproben deutlich, während QUILT2 und GLIMPSE2 eine minimale Abhängigkeit von der Stichprobengröße zeigten. Referenzpanel-Optimierung: Populationsspezifisches CKB verbesserte die Genauigkeit für QUILT2 und GLIMPSE2 signifikant, hatte aber einen vernachlässigbaren Einfluss auf STITCH, das auf interner Haplotyp-Inferenz basiert. Tiefenschwellenwerte: Alle Werkzeuge erreichten eine robuste Genauigkeit bei moderaten Sequenztiefen (≥ 0,5x), aber STITCH schnitt bei ultraniedrigen Tiefen (≤ 0,1x drastisch unterdurchschnittlich ab). GLIMPSE2 mit CKB erzielte die höchste Gesamtgenauigkeit, während QUILT2 Präzision und Recheneffizienz ausbalancierte. Für nicht-invasive pränatale Tests (NIPT)-Daten sicherte GLIMPSE2+CKB eine ausreichende Genauigkeit für nachgelagerte Analysen. Ein Entscheidungsrahmen wird vorgeschlagen, der populationsgematchte Panels und tiefenangepasste Werkzeuge priorisiert und umsetzbare Leitlinien zur Optimierung von ULDS-WGS in vielfältigen Forschungsumgebungen bietet. Diese Erkenntnisse verbinden methodische Fortschritte mit praktischer Umsetzung und ermöglichen eine kosteneffiziente Skalierung genomischer Studien, ohne die Datenqualität zu beeinträchtigen.

Einleitung

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Ultra-Low-Depth-Sequenzierung (ULDS), definiert als Sequenzierungsabdeckung unter 1x, hat aufgrund ihrer niedrigen Kosten, breiten Genomabdeckung und der Kompatibilität mit verschiedenen Probentypen an Bedeutung gewonnen. Sie hat bereits klinischen Wert in Anwendungen wie nicht-invasiver pränataler Test (NIPT)1, Krebsmonitoring2 und Chromosomenkopienzahlvariation (CNV) 3,4 gezeigt. Über die klinische Diagnostik hinaus haben die sinkenden Kosten der Sequenzierung und schnelle Fortschritte in der Bioinformatik es ULDS ermöglicht, eine wachsende Rolle in der Populationsgenomik und der Forschung zu komplexen Merkmalen zu spielen. Durch die Kombination von ULDS-Daten mit Haplotyp-Referenzpanels im Populationsmaßstab ermöglicht die Genotypimputation die Rückgewinnung genomweiter Varianteninformationen auf individueller Ebene. Infolgedessen hat sich ULDS als kostengünstige Alternative zu traditionellen Single-Nucleotid-Polymorphismus-(SNP)-Arrays und High-Depth-Whole-Genome Sequencing (WGS)5 etabliert, insbesondere in groß angelegten Studien wie genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) und Populationsstruktur-Analysen.

Frühere Forschungen haben die Machbarkeit gezeigt, verschiedene genetische Studien unter Verwendung von NIPT-Sequenzierungsdaten durchzuführen, darunter Variantenaufrufe, Rekonstruktion der Populationsgeschichte, Inferenz von viralen Infektionsmustern und GWAS6.

Trotz dieser Vorteile stellt die äußerst spärliche Beschaffenheit der ULDS-Daten besondere Herausforderungen dar. Auf Variantenebene sind viele Standorte völlig unbeobachtet oder nur durch ein einziges Allel pro Individuum repräsentiert, was zu unzureichender Datenqualität für nachgelagerte Analysen führt. Die Genotyp-Imputation ist daher unerlässlich, indem Haplotypstrukturen aus großen Referenzpanels (z. B. 1000 Genomes7 oder populationsspezifische Ressourcen) genutzt werden, um fehlende oder unsichere Genotypen statistisch abzuleiten. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Imputation aus NIPT-Daten eine hohe Genauigkeit erreichen und eine robuste statistische Kraft im GWAS zur Identifizierung von trait-assoziierten Varianten8 erhalten kann. Mit demSTITCH-9-Algorithmus wurden NIPT-Daten (mittlere Tiefe ~0,15x) in einer Kohorte von 20.900 chinesischen Schwangeren erfolgreich imputiert, was zur Identifizierung von schwangerschaftsassoziierten Loci führte. Die imputierten Genotypen zeigten eine starke Übereinstimmung mit hochdetaillierten WGS-Daten in den GWAS-Ergebnissen (Pearson R² > 0,8)10.

Der Erfolg von ULDS-basierten Analysen hängt entscheidend von der Imputationsgenauigkeit ab, die von der Sequenzierungstiefe, Qualität des Referenzpanels und Populationsmatch, der Leistung des Imputationsalgorithmus, der Stichprobengröße und dem Allelfrequenzspektrum11 beeinflusst wird. Unter diesen ist die Wahl des Referenzpanels ein wesentlicher Faktor für die Genauigkeit der Imputation. Häufig verwendete Panels umfassen global repräsentative Ressourcen wie das 1000 Genomes Project (1KGP)7, TOPMed12 und das Haplotype Reference Consortium (HRC)13 sowie zunehmend verfügbare populations- oder regionsspezifische Panels wie Singapore 10,000 Genomes (SG10K)14, die China Kadoorie Biobank (CKB)15. Ein weiterer wichtiger Faktor für die Imputationsleistung ist die Wahl des Algorithmus. Mehrere Werkzeuge wurden entwickelt, um den einzigartigen Herausforderungen der Low-Depth-Sequenzierung gerecht zu werden, was die praktische Anwendung der Imputation in groß angelegter genetischer Forschung erheblich voranbrachte. Während Imputationsmethoden wie Beagle (v5+)16, Minimac417 und IMPUTE511 für SNP-Array- und mittel- bis hochtiefe WGS-Daten weit verbreitet sind, leisten sie in ULDS-Umgebungen oft suboptimal. In jüngerer Zeit wurden spezialisierte Werkzeuge entwickelt, um diese Herausforderungen zu bewältigen. STITCH9 leitet Haplotypen direkt aus niedrigtiefen Sequenzierungswerten ab und eignet sich besonders gut für große homogene Kohorten. QUILT218 verwendet eine komprimierte Haplotyp-Bibliothek und ein lokalisiertes Likelihood-Modell, was eine effiziente Imputation mit riesigen Referenzpanels ermöglicht und einzigartige Anwendungen in der pränatalen Genomik bietet. GLIMPSE219, eine Erweiterung des ursprünglichen GLIMPSE-Frameworks, bietet weitere Verbesserungen sowohl in Genauigkeit als auch in der Recheneffizienz.

Obwohl diese Werkzeuge große Fortschritte darstellen, wurde ihre relative Leistung unter verschiedenen experimentellen Designs (z. B. Sequenzierungstiefe, Kohortengröße und Auswahl des Referenzpanels) nicht systematisch bewertet, sodass Forscher keine klare Orientierung bei der Auswahl der passendsten Strategie erhalten. Um diese Lücke zu schließen, wurden drei weit verbreitete ULDS-Imputationswerkzeuge – STITCH, QUILT2 und GLIMPSE2 – systematisch unter verschiedenen Sequenzierungstiefen und Stichprobengrößen bewertet. Ihre Leistung wurde anhand von zwei ostasiatischen Referenzpanels bewertet, die für chinesische Bevölkerungen sehr relevant sind. Die Ergebnisse zeigen, dass die ULDS-Imputation bei Sequenzierungstiefen ≥0,5x im Allgemeinen zuverlässig ist, während Tiefen <0,1x deutlich größere Kohorten erfordern, um akzeptable Genauigkeit zu erreichen. Die Auswahl des Referenzpanels sollte auf den Studienkontext zugeschnitten sein, wobei populationsgematchte Panels wie CKB die Imputationsgenauigkeit verbessern. Darüber hinaus sind diese Ansätze direkt auf ultraniedrige Tiefendaten anwendbar, die in groß angelegten Populationsstudien und NIPT generiert werden. Diese Studie schafft somit einen praktischen Rahmen für die Werkzeugauswahl in der ULDS-basierten Forschung und bietet methodische Leitlinien für zukünftige Anwendungen in der Populationsgenetik und komplexen Merkmalsanalysen.

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Protokoll

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Alle Teilnehmer haben vor der Teilnahme eine schriftliche informierte Einwilligung eingereicht. Die Studie mit hochdetaillierten WGS-Daten wurde vom BGI Institutional Review Board (BGI-IRB 23058-T2) geprüft und genehmigt, und die Genehmigung für die Sammlung menschlicher genetischer Ressourcen wurde von der Human Genetic Resources Administration of China ([2023] CJ0262) eingeholt. Die Studie mit ULDS-Daten aus dem NIPT wurde vom Institutional Review Board des Wuhan Children's Hospital (2021R062) und dem BGI Institutional Review Board (BGI-IRB 21088) genehmigt, mit zusätzlicher Genehmigung der Human Genetic Resources Administration of China ([2021] CJ2002).

HINWEIS: Diese Studie umfasste zwei Arten von WGS-Daten. Der erste Typ bestand aus hochdetaillierten WGS-Daten (30xx), die aus Blutproben von 500 Personen aus einer natürlichen Populationskohorte in Shenzhen gewonnen wurden. Diese Daten wurden verwendet, um einen hochwertigen Ground-Truth-Datensatz zu erstellen und anschließend für Downsampling- und Genauigkeitsbewertungen durchzuführen. Der zweite Typ bestand aus ULDS-Daten, die aus dem NIPT von 10.000 schwangeren Frauen aus dem Raum Wuhan stammten.

1. Umfassende Gesamtgenomsequenzierungsdaten

  1. Nehmen Sie 500 periphere Blutproben (je 5 ml) von einer allgemeinen Bevölkerungskohorte nach informierter Einwilligung ab. Bewahren Sie Proben in EDTA-Röhrchen auf und transportieren Sie sie bei 2-8 °C.
  2. Zentrifugiere Blut bei 1.600 x g für 10 Minuten bei 4 °C, um Plasma und Buffy Lack zu trennen. Sammeln Sie den Buffy Coup sorgfältig ein und lagern Sie ihn bei -80 °C bis zur DNA-Extraktion.
  3. Extrahieren Sie genomische DNA aus dem Buffy Coat mit einem magnetischen Perlen-Kit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
  4. Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration mittels eines fluorometrischen Tests und bewerten Sie die DNA-Integrität mittels Agarosegel-Elektrophorese. Ausgewählte Proben mit Gesamt-DNA ergeben ≥1 μg, Konzentration ≥12,5 ng/μL und Fragmentlänge >20 kb ohne sichtbaren Abbau für die Bibliotheksvorbereitung.
  5. Schneiden Sie 80–200 ng hochwertiger genomischer DNA auf eine durchschnittliche Größe von 350–400 bp durch Ultraschalluntersuchung.
  6. Endreparatur bei 20 °C für 30 Minuten, Adapterligation bei 20 °C für 15 Minuten und Zirkularisierung bei 37 °C für 30 Minuten zur Erstellung PCR-freier Bibliotheken. Erzeugen Sie DNA-Nanobälle (DNBs) mittels Rolling-Circle-Amplifikation (RCA). Sequenz-gepaarte Endbibliotheken (PE100, Leselänge 100 bp) auf einer DNBSEQ-Plattform bis zu einer Zieltiefe von ~30x (durchschnittlich 100 Gb pro Sample). Speichere rohe Sequenzierungslesungen im FASTQ-Format für nachgelagerte Analysen.
    HINWEIS: Behandeln Sie alle vom Menschen stammenden Proben unter BSL-2-Laborbedingungen. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen, um DNA-Abbau zu verhindern. Entsorgen blutbasierte Materialien als biologisch gefährliche Abfälle; Entsorgen Sie chemische Reagenzien gemäß den institutionellen Richtlinien für gefährliche Abfälle.

2. NIPT-Daten mit ultraniedriger Tiefe (~0,1x WGS)

  1. Entnehmen Sie 10.000 mütterliche Blutproben (je 5 ml) für routinemäßige nicht-invasive pränatale Tests (NIPT). Verwenden Sie EDTA-Röhren und transportieren Sie bei 2-8 °C; Verarbeiten Sie das Plasma innerhalb von 8 Stunden nach der Entnahme.
  2. Für stabilisierte zirkulierende DNA-Röhren (K-Röhren oder G-Röhren) werden bei 6-35 °C mit temperaturkontrollierten Trägern transportiert und innerhalb von 96 Stunden gemäß den Standardverfahren des Herstellers verarbeitet.
  3. Zentrifugiere Blut bei 1.600 x g für 10 Minuten bei 4 °C, um das Plasma zu trennen. Sammeln Sie vorsichtig die obere Plasmaschicht auf, ohne die Buffy-Schicht oder das Zellpellet mit einer Pipette zu stören, und übertragen Sie sie in ein neues Rohr. Zentrifugieren Sie das gewonnene Plasma erneut bei 16.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C, um eventuelle Restzellen oder Ablagerungen zu entfernen. Übertrage vorsichtig das klärt überlagerte Plasma (zellfreies Plasma) in ein frisches Röhrchen zur DNA-Extraktion.
  4. Extraktion der zirkulierenden zellfreien DNA (cfDNA) aus dem Plasma mit einem Nukleinsäureextraktionsset. Endreparatur bei 20 °C für 30 Minuten, Adapterligierung bei 20 °C für 15 Minuten und PCR-Verstärkung (12 Zyklen, 98 °C Denaturierung 10 S, 60 °C Glühen 30 Sekunden, 72 °C Denaturierung 30 Sekunden).
  5. PCR-Produkte reinigen und Bibliotheken bei 37 °C für 30 Minuten zirkulariseren. Generiere DNBs über RCA. Sequenz-Single-End-Bibliotheken (SE35, Leselänge 35 bp) auf einer BGISEQ-500-Plattform. Speichere die Rohsequenzierungsdaten im FASTQ-Format.
    HINWEIS: Plasmaproben als potenziell infektiöses Material unter BSL-2-Bedingungen behandeln. Minimieren Sie Gefrier-Tau-Zyklen, um den Abbaus der cfDNA zu reduzieren. Entsorgen Sie Plasmaabfälle und Kunststoffverbrauchsmaterialien als biologisch gefährliches Material.

3. Datenvorverarbeitungs-Pipeline

  1. Um die Leistung von Genotyp-Imputationswerkzeugen unter unterschiedlichen Sequenzierungstiefen systematisch zu bewerten, führen Sie einen standardisierten Vorverarbeitungs-Workflow sowohl auf den ursprünglichen hochintensiven WGS-Daten (30x) als auch auf ultraniedrig-tiefen-NIPT-Daten (<0,1x) durch, einschließlich simulierter Downsampling, Qualitätskontrolle, Leseausrichtung, Duplikatentfernung und Rekalibrierung des Basis-Qualitätsscores (BQSR).
    HINWEIS: Die Schritte von diesem Punkt bis zur Bewertung der Imputationsgenauigkeit bilden das Hauptprotokoll (Abbildung 1) dieser Studie. Der spezifische Code ist in Supplementary File 1 zu finden.
  2. Downsampling
    1. Generiere eine Reihe von heruntergemusterten Datensätzen aus den ursprünglichen 30-fachen Hochtiefen-Sequenzierungsproben. Verwenden Sie zwei Strategien, um die Sequenzierungsmerkmale der NIPT-Daten realistisch nachzuahmen, wie unten beschrieben.
    2. Zufällige Teilstichprobe: Verwenden Sie seqtk v1.5 (https://github.com/lh3/seqtk) mit einem festen zufälligen Seed von 100, um vier Ebenen niedrig-tiefen-Daten zu erzeugen (0,05x, 0,1x, 0,5x und 1.0x).
    3. NIPT-ähnliche Lesestruktursimulation: Behalten Sie nur die erste Leseart (R1) jeder gepaarten Leseart und kürzen Sie alle erhaltenen Lesearten auf 35 bp mit Seqtk trimfq -L 35, was mit der typischen Single-End-Short-Read-Natur der ultra-niedrig-tiefen NIPT-Sequenzierung übereinstimmt.
  3. Qualitätskontrolle
    1. Verarbeite alle rohen FASTQ-Dateien mit fastp v0.23.420. Verwenden Sie folgende Parameter: --qualified_quality_phred=5 (Basisqualitätsschwelle), --unqualified_percent_limit=50 (maximaler Prozentsatz niedrigqualitativer Basen erlaubt), --n_base_limit=10 (maximal N Basen pro Lese) und benutzerdefinierte Adapterentfernung mit --adapter_sequence=AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAG
      GAAGACAA (R1) und --adapter_sequence_r2=AAGTCGGATCGTAGCC
      ATGTCGTTCTGTGAG
      CCAAGGAGTTG (R2).
    2. Deaktivieren Sie Poly-G-Tail Trimming (--disable_trim_poly_g) und generieren Sie Berichte sowohl im JSON- als auch im HTML-Format für jede Stichprobe.
  4. Ausrichtung und Entfernung von Doppelgängern
    1. Richten Sie hochwertige Lesungen auf das menschliche Referenzgenom GRCh38 (hg38)21 mit BWA v0.7.16a-r118122 aus.
    2. Führen Sie die Ausrichtung mit dem aln-Algorithmus durch (-e 10 -t 4 -i 5 -q 0), gefolgt von samse für die Ein-End-Ausrichtung mit Lesegruppeninformation.
    3. Konvertiere die resultierenden SAM-Dateien in BAM, sortiert (samtools sort -@ 8) und entferne Duplikate mit SAMtools v1.323 (samtools rmdup). Indexiere alle BAM-Dateien.
  5. Rekalibrierung des Basisqualitätsscores (BQSR)
    1. Führe BQSR mit GATK v4.0.4.024 durch. Trainieren Sie das Rekalibrierungsmodell auf drei hochkonfidenziellen Variantendatensätzen: dbSNP build 14625, Mills und 1000G Gold Standard indels21 sowie die GATK Resource Bundle24 known indels file für GRCh38. Die verwendeten Bundle-Dateien beziehen sich auf das offizielle GATK-Beispiel (https://github.com/gatk-workflows/gatk4-data-processing/blob/master/processing-for-variant-discovery-gatk4.hg38.wgs.inputs.json). Insgesamt sollten drei Dateien und die entsprechenden Indexdateien heruntergeladen werden.
    2. Starte BaseRecalibrator gefolgt von ApplyBQSR, um neu kalibrierte BAM-Dateien zu generieren. Indexiere alle BAMs mit SAMtools v1.3.
      HINWEIS: Alle simulierten Datensätze wurden identischer Vorverarbeitungsschritte abgebaut, Qualitätskontrolle, Ausrichtung, Duplikatentfernung und BQSR unterzogen, um Konsistenz und Vergleichbarkeit bei nachfolgenden Leistungsbewertungen der Imputation sicherzustellen.

4. Genotypimputation

  1. Datenaufbereitung
    1. Aufbau von Imputationsdatensätzen: Erstellen Sie mehrere Evaluationsdatensätze, um systematisch Genotyp-Imputationswerkzeuge über verschiedene Tiefen und Stichprobengrößen hinweg zu benchmarken, wie unten beschrieben. Insgesamt werden neun Kombinationen basierend auf den oben genannten unterschiedlichen Stichprobengrößen und Sequenzierungstiefen gebildet. Die Eingabedateien bestehen aus den Sequenzierungsdaten BAM-Dateilisten (bamlist.txt) für die oben genannten neun Teilmengen nach Qualitätskontrolle, die in den entsprechenden bamlist.txt-Dateien gespeichert sind. Weitere Eingabedateien umfassen das menschliche Referenzgenom (GRCh3821) und die genetische Karte aus dem 1000 Genomes Project7.
      1. Herabgeschnittene hochintensiven WGS-Daten: Wählen Sie zufällig zwei Teilmengen (200 und 500 Stichproben) aus 500 Individuen mit 30-facher Tiefe aus. Nehmen Sie jede Teilmenge auf vier Tiefen herunter (1x, 0,5x, 0,1x und 0,05x), um acht experimentelle Bedingungen zu erzeugen.
      2. NIPT-basierter ULDS-Datensatz: Kombinieren Sie 10.000 ultra-niedrig-tiefe NIPT-Proben (durchschnittliche Tiefe ist 0,102x, Abbildung 2) mit 50 hochintensiven Proben, die auf 0,1x heruntergesat wurden.
    2. Spezifikation der Analyseregion: Beschränken Sie alle Analysen auf den Bereich Chromosom 1 (CHR1:150.500.000-160.500.000) (10 MB) mit einem 500-kb-Puffer für die Imputation, um eine direkte Vergleichbarkeit über Werkzeuge hinweg sicherzustellen.
    3. Auswahl des Referenzpanels: Verwenden Sie zwei Referenzpanels (Tabelle 1): das CCB-Panel, das aus chinesischen Bevölkerungsdaten zusammengestellt ist, und das 1KGP-EAS-Panel, das aus dem ostasiatischen Subset des 1000 Genomes Project abgeleitet ist.
      HINWEIS: Das CGB-Referenzpanel15 wurde mit hochdetaillierten (~15x) Ganzgenomsequenzierungsdaten von 9.964 chinesischen Erwachsenen in der China Kadoorie Biobank, einer großen prospektiven Kohortenstudie, erstellt. Diese Stichproben stammen aus einer natürlichen Population mit minimaler phänotypischer Verzerrung, homogener Han-chinesischer Abstammung und konsistenter Populationsstruktur, was sie besonders gut für die Genotyp-Imputation in chinesischen Kohorten geeignet macht. Yu et al. 15 zeigten, dass in einem GWAS mit realem Phänotyp für die Höhe die Imputation mit dem CGB-Panel die Anzahl der detektierten SNPs verdreifacht und die Anzahl der genomweiten signifikanten Varianten verdoppelte. Das 1000 Genomes Project (1KGP)7,26, die am weitesten verbreitete genomische Referenz, umfasst 585 Individuen in seiner ostasiatischen (EAS) Phase-3-Teilgruppe. Diese Teilmenge umfasst fünf ostasiatische Populationen, die eine Sequenzierungstiefe von etwa 30-fach aufweisen, darunter Han-Chinesen in Peking (CHB), Südliche Han-Chinesen (CHS), chinesische Dai in Xishuangbanna (CDX), Kinh in Ho-Chi-Minh-Stadt, Vietnam (KHV) und Japaner in Tokio (JPT).
  2. Imputationswerkzeuge
    1. Bewerten Sie drei Imputationsalgorithmen, die aufgrund ihrer unterschiedlichen Modellierungsstrategien und Anwendbarkeit auf Ultra-Low-Depth Sequencing (ULDS)-Daten ausgewählt wurden.
      1. STITCH: STITCH (v1.6.6) ist ein referenzfreier, haplotypbasierter Imputationsalgorithmus, der optional externe Referenzhaplotypen integrieren kann. Fügen Sie BAM-Listen und menschliches Referenzgenom (GRCh38) als Eingabedateien ein. Bereite Referenzpaneldateien (hap/legend/pos) bei der Durchführung referenzbasierter Imputation vor. Fügen Sie folgende Schlüsselparameter hinzu: Method=Diploid, Puffer=500 kb, K=10 ahnenHaplotypen und nGen=4x Stichprobengröße/K (wie in der STITCH-Dokumentation empfohlen). Erzeugen Sie Ausgabedateien mit Dosierungen pro SNP-Genotyp für alle Personen.
        HINWEIS: Laut der offiziellen STITCH-Dokumentation ist K die Anzahl der Ahnenhaplotypen im Modell. Ein größeres K verbessert die Imputationsgenauigkeit für größere Proben und höhere Abdeckungen, erhöht aber auch die Rechenzeit, und die Genauigkeit kann bei geringerer Abdeckung sinken.
      2. QUILT2: QUILT2 wendet einen bayesschen referenzgesteuerten Ansatz an, der für ULDS-Daten optimiert ist. Führen Sie die Vorbereitung des Referenzpanels mit dem bereitgestellten prepare_reference Skript durch, das die genetische Karte und die Regionskoordinaten angibt. Führe den Imputationsdiploiden Modus mit derselben Puffergröße (500 kb) und nGen-Einstellung wie STITCH aus, um die Vergleichbarkeit sicherzustellen.
      3. GLIMPSE2: GLIMPSE2 ist ein HMM-basiertes, referenzbasiertes Imputationswerkzeug, das für großflächige und sehr tiefgründige Sequenzierungsdatensätze entwickelt wurde. Führen Sie die Imputation mit GLIMPSE2_phase_static aus, wobei Eingabe-BAM-Liste, menschliches Referenz-VCF-Panel, genetische Karte, Eingaberegion = chr1:150.000.000-161.000.000, Ausgaberegion = chr1:150.500.000-160.500.000 (zur Aufrechterhaltung eines 500-kb-Puffers) angegeben wird. Die hier eingetragene BAM-Listendatei muss zwei Spalten enthalten: Eine ist der BAM-Pfad, die zweite ist der Beispielname. Wenn die zweite Spalte nicht eingegeben wird, wird jeder BAM-Dateiname als Beispielname in der ausgegebenen VCF-Datei verwendet.

5. Bewertung der Imputationsgenauigkeit

  1. Wahrheitsmengendefinition
    1. Wählen Sie 50 Personen aus, die in 30-facher Tiefe als Ground-Truth-Datensatz sequenziert sind. Beziehen Sie diese Proben in die experimentellen Downsampling-Bedingungen ein, um die Vergleichbarkeit sicherzustellen.
    2. Führen Sie Variantenaufrufe für die Wahrheitsmenge mit folgender Pipeline aus: SOAPnuke27 für QC, BWA für Ausrichtung, Picard für Duplikatmarkierung, GATK v4.0.4.0 BQSR und HaplotypeCaller für Variantenaufrufe, DPGT (https://github.com/BGI-flexlab/DPGT) für gemeinsame Aufrufe und BCFtools v1.1123 für Variantenqualitätsfilterung.
    3. Behalten Sie nur hochzuverlässige PASS-Varianten bei, um eine Benchmark-VCF-Datei zu generieren. Beschränken Sie die Auswertung auf chr1:150.500.000-160.500.000, was mit den imputierten Datensätzen übereinstimmt.
  2. Datenharmonisierung und Filterung
    1. Verarbeiten Sie imputierte VCF-Dateien von allen Werkzeugen mit PLINK2.028. Dosierungsdaten extrahieren und in das PG-Format umwandeln.
    2. Anwendung der SNP-Qualitätskontrolle mit folgenden Filtern: Kleinallelfrequenz (MAF) ≥ 0,05 (--maf 0,05), Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE) p-Wert ≥ 1e-6 (--hwe 1e-6), nur biallelische SNPs (--max-Allele 2).
    3. Exportvarianten, die QC zum Raw-Format übergeben, um nachgelagert zu vergleichen.
  3. Genauigkeitsmetriken
    1. Vergleichen Sie die zugeschriebenen Dosierungen mit den Ground-Truth-Dosierungen für jedes SNP. Berechnen Sie Pearson-Korrelationskoeffizienten (R) auf SNP-zu-SNP-Basis, behalten Sie nur Stellen beider Datensätze und berechnen Sie den Mittelwert der quadratischen Korrelationskoeffizienten (R²) über alle bewerteten SNPs, um die Gesamtgenauigkeit der Imputation für jede Bedingung zu quantifizieren.
    2. Verwenden Sie diese Genauigkeitsmetrik, um die Übereinstimmung der Genotyp-Dosierungsschätzungen zwischen zugeschlagenen und echten Genotypen zu erfassen.

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Ergebnisse

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Einfluss der Stichprobengröße auf die Imputationsgenauigkeit
Die Erhöhung der Stichprobengröße von N = 200 auf N = 500 verbesserte die Imputationsgenauigkeit von STITCH, insbesondere unter Bedingungen mit geringer Abdeckung. Zum Beispiel erreichte STITCH mit einer 1x-Abdeckung im CGB-Referenzpanel eine R2> von 0,916 (N=500) im Vergleich zu 0,882 (N=200), was einem Anstieg von 3,4 % entspricht (Abbildung 3

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Diskussion

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Diese Studie bewertete systematisch die Leistung von drei weit verbreiteten Genotyp-Imputationsinstrumenten für ULDS, wobei das Hochtiefen-WGS als Goldstandard diente. Eine zentrale methodologische Stärke liegt in der Einführung einer einheitlichen Vorverarbeitungspipeline – die Ausrichtung, Qualitätskontrolle und Rekalibrierung der Basisqualitätswerte umfasst –, die Batch-Effekte minimiert und Vergleichbarkeit über Werkzeuge und Bedingungen hinweg sicherstellt. Durch das Heruntersamplin...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

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Diese Studie wurde vom Shenzhen Medical Research Fund (B2404004), dem Nationalen Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm Chinas (2023YFC2605400, 2022YFC2502402), dem Shenzhen Science and Technology Program (SYSPG20241211173852024), dem Offenen Forschungsprojekt im Staatlichen Schlüssellabor für Gefäßhomöostase und -umgestaltung (Peking-Universität) (2025-SKLVHR-013) sowie dem Schlüsselbereichsforschungs- und Entwicklungsprogramm der Provinz Guangdong (2023B0303040001) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Daten
10.000 NIPT-Proben in niedriger TiefeDiese ZeitungUltra-Low-Depth-Ganzgenomsequenzierungsdaten, die als Imputationsbenchmark verwendet werden.
500 Hochtiefen-WGS-ProbenDiese Zeitung30& Mal; hochintensives WGS als Goldstandard/Wahrheitsset verwendet.
Referenzpanel
1KGP-EAS Referenzpanel1000 Genomes Projekt (Ostasien)Teilmenge von 1KGP für ostasiatische abstammungsspezifische Imputation.
CKB-ReferenzgremiumChina Kadoorie BiobankIndividuelles, populationsspezifisches Panel zur Genotypimputation.
Software und Algorithmen
BCFtools v1.11GitHub (samtools/bcftools)Verwendet zum Zusammenführen und Sortieren von Chromosomenergebnissen sowie zum Filtern von Varianten.
BQSR des GATK 4.0.4.0 ToolsetBroad InstituteVerwendet für die Rekalibrierung des Basisqualitätsscores (BQSR).
BWA-MEM .7.16a-r1181Heng Li / GitHubZum Ausrichten der Rohlesungen auf GRCh38.
DPGT (Distributed Population Genetics Tool)BGIEin verteiltes Analysewerkzeug für populationsgenetische Analysen, das das gemeinsame Aufrufen von Millionen von WGS-Proben ermöglichte. Verfügbar bei [GitHub - BGI-flexlab/DPGT](https://github.com/BGI-flexlab/DPGT)
fastp.0.23.4Open Source (Chen et al., 2018)Zur Qualitätskontrolle und zum Trimmen der Adapter.
GLIMPSE2Universität OxfordSchnelle Genotyp-Phasierung und -Imputation für WGS mit geringer Abdeckung
Ursprünglicher Code für AnalysenDiese ZeitungSupplementary File 1 Originalcode für Analysen
Picard-ToolkitBroad InstituteVerwendet zum Markieren von Duplikate und zur Umwandlung von Dateiformaten.
Plink 2.0C. Chang, S. Purcell / Broad InstituteFür die Genotyp-Formatkonvertierung und Assoziationsanalyse.
Python 3.8Python Software FoundationVerwendet für Skripting, Automatisierung und Datenanalyse.
QUILT2Oxford Big Data InstituteHMM-basierte Imputation mit externen Referenztafeln
R 4.1.3Die R-StiftungWird zum Ausführen von STITCH, QUILT2 und Plot/Statistik verwendet.
SAMtools v1.3GitHub (samtools/samtools)Zum Bearbeiten von SAM/BAM-Dateien.
Seqtk-1.5GitHub (lh3/seqtk)Toolkit zur Verarbeitung von Sequenzen in FASTA/Q-Formaten. Verfügbar bei [GitHub - lh3/seqtk](https://github.com/lh3/seqtk)
SOAPnukeBGIFür die Qualitätskontrolle und Filterung von NGS-Daten.
STITCH v1.6.6Universität OxfordImputationswerkzeug, optimiert für Ultra-Low-Coverage Sequenzierung
TabixGitHub (samtools/tabix)Verwendet zum Indexieren und Abfragen von bgzippeden VCF-Dateien.
Andere Materialien
GATK-BündeldateienGATKVerfügbar unter [https://github.com/gatk-workflows/gatk4-data-processing/blob/master/processing-for-variant-discovery-gatk4.hg38.wgs.inputs.json]
Genetische Karte für 1000G (GRCh38)Oxford / 1000 Genome ProjektErforderlich für Phasen-/Imputationswerkzeuge
GRCh38Genom-ReferenzkonsortiumVerwendet für Leseausrichtung und Variantenaufrufe

Referenzen

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