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Methodenartikel

Zirkulierendes Gliommodell für chimäre Antigenrezeptor-T-Zelltherapie-Untersuchungen

406 Ansichten

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DOI:

10.3791/68881

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17. Oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll etabliert ein zirkulierendes Gliommodell durch die laterale Ventrikelinjektion, um die therapeutische Wirkung der chimären Antigenrezeptor-T-Zelltherapie in vivo zu untersuchen.

Zusammenfassung

Zirkulierende Tumorzellen im Liquor cerebrospinalis (CSF) sind ein wesentlicher Faktor für das Tumorrezidiv und die intrakranielle Metastasierung bei Gliomen. Viele Studien versuchen, wirksame Strategien zu identifizieren, um den zirkulierenden Tumor im Liquor zu bekämpfen und zu eliminieren. Die T-Zell-Therapie mit chimären Antigenrezeptoren (CAR) wurde häufig bei verschiedenen zirkulierenden Tumoren eingesetzt. Die Forschung ist jedoch begrenzt, da es kein geeignetes Modell für zirkulierende Gliome gibt. Hier wurde ein zirkulierendes Gliommodell entwickelt und in CAR-T-Zelltherapie-Untersuchungen eingesetzt. Dieses Modell wurde unter Verwendung der lateralen Ventrikelinjektion konstruiert, die bei der lokalen Behandlung von intrakraniellen Erkrankungen weit verbreitet ist. Die Gliomzellen wurden in den lateralen Ventrikel injiziert, um den intrakraniellen Primärtumor zu bilden. Die Tumoren, die aus dem lateralen Ventrikel abgestoßen wurden, wurden verwendet, um den zirkulierenden Tumor im Liquor anzuzeigen. Das Modell ist einfach zu bauen und kann in verschiedenen Studien zur CAR-T-Zelltherapie des zirkulierenden Glioms angewendet werden. Als Ergebnis bietet das zirkulierende Gliommodell ein einzigartiges Gliommetastasenmodell für effektive CAR-T-Zelltherapie-Studien des zirkulierenden Tumors.

Einleitung

Das Gliom ist der häufigste primäre bösartige Hirntumor bei Erwachsenen 1,2. Aktuelle Behandlungen, einschließlich Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie, zeigen eine begrenzte Wirksamkeit mit einem medianen Überleben von nur 14-15 Monaten 3,4,5. Zirkulierende Gliomzellen im Liquor spielen eine entscheidende Rolle bei Tumorrezidiven und intrakraniellen Metastasen 6,7. Daher besteht ein dringender Bedarf, effektivere Behandlungsstrategien zu entwickeln, um die zirkulierenden Gliomzellen zu eliminieren.

Die neuere Forschung zu Gliomen hat sich hauptsächlich auf intrakranielle Primärtumoren konzentriert 8,9. Das wichtigste Problem, das in der Klinik angegangen werden muss, ist jedoch, wie die zirkulierenden Gliomzellen gezielt und eliminiert werden können. Daher müssen Studien zum zirkulierenden Gliom vor oder nach der Operation mehr Aufmerksamkeit erhalten. Die T-Zelltherapie mit chimären Antigenrezeptoren (CAR) ist die häufigste Strategie, die in Studien an zirkulierenden Tumorzellen angewendet wird10,11. Aufgrund der besonderen anatomischen Struktur intrakranieller Tumoren ist es jedoch schwierig, ein geeignetes zirkulierendes Gliommodell zu entwickeln, das für die Untersuchung des zirkulierenden Glioms 12,13,14,15,16 von entscheidender Bedeutung ist.

Diese Studie hat ein einzigartiges zirkulierendes Gliommodell auf der Grundlage der lateralen Ventrikelinjektion generiert. In diesem Modell werden die Gliomzellen in den lateralen Ventrikel injiziert, und der intrakranielle Primärtumor und der zirkulierende Tumor im Liquor werden durch in vivo biolumineszierende Bildgebung und Durchflusszytometrie an Tag 10 nachgewiesen. Die CAR-T-Therapie wurde eingeleitet, als die Tumorlast in den zirkulierenden Gliom-Modellmäusen etwa 6,5 × 105p/s erreichte. Die Tumorlast wurde alle 5 Tage überwacht, um die therapeutische Wirkung von CAR-T-Zellen zu beurteilen. Dieses Modell ahmt den Zustand der Abschuppung von Tumorzellen bei Gliompatienten nach und kann in verschiedenen Studien zu zirkulierenden Gliomen eingesetzt werden.

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Protokoll

Die Tierversuche in dieser Studie wurden alle vom Institutional Review Board und der Tierethikkommission der Nanjing Medical University (IACUC-1905048) genehmigt und überwacht. Für die vorliegende Studie wurden weibliche Mäuse im Alter von 6-8 Wochen verwendet. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

  1. Halten Sie die Mäuse in einer Barriere, 12 h/12 h Hell-Dunkel-Zyklus, Umgebungstemperatur von 24 °C und relative Luftfeuchtigkeit von 50 % Käfig.
  2. Wiegen Sie die Mäuse und betäuben Sie sie (gemäß institutionell anerkannten Protokollen) mit einer intraperitonealen Injektion von 50 mg/kg Pentobarbital-Natrium und 10 mg/kg Xylazin17.
    HINWEIS: Die Kombination von Pentobarbital-Natrium und Xylazin wird häufig in stereotaktischen Injektionsverfahren der Maus verwendet. Die richtige Anästhesie wurde durch das Fehlen einer Reaktion auf ein Zehenklemmen bestätigt, was sicherstellte, dass das Tier vor der Operation völlig bewusstlos war. Um Trockenheit und Schädigung der Hornhaut zu verhindern, wurde während der Anästhesie eine tierärztliche Augensalbe auf die Augen aufgetragen.
  3. Entfernen Sie die Haare auf dem Kopf einer Maus mit einem Versuchstierrasierer und befestigen Sie den Kopf und die Gliedmaßen der Maus auf dem stereotaktischen Apparat.
  4. Sterilisieren Sie den Kopf der Maus mit dem Iodophor mit einem Wattestäbchen und bedecken Sie den Rest des Körpers der Maus mit dem sterilen chirurgischen Handtuch.
  5. Schneiden Sie die Kopfhaut mit einem Skalpell etwa 1 cm entlang der Mittellinie auf der Oberseite der rechten Stirn ein.
    HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente sollten vor dem Gebrauch ordnungsgemäß sterilisiert werden, um Infektionen zu vermeiden. Es sollte darauf geachtet werden, die Instrumente mit Vorsicht zu handhaben, um Verletzungen zu vermeiden, und alle Eingriffe sollten in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden.
  6. Passen Sie den Nasenclip und den Ohrstab an und achten Sie darauf, dass der Höhenunterschied der Z-Achse zwischen der Lambda-Naht und dem Bregma kleiner oder gleich 0,05 mm ist.

2. Aufbau des zirkulierenden Gliommodells

  1. Markieren Sie den Punkt 1,5 mm zur rechten Seite der Mittellinie und 1,1 mm zur hinteren Seite des Bregmas mit einem Wattestäbchen, das in Enzianviolett getaucht ist (Koordinaten: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm von Bregma).
  2. Bohren Sie mit einem Miniatur-Schädelbohrer mit einem Durchmesser von 0,5 mm Löcher an den Zielkoordinaten, um die Dura mater freizulegen.
  3. Mit Kochsalzlösung abspülen, um Knochenreste zu entfernen.
  4. 5 μl Tumorzellsuspension mit einer Mikrospritze mit tiefenbegrenzendem Stopfen (GL261-Luc-Gfp, 1×105 Zellen/μl in PBS mit 0,1 % BSA) aufziehen.
  5. Führen Sie die Nadel mit einer Geschwindigkeit von 0,2 mm/s bis zu einer Tiefe von 3,0 mm ein, drehen Sie die Nadel um 0,5 mm zurück und halten Sie 10 s lang inne, um den Gewebedruck zu stabilisieren.
  6. Injizieren Sie die Zellen mit einer kalibrierten Mikroinjektionspumpe mit einer Verweildauer von 10 Minuten nach der Injektion, um den Rückfluss zu minimieren.
  7. Ziehen Sie die Mikrospritze langsam heraus und üben Sie mit einem sterilen Wattestäbchen 30-60 s lang Druck auf die Injektionsstelle aus.
  8. Vernähen Sie die Kopfhaut mit resorbierbarem chirurgischem Nahtmaterial (6-0) und desinfizieren Sie den Schnitt erneut mit Iodophor.
  9. Legen Sie die Maus zum Aufwärmen auf ein präzisionsgesteuertes 37 °C-Heizkissen und überwachen Sie den Gesundheitszustand.
  10. Bringen Sie die Maus wieder in einen sauberen Käfig, nachdem Sie einen anhaltenden Aufrichtreflex und eine spontane Fortbewegung gezeigt haben.
  11. Stellen Sie die Maus mit einem in vivo biolumineszierenden Bildgebungssystem (IVIS Spectrum) dar, um den transplantierten Tumor am 10. Tag nach der Tumorgeburt zu erkennen.
  12. Injizieren Sie der Maus intraperitoneal D-Luciferin-Kaliumsalz (150 mg/kg).
    HINWEIS:D-Luciferin-Kaliumsalz mit sterilem D-PBS verdünnen.
  13. Induzieren Sie während der 10-minütigen Wartezeit eine Anästhesie mit 2 % Isofluran in 1 L/min O2.
    HINWEIS: Isofluran sollte in einer belüfteten Chemikalienhaube verwendet werden, um die Exposition gegenüber Anästhesiedämpfen zu minimieren. Damit soll die Sicherheit sowohl der Tiere als auch der Forscher während des Eingriffs gewährleistet werden.
  14. Halten Sie die Anästhesie bei 1,5 % Isofluran über den Nasenkonus aufrecht.
  15. Führen Sie biolumineszierende Bildgebung mit dem IVIS-Spektrum durch.
  16. Führen Sie eine Liquorentnahme durch, indem Sie die zerebellomedulläre Zisterne in der Maus punktieren.
    HINWEIS:Der Liquor wurde bei Mäusen unter Isofluran-Anästhesie durch Punktion der zerebellomedullären Zisterne entnommen. Alle Eingriffe, einschließlich Anästhesie, chirurgischer Exposition und Probenentnahme, wurden unter SPF-Bedingungen durchgeführt, um das Kontaminations- und Infektionsrisiko zu minimieren. Die Mäuse wurden in Bauchlage auf einen stereotaktischen Rahmen gelegt, und die Cisterna magna wurde sorgfältig unter einem Präpariermikroskop belichtet. Eine 27 G Hamilton Spritzennadel wurde verwendet, um die Zisterne zu punktieren und Liquor in einer Freihandtechnik zu sammeln. Von jeder Maus wurden etwa 5-10 μl klarer Liquor gewonnen. Um das Infektionsrisiko weiter zu verringern, wurde das Operationsfeld vor der Punktion mit Iodophor sterilisiert und alle chirurgischen Instrumente autoklaviert. Nach der Liquorentnahme wurde die Einstichstelle vorsichtig mit steriler Watte zusammengedrückt, um ein Austreten von Flüssigkeit zu verhindern. Die Mäuse wurden dann auf ein Wärmekissen gelegt und kontinuierlich überwacht, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hatten. Postoperative Analgetika wurden verabreicht, um die Beschwerden zu lindern. Die Tiere wurden täglich an mindestens drei aufeinanderfolgenden Tagen beobachtet, um sicherzustellen, dass keine neurologischen Symptome oder Anzeichen einer Infektion auftraten.
  17. Führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um Tumorzellen im Liquor nachzuweisen. Die GFP+- Population repräsentiert Tumorzellen.
    HINWEIS: Die murine Gliom-Zelllinie GL261 wurde entwickelt, um die Luciferase (Luc) zu tragen. Wenn der Fluoreszenzwert ~5 erreicht × 105p/sand Tumorzellen im Liquor nachgewiesen werden, ist das Verfahren erfolgreich. Die verwendete Bildgebungssoftware war Living Image 4.5.2, und die Bildgebungsparameter wurden auf Lumineszierend eingestellt.
  18. Wählen Sie die Mäuse mit erfolgreicher Tumorbildung aus, um die therapeutische Wirksamkeit der CAR-T-Zellen zu bewerten.

3. Behandlung des zirkulierenden Glioms durch Injektion von CAR-T-Zellen in den Seitenventrikel

  1. Wenn die Tumorgröße in den zirkulierenden Gliom-Modellmäusen ~6,5 × 105 p/s beträgt, wählen Sie diese Mäuse für die CAR-T-Behandlung aus.
  2. Wiegen Sie die zirkulierenden Gliom-Modellmäuse und betäuben Sie die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von 50 mg/kg Pentobarbital-Natrium und 50 mg/kg Xylazin.
  3. Wiederholen Sie den Vorgang der Schritte 1.3-1.5.
  4. Trennen Sie die Kopfhaut und den Schädel und lokalisieren Sie genau das Bohrloch, das bei der Konstruktion des zirkulierenden Gliommodells gemacht wurde, und befolgen Sie das in den Schritten 2.2-2.3 beschriebene Verfahren.
  5. Aspirieren Sie 10 μl CAR-T-Zellsuspension mit einer Mikrospritze, führen Sie die Nadel vorsichtig in den Seitenventrikel der Maus ein, stellen Sie die Injektionstiefe mit dem stereotaktischen Gerät ein und verabreichen Sie langsam die CAR-T-Zelllösung.
    HINWEIS: In Übereinstimmung mit der Injektion von GL261-Zellen wurden CAR-T-Zellen mit einer Injektionstiefe von 2,5 mm in den rechten lateralen Ventrikel (Koordinaten: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm vom Bregma) injiziert.Die Kontrollgruppe wurde mit PBS- anstelle von CAR-T-Zellen behandelt.
  6. Halten Sie die Nadel 10 Minuten lang gedrückt, entfernen Sie dann langsam die Nadel und drücken Sie leicht mit steriler Gaze auf die Injektionsstelle, um Blutungen nach Abschluss der Injektion zu vermeiden. Vernähen Sie die Kopfhaut mit resorbierbarem chirurgischem Nahtmaterial (6-0) und desinfizieren Sie den Schnitt.
  7. Legen Sie die Maus zum Aufwärmen auf ein präzisionsgesteuertes 37 °C-Heizkissen und überwachen Sie den Gesundheitszustand.
  8. Bringen Sie die Maus wieder in einen sauberen Käfig, nachdem Sie einen anhaltenden Aufrichtreflex und eine spontane Fortbewegung gezeigt haben.
  9. Führen Sie in vivo biolumineszierende Bildgebung durch, um das Wachstum von Tumoren bei Mäusen zu überwachen. Die optische Bildgebung ermöglicht die Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit von CAR-T-Zellen.
  10. Wiegen Sie die Mäuse jeden zweiten Tag und führen Sie alle 5 Tage eine BLI-Bildgebung durch, um das Tumorwachstum genauer zu verfolgen, bis der terminale Endpunkt erreicht ist.
  11. Euthanasieren Sie die Maus und fixieren Sie das Hirngewebe für 24-48 h in 4% Paraformaldehyd.
  12. Betten Sie das Gewebe in Paraffin ein und schneiden Sie es in 5 μm dicke Scheiben.
  13. Entparaffinieren Sie die Abschnitte, rehydrieren Sie sie durch abgestufte Alkohole, färben Sie sie mit Hämatoxylin, färben Sie sie mit Eosin und befestigen Sie die Abschnitte mit einem Deckglas.
    HINWEIS: In der vorliegenden Studie war der terminale Endpunkt Tag 30, und die Mäuse wurden durch eine Überdosis Pentobarbital-Natrium mit einer intraperitonealen Injektion euthanasiert. Die Mäusekadaver wurden dem Medical Experimental Animal Center der Nanjing Medical University zur Entsorgung übergeben. Weggeworfene Nadeln wurden in einen Behälter für scharfe Gegenstände gelegt und zur zentralen Entsorgung an die Abteilung für Labor- und Gerätemanagement der Medizinischen Universität Nanjing übergeben.

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Ergebnisse

Die schematische Darstellung des zirkulierenden Gliommodells für die CAR-T-Therapie ist in Abbildung 1 dargestellt. CAR-T-Zellen wurden mit einer Mikrospritze in den Seitenventrikel injiziert, um ihre therapeutische Wirkung zu demonstrieren. Diese Methode ermöglicht die direkte Abgabe der CAR-T-Zellen an das Gehirn und zielt dabei auf die zirkulierenden Gliomzellen ab. Das Injektionsverfahren wurde am 11. Tag nach der Implantation von GL261-Zellen in den Seit...

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Diskussion

Das in dieser Studie etablierte zirkulierende Gliommodell mittels lateraler Ventrikelinjektion stellt einen signifikanten Fortschritt dar und bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Modellen. Die Technik der lateralen Ventrikelinjektion ist hochgradig reproduzierbar und ermöglicht eine konsistente Tumormodellierung in einem relativ kurzen Zeitrahmen. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Forscher, die die Ausbreitung von Tumorzellen in den Liquor untersuchen und die Wirksa...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (82230059) und dem Jiangsu Provincial Key Research Development Program of China (BE2022770) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Resorbierbares chirurgisches NahtmaterialVerifizierter Lieferant - Shanghai Pudong Jinhuan Medizinische Produkte Co., LtdNr. R611
CAR-TKreative Biolabore
D-Luciferin-KaliumsalzMCEHY-12591B
GL261-LUC-GFPVerifizierter Lieferant - Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.ZQ0932
In-vivo-Biolumineszenz-BildgebungssystemTanonTanon ABL X6
Rasierer für LabortiereBeyotime BiotechnologieFS600
MäuseAnimal Core Facility der Medizinischen Universität Nanjing
MikroinjektionspumpeRWDNr. R462
MikrospritzeHamilton87943
Mini-SchädelbohrerRWD78001
Pentobarbital-Natrium ChemSrc57-33-0
Stereotaktische ApparaturRWD68043
XylazinChemSrc7361-61-7

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

CAR T ZelltherapieLiquor TumorGliommetastaseInjektion in den Seitenventrikelintrakranieller TumorTumorrezidivzirkulierende Tumorzellenintrakranielle Metastase
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