Methodenartikel

Aufschluss über die elektromechanische Steuerung der Gewebehomöostase mit einem zweischichtigen mikrofluidischen Gerät

DOI:

10.3791/68894

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19. September 2025

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1School of Life Sciences, Westlake University, 2Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4Research Center for Industries of the Future, Westlake University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Herstellung eines einzigartigen zweischichtigen mikrofluidischen Geräts vor, um die elektromechanische Regulation der Homöostase des Epithelgewebes zu untersuchen. Das Gerät legt statische physiologische elektrische Ströme senkrecht zur Gewebeebene an, die die Zell-Zell-Adhäsion, Proliferation und Extrusion beeinflussen. Lebendzell-Imaging und mechanische Stressmessungen enthüllen die Mechanismen dieser Prozesse.

Zusammenfassung

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Das Zellverhalten und das Zellschicksal werden durch elektrische Ströme oder Felder beeinflusst, die endogen oder extern angelegt sind. Statische elektrische Signale können in kundenspezifischen mikrofluidischen Geräten angewendet werden, um die elektrische Umgebung in langsamen physiologischen Prozessen wie Entwicklung, Wundheilung und Homöostase nachzuahmen. Eine wichtige Klasse zellulärer elektrischer Studien ist die Kontrolle der Zellmigration durch statische galvanische Ströme in der Ebene in einfachen mikrofluidischen Kanälen, die gewickelte Ströme nachahmen, mit Stromdichten von ~0,1-1000 A/m2. Aufgrund der inkompatiblen Geometrie sind diese Geräte jedoch nicht geeignet, um elektrische Effekte in der Gewebehomöostase zu untersuchen, bei der die Zellen eine apiko-basale Polarität und eine transepitheliale Potentialdifferenz (TEPD) annehmen. Hier beschreiben wir ein einzigartiges mikrofluidikbasiertes Gerät, das physiologische Ionenströme senkrecht zur Ebene der konfluenten Epithelzellschichten anwendet, um die TEPD zu stören und die elektrische Regulation der stationären Zustände des Gewebes zu untersuchen. Der Aufbau besteht aus einem zweischichtigen, UV-härtenden Polymer, das in ein weiches Polyacrylamid-Gelsubstrat eingebettet ist, das mit einem extrazellulären Matrixprotein der Wahl beschichtet ist. Dieses mikrofluidische Gerät bietet die richtige Geometrie und das durchlässige Substrat, um einen relativ gleichmäßigen Ionenstrom über die Zellschichten im Zentimetermaßstab zu induzieren. Der Aufbau ist kompatibel mit konfokaler Lebendzell-Bildgebung und Traktionskraftmikroskopie, um auf mechanische Spannungen zu schließen, die durch die transepithelialen Ströme induziert werden. Auffällig ist, dass die Proliferation, Extrusion und Migration von Zellen innerhalb des konfluenten Epithels in Abhängigkeit von der Richtung des Ionenstroms kollektiv beeinflusst werden, wodurch ein neuer Gewebezustand induziert wird, der durch unterschiedliche Zell-Zell-Interaktionsstärken, Zellereignisse (Tod und Proliferation) und Gewebestrukturen gekennzeichnet ist. Das elektrisch gesteuerte Zellverhalten kann als elektrisch induzierte mechanische Stress- und Zellantwort verstanden werden. Dieses neuartige mikrofluidische Gerät und Protokoll bieten das Werkzeug und die Dokumentation, die für die Mechanobiologie und das Bioengineering erforderlich sind, um elektrische Effekte in der Gewebehomöostase zu untersuchen und neuartige Tissue-Engineering-Anwendungen zu entwickeln.

Einleitung

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Bioelektrische Signale sind wichtige biophysikalische Faktoren, die zur Steuerung des Zellverhaltens beitragen. Das bekannteste Beispiel ist das Aktionspotential in Neuronen und Herzzellen, die elektrische Signale über weite Strecken (bis zu einem Meter) und bei hohen Frequenzen (bis zu Hunderten von Hertz) übertragen1. Elektrische Impulse, die mit Elektroden angelegt werden, können zur Stimulierung des Auslösepotentials verwendet werden und sind in der Forschung und in medizinischen Anwendungen nützlich2. Endogene bioelektrische Signale in langsamen physiologischen Prozessen wie Entwicklung, Wundheilung und Homöostase 3,4,5,6,7,8 wurden ebenfalls gemessen 9,10 über Zeiträume von Stunden bis Tagen. Ein wichtiges Beispiel sind konfluente Epithelschichten, die aktiv eine transepitheliale Potentialdifferenz (TEPD) von wenigen bis zu mehreren zehn Millivolt aufrechterhalten 4,11. Ein Schnitt oder eine Wunde in diesen konfluenten Schichten erzeugt einen Kurzschlussstrom, der durch die elektrische Aktivität des Gewebesangetrieben wird 12,13. Mit verschiedenen Techniken wurden gewickelte Ströme bis zu mehreren zehn μA/cm2 und elektrische Felder bis zu Hunderten von mV/mm beschrieben. Studien deuten darauf hin, dass diese elektrischen Signale einen Richtungshinweis für Zellen erzeugen, in Richtung Wund- oder Infektionsstellen zu wandern, der für den Heilungsprozess wichtig ist 3,6,14. Im Allgemeinen sind sowohl statische (oder langsam variierende) als auch schnell variierende elektrische Signale wichtig und lösen unterschiedliche Zell- oder Gewebereaktionen aus.

Im Bereich der langsam variierenden Signale ist ein wichtiges Phänomen der elektrisch angetriebene Migrationsprozess, der als "Galvanotaxis" bezeichnet wird. Kontrollierte galvanische Ströme in der Ebene können in mikrofluidischen Bauelementen mit einfachen Kanälen angewendet werden, um die gewickelten Ströme nachzuahmen, während die Zellmigration in Abhängigkeit von der Stromdichte untersucht wird15,16. Es wurde festgestellt, dass elektrische Felder von 0,1-1000 V/m (entsprechende Stromdichte von 0,1-1000 A/m2) die Zellmigration in vielen Zelltypen in diesem In-vitro-Setting antreiben17, während Signalwege, die für die Chemotaxis (Zellmigration, die von chemischen Gradienten geleitet wird), wie PI3K, an der Galvanotaxis beteiligt sind 7,18. "Bare-bones"-Mikrofluidikgeräte für die Galvanotaxis-Untersuchung können mit Standard-Weichlithographie- und Mikrofabrikationstechnikenhergestellt werden 19. Diese Bauelemente bestehen typischerweise aus einem Einkanal-Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substrat, das mit einem Glasobjektträger verbunden ist (Kanalquerschnittsgröße: Hunderte von Mikrometern, Länge: Zentimeter). Elektroden, die zur Versorgung des statischen Stroms verwendet werden, werden weit entfernt vom Zellbereich installiert und mit oder ohne Salzbrücken verbunden. Die Salzbrückenverbindung kann durch Stanzen von Löchern durch das PDMS-Substrat, mikrofluidische Verbindungen und mit Agar gefüllte Schläuche hergestellt werden. Der einfache Glasobjektträger (typischerweise 170 μm dick) unter dem Kanal unterstützt auch die hochauflösende Bildgebung lebender Zellen während der Galvanotaxis-Experimente, was ein entscheidendes Merkmal für die Untersuchung des Prozesses ist.

Die Rolle endogener elektrischer Signale bei der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase ist viel weniger verstanden als die bei der Wundheilung. Ein wichtiger Grund ist der Mangel an geeigneten Instrumenten, um diese Effekte in intaktem Gewebe zu untersuchen. Das mikrofluidische Gerät für die Galvanotaxis ist aufgrund seiner Geometrie, die nur elektrische Ströme in der Ebene unterstützt, für diesen Zweck nicht geeignet. Im Zusammenhang mit der epithelialen Homöostase wird ein neues Gerät benötigt, um die TEPD- oder Out-of-Plane-Ströme in einer konfluenten Epithelschicht zu kontrollieren und zu stören. Um das Ziel zu erreichen, eine relativ gleichmäßige Ionenstromdichte über eine Monoschicht anzuwenden, haben wir ein mikrofluidisches Gerät mit Innovationen in Bezug auf die Gerätegeometrie, den Materialverbrauch und die biomechanischen In-situ-Messmöglichkeiten entwickelt und hergestellt4. Letzteres ist wichtig, da elektrische Effekte das Zellverhalten durch Kopplung mit biomechanischen und mechanobiologischen Signalwegen beeinflussen können, die mit dieser Funktion untersucht werden können.

Dieses neue Gerät weist mehrere innovative Funktionen auf. Es besteht aus zwei Schichten anstelle des einen Kanals, der bei den Galvanotaxis-Geräten zu finden ist (Innovation in der Geometrie), wobei die Verbindung zu den Elektrodenkammern ähnlich wie in den letzteren beibehalten wird. Die erste mikrofluidische Schicht hat Kanäle, um Ionenströme in die Geweberegion (oder von ihr weg) zu leiten, während die zweite Schicht eine Öffnung hat, die diesen Strom senkrecht über das Epithel leitet, das auf dieser zweiten mikrofluidischen Schicht sitzt (Abbildung 1A, B). Mikrofabrikationstechniken werden eingesetzt, um ausreichend dünne Schichten herzustellen, so dass trotz der Stapelung der mikrofluidischen Schichten, die die Probendicke erhöht, eine hochauflösende konfokale Bildgebung möglich ist. Für die anderen wichtigen Innovationen ist ein synthetisches Hydrogel aus Polyacrylamid (PA) in die Mitte des Geräts eingearbeitet, das eine entscheidende Rolle spielt (Abbildung 1A,B). Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieses Gels, wie z. B. die verfügbare Chemie zur Beschichtung extrazellulärer Matrixproteine, die Permeabilität für Ionen sowie die bekannte Elastizität, sind jeweils wesentlich für die Zelladhäsion und das Zellwachstum, die Anwendung von Strömen außerhalb der Ebene und die Messung der mechanischen Belastung20 während der elektrischen Stimulation. Barrierestrukturen werden in Schicht 1 des Gewebebereichs eingebaut, um die PA-Gel-Vorläuferlösung einzuschließen, wie dies in früheren mikrofluidischen Geräten21 geschehen ist (Abbildung 1A, B). Zu guter Letzt wird ein anderes Material22 für die Herstellung der Vorrichtung verwendet, da die PA-Gelpolymerisation an PDMS-Oberflächen, die für Sauerstoffgas durchlässig sind, sauerstoffgehemmt ist, das eine Polymerisation und eine dichte Bindung von PA-Gel ermöglichen kann. All die innovativen Funktionen sind entscheidend für das Funktionieren des neuen Geräts.

Insgesamt wird die eingehende Untersuchung statischer oder langsam variierender bioelektrischer Signale in der Homöostase intakter Gewebe mit diesem neuen Gerät ermöglicht, dessen Protokoll im Folgenden detailliert beschrieben wird. Das Protokoll und die Ergebnisse, auf die hier Bezug genommen wird, konzentrieren sich auf die Epithelzelllinie Madin Darby Canine Kidney II (MDCK II), einschließlich der Zellereignisse (Proliferation, Tod, Extrusion und Migration) und strukturellen Veränderungen des Gewebes, die durch den elektrischen Strom induziert werden. Diese Studien sind auch lehrreich für Forscher, die daran interessiert sind, diese Technik anzuwenden, um die elektrische Regulation des Epitheltransports und die Induktion von Zellereignissen und Änderungen des Zellschicksals in Zellschichten und komplexeren Systemen wie Primärzellen und 2D-Organoiden zu untersuchen.

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Protokoll

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HINWEIS: Dieses Protokoll enthält Schritte zur Konstruktion eines Aufbaus, der statische elektrische Ströme anlegt und die TEPD konfluenter Epithelien stört, und zur Untersuchung seiner Auswirkungen durch Lebendzellbildgebung und mechanobiologische Techniken (Abbildung 1). Der Aufbau besteht aus Vorrichtungen aus mikrofluidischen Chips, die mit Kartuschen, Einsätzen und Halterungen verbunden sind, um mehrere Geräte für Multiplex-Experimente an einem Mikroskop unterzubringen, einem Paar Elektrodenkammern, die mit einem Quellenmessgerät und Geräten verbunden sind, und einem Deckel der Lebendzellkammer für die Aufrechterhaltung ordnungsgemäßer Lebendzellbedingungen (Abbildung 1C). Die Konstruktionsprinzipien und CAD-Dateizeichnungen der Cartridge und anderer wichtiger Komponenten des Setups finden Sie in der Zusatzdatei 1. Die Schritte umfassen: 1) PDMS-Softlithographie; 2) Chipherstellung und Gerätemontage; 3) Abschluss der Einrichtung; und 4) Monolayer-Wachstum und Experimente mit lebenden Zellen. Detaillierte Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Materialien finden Sie in der Materialtabelle.

1. PDMS-Softlithographie

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Herstellung von PDMS-Elastomeren aus SU-8-Wafern (Abbildung 2A, B) beschrieben, um UV-härtende klebstoffbasierte Schichten des mikrofluidischen Chips zu formen.

  1. PDMS-Softlithographie
    1. Herstellung eines separaten SU-8-basierten Wafers für jede mikrofluidische Schicht, Schicht 1 und 2, unter Verwendung von Photolithographietechniken (Ergänzende Datei 2 und Ergänzende Datei 3).
      HINWEIS: Die Herstellung von Wafern kann einen Monat dauern, wenn eine Anfrage an eine Mikrofabrikations-/Reinraumeinrichtung gesendet wird. Die Siliziumätztechnik für die Waferherstellung kann ebenfalls verwendet werden.
    2. Silanisieren des Siliziumwafers, um das Entformen von PDMSzu ermöglichen 19.
      1. Reinigen Sie den Wafer mit einer unter Druck stehenden Stickstoff-Luftblaspistole. Die Oberfläche des Wafers wird durch Anwendung eines kurzen Sauerstoffplasmaprozesses (30 s, 30 W in 20 sccm O2 -Gasströmung bei einem Reaktordruck von 1-3 mbar) aktiviert23.
      2. 200 μl Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichlorsilan in einer sauberen Kunststoffkappe (Durchmesser 60 mm, Höhe 15 mm) pipettieren. Setzen Sie die Kappe neben dem Wafer in den Vakuum-Exsikkator (nur zur Silanisierung). Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und warten Sie 1-2 Stunden, während sich das verdampfte Silan als Monoschicht auf dem Siliziumwafer ablagert.
        ACHTUNG: Silan ist ätzend und giftig. Tragen Sie Handschuhe und eine Schutzbrille und arbeiten Sie in einem Abzug, um einen sicheren Betrieb zu gewährleisten.
        HINWEIS: Ein neu silanisierter Wafer kann zur Herstellung von 10-20 Stück PDMS-Formen verwendet werden. Die Vakuumzeit hängt vom Zustand der Vakuumpumpe ab. Eine übermäßige Silanisierung führt zu einer ungleichmäßigen Dicke und führt zu einem trüben Erscheinungsbild, das es zu vermeiden gilt. Lagern Sie den Wafer bei Nichtgebrauch in feuchtigkeitskontrollierten Kammern. Die PDMS-Strukturen, die aus neuen Wafern hergestellt werden, können mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM) überprüft werden.
    3. Ausreichend basisches PDMS-Harz und Vernetzungsmittel in einer Petrischale (Durchmesser 150 mm, Höhe 25 mm) einige Minuten lang gründlich (b:w = 10:1 und 70-80 g) mischen. Stellen Sie sicher, dass sich gleichmäßig kleine Bläschen in der Mischung bilden, was eine gute Mischung bestätigt. Füllen Sie die Mischung in 50 mL Zentrifugenröhrchen um und zentrifugieren Sie sie bei 550 x g für 3 min, um Luftblasen gründlich zu entfernen.
      HINWEIS: PDMS-Flüssigkeit ist klebrig und schwer zu reinigen; Seien Sie vorsichtig beim Einschenken. Reinigen Sie mit Isopropanol, wenn die Tischoberflächen durch verschüttetes PDMS-Gemisch verunreinigt sind.
    4. Gießen Sie die PDMS-Mischung vorsichtig in eine Kunststoff- oder Glasschale (Durchmesser 150 mm, Höhe 25 mm) mit flachem Boden auf den Wafer und drücken Sie dann den Wafer nach unten, um PDMS von der Unterseite des Wafers zu entfernen. Entgasen Sie das Gemisch mit einer Vakuumpumpe.
      HINWEIS: Das Spülen von flüssigem PDMS von der Unterseite des Wafers ist wichtig. Eine dicke PDMS-Schicht an der Unterseite erschwert das Entfernen des Wafers aus der Kunststoffschale, wodurch die Wahrscheinlichkeit steigt, dass der Wafer zerbricht. Alternativ kann man das PDMS entlang der Kante des Wafers schneiden und den Wafer in der Petrischale halten. Stellen Sie eine PDMS-Dicke von ca. 1,5 mm für Schicht 1 sicher, um die Flexibilität der Form in späteren Fertigungsschritten zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die PDMS-Dicke für Schicht 2 etwa 2,5 mm beträgt, um die Wahrscheinlichkeit eines Durchhängens in späteren Fertigungsschritten zu verringern. Die PDMS-Dicke wird mit einem Lineal gemessen, nachdem die PDMS-Formen in die gewünschten Formen geschnitten wurden.
    5. Härten Sie das PDMS 2 h lang bei 80 °C im Ofen aus und stellen Sie sicher, dass die Form während des Prozesses so horizontal wie möglich aufgestellt wird. Lassen Sie die PDMS-Form und den Wafer auf Raumtemperatur abkühlen. Entfernen Sie die PDMS-Form vorsichtig mit einer scharfen chirurgischen Klinge und einer gepolsterten Pinzette vollständig vom Wafer.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Oberfläche des Wafers nicht zu zerkratzen. Prüfen Sie, ob sich PDMS-Reste auf der Waferoberfläche bilden, wenn PDMS abgezogen wird. Dies signalisiert, dass die Waferoberfläche wieder silanisiert werden soll.
    6. Schneiden Sie die PDMS-Form in Blöcke, die die gewünschten Merkmale enthalten, und lagern Sie diese Blöcke in sauberen Petrischalen (Durchmesser 150 mm, Höhe 25 mm) oder in einer Vakuumkammer, wenn sie nicht verwendet werden. Manipulieren Sie die PDMS-Form, ohne die wesentlichen Merkmale zu berühren.

2. Chipherstellung und Gerätemontage

HINWEIS: Verwenden Sie ein niedrigviskoses, UV-härtendes Polymer (maximaler UV-Absorptionsbereich 350-380 nm), um den mikrofluidischen Chip durch PDMS-Formgebung herzustellen. Der UV-härtende Klebstoff ermöglicht die Integration von Polyacrylamid (PA)-Hydrogel als transparentes, ionendurchlässiges und elastisches Zellsubstrat. Die Eigenschaften des PA-Gels sprechen dafür, dass es sich um einen mechanischen Stresssensor handelt, der die Bildgebung von lebenden Zellen und die Stimulation des statischen Stroms ermöglicht. Der Chip wird schließlich an einer Kartusche befestigt, in der sich das Kulturmedium befindet und die mit den Elektrodenkammern verbunden ist.

  1. Vorbereitung des Glasdeckglasbodens
    1. Ritzen Sie die erforderliche Menge an rechteckigen Glasdeckgläsern (170 μm) mit einem Diamantschneider auf eine Größe von 37 × 24 mm2 ein, um sie an die Patronenabmessungen anzupassen (Zusatzdatei 4).
      HINWEIS: Der Deckglas hat eine Dicke von 170 μm, die mit hochauflösender Bildgebung kompatibel ist, ist jedoch zerbrechlich und erfordert eine sorgfältige Handhabung. Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz. Entsorgen Sie die rechteckigen Glasdeckgläser sofort, wenn sichtbare Risse auftreten, da Späne von diesen rechteckigen Glasdeckgläsern eine Auslaufgefahr darstellen können. Alternativ können Sie Deckgläser in der richtigen Größe bei den Herstellern von Deckgläsern bestellen. Vermeiden Sie es, die Oberflächen von rechteckigen Glasdeckgläsern mit bloßen Händen zu berühren und Flecken zu hinterlassen, die die Bildqualität beeinträchtigen können.
    2. Legen Sie die rechteckigen Deckgläser ohne Überlappung in eine saubere Petrischale und überführen Sie sie in eine Plasmakammer. Einen Vakuumzustand herbeiführen, aber zum Schluss etwas Luft einlassen. Aktivieren Sie die Oberflächen der rechteckigen Glasdeckgläser mit Luftplasma (30 s bis 5 min, 29,6 W, je nach Gerätezustand)
      HINWEIS: Im folgenden Schritt (Schritt 2.1.3) sollten nur die Seiten verwendet werden, die vollständig dem Plasma ausgesetzt sind (d. h. die oberen Flächen). Schritt 2.1.3 innerhalb von 30 Minuten nach der Plasmaexposition abschließen. Die Kammer sollte zu diesem Zeitpunkt rosa-violett erscheinen, wenn Luftplasma erzeugt wurde. Wenn die letztgenannten Bonding-Schritte erfolgreich sind, reduzieren Sie die Plasmadauer der Einfachheit halber.
    3. Bereiten Sie 10 ml Oberflächenbehandlungslösung aus 0,3 % Essigsäure und 0,5 % 3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylat vor, gelöst in 100 % Ethanol. Behandeln Sie rechteckige Glasdeckgläser mit dieser Lösung in einer Petrischale (Durchmesser 150 mm, Höhe 25 mm) für 5 min auf einem Schüttler, um eine gute Haftung mit UV-härtenden mikrofluidischen Schichten auf Klebstoffbasis zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass die rechteckigen Glasdeckgläser vollständig in die Lösung eingetaucht sind und beide Seiten behandelt sind.
      ACHTUNG: Die Lösung zur Oberflächenbehandlung ist korrosiv. Fassen Sie es in einem Abzug.
    4. Spülen Sie rechteckige Glasdeckgläser dreimal mit 100 % Ethanol aus, ohne sie während des Prozesses trocknen zu lassen. Trocknen Sie rechteckige Glasdeckgläser nacheinander mit Stickstoffgas und einer Blaspistole. Sorgen Sie für eine ausreichende Blasgeschwindigkeit, die Flüssigkeitströpfchen sauber von den Deckglas-Untergründen entfernt und Flüssigkeitsflecken verhindert. Bewahren Sie rechteckige Glasdeckgläser in einer sauberen Petrischale (Durchmesser 150 mm, Höhe 25 mm) auf.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Blaspistole, um den Luftstrom parallel zu den Deckglasböden zu leiten, und vermeiden Sie eine übermäßige Blasgeschwindigkeit, um ein Zerbrechen der Gläser zu verhindern.
  2. Schicht-1-Fertigung (Abbildung 2C)
    1. Legen Sie eine saubere PDMS-Form der Schicht 1 mit der Vorderseite nach oben auf einen sauberen Kunststoffdeckel (Durchmesser 60 mm, Höhe 15 mm) und glätten Sie sie. Pipettieren Sie 500 μL flüssigen UV-härtenden Klebstoff langsam auf die Form und benetzen Sie alle überstehenden Strukturen vorsichtig mit Hilfe eines Spachtels. Entfernen Sie Luftblasen, die durch den Benetzungsprozess entstehen.
      HINWEIS: Saubere PDMS-Formen können mit Klebeband hergestellt werden, um Staub oder UV-härtende Klebstoffreste zu entfernen, oder durch Reinigung mit Ethanol. Bewahren Sie PDMS-Formen als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme in Vakuumkammern auf, wenn sie nicht verwendet werden.
    2. Drücken Sie das Deckglas vorsichtig auf die PDMS-Form. Verhindern Sie, dass überschüssiger UV-härtender Klebstoff die Oberseite des Deckglases benetzt, da UV-härtende Klebstoffreste ein sauberes und flaches Deckglas verhindern können. Entfernen Sie überschüssigen UV-härtenden Klebstoff mit Laborwischern.
      HINWEIS: Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Merkmale der PDMS-Form, die auf die UV-härtende Klebeschicht übertragen wird, mit der Kartusche übereinstimmen, mit der sie verbunden wird. Markieren Sie dazu das Deckglas mit einem löslichen Filzstift an der Stelle, an der sich die Mittelpunkte der Patronenvertiefungen (drei an der Zahl) befinden. Verwenden Sie diese Markierungen, um das Deckglas an den PDMS-Formmerkmalen auszurichten, wenn Sie das rechteckige Glasdeckglas nach unten drücken.
    3. Härten Sie die Struktur unter gleichmäßig beleuchtetem UV-Licht (363-370 nm, 224 mW/cm2) 10 s lang teilweise aus. Wischen Sie die Flecken später mit 75% Ethanol ab. Halten Sie die Struktur fest auf einer ebenen Fläche und schälen Sie die PDMS-Form der Schicht 1 langsam von ihr ab.
      HINWEIS: Die partielle Aushärtung ermöglicht die Bildung einer ausreichend festen, UV-härtenden Klebeschicht, die das Ablösen der PDMS-Form in diesem Stadium ermöglicht. Dies erleichtert auch die Verklebung mit einer teilweise ausgehärteten Schicht 2 in nachfolgenden Schritten zur Herstellung eines zweilagigen, UV-härtenden Klebstoffaufbaus. Die PDMS-Form der Schicht 1, die mit einer Dicke von 1,5 mm (Schritt 1.2.4) vorbereitet wurde, sorgt für eine ausreichende PDMS-Flexibilität, die die Wahrscheinlichkeit verringert, dass das dünne Deckglas während des Schälvorgangs zerbricht. Die PDMS-Form kann bis zu zehn bis zwanzig Mal wiederverwendet werden, danach kann sich eine weißliche Schicht aus UV-härtenden Klebstoffresten auf der PDMS-Oberfläche befinden, die die Strukturdicke verringert. Verwenden Sie in diesem Fall neue PDMS-Formen.
  3. Layer-2-Fertigung (Abbildung 2D)
    1. Legen Sie eine saubere PDMS-Form der Schicht 2 mit der Vorderseite nach unten auf eine flache PDMS-Platte (Brammenstärke von > 2,5 mm, um eine hohe Steifigkeit zu gewährleisten). Tippen Sie mit einer Pinzette vorsichtig von oben auf die Gesichtszüge. Achten Sie auf die Schnittstelle für Abdunkelung oder optischen Kontrast unter den Merkmalen - dies deutet auf einen ordnungsgemäßen Kontakt hin.
      HINWEIS: Die Stützpfeiler, die die Hauptmerkmale (zwei runde Öffnungen und ein Schlitz) umgeben, sind entscheidend, um ein Durchhängen der PDMS-Formoberfläche zu verhindern.
    2. Füllen Sie den Raum zwischen PDMS-Form und Platte mit flüssigem, UV-härtendem Klebstoff über den Kapillareffekt. Härten Sie die Struktur unter UV-Licht (363-370 nm, 224 mW/cm 2) 10 s lang teilweise aus.
    3. Ziehen Sie die UV-härtende Verbundklebeschicht und die PDMS-Form vorsichtig mit einer weich gepolsterten Pinzette von der PDMS-Platte ab. Schneiden Sie überschüssige Kanten der UV-härtenden Klebeschicht bei Bedarf mit einer scharfen Schere ab.
  4. Verklebung von Schicht 1 und 2 (Abbildung 2E)
    1. Legen Sie Schicht 1, die an einem rechteckigen Glasdeckglas befestigt ist, auf eine ebene Fläche. Richten Sie Schicht 2 (die noch an der PDMS-Form befestigt ist) an Schicht 1 aus, und drücken Sie beide Schichten fest, um sicherzustellen, dass "Schatten" unter den Merkmalen sichtbar sind.
    2. härten Sie die Struktur unter UV-Licht (363-370 nm, 224 mW/cm²) 10 s lang aus, um die Schichten 1 und 2 zu verbinden, die die zweischichtige Struktur des mikrofluidischen Chips bilden. Ziehen Sie die PDMS-Form vorsichtig vom Chip ab.
      HINWEIS: Um das erfolgreiche Ablösen der PDMS-Form vom Chip zu gewährleisten, trennen Sie in Schritt 2.4.1 mit einer Pinzette jede PDMS-Stützsäule von der UV-härtenden Klebeschicht 2. Diese Maßnahme trägt dazu bei, die Gesamthaftung zwischen der PDMS-Form und der für das Abziehen wichtigen Schicht 2 zu verringern.
  5. Integration von Polyacrylamid-Gel (Abbildung 2F)
    HINWEIS: Bereiten Sie vor diesem Abschnitt so viele Chips vor, wie für ein Multiplex-Experiment erforderlich sind.
    1. Bereiten Sie die PA-Gel-Vorläuferlösung vor, indem Sie die Zutaten in der folgenden Tabelle vorsichtig mischen, entsprechend der PA-Gel-Steifigkeitder Wahl 24 (siehe Tabelle 1). Achten Sie darauf, während des Pipettierens keine Luftblasen einzuführen, da Sauerstoff die Gelierung hemmt.
      ACHTUNG: TEMED und APS sind giftig. Arbeiten Sie in einem Abzug und tragen Sie Handschuhe.
      HINWEIS: Sorgfältiges Pipettieren und Handhaben sind erforderlich, da es sich um kleine Flüssigkeitsmengen handelt (1 μl TEMED für 1 mL PA-Gel-Vorläuferlösung). Die Gelsteifigkeit kann das Zellverhalten beeinflussen, wie viele mechanobiologische Studien gezeigt haben. Wählen Sie die Steifigkeit, die für Ihre Experimente am besten geeignet ist. Fluoreszierende Kügelchen dienen als Referenzmarker für die Gelverformung und die mechanische Spannungsinferenz. Vortex-Bead-Lösung, bevor Sie die Lösung in die PA-Gel-Vorläuferlösung pipettieren. Es wird empfohlen, das kleine Volumen TEMED zuletzt nicht zu mischen, da PA-Gel-Vorläuferlösungen zu gelieren beginnen, wenn beide Initiatoren hinzugefügt werden, und kleine Volumina in dieser kurzen Zeit schwer gründlich zu mischen sind.
    2. Pipettieren Sie sofort 10 μl der PA-Gel-Vorläuferlösung in die Mitte der Geweberegion und auf den Schlitz von Schicht 2 (Abb. 1B, 2F). Mit einem runden Glasdeckglas (Durchmesser 10 mm) vorsichtig andrücken, sodass ein flaches Gel entsteht. Beobachten Sie, wie die PA-Lösung durch den Schlitz in die Schicht 1 fließt und an der Reihe der Sperrpfeiler anhält.
      HINWEIS: Das Volumen von 10 μl PA-Gel-Vorläuferlösung erzeugt ein 100 μm dickes Gel über Schicht 2. Ändern Sie dieses Volumen je nach gewünschter Geldicke. Pipettieren Sie die Lösung so schnell wie möglich auf den Chip, da die PA-Lösung nach Zugabe von Initiatoren zu polymerisieren beginnt. Drücken Sie die Lösung mit der richtigen Kraft, um zu verhindern, dass die Lösung über die Sperrsäulen läuft und den Kanal blockiert. Entsorgen Sie den Chip, wenn die Kanäle blockiert sind. Bei weichen Gelen mit einer Steifigkeit von 5 kPa oder weniger verwenden Sie wasserabweisendes Glas, um die runden Glasdeckgläser zu behandeln und die Deckgläser hydrophob zu machen. Tauchen Sie insbesondere die Deckgläser 5 Minuten lang in wasserabweisendes Glas, spülen Sie sie 3 Mal mit 100 % Ethanol ab und trocknen Sie sie mit Stickstoffgas. Dies erleichtert das spätere Ablösen des Deckglases vom polymerisierten Gel, ohne das Gel zu zerstören.
    3. Härten Sie den mikrofluidischen Chip sofort unter UV-Licht (363-370 nm, 224 mW/cm2) für 5 min aus. Warten Sie mindestens ~1 h, bis sich das PA-Gel vollständig verfestigt hat.
      HINWEIS: Dadurch wird der Chip vollständig ausgehärtet, während sich das polymerisierte PA-Gel mit der Struktur verbinden kann. Die Schritte 2.5.1, 2.5.2 und 2.5.3 sollten in schneller Folge ausgeführt werden.
    4. Inkubieren Sie den Chip mindestens 1 h oder länger gründlich in HEPES (0,1 M, pH 7,4), um das Gel zu benetzen und die Haftung zwischen Deckglas und Gel zu lösen. Entfernen Sie das Deckglas vorsichtig mit einer scharfen Pinzette.
      HINWEIS: Verlängern Sie bei weicheren Gelen mit einer Steifigkeit von 5 kPa oder weniger die Inkubationszeit auf einem Shaker auf bis zu 10 Stunden, um eine saubere Entfernung des Deckglases vom Gel zu gewährleisten, ohne die Gelstruktur zu stören. Manchmal können sich zwischen dem rechteckigen Deckglasboden und der UV-härtenden Schicht 1 auf Klebstoffbasis Strukturmuster von mehreren Dutzend und Hunderten von Mikrometern bilden. Diese Muster können die Hellfeld-Bildgebung beeinträchtigen, haben aber nur minimale Auswirkungen auf die Fluoreszenzbildgebung. Dies kann durch Plasmaaktivierung von rechteckigen Deckgläsern wie in Schritt 2.1.2 verbessert werden.
  6. Verklebung von Chip und Kassette (Abbildung 2F)
    1. Legen Sie eine gereinigte, medizinische Polycarbonat-Kartusche (Zusatzdatei 4) mit der Unterseite nach oben auf eine ebene Fläche. Trocknen Sie das Gel auf dem Chip mit Labortüchern von der Seite ab. Richten Sie den Chip mit der bedruckten Seite nach unten an der Patrone aus.
      HINWEIS: Beim Testen neuer Kartuschendesigns kann man Bearbeitungs- oder 3D-Druckverfahren verwenden. Wenn das Design festgelegt ist, kann man im Spritzgussverfahren große Mengen der Kartusche herstellen.
    2. Pipettieren Sie den UV-härtenden Klebstoff in die Spalten zwischen Chip und Patrone, die per Kapillareffekt gefüllt werden. Aushärtung mit UV-Licht (363-370 nm, 224 mW/cm 2) für 5 min.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass kein UV-härtender Klebstoff in die Kanäle oder auf die andere Seite des Deckglasbodens überläuft.
  7. Entfernung von nicht polymerisierter PA-Lösung
    1. Verwenden Sie einen PDMS-Stopfen und eine Spritze, um ca. 5 ml HEPES (0,1 M, pH 7,4) durch die Abfallentnahmekanäle zu ziehen, um die nicht polymerisierte PA-Gel-Vorläuferlösung auszuspülen, die für die Zellen giftig ist.
    2. Inkubieren Sie das Gel im Gerät mit 2 mL HEPES (0,1 M, pH 7,4) pro Gerät und legen Sie es für 1-2 Tage auf einen Schüttler, um eine vollständige Entfernung der nicht polymerisierten PA-Gel-Vorläuferlösung sicherzustellen.

3. Abschluss der Einrichtung

HINWEIS: Wenn die Geräte fertig sind, schließen Sie die Einrichtung ab (Abbildung 1C), indem Sie das PA-Gel mit dem ECM-Protein für die Zellaussaat beschichten, die Geräte für die elektrische Stimulation an die Elektrodenkammer anschließen und die Geräte in Einsätze, Halterungen und einen Deckel der Lebendzellkammer für Multiplex-Experimente zur Bildgebung lebender Zellen platzieren.

  1. Aufbereitung von sterilisierten Bauteilen
    1. Alle Komponenten des Aufbaus mit Ausnahme des Geräts (Materialtabelle) sollten in der folgenden Reihenfolge beschallt werden: zuerst 30 Minuten lang in Seifenwasser, dann 30 Minuten lang in MQ-Wasser und schließlich 30 Minuten lang in 75%igem Ethanol. Danach trocknen Sie sie in einem Ofen bei 60 °C und behandeln Sie sie 30 Minuten lang mit UV-Licht bei 200-280 nm in einer Biosicherheitswerkbank, um eine Sterilisation zu erreichen.
  2. PA-Gel-Funktionalisierung mit ECM-Protein
    1. Sterilisieren Sie die Geräte mit UV-Licht (200-280 nm) in einer Biosicherheitswerkbank.
    2. Bereiten Sie die benötigte Menge an 50 μg/mL Collagen I Arbeitslösung in 1x DPBS auf Eis vor.
      HINWEIS: Halten Sie den Kollagen-I-Vorrat auf Eis, um eine Gelierung zu verhindern. 100-150 μl Kollagen I Arbeitslösung sind für jedes Gerät erforderlich, um das Gel vollständig einzutauchen. Pipettieren Sie vorsichtig Kollagen-I-Lösungen, um Faserbildung zu vermeiden.
    3. Bereiten Sie die erforderliche Menge Sulfo-SANPAH (SS) Arbeitslösung auf Eis vor. Für jede Gelbehandlung werden ca. 80 μl SS-Arbeitslösung benötigt, wobei 2 μl SS-Stammlösung (gelöst in wasserfreiem DMSO) in 80 μl kaltem HEPES (ab 4 °C Kühlschrank, 0,1 M, pH 7,4) verdünnt werden.
      HINWEIS: SS ist feuchtigkeitsempfindlich; Vermeiden Sie Feuchtigkeitskondensation auf dem Produkt, indem Sie die Lagerfläschchen vor dem Öffnen auf Raumtemperatur ausgleichen. Verwenden Sie No-weigh SS für eine optimale Leistung und bereiten Sie die Bestände in wasserfreiem DMSO vor. Verwenden Sie es so schnell wie möglich. Ein kalter HEPES-Puffer wird verwendet, um die Hydrolyserate von SS in Vorbereitung auf die SS-Arbeitslösung zu reduzieren. Jedes Gel erfordert zwei Behandlungen mit der SS-Arbeitslösung, um sicherzustellen, dass die PA-Geloberfläche gut funktionalisiert wird.
    4. Trocknen Sie das Gel im Gerät, indem Sie die Ränder des Gels mit Labortüchern abtupfen. Pipettieren Sie 80 μl SS-Arbeitslösung auf das Gel und stellen Sie sicher, dass die Geloberfläche vollständig in die SS-Lösung eingetaucht ist. Behandeln Sie das Gel 5 Minuten lang mit UV (363-370 nm, 24,5 mW/cm2), um SS zu aktivieren. Spülen Sie es 3 Mal mit kaltem HEPES (0,1 M, pH 7,4).
      HINWEIS: Pipettieren Sie SS vorsichtig in der Mitte der Patronenvertiefung, um zu verhindern, dass SS von der Wand angezogen wird.
    5. Wiederholen Sie Schritt 3.2.4, spülen Sie jedoch dreimal mit kaltem 1x DPBS am Ende.
      HINWEIS: Die Schritte 3.2.3 bis 3.2.5 sollten kurz hintereinander durchgeführt werden, um eine SS-Hydrolyse zu verhindern. Das gespülte Gel sollte zu diesem Zeitpunkt in einem dunkleren Rotton erscheinen, wenn die Oberflächenaktivierung durch SS erfolgreich ist.
    6. Pipettieren Sie 100 μl Kollagen I-Lösung auf das PA-Gel und achten Sie darauf, dass das Gel vollständig eingetaucht ist. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, dann nicht gebundenes Kollagen dreimal mit 1x DPBS abspülen. Tauchen Sie das Gel vor Gebrauch in 1x DPBS.
      HINWEIS: Die mit Kollagen I-beschichtete Probe kann einige Tage im Kühlschrank bei 4 °C gelagert werden.
  3. Anschluss von Geräten an Elektrodenkammern
    1. Befestigen Sie die Geräte mit Schrauben an den Einsätzen (Bild 1C, Schraubentyp: M3 x 10 mm). Befestigen Sie dann bis zu vier Geräteeinsatzbaugruppen an der Halterung, die für die Montage auf einem Mikroskoptisch vorgesehen ist (Schraubentyp: M3 x 5 mm).
      HINWEIS: Wenn die maximale Anzahl von Geräteeinsatzbaugruppen nicht verwendet wird, wird empfohlen, alle anderen Halterungsschlitze mit leeren Geräten zu füllen, um den Raum abzudichten, damit für die späteren Bildgebungsexperimente gute Lebendzellbedingungen erhalten bleiben. Leere Geräte können einfach hergestellt werden, indem Patronen auf blanke rechteckige Glasabdeckgläser geklebt werden.
    2. Füllen Sie die Geräte mit Nährmedium (DMEM++, 2 mL in jeder der Hauptvertiefungen). Ziehen Sie weiter 2 ml Medium durch die Abfallentsorgungskanäle, um das 1x DPBS auszuspülen und zu ersetzen.
    3. Bereiten Sie zwei 50-ml-Röhrchen mit Kappen vor, die Durchgangslöcher haben, die als Elektrodenkammern fungieren. Erstellen Sie Löcher in geeigneter Größe und Menge, um die Platinelektroden und Tygon-Schläuche sicher zu befestigen und die Elektrodenkammern mit den Geräten zu verbinden. Füllen Sie jede Elektrodenkammer mit 45 ml Nährmedium.
      HINWEIS: Mit scharfen chirurgischen Klingen können leicht Löcher in den Kappen erzeugt werden.
    4. Bereiten Sie die Verbindung zwischen Elektrodenkammern und Geräten vor: Befestigen Sie zwei Schlauchanschlüsse an jedem Gerät. Stecken Sie eine Schlauchklemme auf jeden Tygon-Schlauch (Abbildung 1C). Ziehen Sie das Nährmedium mit einer Spritze durch die Schläuche und klemmen Sie sie fest. Verbinden Sie ein Ende des mediumgefüllten Schlauchs mit der Elektrodenkammer und das andere mit dem Gerät.
      HINWEIS: Verringern Sie die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Blasen in Rohren, indem Sie vorgewärmtes Medium verwenden und/oder das Medium in einer Vakuumkammer entgasen. Verhindern Sie, dass sich Luftblasen an der Schnittstelle zwischen dem Tygon-Schlauch und dem Schlauchanschluss bilden, drücken Sie die Schlauchenden zusammen, um die Oberfläche des Mediums auszubeulen, bevor Sie in das Medium im Schlauch eintauchen, oder befestigen Sie es physisch an den Schlauchanschlüssen.
    5. Passen Sie die relativen Höhen zwischen den Oberflächen des Kulturmediums in den Geräten und Elektrodenkammern mit einer Laborbuchse an. Lösen Sie die Schlauchschellen und lassen Sie alle mittleren Oberflächen auf die gleiche Höhe ausgleichen.
      HINWEIS: Denken Sie daran, die Schlauchklemmen zu befestigen, wenn das gesamte Setup bewegt wird, um ein Überlaufen von Flüssigkeiten zu vermeiden.
    6. Führen Sie eine Qualitätskontrolle durch, indem Sie den Widerstand jedes Geräts separat mit einem Messgerät für die elektrische Quelle messen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie nur die Schlauchklemme des Geräts lösen, für das der Widerstand gemessen wird, während Sie die Clips der anderen parallel angeschlossenen Geräte sicher befestigt halten.

4. Monolagenwachstum und Experimente mit lebenden Zellen

HINWEIS: Um eine geeignete konfluente Monoschicht zu bilden und eine gleichmäßig verteilte elektrische Stromdichte zu erreichen, die von der Konfluenz und dem elektrischen Widerstand der Monoschicht abhängt. Stellen Sie dann sicher, dass die richtigen Bedingungen für lebende Zellen an einem Mikroskop für Langzeitbildgebung und elektrische Stimulationsexperimente herrschen.

  1. Wachstum von Monolayern
    1. Entfernen Sie MDCK-Zellen mit Trypsin aus T25-Kolben. Zentrifugieren und zählen Sie das mittlere Volumen, das benötigt wird, um 0,1 Millionen Zellen zu erhalten. Suspendieren Sie diese Anzahl von Zellen und mischen Sie sie gut in 2 mL Medium in Zentrifugenröhrchen.
    2. Pipettieren Sie das gesamte zellbeladene Medium in die Vertiefung in den Gewebebereich. Lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang sedimentieren, bevor Sie das gesamte Setup langsam in einen Gewebekultur-Inkubator überführen.
      HINWEIS: Für jedes Gerät entspricht eine Seeding-Dichte von 0,1 Millionen Zellen 0,06 Millionen Zellen pro Quadratzentimeter (6 × 104 Zellen/cm2). Diese Aussaatdichte ist spärlich genug, und die Zellen wachsen 2 Tage lang, bevor sie einen konfluenten Zustand erreichen. Dieser Prozess gewährleistet eine richtig polarisierte und homogene Monoschicht, ohne dass überschüssige ungebundene Zellen abgespült werden müssen, die das Gewebe stören könnten. Es ist wichtig, dass der Sedimentationsschritt ungestört bleibt, damit es zu einer gleichmäßigen Aussaat der Zellen kommt.
    3. Lassen Sie die Zellen im Inkubator (37 °C, 5% CO2, 90% Luftfeuchtigkeit) 72 h lang wachsen, um eine Zelldichte von >~50 Zellen/100μm 2 zu erreichen. Überprüfen Sie täglich an einem Tischmikroskop mit Phasenkontrast, um den Wachstumsprozess zu überwachen.
      HINWEIS: Mit dieser Anzahl von ausgesäten Zellen haben die MDCK-Zellen nach 24 Stunden eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht, nach 48 Stunden eine vollständige Konfluenz und eine weitere Zunahme der Zelldichte und Gewebereifung bis 72 Stunden. Nach 24 h beträgt die durchschnittliche Zelllänge etwa 10-20 μm. Nach 48 h haben Zell-Zell-Verbindungen und der Zellkörper einen klaren Kontrast unter Phasenkontrastbildgebung. Dieser Kontrast reduziert sich nach 72 h drastisch.
  2. Bildgebung von lebenden Zellen
    1. Wählen Sie je nach experimentellem Bedarf ein Epifluoreszenz- oder ein Konfokalmikroskop. Wenn Zellen exprimieren oder mit Fluoreszenzmarkern gefärbt werden, wählen Sie konfokal für die dreidimensionale Beobachtung der Zellform und der Verformungen des Gelsubstrats. Wählen Sie für die zweidimensionale Betrachtung Phasenkontrast und Epifluoreszenz, die eine geringere Phototoxizität erzeugen. Schalten Sie das Lebendzellsystem 1 Stunde vor dem Aufbau des Mikroskops ein, damit sich der Inkubator auf dem Mikroskoptisch auf 37 °C, 5 % CO2 und 90 % Luftfeuchtigkeit stabilisieren kann.
      HINWEIS: Die Steuerung des Live-Zellen-Systems zeigt die Bedingungen im Inkubator auf der Bühne an und gibt eine Warnung aus, wenn die Bedingungen suboptimal sind. Da sich der Deckel des Inkubators auf der Bühne von dem kommerziellen Inkubator unterscheidet, da Geräteschläuche untergebracht werden müssen, die nach außen ragen, muss das System neu kalibriert werden, um gute Bedingungen für lebende Zellen für Langzeitexperimente (einige Tage bis zu einer Woche) zu gewährleisten. Die Kalibrierung kann auf der Grundlage des Benutzerhandbuchs durchgeführt werden, und die Positionen der Sensoren müssen in Experimenten genauso beibehalten werden wie unter den Kalibrierungsbedingungen. Überprüfen Sie die Verdampfungsrate des Mediums im Inkubator auf der Bühne und die pH-Bedingungen mit phenolrotem Medium.
    2. Montieren Sie das Setup mit den Elektrodenkammern an den Seiten auf das Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass der elektronische Tisch des Mikroskops ausreichend Platz hat, um sich zu bewegen und nicht gegen die Elektrodenkammern zu stoßen. Stellen Sie sicher, dass die mittleren Oberflächenhöhen ausgeglichen sind und sich auf der gleichen Höhe wie die in den Geräten und den Elektrodenkammern befinden.
      HINWEIS: Die Mediumoberfläche in den Vertiefungen des Geräts, in der sich die Geweberegion befindet (Abbildung 1C), hat einen erheblichen Einfluss auf die Hellfeld- und Phasenkontrastbildgebung. Der Meniskus führt zu einer unerwünschten Lichtfokussierung. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Mediums am Rand der Vertiefung flach ist, aber beachten Sie, dass die Verdunstung des Mediums in der Kammer der lebenden Zellen nach einiger Zeit zu einer Verformung dieser ebenen Oberfläche führt. Um dieses Problem zu lösen, besteht eine Lösung darin, ein flaches Glasdeckglas in Kontakt mit der mittleren Oberfläche zu bringen, um diese Oberfläche abzuflachen. Dieses Deckglas sollte eine kleinere Fläche als die Vertiefung haben, damit es den Gasaustausch, der für das Zellwachstum wichtig ist, nicht behindert. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, Mineralöl in Zellkulturqualität auf das Medium zu schichten.
    3. Richten Sie die Software ein.
      1. Wählen Sie 10x oder 20x Objektive für die Ganzgewebebildgebung mit einem Epifluoreszenzmikroskop und 30x Objektivlinsen (WD 0,8 mm, NA 1,05) für konfokale Bildgebung mit höherer Auflösung.
      2. Wählen Sie für die Ganzgewebebildgebung mehrere Positionen, um den rechteckigen Bereich im Gewebebereich abzudecken (Abbildung 1A, z. B. 5 Reihen x 5 Spalten, wobei die mittlere Reihe den Schlitz abdeckt, während die anderen außerhalb des Schlitzes liegen). Wählen Sie die Fluoreszenz- und Hellfeldkanäle entsprechend den im Ergebnisteil verwendeten Zelllinien (Kanal 488 für grüne Fluoreszenz und Kanal 561 für rote Fluoreszenz). Wählen Sie ein Zeitintervall von 1 Stunde, um die Phototoxizität in diesem Langzeitbildgebungsexperiment für bis zu einige Tage zu reduzieren.
        HINWEIS: Andere Objektive, wie z. B. 4x, können gewählt werden, wenn eine größere Ansicht des gesamten Gewebes erforderlich ist.
  3. Elektrische Stimulation
    1. Überprüfen Sie die Anzahl der Geräte, den relativen Gerätewiderstand und den elektrischen Zielstrom jedes Geräts. Entscheiden Sie sich für den gesamten elektrischen Strom, der für einige Stunden bis zu einer Woche in der Gesamtkonfiguration entnommen werden soll.
    2. Geben Sie ein elektrisches Signal im Stromzangenmodus ab. Für 3 Geräte mit gleichem Kanalwiderstand, mit einer Kontrollgruppe (kein elektrischer Strom, Schlauchclip befestigt), einer apikal-basalen (AtB) Strombedingung und einer basal-zu-apikalen (BtA) Strombedingung (Abbildung 1D) liefern Sie einen Gesamtstrom von 20 μA mit einem Source-Meter. Dies führt dazu, dass für jedes Gerät 10 μA mit einer geschätzten Stromdichte von ~10 μA/cm2 bereitgestellt werden, die physiologisch relevant ist (weitere Details in der Diskussion).
      HINWEIS: Die Gesamtspannung liegt je nach Länge des Tygon-Schlauchs bei etwa zehn Millivolt. Ein solcher elektrischer Strom kann für einige Tage bis zu einer Woche kontinuierlich zugeführt werden. Der Phenolrot-Indikator verfärbt sich in den Elektrodenkammern (in der Kammer mit der positiven Elektrode saurer), aber nicht im Inkubator auf der Bühne, der gut kalibriert ist. Die Zellen bleiben so lange gesund, wie die Bedingungen für lebende Zellen gut aufrechterhalten werden. Die Forscher können das Medium im Inkubator auf der Bühne alle zwei Tage und das Medium in den Elektrodenkammern alle paar Tage wechseln. Befestigen Sie die Schlauchschellen beim Wechseln der Elektrodenkammern, um ein Überlaufen des Mediums zu vermeiden. Denken Sie daran, wie in Schritt 3.1.1 erwähnt, ein leeres Gerät zu haben, um den Platz für die Halterung abzudecken. Dadurch wird sichergestellt, dass sich die Lebendzellkammer im richtigen Zustand befindet.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier vorgestellten Ergebnisse sind eine Adaption der Vorgängerpublikation4; Weitere Informationen finden Sie in dieser Veröffentlichung.

Dieses Protokoll ermöglicht das Anlegen eines externen Ionenstroms oder elektrischen Feldes senkrecht zur Ebene von Zellen oder Geweben. Diese elektrische Stimulation stört die endogene transepitheliale elektrische Potentialdifferenz (TEPD) und ermöglicht es, die Rolle von TEPD bei der Steuerung des Gewebeverhaltens zu untersuchen...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll bietet detaillierte Schritte und Designlogik zur Herstellung eines neuartigen mikrofluidischen Geräts, zur Durchführung von Experimenten zur transepithelialen elektrischen Potentialstörung und zur Untersuchung bioelektrischer Effekte durch Lebendzellbildgebung und mechanobiologische Methoden. Die Bedeutung dieser Methode wird im Vergleich zu anderen verwandten Methoden deutlich. Eine verwandte Methode verwendet beispielsweise einen einfachen mikrofluidischen Chip mit ein...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stellen Sie sicher, dass alle Autoren alle Interessenkonflikte offengelegt haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

XJ, PX, FF und TBS bestätigen die hilfreichen Gespräche mit Dr. Xumei Gao, Xinru Yu und anderen Gruppenmitgliedern des Tissue Biophysics Laboratory. Wir danken der Customized Technology Service Facility (CTSF) an der Westlake University für die Unterstützung bei unserer Schaltplanzeichnung. Diese Arbeit wurde von der Westlake Education Foundation, dem Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine und dem Research Center for Industries of the Future (RCIF) an der Westlake University unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1x DPBSGibco14190144
3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat, TPMSigma2530850Nach dem Öffnen unter Stickstoff lagern.
50 mL Falcon RöhrchenCorning430829Stanzen Sie 4 Löcher in die 50-ml-Falcon-Röhrchenkappe, damit Elektrode und Schlauch durch die Kappe geführt und in das Medium eingetaucht werden können. Für ein mikrofluidisches Gerät werden mindestens 2 Kappen benötigt.
EssigsäureSinopharm10000208
Acrylamid-Lösung, 40%Sigma79061Giftig
LuftpumpeOKO-LaborOKO-APBestandteil des Mikroskop-Tischinkubators
Ammoniumpersulfat, APSAladdinA112447
Patrone--Die Kartusche ist eine Sonderanfertigung, und das Design bezieht sich auf Ergänzungsmaterial. Der Rohstoff ist PC Makrolon 2858 Medical Grade, und hier finden Sie weitere Details: https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
Clips--Robert Clip, für Schläuche  mit einem äußeren Durchmesser von 4,5 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144
Kollagen ICorning354236
DI Milli-Q WasserMilli-Q-
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Kulturmedium, DMEM (hoher Glukosegehalt)Gibco11965092DMEM++ ist DMEM mit zusätzlichen 10%  FBS (Sigma-Aldrich) und 100  Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin (Gibco).
Gehäuse schwarzer KäfigOKO-LaborNr. H201Bestandteil des Mikroskop-Tischinkubators
Inverses Epi-FluoreszenzmikroskopOlympIX83
Ethanol absolutSinopharm10009218
Fötales RinderserumSigmaNr. F8318
Fluoreszierende Kügelchen, 0,1 μ L, rot (580/605)ThermoNr. F8801
GaskammerOKO-LaborH201-PRIOR-SP200/400/600Bestandteil des Mikroskop-Tischinkubators
Manueller GasmischerOKO-Labor2GF-MISCHERBestandteil des Mikroskop-Tischinkubators
GeneticinGibco10131027GFP– Aktin und H1– GFP MDCK wurden unter Verwendung von Medien aufrechterhalten, die mit 0,5 μm ergänzt wurden; mg/ml Genetik (Gibco) zur Aufrechterhaltung ihrer Genexpression
HEPESSigma736459
IsopropanolSinopharm80109218
KimwipesKimberly-Clark ProfessionalLH-70155Scheibenwischer für Labors
Längere Schraube--Vernickelte Präzisions-Präzisionsschraube mit rundem Kopf, M3 x 10 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Mikrofluidischer Konnektor--Gerader Verschraubungsverschraubung aus Polypropylen, 1/16"-10-32UNF. https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=16&detail_redpacket_pop=true&id=555839592609<k2=1752310108435i7ldxj7ekdgu9qhnphlmj&ns=1&priceTId=2150470617523101021033708e1a4b&query=10-32unf%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E7%9B%B4%E9%80%9A%E6%8E%A5%E5%A4%B4%20%E5%A1%91%E6%96%99%E5%A4%96%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E6%8E%A5%E5%A4%B4&skuId=3600497427939&spm=a21n57.1.hoverItem.1&utparam=%7B%22aplus_abtest%22%3A%2245243a364caf5527e8392ded0656451a%22%7D&xxc=taobaoSearch
Halterung für Multiwell-PlattenOKO-LaborH201-MW-HALTER-NZ500Bestandteil des Mikroskop-Tischinkubators
N',N'-Methylenbisacrylamid, 2%Sigma110269Giftig
NOA 73Norland Produkte17-345UV-härtender Klebstoff
Penicillin-Streptomycin, PS (10.000 U/ml)Gibco15140122
Petrischale (150 mm & akut; 25 mm)Corning430599Beständigkeit bis mindestens 80 > C für 2 h
Pico Plasma-WerkzeugDiener Electronic GmbH + Co. KGPico PlasmaFür die O2 Plasmabehandlung
Plasma-ReinigerHarrick PlasmaPDC-002Für die Luftplasmabehandlung
Kunststoffschale (Durchmesser 60 mm, Höhe 15 mm)Nest705001
Platin-ElektrodenTianjin Aida HengshengNr. PT005Durchmesser 0,5 mm, Länge 37 mm 
Rain-X Original Glas wasserabweisendITW Chemische Produkte800002242
Rechteckiges DeckglasMarienfeld0107222  1,5 Stunden, 24 & akut; 50 mm2, 170 μ m Dicke
Rundes DeckglasMarienfeld0111500  1,5H, rund 10 mm Durchmesser
Kürzere Schraube--Vernickelte Präzisions-Präzisionsschraube mit Rundkopf, M3 x 4 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Sulfo-SANPAH, ohne GewichtThermoNr. A35395SS-Stammlösung: 20 mg/ml in wasserfreiem DMSO, 2 μ L für jeden; SS-Arbeitslösung: 0,5 mg/mL SS in HEPES (0,1 M, pH 7,4).
SYLGARD 184 Silikon-Elastomer-KitDow CorningH052KCM147Das Endprodukt ist Polydimethylsiloxan, PDMS. Dieses Kit enthält das Basis-PDMS-Harz und das Vernetzungsmittel.
TemperatureinheitOKO-LaborH201-T-EINHEIT-BLBestandteil des Mikroskop-Tischinkubators
Tetramethylethylendiamin, TEMEDSigma110189Giftig
Touchscreen-AnzeigeOKO-LaborOKO-TOUCHBestandteil des Mikroskop-Tischinkubators
Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichlorsilanSigma78560459
Trypsin-EDTA (0,25 %)Gibco25200072
Tygon-SchläucheTygonAJK00002Außendurchmesser (AD) = 3,2 mm, Innendurchmesser (ID) = 1,6 mm
Ultraschall-ReinigerSupmileKD-300DE
UV-LED-HärtungsmaschineGHUVGHS-MFLGUV-LED-Lichtquelle, Emision-Reichweite: 363– 370 nm, maximale Leistungsdichte: 230 mW/cm2
Vibrationsfreies BefeuchtungsmodulOKO-LaborHM-VFBestandteil des Mikroskop-Tischinkubators
VisiviewVisitron Systems GmbH-Imaging-Software
Wafer-Schicht1Nationale Universität von Singapur, Institut für Mechanobiologie, Mikrofabrikationsanlage-Der Wafer ist eine Sonderanfertigung, und das Design bezieht sich auf ergänzendes Material.
Wafer-Schicht2Nationale Universität von Singapur, Institut für Mechanobiologie, Mikrofabrikationsanlage-Der Wafer ist eine Sonderanfertigung, und das Design bezieht sich auf ergänzendes Material.

Referenzen

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  4. Saw, T. B., et al. Transepithelial potential difference governs wound healing by electromechanics. Nat Phys. 18 (9), 1122-1128 (2022).
  5. Ferreira, F., Moreira, S., Zhao, M., Barriga, E. H. Stretch-induced collective cell migration in vivo. Nat Mater. 24, 452-470 (2025).
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