Eine quantitative Bewertung der Phagozytose allogener und xenogener Erythrozyten durch Rattenmakrophagen in vitro

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt ein standardisiertes in vitro Protokoll zur Quantifizierung und zum Vergleich der Phagozytoseraten von xenogenen (humanen) und allogenen (Ratte) roten Blutkörperchen durch isolierte Rattenmakrophagen.

Zusammenfassung

Bei der xenogenen Zelltransplantation kommt es selbst in immundefizienten Tiermodellen häufig zu einer erheblichen Immunabstoßung. Unter den verbleibenden Immunkomponenten können Makrophagen transplantierte menschliche Zellen aktiv phagozytieren, was eine Herausforderung für die langfristige Transplantation darstellt. Um dies zu untersuchen, haben wir einen standardisierten in vitro Assay entwickelt, um die Makrophagen-vermittelte Phagozytose von menschlichen und Ratten roten Blutkörperchen (RBCs) zu quantifizieren. Peritoneale Makrophagen der Ratte wurden isoliert, kultiviert und entweder mit menschlichen oder Ratten-Erythrozyten exponiert. Humane Erythrozyten wurden mit CD235a identifiziert, während Ratten-Erythrozyten mit DeepRed vormarkiert wurden. Die durchflusszytometrische Analyse wurde mit CD163 durchgeführt, um Makrophagen und den Ausschluss von Propidiumjod (PI) zu identifizieren, um lebende Zellen zu schleusen. Die Ergebnisse zeigten einen erheblichen Unterschied in der phagozytären Aktivität: 5,08 % der Makrophagen verschlangen menschliche Erythrozyten, während nur 1,59 % die Erythrozyten von Ratten phagozytierten, was einen relativen Phagozytoseindex von 3,21 ergab. Dieses Protokoll ermöglicht eine quantitative Bewertung der Immunkompatibilität und bietet eine reproduzierbare Methode zur Bewertung der angeborenen Immunantwort bei der Xenotransplantation. Es birgt das Potenzial, die Spender-Empfänger-Auswahl zu verfeinern und immunsuppressive Strategien in der translationalen Forschung zu steuern.

Einleitung

Der Einsatz der xenogenen Zelltransplantation, insbesondere die Transplantation menschlicher Zellen in Tiermodelle, ist eine wesentliche Strategie in der biomedizinischen Forschung¹. Es ermöglicht die Bewertung des Überlebens, der Transplantation und der Immunantwort von Zellen in einer kontrollierten in vivo-Umgebung . Während Mausmodelle dieses Feld aufgrund ihrer gut charakterisierten Genetik und einfachen Manipulation in der Vergangenheit dominiert haben, stellt ihre geringe Größe eine erhebliche Einschränkung bei Studien dar, die große Blutmengen oder hohe Zellausbeuten erfordern. Im Gegensatz dazu bieten Ratten mehrere Vorteile, darunter eine größere Körpermasse, eine verbesserte physiologische Relevanz für menschliche Systeme und eine höhere Ausbeute an biologischen Proben wie Blut oder Peritonealmakrophagen². Daher werden Rattenmodelle zunehmend in Studien zur hämatopoetischen und Immunsystemforschung eingesetzt³.

Eine der größten Herausforderungen bei der xenogenen Transplantation ist die Immunabstoßung. Selbst in immundefizienten Modellen, in denen T-Zellen, B-Zellen oder NK-Zellen genetisch abgetragen werden, bleiben verbleibende angeborene Immunzellen, insbesondere Makrophagen, funktionell aktiv⁴. Makrophagen dienen als Verteidiger der ersten Linie des Immunsystems des Wirts, indem sie fremde Zellen durch Phagozytose erkennen und eliminieren⁵. Dieser Prozess wird teilweise durch die Interaktion zwischen dem signalregulatorischen Protein alpha (SIRPα) auf Makrophagen und CD47 reguliert, einem "Friss mich nicht"-Signal, das auf den meisten Zelltypen exprimiert wird. Wenn CD47 aus menschlichen Zellen von Nagetieren SIRPα nicht erkannt wird, kann diese Diskrepanz zu einer verstärkten Phagozytose führen. Auch bei diesen freizügigen immundefizienten^{Tieren besteht dieses} Phänomen ^6,7.

Die Quantifizierung der Makrophagen-vermittelten Phagozytose ist in diesem Zusammenhang entscheidend für die Bewertung der Überlebenswahrscheinlichkeit von Zellen und für die Optimierung von Transplantationsstrategien⁸. Obwohl verschiedene in vivo - und ex vivo-Methoden entwickelt wurden, um die Immunabstoßung zu beurteilen, sind standardisierte in vitro Assays für Makrophagen-Phagozytose nach wie vor begrenzt. Traditionelle, auf Mikroskopie basierende Methoden sind oft arbeitsintensiv und es mangelt ihnen an quantitativer Genauigkeit. Im Gegensatz dazu bietet die Durchflusszytometrie einen einzelzellbasierten Assay und eine quantitative Plattform, die in der Lage ist, Zelltypen genau zu unterscheiden und die phagozytäre Aufnahme durch Oberflächenmarkerdetektion zu messen.

In diesem Artikel haben wir einen standardisierten in vitro Assay entwickelt, um die differentielle Phagozytose von humanen und ratten Erythrozyten durch Peritonealmakrophagen der Ratte zu bewerten. Erythrozyten dienen aufgrund ihrer einfachen Struktur und Expression von CD47, das als "Selbst"-Signal zur Hemmung der Makrophagen-vermittelten Clearance fungiert, als ideales Modell für Phagozytose-Assays⁹. In diesem Protokoll werden peritoneale Makrophagen der Ratte über eine Peritonealspülung entnommen, in vitro kultiviert und entweder menschlichen Erythrozyten oder allogenen Erythrozyten der Ratte ausgesetzt, die mit DeepRed markiert sind. Nach der Co-Inkubation wird die Durchflusszytometrie verwendet, um die Internalisierung von Erythrozyten durch Makrophagen zu beurteilen. Makrophagen werden durch CD163-Expression identifiziert, humane Erythrozyten durch CD235a und Ratten-Erythrozyten durch DeepRed-Fluoreszenz. Tote Zellen werden durch PI-Färbung ausgeschlossen, wodurch sichergestellt wird, dass nur lebensfähige Makrophagen analysiert werden.

Dieser Ansatz ermöglicht eine genaue, quantitative Bewertung der phagozytischen Aktivität von allogenen und xenogenen Erythrozyten in vitro und gibt Aufschluss über das Ausmaß der Makrophagen-vermittelten Immunclearance. In unseren Experimenten zeigten Rattenmakrophagen eine signifikant höhere Phagozytose von humanen Erythrozyten (5,08%) im Vergleich zu Ratten-Erythrozyten (1,59%), was zu einem relativen Phagozytoseindex von 3,21 führte. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der angeborenen Immunmechanismen in xenogenen Umgebungen und unterstreichen den Wert dieses Assays für die präklinische Modellvalidierung.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier vorgestellte Protokoll eine reproduzierbare und effiziente Methode zur Messung der Makrophagen-Phagozytose in vitro bietet. Es ist besonders nützlich für Forscher, die in den Bereichen Xenotransplantation, hämatopoetische Stammzellforschung und immunologische Kompatibilitätstests arbeiten. Durch die Bereitstellung eines standardisierten Rahmens für die Phagozytose-Quantifizierung kann dieser Assay zu einer verbesserten experimentellen Reproduzierbarkeit und einem besseren Verständnis der angeborenen Immunantworten in speziesübergreifenden Transplantationsmodellen beitragen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien und Verfahren durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Jiangsu (UJS-IACUC) genehmigt wurden (Zulassungs-Nr. UJS-IACUC-2021090102). Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Affiliated Hospital der Jiangsu University genehmigt. Alle Proben wurden von Patienten entnommen, die eine Einverständniserklärung erteilt hatten. Der entfernte Überstand sollte in einen speziellen Abfallflüssigkeitstank gegeben und der Abteilung für Infektionskrankheiten des Krankenhauses übergeben werden.

1. Isolierung von Makrophagen

1. Vorbereitung: Bereiten Sie die notwendigen Materialien vor, einschließlich Versuchsratten, Anästhesiebehälter, Becher und Isofluran als Anästhetikum, und kühlen Sie die Zentrifuge auf 4 °C vor.
2. Anästhesieren und Opfern der Ratten: Gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierpflege sollten Ratten nach Inhalation einer übermäßigen Isofluran-Anästhesie eingeschläfert werden.
3. Alkoholdesinfektion: Legen Sie die getötete Ratte in ein Becherglas und fügen Sie eine ausreichende Menge 75%iges Ethanol hinzu, um die Ratte vollständig zu bedecken. 10 Min. einweichen.
4. Injektion und Mischen von Bauchflüssigkeit: Desinfizieren Sie den Bauch der Ratte und injizieren Sie mit einer Spritze 50 ml eiskaltes, steriles PBS in die Bauchhöhle entlang der Mittellinie.
   1. Schütteln Sie die Ratte sanft und massieren Sie die Bauchdecke mit den Fingern, um eine gründliche Durchmischung der Flüssigkeit in der Bauchhöhle zu gewährleisten. 2-3 Min. einmassieren.
5. Sammlung der Bauchflüssigkeit: Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Bauchdecke der Ratte, kippen Sie den Körper leicht und saugen Sie die Bauchflüssigkeit mit einer Spritze ab.
6. Zentrifugation: Die aufgefangene Flüssigkeit bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
7. Erythrozytenlyse: Fügen Sie das 3-5-fache des Zellpelletvolumens des RBC-Lysepuffers hinzu und mischen Sie es vorsichtig für 1-2 Minuten.
   HINWEIS: Wenn das Volumen des Zellpellets beispielsweise 1 ml beträgt, fügen Sie 3-5 ml Lysepuffer hinzu. Dieser Schritt kann bei Raumtemperatur oder bei 4 °C durchgeführt werden, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400-500 x g für 5 min. Die Zentrifugation bei 4 °C ist effektiver. Aufgrund des osmotischen Drucks werden die Erythrozyten lysiert und die Lösung färbt sich rot. Nach der Zentrifugation den roten Überstand entfernen.
   1. Rezept für Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC): Löse 8,3 g NH4Cl, 1,0 g KHCO3 und 1,8 ml 5 % EDTA in 800 ml destilliertem H₂O und filtere durch einen 0,2-μm-Filter, qs bis 1000 ml mit destilliertem H₂O und stelle den pH-Wert von 7,2 ~ 7,4 ein. Wenn der rote Niederschlag noch sichtbar ist, wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Lösung klar und transparent wird. In der Regel hat eine kleine Menge an verbleibenden Erythrozyten keinen Einfluss auf nachfolgende Assays (wenn nur wenige Erythrozyten im Pellet vorhanden sind, kann dieser Schritt weggelassen werden).
8. Zellwäsche: Waschen Sie die Zellen zweimal mit ca. 10 ml vorgekühltem RPMI 1640 Medium. Bei 500 x g für jeweils 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
9. Zellresuspension und -zählung: Resuspendieren Sie die Zellen in einem vorgekühlten Medium, das aus RPMI 1640 + 1 % FBS + 1 % PS besteht, zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Färbung und beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen.
10. Zellkultur: Falls eine Kultur erforderlich ist, säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 1 × 10⁶/ml in einer 24-Well-Kulturplatte mit 1 ml RPMI 1640-10 % FBS-1 % PS-Medium pro Well. Tauschen Sie nach 2 Stunden Inkubation das Medium aus und waschen Sie die Vertiefungen 1-2 Mal mit RPMI 1640 Medium, um nicht adhärente Zellen zu entfernen.
    HINWEIS: Die adhärenten Zellen bilden eine Monoschicht aus Makrophagen. Wenn eine RNA-Extraktion erforderlich ist, fügen Sie dem Zellpellet 1 ml Trizol hinzu, pipettieren Sie mehrmals, um die Zellen zu zerstören, und geben Sie die Mischung zur sofortigen RNA-Extraktion in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen oder lagern Sie sie bei -80 °C. Für die FACS-Analyse stellen Sie die Zellzahl auf 1 × 10⁶ pro Röhrchen ein, fügen Sie 20 μl FACS-Puffer hinzu und fahren Sie mit der FACS-Färbung fort. FACS-Puffer: DPBS + 2% FBS, Filter sterilisieren durch einen 0,22 μm Filter, gelagert bei 4 °C).

2. Entnahme von Erythrozyten von Ratten oder Menschen

1. Zubereitung: 15 mL Zentrifugenröhrchen und 10 mL Spritzen mit Heparin vorspülen.
2. Entnahme von Rattenherzblut: Nachdem Sie die Ratte betäubt und geopfert haben, schneiden Sie vorsichtig einen kleinen Abschnitt des Schwanzes der Ratte mit einer Schere ab und sammeln Sie Blut aus der Schwanzvene.
3. Entnahme von menschlichem Blut: Sammeln Sie menschliches Blut mit der Venenpunktionstechnik.
4. Mischen von Blutproben: Mischen Sie 1 ml PBS mit 1 ml venösem Blut oder Rattenblut.
5. Ficoll-Dichtegradiententrennung: Geben Sie 1,5 ml Ficoll-Lösung mit einer Dichte von 1,077 in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen für menschliches peripheres Blut; 1,5 ml Ficoll-Lösung mit einer Dichte von 1,084 in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen für Rattenblut geben.
6. Schichtung von Blutproben: Schichten Sie die verdünnten Blutproben langsam entlang der Wand des Zentrifugenröhrchens auf die entsprechende Dichtegradientenlösung.
7. Zentrifugation: Zentrifugieren Sie bei 400 x g für 30 min bei einer Temperatur von 18-20 °C.
8. Entfernung von Plasma- und Lymphozytenschichten: Entfernen Sie die obere Plasmaschicht, die Lymphozytenschicht und die Ficoll-Lösungsschicht, sodass nur die untere Schicht der roten Blutkörperchen übrig bleibt.
9. Waschen der roten Blutkörperchen: Waschen Sie die Erythrozyten einmal mit 10 ml PBS.
10. Zentrifugieren und Entfernen des Überstands: Bei 400 x g für 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
11. Zellresuspension und -zählung: Geben Sie 1 ml RPMI 1640 Medium in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, mischen Sie es mit einer angemessenen Menge Pellet roter Blutkörperchen und führen Sie eine Zellzählung durch.

3. In-vitro-Phagozytose-Assay

1. Isolierung und Kultur von Makrophagen: Isolieren Sie Makrophagen und säen Sie sie mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/Well in einer 12-Well-Kulturplatte aus. Bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 2 h inkubieren, damit die Zellen anhaften können.
2. Entfernung von nicht adhärenten Zellen: Nach 2 Stunden Inkubation nicht adhärente Zellen vorsichtig entfernen und vorsichtig mit RPMI 1640 Medium waschen.
3. Fortgesetzte Kultur: Kultivieren Sie die adhärenten Makrophagen bis zu 2 Stunden lang, um eine vollständige Haftung am Boden der Kulturplatte zu gewährleisten.
4. Hungerbehandlung: Ersetzen Sie nach 2 Stunden das Medium durch serumfreies RPMI 1640 und inkubieren Sie es 2 Stunden lang unter Hungerbedingungen, um die phagozytische Aktivität der Makrophagen zu erhöhen.
5. Zugabe von humanen Zellen: Mit DeepRed vorgefärbte humane Zellen in die Kulturplatte geben und bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 2 h inkubieren, damit Makrophagen die menschlichen Zellen phagozytieren können.
6. Schlussfolgerung und Analyse: Nach dem Phagozytose-Assay ist die phagozytische Aktivität unter dem Mikroskop zu beobachten oder mittels Durchflusszytometrie (FACS) zu quantifizieren.

4. Durchflusszytometrie

1. Zellvorbereitung: Verdauen Sie die Zellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA und stoppen Sie den Verdau mit RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS. Zentrifugieren Sie die Zellen, verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in FACS-Puffer und zählen Sie sie. Bereiten Sie 1 × 10⁶ Zellen pro Röhrchen in zwei Röhrchen vor. Bereiten Sie zusätzlich ein Röhrchen mit menschlichen Erythrozyten und ein Röhrchen mit Erythrozyten von Ratten vor.
2. Vorbereitung des Einzelfärberöhrchens: Geben Sie den Maus-Anti-Ratten-CD163-Antikörper in ein Probenröhrchen, den Maus-Anti-Human-CD235a-Antikörper in das menschliche Röhrchen der roten Blutkörperchen und DeepRed in das Röhrchen der roten Blutkörperchen der Ratte.
   1. Inkubieren Sie diese Röhrchen 30 Minuten lang unter Lichtschutz auf Eis und mischen Sie sie alle 10 Minuten. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu, um alle ungebundenen Antikörper abzuwaschen, zentrifugieren Sie und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl FACS-Puffer.
3. Probenvorbereitung: Geben Sie Maus-Anti-Ratten-CD163, Maus-Anti-Human-CD235a-Antikörper und DeepRed in die Probenröhrchen. 30 min auf Eis lichtgeschützt inkubieren, alle 10 min mischen. Geben Sie 1 ml FACS-Puffer in jedes Probenröhrchen, um alle ungebundenen Antikörper abzuwaschen, zentrifugieren Sie und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl FACS-Puffer.
4. Analyse: Ausschluss der Zelladhäsion durch Gating auf FSC-H versus FSC-A. Verwenden Sie die Einzelfärberöhrchen, um die entsprechenden Spannungs- und Kompensationseinstellungen einzustellen, bevor Sie die Proben analysieren (Abbildung 1). Analysieren Sie die Daten mit der Software FlowJo v10.8.1.
   HINWEIS: Zur Einstellung der Kompensation wurden CD163-FITC und PI einfach gefärbte Steuerungen verwendet.

Ergebnisse

Durch die durchflusszytometrische Analyse können wir auf die Phagozytoserate von Rattenmakrophagen gegenüber humanen Erythrozyten und Ratten-Erythrozyten schließen. Tote Zellen werden zunächst mittels PI ausgeschlossen. CD163-positive Makrophagen, die CD235a-positive Makrophagen exprimieren, weisen auf die Phagozytose menschlicher Erythrozyten hin. Der Anteil der Makrophagen, die phagozytierte hRBCs aufweisen, ist definiert als die Phagozytoserate von Rattenmakrophagen gegenüber humanen ...

Diskussion

In dieser Studie wurde ein robuster und reproduzierbarer in vitro Assay zur Bewertung der Makrophagen-vermittelten Phagozytose sowohl von xenogenen als auch von allogenen Erythrozyten etabliert. In dieser Studie wurden humane Erythrozyten mit CD235a-BV421 markiert, während Erythrozyten von Ratten mit DeepRed-Farbstoff gefärbt wurden. Wenn Makrophagen die markierten Erythrozyten phagozytieren, werden die konjugierten Antikörper (CD235a-BV421) oder der Farbstoff (DeepRed) zusammen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,05 % Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25300062
Tiefrote Blutzellen-Tracker	ThermoFisher	C34565	Das Pulver (15 & mu; g) wurde im DMSO aufgelöst (20 & mu; L)
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma	D2650
Dulbeccos Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (DPBS)	ThermoFisher	C10010500BT
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva	17144002
Ficoll-Paque PREMIUM	Cytiva	17544602
Maus-Antihuman-Antikörper CD235a BV421	BD Biosciences	562938
Maus-Antiratten-Antikörper CD163 FITC-Antikörper	BIO-RAD	MCA342F
Protein K	Sigma	P2308
RPMI 1640	ThermoFisher	11875093