Methodenartikel

Einfaches und wirksames Verfahren zur Hämostase in den Mausarterien

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DOI:

10.3791/68907

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28. November 2025

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1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases, Ministry of Education, and Key Laboratory of Ruminant Infectious Disease Prevention and Control (East), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 3Manzhouli International Travel Health Care Center, 4Shenyang Baihao Biotechnology Co., Ltd., 5The Affiliated Animal Hospital of Jinzhou Medical University, Collaborative Innovation Center Zoonosis Prevention and Treatment of Jinzhou Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie zielt darauf ab, eine wirksame Methode zur Erreichung von Hämostase in Mausarterien zu entwickeln.

Zusammenfassung

Bei arteriellen Punktionen oder Kanülöffnungen bei Mäusen ist oft eine dauerhafte Ligatur der Arterie erforderlich, da die Hämostase nach dem Nadelentzug schwierig ist. Dies führt zu einer dauerhaften ischämischen Verletzung im zugeführten Gewebebereich. Eine solche lokalisierte Ischämie führt häufig zu sekundären Komplikationen und beeinträchtigt die experimentellen Ergebnisse in Tiermodellen. Die derzeitige Methode zielt darauf ab, die Einstichstelle nach dem Eingriff zu versiegeln und gleichzeitig den normalen Blutfluss aufrechtzuerhalten, um eine postoperative Ischämie zu verhindern. Bei dieser Methode wird ein Fettgewebefragment direkt vom Versuchstier entnommen, eine arterielle Punktion mit Standardtechniken durchgeführt und anschließend die Stichstelle mit dem Fettpolster umwickelt, um eine Hämostase zu erreichen und gleichzeitig die Durchblutung aufrechtzuerhalten. In dieser Studie wurde bei Mäusen eine beidseitige Punktion der gemeinsamen Halsschlagader durchgeführt, gefolgt von einer Hämostase mit einer Fettumwicklungstechnik. Die Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI) zeigte keine Unterschiede in den Veränderungen des zerebralen Blutflusses zwischen der Placebo- und der operierten Mäusegruppe, und es wurden keine signifikanten Veränderungen bei präoperativen versus postoperativen cerebralen Blutflussmessungen in der operierten Gruppe beobachtet. Die histologische Untersuchung, die 7, 14 und 28 Tage nach der Operation durchgeführt wurde, ergab: (1) die Hirnarchitektur (H&E-Färbung), (2) die neuronale Morphologie intakte ohne degenerative Veränderungen (Nissl-Färbung) und (3) das Fehlen pathologischer Veränderungen in Hirnschnitten. Diese arterielle Hämostase-Technik nutzt die biegsame Natur des Fettgewebes und physiologischer Gerinnungsmechanismen. Der Eingriff umfasst: (1) das Umwickeln autologs Fett um die Einstichstelle, (2) das Sichern mit Nähten, um optimalen Kontakt mit der arteriellen Adventitie sicherzustellen, und (3) das Eindringen des entweichenden Blutes in die Fett-Arterie-Schnittstelle zu lassen, wo es gerinnt. Dieser Dreifachmechanismus ermöglicht eine zuverlässige Hämostase, erhält die arterielle Patency und verhindert ischämische Komplikationen postoperativ. Die Methode zeigt bemerkenswerte prozedurale Einfachheit, klinische Wirksamkeit und ausgezeichnetes translationales Potenzial.

Einleitung

In Tiermodellen ist die Erzeugung von arteriellen Verletzungen ein umfangreich genutzter experimenteller Ansatz zur Modellierung verschiedener pathologischer Zustände, darunter zerebrale Ischämie-Reperfusionsmodelle, Karotis- (CCA) oder Aorten- (AO) Atherosklerosemodelle sowie Modelle der Rückenmarksischämie.

Nimmt man das Modell der zerebralen Ischämie-Reperfusion (MCAO) der Mäuse als Beispiel sieht der aktuelle Standardmodellierungsansatz 1,2,3 darin vor, die äußere Halsschlagader (ECA) isolieren, ihr distales Ende ligaturieren, das proximale ECA mit einem arteriellen Clip klemmen, während eine Streunaht gesetzt wird, ein Einstichloch zwischen diesen Punkten entstehen und ein Filament rückwärts durch das CCA eingeführt werden, Sicherung von Gefäß und Filament mit der Stagnaht, Durchschneiden des ECA zwischen der Einstichstelle und der distalen Ligatur, Lösen des arteriellen Clips, Umleitung des Filaments in die interne Halsschlagader (ICA), um die mittlere Gehirnarterie zu verschließen, und beim Zurückziehen des Filaments die proximale ECA ligadieren.

Obwohl dieses Verfahren eine Reperfusion erreicht, stellt es nur den Blutfluss zwischen dem Common und ICA wieder her, wodurch die ECA dauerhaft getrennt ist. Diese ECA-Durchschnitt verursacht ischämische Schäden an den ipsilateralen Gesichtsregionen, eine unbeabsichtigte Verletzung, die nicht nur den chirurgischen Eingriff erschwert, sondern auch Störungstraumata bei Versuchstieren verursacht und die Studienergebnisse gefährden kann. Besorgniserregender ist, dass in einigen experimentellen Protokollen 4,5 Forscher eine direkte CCA-Punktion durchführen, eine Naht eingesetzt wird, um das MCAO zu etablieren, und dann sofort entfernt wird, gefolgt von einer dauerhaften Ligierung an beiden Enden der Punktionsstelle zur Hämostase. Diese Methode erhöht jedoch direkt den Gefäßdruck, was die Herznachlastung erhöht und möglicherweise zu Herzinsuffizienz6 führt.

Unter Verwendung des Maus-CCA- oder AO-Endothel-Verletzungsmodells mit einer fettreichen Ernährung zur Etablierung von Atherosklerose beinhaltet die konventionelle Methodik 7,8,9,10 die Durchführung von arteriellen Punktionen in der CCA, der Bauchaorta (AA) oder der Femurarterie (CFA), das Einsetzen eines Ballonkatheters zur Einleitung der Endothelentudation und die Hämostase durch dauerhaftes Ligaieren beider Enden der Einstichstelle. Dieser Standardansatz weist mehrere kritische Einschränkungen auf: Die obligatorische Ligation erzeugt eine lokalisierte Ischämie distal vom Okklusionsort. Noch schädlicher ist, dass die Lipidansammlung an den Ligationsstellen stattfindet. Die Validität des Kompromissmodells wird durch die Beeinflussung lokaler Hämodynamik beeinflusst, die die Arzneimittelabgabe zur Zielerfassung von Läsionen beeinträchtigt und die pharmakologischen Bewertungsergebnisse verzerrt.

Im Modell der Maus-Rückenmarksischämie umfasst der Eingriff eine arterielle Punktion (über CCA-, AA- oder CFA-Zugang), gefolgt vom Einsetzen eines Ballonkatheters, um an den Zielstellen Ischämie zu induzieren11. Nach dem Ballonentzug wird die konventionelle Hämostase durch dauerhaftes Ligieren der Punktionsstelle beidseitig erreicht.

In allen drei genannten Modellen wird die Hämostase nach der Punktion einheitlich durch beidseitige Ligierung der Stichstelle erreicht. Obwohl wirksam zur Blutungskontrolle, führt dieser Ansatz zwangsläufig zu lokalisierter Ischämie, was zu sekundären Komplikationen führt, die letztlich die Modellvalidität beeinträchtigen. Die Aufrechterhaltung der vaskulären Öffnung während hämostatischer Eingriffe ist daher physiologisch und experimentell entscheidend. Daher stellt dieser Artikel eine innovative, einfache und effektive arterielle Hämostasemethode für Mausexperimente vor. Der Eingriff beinhaltet zunächst das Abklemmen beider Enden der Einstichstelle mit arteriellen Gefäßklammern und anschließend das Umwickeln der Arterie mit einem 3 mm × 3 mm × 1 mm dicken Fettpad, um die Einstichung abzudecken. Das Fettpolster wird mit einer Ligaturnaht um die Arterie befestigt. Die arteriellen Klammern werden allmählich gelöst, und die Verspannung der Ligatur wird anhand der Blutung angepasst, bis eine vollständige Hämostase erreicht ist. Dieser Ansatz stellt die Durchblutung wieder her, hält die normale Hämodynamik aufrecht und verhindert ischämische Schäden an umliegenden Geweben, die durch dauerhafte Gefäßligierung verursacht werden. Es ist besonders vorteilhaft für die langfristige postmodellierende Beobachtung von Mauserkrankungen und zur Bewertung pharmakologischer Interventionen, wodurch die experimentelle Strenge präklinischer Studien erheblich verbessert wird.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden in strikter Einhaltung der Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt (Protokollgenehmigung Nr. SNLL25040501; Tierbenutzungslizenz Nr. SYXK(Liao) 2021 - 0010), gegründet vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Shenyang Agricultural University. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Experimentelle Vorbereitung

  1. Tierdetails und Dokumentation: Dokumentieren Sie alle Tierforschungsdaten gemäß den ARRIVE-Richtlinien (Tierforschung: Meldung von In Vivo-Experimenten). Verwenden Sie männliche Balb/C-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen, die 22 g ± 4 g wiegen. Halten Sie die Wohnverhältnisse bei 24 ± 2 °C mit 55 % ± 5 % relativer Luftfeuchtigkeit unter einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus.
  2. Tierzubereitung
    1. Betäuben Sie die Mäuse mit einem Isofluran-Verdampfer (nach institutionell genehmigten Protokollen). Anästhesie mit 4 % Isofluran induzieren und dann mit 2 % Isofluran aufrechterhalten.
    2. Nach der Anästhesie wird die Hals- und Schädelregion enthaart und die freiliegende Haut mit Povidon-Jod desinfiziert, gefolgt von 75 % Ethanol, um die Rückstände zu entfernen.
    3. Setzen Sie die Mäuse für alle weiteren experimentellen Verfahren auf ein 37 °C Heizkissen.
  3. Messung des Basisdurchflusses des Gehirns bei Mäusen
    1. Stellen Sie die Mäuse in eine Bauchlage auf. Mache einen Schnitt auf der Kopfhaut in der Mittellinie, um die Parietalknochen freizulegen. Sezieren Sie vorsichtig und entfernen Sie die darüber liegende Faszienschicht von der Schädeloberfläche.
    2. Stellen Sie das LSCI-System so an, dass es das freiliegende Mausparietalbein mit 10-facher Vergrößerung scannt, und erfassen Sie die Ausgangsdaten zum Gehirnblutfluss.
  4. Fettpolster entnehmen und arterielle Punktion durchführen
    1. Stellen Sie die Mäuse in Rückenlage um. Mach einen Mittellinien-Halsschnitt. Entnehmen Sie ein 3 mm × 3 mm × 1 mm großes subkutanes Fettgewebetransplantat für den späteren Gebrauch.
    2. Führen Sie eine stumpfe Dissektion der Submandibulardrüse, des Musculus sternohyoid und des Musculus sternocleidomastoideus durch. Decke beide CCA auf.
    3. Befreie die CCA, um ICA und ECA zu entlarven.
    4. Legen Sie Gefäßklemme 1 am distalen Ende des CCA an und setzen Sie Gefäßklemme 2 am proximalen Ende.
    5. Stechen Sie die CCA zwischen den beiden Klemmen mit einer 23-G-Nadel ein.
  5. Auftragen des Fettpolsters
    1. Nach der Nadelentfernung wickelt man die CCA an der Einstichstelle mit der Schnittfläche (nicht-Serosa-Seite) des Fettpads.
    2. Setzen Sie eine 4-0-Naht unter die fettumwickelte Stelle; Dann binde eine einzelne Kugel sanft über die Fettoberfläche, um Druck auszuüben und einen sicheren Kontakt zwischen der Fettplatte und der Gefäßwand auszuüben; Schließlich wird die Ligatur schrittweise angepasst, um einen Druckausgleich für die Hämostase zu erreichen.
    3. Heben Sie das distale CCA mit einem feuchten Wattestäbchen an. Gefäßklemme 1 lösen und den Abstrich langsam herausziehen, um einen allmählichen Blutfluss zur Einstichstelle zu ermöglichen.
    4. Überprüfen Sie die Durchblutung; Wenn aktive Blutungen festgestellt wurden, klemmen Sie das distale CCA mit Gefäßklemme 1 erneut an.
    5. Warte 1 Minute, dann löse langsam die Gefäßklemme 1; Bei einer Blutung wird das Fettpolster neu positioniert oder der einzelne Wurf der Ligatur leicht angespannt, um den Druck zu erhöhen; Setzen Sie diese Anpassungen fort, bis eine vollständige Hämostase erreicht ist.
    6. Heben Sie die proximale CCA mit einem feuchten Wattestäbchen an. Gefäßklemme 2 lösen und den Abstrich schrittweise herausziehen, um einen kontrollierten Blutfluss zur Stichstelle zu ermöglichen.
    7. Wenn eine Blutung auftritt, klemmen Sie die distale CCA erneut mit einer vaskulären Klemme 2.
    8. Ziehe den einzelnen Dreh der Naht leicht fest, um den Druck zu erhöhen; 1 Minute warten, dann die proximale CCA anheben und die Gefäßklemme 2 lösen; Langsam rollt er den feuchten Wattestäbchen in Richtung der Einstichstelle.
    9. Wenn die Blutung anhält, wiederholen Sie die beiden vorherigen Schritte, bis die vollständige Hämostase erreicht ist.
    10. Fügen Sie mit der Naht einen zusätzlichen Wurf hinzu, um einen Doppelknoten über dem ursprünglichen zu bilden, wodurch das Fettpolster besser an der Gefäßwand gesichert wird und durch ausgewogene intravaskuläre und äußere Kräfte eine Hämostase erreicht werden.
    11. Bestätigen Sie, dass die gemeinsamen Halsschlagader auf beiden Seiten des Fettpads gefüllt waren und einen konstanten Gefäßdurchmesser aufweisen; Betrachte dies als erfolgreiche Wiederherstellung des Blutflusses und Hämostase.
    12. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren, um eine Einstichhämostase an der kontralateralen Halsschlagader durchzuführen.
    13. Die beidseitigen gemeinsamen Halsschlagadern bei Scheinmäusen freizulegen, ohne Arterienpunktion oder Fettpolster zu wickeln, während alle anderen Verfahren identisch mit der operierten Gruppe bleiben.
    14. Nähen Sie den chirurgischen Zervikalschnitt und wenden Sie ein Antiseptikum auf.
  6. Durchführung postoperativer Untersuchung des zerebralen Blutflusses
    1. Nach Abschluss der beidseitigen CCA-Puncturhämostase bei den Mäusen wird das LSCI-System angepasst, um das freiliegende Parietalbein zu scannen und 10-fach vergrößerte Bilder zu machen; Dann dokumentieren Sie die Veränderungen des zerebralen Blutflusses.
    2. Nähen Sie den Kopfhautschnitt und tragen Sie Desinfektionsmittel auf, lassen Sie die Mäuse sich auf einem 37 °C Heizkissen erholen, bevor Sie sie zur weiteren Pflege in den Halterkäfig zurückbringen.
  7. Durchführung postoperativer Überwachung und Gewebeentnahme
    1. Überwachen und dokumentieren Sie täglich den Überlebensstatus, die motorische Aktivität und etwaige Anzeichen von Blutungen im cervicomandibulären Bereich der Mäuse während der postoperativen Zeit.
    2. An den postoperativen Tagen 7, 14 und 28 werden die Mäuse mit Kohlendioxid (gemäß den institutionell genehmigten Protokollen) eingeschläfert und das Gehirngewebe in 4%igen Paraformaldehyd repariert.

2. Pathologische Untersuchung

  1. Nach 24 Stunden Fixierung wird das Gehirngewebe durch einen Ethanolgradienten dehydriert, mit Xylol entfernt und Paraffin zur Sektionierung eingebettet.
  2. Führen Sie H&E-Färbungen an Hippocampusschnitten durch und untersuchen Sie die Morphologie des Gehirngewebes unter dem Mikroskop.
  3. Führen Sie eine Nissl-Färbung an Hippocampusschnitten durch und untersuchen Sie die neuronale Architektur unter dem Mikroskop.

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Ergebnisse

Die Analyse der prä- und postoperativen Laser-Speckle-Kontrastbildaufnahmen sowie der relativen Perfusionsmessungen sowohl in der Placebo- als auch in der operierten Gruppe zeigte keine signifikanten Veränderungen und zeigte, dass diese arterielle Hämostase-Technik die Punktionsstelle der gemeinsamen Halsschlagader erfolgreich versiegelte, ohne den zerebralen Blutfluss zu beeinträchtigen (Abbildung 1).

Die Mäuse in der operierten ...

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Diskussion

In MCAO-Modellen rekapituliert die Erhaltung der ECA die klinische Pathologie besser, indem sie gesichtischämische Schäden im Zusammenhang mit ECA-Ligation und -Transsektion verhindert. Während der konventionelle Ansatz der Filamentinsertion mittels CCA-Punktion technische Einfachheit bietet, erfordert er eine beidseitige Ligatur der Stichstelle, was zu einer zerebralen Perfusion führt, die von der Circle of Willis-Kollateralzirkulation abhängt, einer suboptimalen Darstellung de...

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Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Scientific Research Project der Customs General Administration (Fördernr. 2005HK006) unter dem Projekttitel "Forschung, Entwicklung und Anwendung der Multiplex-Pathogen-Nachweistechnologie für Vektoren – übertragene Infektionskrankheiten in den Grenzgebieten Nordchinas" unterstützt. Und diese Arbeit wurde auch vom Nationalen Schlüssel-F&E-Programm Chinas (Zuschuss Nr. 2022YFC2302700) und dem Internationalen Programm für Wissenschafts- und Technologiekooperation des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (Zuschuss Nr. KY201901014). Die erfolgreiche Entwicklung dieser arteriellen Hämostase-Methode gebührt Professor Perry (Chefredakteur des Perry Manual of Mouse Experiments) für seine fachkundige Anleitung und der RWD Life Science Co., Ltd. (Shenzhen) für die Bereitstellung des Laser-Speckle-Kontrastbildgebungssystems großen Dank. Unser Mentor Professor Han Xiaohu, und Shenyang Biohao Biotech Co., Ltd., für ihre unschätzbare Unterstützung wurde aufrichtig gedankt. Ein herzlicher Dank gilt auch allen Mitwirkenden, die diese Forschung ermöglicht haben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4-0 mit FadennadelShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd
Balb/C-MausBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd6-8w, männlich
DHG-Serie Heiz- und TrocknungsofenShanghai Yiheng Technology Co., LtdDHG-9123A
Hämatoxylin und Eosin (H& E) Hochauflösendes FärbungssetServicebioG1076-500ML
IsofluraneShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdR510-22
Laser-Speckle-AnalysatorShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdRFLSI ZW
Nissl-FarbstofflösungServicebioG1036-100ML
Organisatorische EinbettungsmaschineLeicaHistoCore Arcadia H
Objektbildbildsystem für Dia-ScanningShenzhen Shengqiang Technology Co., LtdSQS-40R
Kleintier-AnästhesiemaschineShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdR500
GewebedehydratorLeicaHistoCore-Perle
Ultrareines WassersystemThermo50132370
Ultradünnes halbautomatisches MikrotomLeicaHistoCore MULTICUT

Referenzen

  1. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
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