Methodenartikel

Mikrofluidischer Chip für axonale Verletzungsmodelle, Aufbau und Ermöglichung von Multi-Omics-Analysen

DOI:

10.3791/68915

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14. Oktober 2025

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1Beijing Advanced Innovation Center for Big Data-Based Precision Medicine, Beihang University, 2Interdisciplinary Innovation Institute of Medicine and Engineering, Beihang University, 3School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 4School of Software, Beihang University, 5School of Beijing, Beihang University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt ein mikrofluidisches System, das die neuronale Stoffwechseldynamik nach axonaler Verletzung modelliert und Bildgebung, Multi-Omics-Analysen und mechanistische Studien des intrinsischen metabolischen Umbaus ermöglicht.

Zusammenfassung

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Neuronen polarisieren zu Dendriten und Axonen und ermöglichen so die interzelluläre Kommunikation. Eine axonale Verletzung stört diese Verbindungen und leitet Schadenssignale an das Soma weiter, was oft zu einer neuronalen Degeneration führt. Daher ist die Aufrechterhaltung der axonalen Homöostase unerlässlich, um die lokale Axonregeneration zu fördern und vor Neurodegeneration zu schützen. Dieser Prozess beruht auf dem zellulären Stoffwechsel, um Energie und biosynthetische Vorläufer bereitzustellen, und wird durch Mechanismen unterstützt, die das metabolische Gleichgewicht regulieren und Nebenprodukte eliminieren. Der neuronale Stoffwechsel ist jedoch zwischen dem Soma und dem Axon unterteilt und wird in vivo weiter durch die umgebende Mikroumgebung beeinflusst, wie z. B. die von Astrozyten abgeleitete Stoffwechselaktivität (z. B. das Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttle). Diese Faktoren erschweren die Untersuchung der intrinsischen Stoffwechselmechanismen von Neuronen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir hier eine mikrofluidische Plattform für die Kultivierung primärer kortikaler Neuronen in vitro entwickelt, die wichtige in vivo beobachtete metabolische Eigenschaften beibehält, einschließlich des physiologischen glykolytischen Flusses und der mitochondrialen Atmung. Dieses System bietet ein vereinfachtes Modell zur Untersuchung des intrinsischen metabolischen Umbaus in Neuronen nach axonaler Verletzung. Herkömmliche mikrofluidische Chips unterstützen in vitro axonale Verletzungsmodelle und sind kompatibel mit der Bildgebung lebender Zellen, der Immunfluoreszenzfärbung und der Hypoxiebehandlung. Um groß angelegte transkriptomische und metabolomische Analysen mit Millionen von Zellen zu ermöglichen, haben wir außerdem mikrofluidische Hochdurchsatz-Chips mit optimierten Betriebsprotokollen entwickelt und hergestellt. Das Gerät verfügt über abwechselnd angeordnete Soma- und Axonkammern, die durch Mikrokanäle verbunden sind, und die axonale Verletzung wird durch Vakuumaspiration von Flüssigkeit aus dem Axonkompartiment induziert. Diese Plattform ermöglicht eine schnelle Bewertung der Metaboliten- und Enzymdynamik und verbessert so die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Multi-Omics-Untersuchungen.

Einleitung

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Neuronen etablieren zwei unterschiedliche Arten von Vorsprüngen mit spezialisierten Funktionen, Axone und Dendriten, durch Polarisation während der Entwicklung 1,2. Die Nervenregeneration bezieht sich auf den Prozess des axonalen Nachwachsens nach einer neuronalen Verletzung3, wobei der Forschungsschwerpunkt auf der Reparatur des Zentralnervensystems (ZNS) liegt. Im Gegensatz zum peripheren Nervensystem verfügt das ZNS über eine eingeschränkte Regenerationsfähigkeit 4,5,6, was bei Patienten mit Rückenmarksverletzungen oder traumatischen Hirnverletzungen häufig zu anhaltenden Funktionsbeeinträchtigungen oder dauerhaften Behinderungen führt 7,8. Daher sind die Entwicklung von Strategien zur Verbesserung der ZNS-Reparatur und die Aufklärung der Mechanismen, die der axonalen Regeneration zugrunde liegen, von entscheidender Bedeutung.

Mikrofluidische Bauelemente, die als integrierte, kostengünstige und hochdurchsatzfähige In-vitro-Kultursysteme fungieren, haben in den letzten Jahren in der Zell- und Neuronenforschung bemerkenswerte Vorteile gezeigt 9,10. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden ermöglicht die mikrofluidische Technologie eine präzise Regulierung von Scherspannungen, Konzentrationsgradienten und räumlichen Strukturen, wodurch authentische physiologische und pathologische Mikroumgebungen genau simuliert werden, um das Zellwachstum, die Migration, die Differenzierung und die Wechselwirkungen zu fördern 11,12,13,14. Mikrofluidik-basierte in vitro axonale Verletzungsmodelle ermöglichen die kompartimentelle Kultivierung neuronaler Zellkörper und -prozesse durch räumliche Polarisation und stellen ein unverzichtbares Werkzeug für die Erforschung der intrinsischen Regenerationsfähigkeit von Neuronen und ihrer metabolischen Anpassungen nach Verletzungen dar15,1 6,17,18. Es bietet einen wichtigen Einblick in die Reaktion von Neuronen auf Verletzungen, die Regulierung von Stoffwechselprozessen19 und die Förderung der axonalen Regeneration20. Bestehende mikrofluidische Plattformen für die axonale Verletzungs- und Stoffwechselforschung stehen jedoch immer noch vor Herausforderungen, darunter geringe neuronale Zellausbeuten, verringerte Genauigkeit bei Stoffwechselmessungen und ein Mangel an standardisierten Betriebsverfahren.

Als Reaktion auf diese Einschränkungen wurde in dieser Studie eine neuartige großmaßstäbliche mikrofluidische Plattform entwickelt, die eine standardisierte Hochdurchsatz-Induktion von axonalen Verletzungen ermöglicht und ausreichend Zellmaterial für kompartimentierte Multi-Omics-Analysen liefert. Dieses integrierte Design stellt sich direkt dem kritischen ungedeckten Bedarf in der Forschung zu neuronalen Verletzungen. Konkret zeichnet sich der von uns entwickelte mikrofluidische Chip durch eine abwechselnde Anordnung von somalen und axonalen Kammern aus, die durch Mikrorillen verbunden sind, wobei die axonale Durchtrennung durch kontrollierte Vakuumaspiration erreicht wird. Dieser Ansatz ist ideal für Studien, die reproduzierbare axonale Verletzungsmodelle mit hohem Durchsatz und präzises metabolisches Profiling erfordern, wie z. B. die Untersuchung der metabolischen Mechanismen, die der axonalen Regeneration zugrunde liegen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden bietet diese Technik einen höheren Durchsatz, eine höhere metabolische Präzision und die Möglichkeit, standardisierte Verletzungsmodelle zu etablieren. So haben frühere Studien beispielsweise die Bedeutung des mitochondrialen Transports für die axonale Regeneration gezeigt 20,21,22,23, während unsere Plattform die Rolle des Glukosestoffwechsels bei der axonalen Regeneration nach Verletzungen weiter aufzeigt. Dieses Protokoll etabliert ein technisches System für groß angelegte Axotomie und Stoffwechselanalyse, das sowohl visuell überprüfbar als auch operativ standardisiert ist.

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Protokoll

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Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Ethikkommission der Beihang Universität durchgeführt und von der Kommission genehmigt (Zulassungscode: BM20210060). Abbildung 1 zeigt den Zeitplan für die Experimente.

1. Aufbau des konventionellen und großflächigen mikrofluidischen Geräts

  1. Entwerfen Sie das mikrofluidische Gerät mit AutoCAD, um zweidimensionale (2D) Schaltpläne und dreidimensionale (3D) Strukturmodelle zu erstellen.
  2. Verwenden Sie diese Designs, um eine Masterform auf einem Siliziumwafer mit SU-8-Negativ-Photolithographie herzustellen.
  3. Replizieren Sie die Urform durch Gießen von Polydimethylsiloxan (PDMS), was zu einem hochpräzisen, funktionalen mikrofluidischen Chip führt.
  4. Gestalten Sie jeden Mikrokanal so, dass er 5 μm hoch ist, so dass nur Axone passieren können, während Somas blockiert werden.
  5. Machen Sie die Mikrokanäle 10 μm breit, um die axonale Kapazität zu erhöhen.
  6. Die Kammern sind so konzipiert, dass sie 120 μm hoch und 220 μm breit sind, um genügend Platz für neuronale Soma zu schaffen.
  7. Verwenden Sie diese mikrofluidische Plattform, um in vivo axonale Verletzungen zu simulieren, indem Sie den Flüssigkeitsfluss und die Platzierung von Neuronen steuern.
  8. Bereiten Sie mit dem Gerät metabolomische und transkriptomische Proben für eine hochpräzise Zellmanipulation vor und ermöglichen Sie eine Hochdurchsatzverarbeitung, um die Probengenauigkeit und biologische Validität zu verbessern.

2. Herstellung von konventionellen und großmaßstäblichen mikrofluidischen Bauelementen

  1. Wiegen Sie die PDMS-Basis und das Härter im Verhältnis 10:1 (w/w) und geben Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen.
  2. Legen Sie das Zentrifugenröhrchen mit dem PDMS-Gemisch in einen Zentrifugalrührmischer. Zum Mischen bei 2000 × g für 4 min zentrifugieren, dann erneut bei 2000 × g für 4 min zentrifugieren, um zu entgasen.
  3. Gießen Sie 13-15 g des entgasten PDMS in die mikrofluidische Form, wobei Sie darauf achten, dass der Boden der Form vollständig bedeckt ist.
  4. Lege die Form in einen Vakuum-Exsikkator. Verwenden Sie eine Vakuumpumpe, um die Luft für 5-10 Minuten zu evakuieren, um Blasen gründlich aus dem PDMS zu entfernen.
  5. Klopfen Sie mit einem Gummiball vorsichtig auf die Oberfläche des PDMS, um verbleibende Oberflächenblasen aufzubrechen.
  6. Die Form in einen Heißluftofen stellen und bei 80 °C 100 min backen, um das PDMS auszuhärten.
  7. Sobald das PDMS vollständig ausgehärtet ist, schieben Sie die Spitze eines Skalpells vorsichtig unter den Rand des PDMS, um es vorsichtig anzuheben und von der Form zu trennen.
  8. Verwenden Sie einen Biopsiestempel mit einem Durchmesser von 2,0-2,5 mm, um Löcher in das PDMS für die Infusion des Kulturmediums und die Zellbeladung zu bohren.
  9. Entfernen Sie alle Oberflächenverunreinigungen mit Klebeband vom PDMS, legen Sie es dann in eine saubere Glasschale und wickeln Sie es zur Aufbewahrung mit Aluminiumfolie ein.
  10. (Fakultativ) Behandeln Sie die PDMS-Oberfläche mit Sauerstoffplasma (30 W, 20 s) und drücken Sie sie dann gegen eine andere Oberfläche, um eine irreversible Verbindung zu erzielen.
  11. Vor dem Experiment wird das mikrofluidische Gerät 5 Minuten lang bei 121 °C und 101 kPa autoklaviert, um die Sterilität zu gewährleisten.

3. Vorbereitung der kortikalen Neuronen

  1. Betäuben Sie 3 postnatale Sprague-Dawley (SD) Ratten (innerhalb von 12 Stunden nach der Geburt), indem Sie sie 5 Minuten lang auf Eis legen, dann schnell enthaupten.
  2. Präparieren Sie den motorischen Bereich der Großhirnrinde und legen Sie das Gewebe in einen vorgekühlten Dissektionspuffer (z. B. 2 ml HBSS ohne Kalzium und Magnesium).
    HINWEIS: Führen Sie alle Gewebedissektionen auf Eis mit vorgekühlten Lösungen durch.
  3. Das Gewebe mit einer sterilen Schere in ca. 1 mm3 Stücke zerkleinern und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben.
  4. 5 Minuten stehen lassen und dann den Überstand vorsichtig absaugen, um das restliche Blut und den Puffer zu entfernen.
  5. Geben Sie vorgewärmte Papainlösung (1 mg/ml) in 5 mL HBSS mit Calcium und Magnesium, das auf 37 °C erhitzt wurde.
  6. In einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 -Gehalt 40 min inkubieren und das Röhrchen 3 Mal alle 10 min vorsichtig umdrehen.
  7. Nach dem Aufschluss wird die Suspension mit einer 200-μl-Pipette 100 Mal vorsichtig verzerrt.
    HINWEIS: Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen, um Zellstress zu vermeiden.
  8. Bei 300 × g 3 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  9. Fügen Sie eine Terminationslösung hinzu, die 1 mg/ml Proteasehemmer enthält (z. B. 600 μl Papain-Dissoziationssystem-Kit-Inhibitor-Fläschchen in 5 ml HBSS mit Calcium und Magnesium), um die Zellen zu resuspendieren.
  10. Die Zellsuspension wird durch ein 40 μm Zellsieb filtriert und das Filtrat in einem neuen Zentrifugenröhrchen gesammelt.
  11. Das Filtrat wird bei 200 × g 10 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen.
  12. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl vollständigem neuronalem Kulturmedium mit 2 % B27 und 1 % GlutaMAX.
  13. Zählen Sie die Zellen (ca. 3 Millionen/Ratte) und stellen Sie die Dichte für die spätere Verwendung auf 1 ×10 6 Zellen/ml ein.

4. Beschichtung

HINWEIS: Behandeln Sie die Deckgläser oder Kulturschalen mit Poly-D-Lysin (PDL)-Lösung, um die Adhäsion der Neuronen zu verbessern und eine optimale Umgebung für das neuronale Wachstum zu schaffen.

  1. Beschichtung von Deckgläsern
    1. Legen Sie ein Deckglas für herkömmliche mikrofluidische Geräte (Φ25 mm, Dicke 0,17 mm) in eine 35-mm-Kulturschale und fügen Sie 2 mL 0,1 mg/mL PDL-Lösung hinzu.
    2. Bei 37 °C für 6 h oder über Nacht inkubieren.
    3. Holen Sie die PDL-Lösung nach der Inkubation vorsichtig zur Wiederverwendung oder ordnungsgemäßen Entsorgung zurück.
    4. Geben Sie 2 ml steriles Reinstwasser in die Schale und drehen Sie sie 50 Mal im Uhrzeigersinn, gefolgt von 50 Mal gegen den Uhrzeigersinn (bei mehreren Schalen drehen Sie sie gleichzeitig in einer größeren Schale).
    5. Saugen Sie das Wasser mit einer Vakuumpumpe an, die an eine sterile Pipettenspitze angeschlossen ist, und sammeln Sie den Abfall in einem Behälter für flüssige Abfälle.
    6. Wiederholen Sie den Waschvorgang (Schritte 4.1.4-4.1.5) insgesamt dreimal.
    7. Lassen Sie die Deckgläser vor der Verwendung in einer Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen.
  2. Beschichtung von Kulturschalen
    1. Geben Sie eine angemessene Menge von 0,1 mg/ml PDL-Lösung in die Kulturschale oder Well-Platte (z. B. geben Sie 2 mL in eine 35-mm-Schale für konventionelle Mikrofluidik und 5 mL in eine 10-cm-Schale für großflächige Mikrofluidik).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Biosicherheitswerkbank ordnungsgemäß mit sterilem Luftstrom funktioniert, um eine Kontamination zu vermeiden.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Lösung den Boden vollständig bedeckt, und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 6 Stunden oder über Nacht.
    3. Nach der Rückgewinnung der PDL-Lösung wird die Kulturschale dreimal mit einer angemessenen Menge sterilem Reinstwasser gewaschen, wie in Schritt 4.1.4 beschrieben.
    4. Entfernen Sie restliches Reinstwasser und trocknen Sie die Kulturschale für die spätere Verwendung in einer Laminar-Flow-Haube an der Luft.

5. Vorbereitung des neuronalen Mediums

  1. Bereiten Sie das komplette Medium für die routinemäßige Neuronenkultur vor.
    1. Entfernen Sie den Kolben von einer 50-ml-Einwegspritze. Legen Sie die Spritze mit dem Gummikopf nach oben auf eine saubere Bank in einer Biosicherheitswerkbank.
    2. Geben Sie nacheinander 500 μl Penicillin-Streptomycin (PS), 1 ml B27, 125 μl GlutaMAX und 500 μl fötales Rinderserum (FBS) nacheinander in die Spritze. Wechseln Sie die Pipettenspitze für jede Komponente, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
      HINWEIS: Fügen Sie jede Komponente in der angegebenen Reihenfolge hinzu, um die Konsistenz zu wahren.
    3. Nehmen Sie ein neues steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Beschriften Sie es als "Neurobasal-A (NBA) + 2% B27 + 0,25% GlutaMAX + 1% FBS + 1% PS".
      HINWEIS: Verwenden Sie NBA, wenn es sich nicht um embryonale Neuronen handelt. Verwenden Sie neurobasal (NB) für embryonale Neuronen.
    4. Befestigen Sie einen 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter am Ende der Spritze.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Filter fest mit der Spritze verbunden ist, um ein Auslaufen zu verhindern.
    5. Verwenden Sie NBA, um die Spritze mit Flüssigkeit bis zu 50 ml zu füllen, einschließlich des Volumens der Additive. Setzen Sie den Kolben wieder ein.
    6. Drücken Sie den Kolben langsam mit ca. 2 ml/s, um die Flüssigkeit in das markierte Zentrifugenröhrchen zu filtrieren.
    7. Ziehen Sie die Kappe des Zentrifugenröhrchens fest. Drehen Sie das Rohr 3-5 Mal um, um das Medium zu mischen.
  2. Vollständiges Medium mit [U-13C6]-Glukose (für die Analyse des metabolischen Flusses): Für die Analyse des metabolischen Flusses des Glukosestoffwechsels in geschädigten Neuronen verwenden Sie zuckerfreies NBA, um ein vollständiges Medium mit [U-13C6]-Glukose herzustellen.
    1. Verwenden Sie glukosefreies NBA als Basislösung und geben Sie vor der Filtration [U-13C6]-Glukose bis zu einer Endkonzentration von 25 mM hinzu (wenn [U-13C6]-Glukose fest ist, berechnen und wiegen Sie sie im Voraus). Halten Sie sich an die gleiche Reihenfolge für die Zugabe anderer Komponenten sowie an die Filtrations- und Mischschritte, wie in Abschnitt 5.1 beschrieben.

6. Zellzählung

  1. Wischen Sie das Hämozytometer gründlich mit 75% Ethanol ab. Stellen Sie sicher, dass alle Oberflächen vollständig trocken sind, bevor Sie fortfahren.
  2. Geben Sie 90 μl sterilen phosphatgepufferten Kochsalzpuffer (PBS) in ein steriles 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
  3. Resuspendieren Sie die gesammelte neuronale Zellsuspension vorsichtig, indem Sie 3-5 Mal auf und ab pipettieren, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.
  4. Mit einer 10-μl-Pipette werden 10 μl der gemischten Zellsuspension in das Zentrifugenröhrchen mit 90 μl PBS (1:10-Verdünnung) überführt.
  5. Verwenden Sie eine 200-μl-Pipette, um die Lösung 10 Mal vorsichtig zu mischen, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen bilden.
  6. Ersetzen Sie die Pipettenspitze durch eine neue 10-μl-Spitze. Ziehen Sie 10 μl der Mischung und geben Sie sie in die Probenkammer des Hämozytometers.
  7. Stellen Sie das Hämozytometer auf den Mikroskoptisch und fokussieren Sie mit dem 20-fach-Objektiv. Lokalisieren Sie das zentrale 4- × 4-Gitter und zählen Sie die Zellen in allen 16 Quadraten nach den Standardregeln des Hämozytometers.
  8. Notieren Sie die Gesamtanzahl der Zellen aus allen 16 Quadraten. Berechnen Sie die Zellkonzentration nach folgender Formel: (Gesamtanzahl × 10) × 104 Zellen/ml.
    HINWEIS: Arbeiten Sie immer in einer Biosicherheitswerkbank mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung.

7. In-vitro-Kultivierung kortikaler Neuronen in konventionellen oder großmaßstäblichen mikrofluidischen Geräten

  1. Protokoll A (Konventionelle mikrofluidische Geräte).
    1. Vergewissern Sie sich, dass die Glasoberfläche in der 35-mm-Kulturschale vollständig trocken ist.
    2. Platzieren Sie den autoklavierten Mikrofluidik-Chip mit einer sterilen Pinzette mit feiner Spitze in der Mitte der Glasoberfläche, wobei die Mikrokanäle nach unten zeigen.
    3. Drücken Sie den Chip mit einer 200-μl-Pipettenspitze vorsichtig auf die Glasoberfläche, um eine vollständige Haftung zu gewährleisten.
    4. Markieren Sie die linke Kammer mit einem Punkt (·) und verwenden Sie einen Permanentmarker, um das Soma-Kompartiment zu kennzeichnen.
    5. Aspirieren Sie 10 μl neuronale Suspension (10 Millionen Zellen/ml) mit einer 10-μl-Pipette.
    6. Geben Sie die Suspension langsam in die Ladeöffnung über dem markierten Soma-Fach ab.
    7. Vergewissern Sie sich, dass die Flüssigkeit ordnungsgemäß in den unteren Behälter der linken Kammer fließt.
    8. Die Kulturschale für 20 min in einen befeuchteten Inkubator (37 °C, 5 % CO2) stellen.
    9. Nehmen Sie die Kulturschale aus dem Inkubator.
    10. Bestätigen Sie mit einem 20-×-Phasenkontrastmikroskop die Perfusion des Mediums vom Soma-Kompartiment zum axonalen Kompartiment durch die Mikrokanäle.
    11. Geben Sie 150 μl neuronales Basalmedium in den oberen Port des axonalen Kompartiments (rechte Kammer), um einen durch die Schwerkraft gesteuerten Fluss zum unteren Reservoir zu ermöglichen.
    12. Geben Sie auf ähnliche Weise 15 μl vollständiges neuronales Medium in den oberen Port des Soma-Kompartiments (linke Kammer).
      HINWEIS: In diesem Stadium sollten die Neuronen sichtbar anhaften, wobei die meisten Zelltrümmer in die untere Vertiefung gespült werden. Tauschen Sie das Medium während der Kultur nicht aus. Verwenden Sie eine einmalige Zugabe des vollständigen neuronalen Mediums, wie in Schritt 5.1.3 beschrieben.
    13. Gießen Sie 20 ml Reinstwasser in eine 150-mm-Kulturschale, um eine Feuchtigkeitskammer zu schaffen. Stellen Sie die 35-mm-Kulturschale in die große Schale.
    14. Übertragen Sie das gesamte Kultursystem in den Inkubator und bewahren Sie es für die erforderliche Dauer (z. B. 7 Tage) auf.
      HINWEIS: Führen Sie alle Zellkulturverfahren unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank durch. Tragen Sie eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel und Handschuhe). Dekontaminieren Sie Arbeitsflächen vor und nach Eingriffen.
  2. Protokoll B (Mikrofluidische Chips in großem Maßstab).
    HINWEIS: Das Standardprotokoll herkömmlicher Spezifikationen wurde mit zwei Modifikationen befolgt.
    1. Verwenden Sie eine 10 cm große Petrischale für die Platzierung des Geräts.
    2. Wählen Sie je nach experimentellem Bedarf entweder Vollkanal- oder Intervallkanal-Seeding, da jede Methode unterschiedliche axonale Verletzungsprotokolle erfordert.
    3. Nachdem die Aussaat abgeschlossen ist, geben Sie 5 ml vollständiges Neuronenkulturmedium in die 10 cm große Petrischale, um das Neuronenwachstum aufrechtzuerhalten.
    4. Geben Sie 20 ml Reinstwasser in eine 150 mm große Schale, um eine Feuchtigkeitskammer zu schaffen. Stellen Sie dann die 10 cm große Schale in die große Schale.
    5. Wie Schritt 7.1.14.

8. Etablierung eines in vitro axonalen Schädigungsmodells in herkömmlichen mikrofluidischen Geräten

  1. Markieren Sie die linke Seite des mikrofluidischen Geräts als somales Kompartiment (wie durch die Markierung "·" gekennzeichnet) und die rechte Seite als axonales terminales Kompartiment.
  2. Säen kortikale Neuronen in das somale Kompartiment.
  3. Kultivieren Sie die Neuronen in vitro bis zum Tag 7 (DIV7), so dass sich die Axone durch die Mikrokanäle bis zum axonalen terminalen Kompartiment ausdehnen können.
  4. Bei DIV7 werden axonale Verletzungsverfahren im axonalen terminalen Kompartiment durchgeführt, um ein in vitro axonales Verletzungsmodell zu erstellen.
  5. Nehmen Sie eine angemessene Menge NBA-Medium und geben Sie es zur späteren Verwendung in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
  6. Kultur kortikaler Neuronen in der mikrofluidischen Vorrichtung für den angegebenen Zeitraum. Bringen Sie das Gerät dann auf eine saubere Arbeitsbank.
  7. Verwenden Sie fusselfreies Papier, um den Boden der 35-mm-Kulturschale zu trocknen. Verwenden Sie eine 200-μl-Pipette, um das Medium aus den beiden rechten Löchern des mikrofluidischen Geräts abzusaugen.
  8. Schließen Sie den Schlauch der Vakuumpumpe an eine sterile, filterfreie 200-μl-Pipettenspitze an, schalten Sie die Vakuumpumpe ein (Saugleistung 60 l/min) und richten Sie die Spitze auf den Verbindungspunkt zwischen dem unteren Loch der Axonendkammer und der Kammer, um das alte Medium abzusaugen (an dieser Stelle brechen Axone aufgrund von Unterdruck).
  9. Setzen Sie die 200-μl-Pipettenspitze wieder ein und ziehen Sie 150 μl NBA auf, indem Sie es langsam durch das untere Loch der rechten Kammer hinzufügen.
    HINWEIS: Wenn der Flüssigkeitsfluss zu langsam ist und sich Blasen bilden, stoßen Sie die Flüssigkeit schnell aus der Spitze aus, um die Kammer schnell zu füllen.
  10. Verwenden Sie abwechselnd die beiden Löcher auf der rechten Seite für die Flüssigkeitszugabe: Verwenden Sie nach jeder NBA-Zugabe sofort die Vakuumpumpe, um Flüssigkeit aus dem anderen Loch anzusaugen, um Axone zu durchtrennen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4 Mal und ersetzen Sie ihn nach der letzten Aspiration durch frisches, vollständiges neuronales Medium.
  11. Aspirieren Sie das alte Medium aus dem Seitenloch des Zellkörpers und fügen Sie bei Bedarf frisches, vollständiges neuronales Medium hinzu, das Medikamente enthält.
  12. Stellen Sie das mikrofluidische Gerät zusammen mit der Kulturschale in eine 150-mm-Kulturschale und kultivieren Sie für die angegebene Zeit (z. B. 24 h).
    HINWEIS: Für die Operation der Axonschädigung ist NBA-Medium erforderlich, da das neuronale vollständige Medium Blasen erzeugt, die den Trennungseffekt beeinflussen.

9. Großflächige axonale Verletzung eines mikrofluidischen Geräts

  1. Methode 1: Manuelle axonale Verletzung.
    1. Säen Sie Neuronen in alle Kammern des mikrofluidischen Geräts.
    2. Inkubieren Sie das Gerät bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 für drei Tage und entfernen Sie dann das gesamte mikrofluidische Gerät.
      HINWEIS: Um mechanische Belastung oder Reißen von Axonen zu vermeiden, die in die Mikrokanäle hineingewachsen sind, entfernen Sie das mikrofluidische Gerät an DIV3 anstelle von DIV7. Dies ist besonders wichtig, wenn das Versuchsdesign eine unbeschädigte Kontrollgruppe umfasst.
    3. Nehmen Sie im DIV7 die Kulturschale mit dem mikrofluidischen Gerät aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf einen sterilen Tisch.
    4. Bereiten Sie ein Mikroskop mit 20-facher Vergrößerung vor und sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 75% Ethanol.
    5. Halten Sie eine sterile gefilterte Pipettenspitze von 10 μl in der Hand und identifizieren Sie Axonbündel in den ursprünglichen Mikrokanälen unter Mikroskopführung.
    6. Führen Sie mit der Pipettenspitze Längskratzer entlang jedes Axonbündels durch.
    7. Beobachten Sie den Axonbruch unter dem Mikroskop in Echtzeit nach dem Kratzen.
      HINWEIS: Tragen Sie beim Umgang mit lebenden Neuronen Nitrilhandschuhe und arbeiten Sie in einer UV-sterilisierten Laborumgebung
  2. Methode 2: Vakuumunterstützte axonale Verletzung.
    1. Säen Sie kortikale Neuronen abwechselnd in dem großformatigen mikrofluidischen Gerät.
    2. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und stellen Sie sie auf 60 L/min ein.
    3. Verbinden Sie das Ende des Vakuumpumprohrs mit einer sterilen Pipettenspitze mit dem Anschluss der Axonkammer.
    4. Vollständige Axontrennung durch Anlegen von Vakuumdruck durch herkömmliche mikrofluidische Protokolle.
    5. (Fakultativ) Um verletzte Axone gezielt zu sammeln, wird zu einem definierten Zeitpunkt nach der Axotomie der Inhalt des Zellkörperkompartiments mit einer Vakuumpumpe (mit einer Saugleistung von 60 l/min) schnell abgesaugt, um die Zellkörper zu entfernen, so dass nur die Axone in den Mikrokanälen verbleiben.

10. Hypoxische Behandlung von konventionellen oder großflächigen mikrofluidischen Geräten

  1. Primäre Neuronen in der mikrofluidischen Vorrichtung und Kultur bis DIV7 unter normoxischen Bedingungen (37 °C, 5 % CO2) säen.
  2. Stellen Sie das mikrofluidische Gerät in eine Hypoxie-Inkubatorkammer und versorgen Sie es mit einem Gasgemisch bestehend aus 1 % O2, 5 % CO2 und ausgewogenem N2.
  3. Verwenden Sie einen Rotameter, um den Gasdurchfluss zu regeln, und stellen Sie ihn auf 25 l/min ein.
  4. Spülen Sie die Kammer 5 Minuten lang, um die Luft zu verdrängen.
  5. Während Sie den Einlass der hypoxischen Kammer festklemmen, schließen Sie das Ausgangsdruckminderventil.
  6. Klemmen Sie den Auslassschlauch der hypoxischen Kammer fest und schließen Sie schließlich das Gasflaschenventil fest.
  7. Inkubieren Sie das mikrofluidische Gerät in der hypoxischen Kammer bei 3 °C für 1 h.

11. Probenvorbereitung von Neuronen, die in vitro mit mikrofluidischen Großgeräten für die Omics-Analyse kultiviert wurden

  1. Probe für die Transkriptomik.
    1. Übertragen Sie das mikrofluidische Gerät mit den beschädigten Axonen 6 h nach Abschluss der Axonverletzung in eine Laminar-Flow-Haube.
    2. Nach dem Entsorgen des alten Mediums waschen Sie die neuronalen Zellen 2-3 Mal mit sterilem PBS.
    3. Verwenden Sie ein Standard-RNA-Extraktionskit, um RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu isolieren und aufzureinigen.
    4. Führen Sie eine RNA-Sequenzierung durch. Durchführung einer anschließenden bioinformatischen Analyse der gewonnenen Sequenzierungsdaten.
  2. Probe für die Analyse des metabolischen Flusses.
    HINWEIS: Um Veränderungen des Glukosestoffwechselflusses in Neuronen nach Verletzungen mit einem groß angelegten mikrofluidischen Gerät zu überwachen, haben wir die [U-13C6]-Glukoseflussverfolgungsanalyse24 eingesetzt. Das Protokoll für die Vorbereitung von Proben für die LC-MS-Analyse lautet wie folgt:
    1. Verwenden Sie P0 SD Rattenbabys für die Experimente. Sezieren Sie kortikale Neuronen und kultivieren Sie sie in vitro , entweder kurzfristig (DIV5-DIV7) oder langfristig (DIV15-DIV30).
    2. Sowohl für junge (DIV5-DIV7) als auch für reife (DIV15-DIV30) Neuronen sind Verletzungsgruppen und unverletzte Kontrollgruppen zu ermitteln.
    3. Das Medium wird durch ein Medium mit 25 mM [U-13C6]-Glukose (Neurobasal-A ohne Glukose, 1 % FBS, 2 % B27, 25 mM [U-13C6]-Glukose) ersetzt und 4 h bei 37 °C inkubiert.
      HINWEIS: Um neuronalen Stress und Apoptose zu vermeiden, die durch osmotische oder pH-Änderungen während des Medienaustauschs verursacht werden, bereiten Sie zusätzliche Neuronen vor, die zum Zeitpunkt der Aussaat in einem Medium kultiviert wurden, das 25 mM [U-13C6]-Glukose enthält, und verwenden Sie dieses Medium für den Austausch.
    4. Nach zweimaligem vorsichtigen Spülen mit 5 mL vorgewärmtem HBSS (kalzium- und magnesiumhaltig) die Proben in flüssigem Stickstoff schockfrosten und bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Tragen Sie Nitrilhandschuhe und einen Laborkittel, wenn Sie mit flüssigem Stickstoff umgehen.

12. Neuronale Immunfluoreszenzfärbung auf der Grundlage konventioneller und großflächiger mikrofluidischer Geräte

HINWEIS: Bei der Kultivierung von Neuronen in vitro mit mikrofluidischen Geräten muss die mögliche Schädigung der neuronalen Axone in Mikrokanälen berücksichtigt werden, die bei der Demontage dieser Geräte zur Lebendzellfixierung auftreten kann.

  1. Verwenden Sie eine Mikroabfall-Vakuumpumpe, um das Nährmedium aus den vier Vertiefungen des mikrofluidischen Geräts zu entfernen.
    HINWEIS: Bewahren Sie die Flüssigkeit während des Immunfluoreszenzfärbeprozesses in zwei Kammern auf. Die Saugparameter sollten nicht zu hoch sein (2,5 l/min ist optimal), um eine Schädigung oder Aspiration von neuronalen Zellkörpern und Axonen zu vermeiden.
  2. Geben Sie 100 μl 1x PBS in jede der beiden oberen Vertiefungen des mikrofluidischen Geräts (PBS fließt auf natürliche Weise in die unteren Vertiefungen).
  3. Setzen Sie die filterlose Spitze am Ende der Vakuumpumpe wieder ein, saugen Sie PBS aus den unteren Vertiefungen an und wiederholen Sie den Vorgang dreimal. Aspirieren Sie in der letzten Iteration alle PBS aus den vier Vertiefungen.
  4. Geben Sie 150 μl 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in jede der beiden oberen Vertiefungen und fixieren Sie sie 10-15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Demontage des Geräts während der Fixierung lebender Zellen, um die neuronale strukturelle Integrität zu erhalten. Dieser Ansatz hilft, die Lokalisationen von neuronalen Somas und Axonen besser zu unterscheiden.
  5. Dreimal mit 1x PBS waschen, dann Neuronen mit Blockierungspuffer inkubieren, der 5 % Ziegenserum, 0,3 M Glycin, 2 % Rinderserumalbumin (BSA), PBS und 0,1 % (oder 0,5 %) Triton X-100 für 1 h enthält.
  6. Verdünnen Sie den primären Antikörper (z. B. βIII-Tubulin, Maus, 1:2000) im Blockierungspuffer, geben Sie 100 μl in die obere linke Vertiefung und 50 μl in die obere rechte Vertiefung und inkubieren Sie mit Neuronen über Nacht bei 4 °C.
  7. Nach dem Aspirieren des Primärantikörpers dreimal mit 1x PBS waschen, wie in den Schritten 12.2-12.3 beschrieben. Geben Sie dann den mit Blockierungspuffer vorbereiteten Sekundärantikörper wie in Schritt 12.6 beschrieben in die oberen Vertiefungen des mikrofluidischen Geräts und inkubieren Sie 30 min im Dunkeln (ggf. mit Alufolie abdecken).
  8. Nach dreimaligem Waschen mit 1x PBS einmal mit Reinstwasser spülen. Verwenden Sie vorsichtig eine gebogene Pinzette, um das Gerät oben rechts am mikrofluidischen Aufbau zu greifen und zu entfernen.
  9. Geben Sie 1 ml PBS in die Kulturschale, um das große Deckglas von der Schale zu trennen.
  10. Ziehen Sie mit einer Pipette 15 μl Eindeckmedium und tropfen Sie es an der für die Deckgläser vorgesehenen Stelle auf das Deckglas.
  11. Senken Sie die Zellenseite vorsichtig auf das Eindeckmedium, setzen Sie das Deckglas auf und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit.
  12. Lassen Sie das Eindeckmedium vollständig bei Raumtemperatur trocknen.
  13. Nachdem das Eindeckmedium bei Raumtemperatur getrocknet ist, verwenden Sie ein konfokales Spinning-Disk-Mikroskop, um die Bildgebung durchzuführen.
  14. Wählen Sie ein 20-fach-Luftobjektiv, stellen Sie die Belichtungszeit auf 100-200 ms pro Bild ein und stellen Sie die Laserleistung auf 5-10 % des Maximums mit 488 nm Anregung für grün fluoreszierendes Protein (GFP) und/oder 561 nm für rot fluoreszierendes Protein (RFP) ein.

13. Bildgebung lebender Zellen in herkömmlichen mikrofluidischen Geräten

  1. Kultur kortikaler Neuronen in der mikrofluidischen Baugruppe bis DIV7.
  2. Bereiten Sie den Farbstoff für lebende Zellen (z. B. eine Sonde für das mitochondriale Membranpotential) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  3. Verdünnen Sie den Farbstoff in einem vorgewärmten (37 °C) neuronalen Erhaltungsmedium.
  4. Laden Sie die Farbstofflösung in das somatische Kompartiment des mikrofluidischen Geräts.
  5. 30 min in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 inkubieren.
  6. Waschen Sie die Fächer 3 Mal vorsichtig mit 3 ml vorgewärmtem (37 °C) HBSS, das Kalzium und Magnesium enthält.
  7. Geben Sie phenolrotfreie Lebendzell-Imaging-Lösung auf den Mikrofluidik-Chip.
  8. (Fakultativ) Fügen Sie GlutaMAX (0,25 %) und B27 (2 %) für eine verlängerte Bildgebung hinzu.
  9. Platzieren Sie den mikrofluidischen Chip auf dem Mikroskoptisch mit der somatischen Kammer auf der linken Seite und der axonalen Endkammer auf der rechten Seite.
  10. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf die Objektivlinse und stellen Sie sicher, dass das Öl mit dem Deckglas unter dem Chip in Kontakt kommt.
  11. Verwenden Sie für die Bildgebung ein 40-faches Objektiv mit einer Belichtungszeit von 150 ms und einer maximalen Laserleistung von 10-15 %.
    HINWEIS: Passen Sie diese Parameter basierend auf der Photostabilität des Farbstoffs an.

14. Datenanalyse

  1. Verwenden Sie die ImageJ-Software, um Mikroskopiebilder zu analysieren. Beurteilen Sie die RNA-Qualität mit einem Bioanalysator. Führen Sie RNA-seq mit einer geeigneten Plattform durch und analysieren Sie sie.
  2. Extrahieren Sie für metabolomische Studien rohe Massenspektrometriedaten mit dem MRMPROBS-Programm (Version 2.60) und sammeln Sie Informationen über identifizierte Metaboliten, einschließlich Isotopendetails und Peakbereiche.
  3. Verwenden Sie GraphPad Prism (Version 8.4.3) für alle statistischen Analysen. Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± SEM. Verwenden Sie ungepaarte zweiseitige t-Tests oder Mann-Whitney-Tests für Gruppenvergleiche und wenden Sie die bidirektionale ANOVA für Vergleiche zwischen mehreren Zeitpunkten innerhalb von Gruppen an (Signifikanz: ns, nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001).

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Ergebnisse

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Um eine umfassende Forschungsplattform für die Untersuchung der metabolischen Regulationsmechanismen in kortikalen Neuronen zu etablieren, kultivierten wir zunächst kortikale Neuronen in einem herkömmlichen mikrofluidischen Gerät, um das Axonwachstum entlang von Mikrokanälen präzise zu kontrollieren (Abbildung 2A). Mit einem geeigneten Design wurden die Mikrokanäle mit einer geringen Höhe (5 μm) und einer größeren Breite (10 μm) konstruiert, so dass jeder Kan...

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Diskussion

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Die Etablierung fortschrittlicher In-vitro-Modelle zur Untersuchung axonaler Schädigung und Regeneration ist unerlässlich, um die molekularen und metabolischen Mechanismen aufzudecken, die an der neuronalen Reparatur beteiligt sind16,19. In dieser Studie stellen wir einen standardisierten Arbeitsablauf vor, der mikrofluidische Geräte, großflächige neuronale Kulturen und präzise axonale Verletzungsprotokolle integriert un...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Beijing Natural Science Foundation (Grant Nos. L222080, F251031, Z240011, 7192103) und der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 82271513)

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Neurobasal-A MediumGibco10888022Nährmedium
Alexa Fluor 488 Anti-MausInvitrogenNr. A-21042Immunfluoreszenz
Analytische WaageShanghai Shunyu Hengping Scientific Instrument Co., Ltd.FA1004Präzises Wiegen von Reagenzien/Proben
B27 (50-fach)Gibco17504044Nährmedium
BCA-Protein-AssayBosterAR1189Proteinkonzentrationen
BioanalysatorAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
RinderserumalbuminGenviewFA016Immunfluoreszenz
ZentrifugalrührmischerDENKENARE-310Mischen von PDMS und Entgasung
CLARIOstarPlus-ACU AnalysatorBMG LABTECHCLARIOstar PlusProteinkonzentrationen
CO2 InkubatorThermo Fisher Scientific (Asheville) LLC3111Inkubation von Zellkulturen bei 37 °; C, 5% CO?
Korrosionsbeständige Membran-VakuumpumpeShanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.LC-85DLCAbsaugen von Abfallflüssigkeit und Absaugen für die Axotomie
D-GLUCOSE (U-13C6, 99%)Cambridge Isotope LaboratorienCLM-1396Metabolischer Fluss
DNase IRoche11284932001Neuronale Kultur
Dr.TOM2 Plattform BGI GenomikDurchführung und Analyse von RNA-seq 
Elektrischer Heißluft-TrockenschrankBIOM Huahong Bonn / Huaying BosiDHG-9070APDMS aushärten
Elektronische WaageShanghai Huachao Industrial Co., Ltd.HC313Routinemäßiges Wiegen von Materialien
Wässriges Eindeckmedium für FluormountSigma-AldrichNr. F4680Immunfluoreszenz
GlutaMAXGibco35050061Nährmedium
GlycinSolarbio GmbHG8200Immunfluoreszenz
HBSSGibco14025092Neuronale Kultur
HBSS, kein Kalzium, kein MagnesiumGibco14175095Neuronale Kultur
Hochdruck-DampfsterilisatorSTIK Instrument (Shanghai) Co., Ltd.HMJ-54ASterilisation von Laborgeräten und -medien
Hypoxische KammerSTEMCELL-Technologien27310Hypoxische Behandlung
BildJNIHWird zur Analyse von Mikroskopiebildern verwendet
Leica MikroskopLeica Microsystems CMS GmbHDMIL LED FluoLive- und Fluoreszenzbeobachtung
Lösung für die Bildgebung lebender ZellenInvitrogenA14291DJBildgebung von lebenden Zellen
Medizinische Niedertemperatur-Aufbewahrungsbox (-80 &Grad; C)Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.DW-86L388JLangzeitlagerung der Probe bei -80 &°; C
Mini-Desktop-VakuumpumpeHaimen Qilin-Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.GL-805Vakuumanwendungen in kleinem Maßstab
MitoTracker Orange CMTMRosInvitrogenM7510Färbung des Mitochondrienmembranpotentials
MRMPROBS-ProgrammVersion 2.60Zur Extraktion von Massenspektrometrie-Rohdaten 
Neurobasales MediumGibco21103049Nährmedium
Neurobasal-A ohne GlukoseGibcoA2477501Nährmedium
PapainWorthingtonLS003127Neuronale Kultur
ParaformaldehydSigma-AldrichNr. P6148Fixierung der Zellen
PDMSDow CorningDC184Herstellung von Geräten
PDS Kit Inhibitor FläschchenWorthingtonLK003182Neuronale Kultur
Penicillin StreptomycinGibco15140122Nährmedium
Phosphatgepufferte KochsalzlösungBioscharfBL302AVerdünnen Sie die Substanzen und reinigen Sie die Zellbehälter
Plasma-ReinigerHarrick PlasmaODC-32G-2Aktivierung
Poly-D-LysinSigma-AldrichNr. P6407Neuronale Kultur
Prisma GraphPadVersion 8.4.3Statistische Auswertungen
Gekühlte ZentrifugeEppendorf AG (Deutschland)5430RProbentrennung bei kontrollierten Temperaturen
RNArep Reine Zell-/Bakterien-Gesamt-RNA-ExtraktionskitTiangenDP430Transkriptomik
RotameterDwyerRMA-23-SSVKontrollieren Sie den niedrigen Sauerstofffluss
StereomikroskopOlympus CorporationSZ2-ILSTProbenbeobachtung und Präparierung
Stuart OrbitalschüttlerKylin-GlockeTS-200Mischen von Zellkulturen/-lösungen mit einstellbaren Geschwindigkeiten
Triton X-100Sigma-AldrichX100Immunfluoreszenz
ULVAC Drehschieber-VakuumpumpeULVAC (Ningbo) Co., Ltd.GLD-N202Erzeugung eines Vakuums für die Filtration/Trocknung
β III-TubulinPromegaNr. G7121Immunfluoreszenz

Referenzen

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