Methodenartikel

Evaluierung therapeutischer Interventionen im SHIP-defizienten Mausmodell der Morbus Crohn-ähnlicher Ileitis und Fibrose

DOI:

10.3791/68928

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14. Oktober 2025

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1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll zeigt, wie das Src-Homologie-2-Domänen-enthaltende 5'-Inositolphosphatase (SHIP)-defiziente Mausmodell für Morbus Crohn (CD)-ähnliche ileale Entzündung und Fibrose verwendet werden kann, um neuartige Therapeutika für Zöliakie zu testen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Morbus Crohn (CD) ist eine chronische, schubförmige Entzündungserkrankung, die durch eine segmentale, transmurale Entzündung gekennzeichnet ist und jeden Teil des Magen-Darm-Trakts betreffen kann. Ein Kennzeichen von Zöliakie ist eine gestörte Darmbarrierefunktion, und Darmfibrose ist eine häufige Komplikation. SHIP-defiziente (SHIP-/-) Mäuse entwickeln spontan eine Dysfunktion der Darmbarriere, eine ileale Entzündung und eine fibrotische Pathologie, was die Schlüsselmerkmale der Zöliakie-ähnlichen Ileitis rekapituliert. Die SHIP-/- Mäuse dienen als wertvolles Modell für die Erprobung von entzündungshemmenden und antifibrotischen Therapien bei Zöliakie.

In diesem Modell beschreiben wir Methoden zur Evaluation therapeutischer Interventionen am Beispiel von Dexamethason als Beispiel für eine wirksame Therapie. Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Charakterisierung der Erkrankung und des Ansprechens auf die Behandlung, einschließlich einer in vivo-Beurteilung der Darmpermeabilität, gemessen mit FITC-Dextran, sowie einer grobpathologischen Untersuchung und detaillierten histologischen Analysen. Histologische Untersuchungen umfassen die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) bei Entzündungen, die Masson-Trichrom-Färbung bei Fibrose und die Färbung mit Alcianblau/Periodensäure-Schiff (PAS) bei Becherzellhyperplasie und -hypertrophie. Zusätzlich werden Zytokine und Entzündungsmarker im Ileumgewebe quantifiziert, um den Entzündungszustand zu beurteilen. Zusammen bieten diese Methoden einen umfassenden Rahmen für die Bewertung der Therapiewirksamkeit im SHIP-/- Mausmodell der Zöliakie-ähnlichen Ileitis. Dieses Protokoll ist allgemein anwendbar für Forscher, die Darmentzündungen, Schleimhautheilung und Darmfibrose untersuchen.

Einleitung

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Die beiden Haupttypen der entzündlichen Darmerkrankung (CED) sind Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC), die beide durch eine chronische gastrointestinale (GI) Entzündung gekennzeichnet sind, die einem schubförmig-remittierenden oder fortschreitenden Verlauf folgen kann1. Obwohl IBD in der Vergangenheit als eine Krankheit westlicher Nationen angesehen wurde, nimmt ihre Inzidenz in Entwicklungsländern in Südamerika, Asien und Afrika rapide zu2. Gleichzeitig steigt die Prävalenz in Nordamerika, Europa und Australien weiter an, wobei zwischen 1990 und 2019 ein Anstieg sowohl der Inzidenz als auch der Prävalenz um fast 50 % gemeldet wurde, was die wachsende globale Gesundheitsbelastung durch CEDunterstreicht 2,3. Trotz erheblicher Forschungsanstrengungen ist die zugrunde liegende Ursache von CED nach wie vor unbekannt. Aktuelle Erkenntnisse deuten auf ein komplexes Zusammenspiel zwischen genetischer Anfälligkeit, Fehlfunktion des Immunsystems und Umweltauslösern, einschließlich Veränderungen des Mikrobioms, hin 4,5.

Es gibt wesentliche Unterschiede zwischen CD und UC. Bei der UC ist die Entzündung auf den Dickdarm beschränkt und zeichnet sich durch eine kontinuierliche Beteiligung aus, die sich auf die Schleimhautschicht beschränkt 6,7. Im Gegensatz dazu ist die Zöliakie durch diskontinuierliche und transmurale Entzündungen gekennzeichnet, die jeden Teil des Magen-Darm-Trakts betreffen können, am häufigsten im terminalen Ileum 6,7. Eine charakteristische Komplikation der Zöliakie ist die Darmfibrose, die zur Bildung von Strikturen und Darmverschluss beiträgt8. Die Fibrose ist definiert durch eine übermäßige Ablagerung von extrazellulären Matrixbestandteilen wie Kollagen und eine Verdickung der Darmmuskelschichten 9,10. Etwa 30 % der Menschen mit Zöliakie entwickeln innerhalb von 10 Jahren nach der Diagnose eine strikte Erkrankung11. Derzeit gibt es keine Therapien, die direkt auf die Fibrose abzielen, ein ungedeckter klinischer Bedarf, der mit geeigneten präklinischen Modellen zur Untersuchung dieser Komplikation adressiert werden kann 9,12.

Um die Pathogenese der CED besser zu verstehen und die Entwicklung neuer Therapien zu erleichtern, wurden zahlreiche Mausmodelle etabliert12. Es gibt zwar eine große Anzahl von Colitis-Modellen, aber nur wenige rekapitulieren die Ileumentzündung und die Zöliakie-assoziierte Fibrose12. Zu diesen gehören die hierin beschriebenen Src-Homologie-2-Domänen-haltigen 5'-Inositolphosphatase-defizienten (SHIP-/-) sowie die SAMP1/YitFc-Mäuse und die Tnf-ΔARE-Mäuse. Diese Modelle spiegeln gemeinsam die Komplexität der menschlichen Zöliakie wider, da jedes von unterschiedlichen zellulären und molekularen Mechanismen gesteuert wird. Die Erkrankung in SAMP1/YitFc-Mäusen resultiert aus einer polygenen Prädisposition, die die epitheliale Barrierefunktion und die Immunregulation beeinträchtigt13,14, während TnfΔARE-Mäuse eine Deletion von AU-reichen Elementen in der TNF-mRNA tragen, was zu einer erhöhten mRNA-Stabilität und TNF-Überproduktion führt15,16. Obwohl diese Modelle wertvoll sind, haben sie ihre Grenzen. Das SAMP1/YitFc-Modell leidet unter einer geringen Züchtungseffizienz, was eine Herausforderung bei der Generierung ausreichender Kohortengrößen für Studiendarstellt 17. Darüber hinaus benötigt das Tnf-ΔARE-Modell bis zu 24 Wochen, um eine bemerkenswerte fibrotische Pathologie zu entwickeln, was die Durchführung von Interventionsstudien teuer und schwierig macht16.

SHIP ist ein negativer Regulator des Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)-Signalwegs und wird überwiegend in hämatopoetischen Zellen exprimiert. Es funktioniert, indem es die 5'-Phosphatgruppe von Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphat entfernt, wodurch die nachgeschaltete PI3K-Signalübertragung18 abgeschwächt wird. Die SHIP-/- Mäuse bieten mehrere Vorteile für präklinische Studien. Diese Mäuse sind relativ einfach zu züchten und zeigen bereits im Alter von 8 Wochen19 Anzeichen von Fibrose. Der beschleunigte fibrotische Umbau in diesem Modell wird wahrscheinlich durch erhöhte Entzündungsreaktionen aufgrund eines dysregulierten PI3K-Signalwegs angetrieben, der zu einer Hyperaktivierung der Immunzellen und einem anschließenden schnellen Gewebeumbau führt. Am wichtigsten ist, dass wir und Kerrs Gruppe unabhängig voneinander gezeigt haben, dass SHIP-/- Mäuse eine Ileitis entwickeln, die der menschlichen CD19,20 sehr ähnlich ist. Für die Relevanz dieses Modells spricht die Tatsache, dass eine Untergruppe von Individuen mit Zöliakie eine reduzierte SHIP-Aktivität sowohl in Ileumbiopsien als auch in PBMCs aufwies21. Darüber hinaus neigen Patienten mit geringer SHIP-Aktivität zu einem schwereren Krankheitsverlauf, der oft mehrere Operationen erfordert22.

SHIP-/- Mäuse beginnen bereits im Alter von 4 Wochen eine spontane, diskontinuierliche Darmentzündung zu entwickeln, die auf das distale Ileum lokalisiert ist, wobei die Entzündung bei allen Mäusen im Alter von 6 Wochen im Alter von20 Jahren auftritt. Im Alter von 8 Wochen haben die Mäuse eine fibrotische Pathologie entwickelt, die durch eine Verdickung der Muscularis externa und eine ausgedehnte Kollagenansammlung in der Submukosa und zwischen den Muskelschichten gekennzeichnetist 19. Die Entzündung in diesem Modell wird durch das von Makrophagen abgeleitete Interleukin-1β (IL-1β)21 angetrieben. Sowohl die Depletion von Makrophagen mit Clodronat-haltigen Liposomen als auch die pharmakologische Blockade des IL-1-Signalwegs mit einem IL-1-Rezeptorantagonisten (Anakinra) verbesserten die Darmentzündung bei SHIP-/- Mäusen21. Zusätzlich zur Ileitis weisen SHIP-/- Mäuse Lungenentzündungen auf, die wir zur Bewertung von Off-Target-Effekten von Therapien für eine lokalisierte intestinale Verabreichung verwendet haben23. Andere haben berichtet, dass die Caspase-8-Hemmung mit Z-IETD-FMK sowohl die Ileum- als auch die Lungenentzündung bei SHIP-/- Mäusensignifikant reduziert 24, was die Lungenpathologie als zusätzliches Merkmal zur Beurteilung der systemischen Entzündungskontrolle weiter unterstützt.

Diese methodische Arbeit greift unsere kürzlich veröffentlichte Arbeit zur erfolgreichen Behandlung mit Dexamethason23 auf und bietet eine detaillierte Beschreibung der wichtigsten technischen Verfahren mit zusätzlichen Überlegungen zur Verwendung von Mausmodellen in pharmakologischen Tests. Insbesondere heben wir Standardparameter für die Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten in Modellen der CED hervor, einschließlich der Bewertung der Darmpermeabilität, der groben Pathologie, der Histopathologie und der proinflammatorischen Mediatoren und Effektoren, und diskutieren, wie diese Daten integriert werden können, um Rückschlüsse auf die therapeutische Gesamtwirksamkeit zu ziehen.

Protokoll

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Studien mit Tieren sollten in Übereinstimmung mit ethischen Protokollen durchgeführt werden, die vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurden, und in Übereinstimmung mit den Leitlinien der nationalen Forschungsräte zur Tierpflege. Alle tierischen Verfahren in diesem Protokoll folgten den ethischen Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und wurden vom Tierpflegeausschuss der University of British Columbia genehmigt (Protokoll A21-0212).

HINWEIS: Um die therapeutische Wirkung des Arzneimittels auf die Darmpathologie von SHIP-/- Mäusen zu beurteilen, schließen Sie SHIP+/+ als gesunde Kontrollen zum Vergleich ein. Für eine therapeutische Intervention beginnen Sie die Behandlung im Alter von 6 Wochen, wenn die Krankheit im Modell vollständig etabliert ist. Hier erhielten sowohl SHIP+//+ als auch SHIP-/- Mäuse 2 Wochen lang täglich eine orale Sonde von Dexamethason in einer Dosis von 3 mg/kg in 0,5 % β-Cyclodextrin (Vehikel) oder das Vehikel allein, in einem Volumen von 10 μL/g.

1. FITC-Dextran-Assay zur Messung der Permeabilität der Epithelbarriere

  1. Schnelle Mäuse für 4 Stunden vor dem Assay.
  2. 4 kDa FITC-Dextran in sterilem 1x PBS auf eine Endkonzentration von 80 mg/ml auflösen.
  3. Bereiten Sie genug für 150 μl pro Maus vor, plus 50 μl extra für die Standardkurve.
    HINWEIS: Minimieren Sie die Lichteinwirkung von FITC-Dextran-Lösung und Plasmaproben während des gesamten Verfahrens.
  4. Halten Sie jede Maus vorsichtig zurück und verabreichen Sie 150 μl der FITC-Dextran-Lösung über eine orale Sonde.
    HINWEIS: Starten Sie sofort nach der Verabreichung der ersten Sonde einen Timer. Warten Sie 10-15 Minuten zwischen den einzelnen Mausen, um genügend Zeit für die gestaffelte Durchführung von Euthanasie und nachgelagerten Eingriffen zu haben, um die Variabilität aufgrund von Zeitunterschieden zu minimieren.
  5. Halten Sie Mäuse 4 Stunden lang ohne Futter.
  6. Euthanasieren Sie Mäuse mit 5% Isofluran (Inhalationsanästhetikum mit 1,5 l Sauerstoff/min), gefolgt von Kohlendioxid gemäß dem institutionellen Standardverfahren. Entnehmen Sie Blut durch Herzpunktion mit 25 G Nadeln und 1 ml Spritze.
  7. Geben Sie sofort 10 μl Säure-Citrat-Dextrose-Lösung zu je 100 μl entnommenem Blut als Antikoagulans. Durch Inversion gründlich mischen.
  8. Zentrifugieren Sie bei 1500 x g für 10 min bei 4 °C und überführen Sie das Plasma (Überstand) vorsichtig in markierte 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie die Proben bis zur Analyse auf Eis und vor Licht geschützt auf.
  9. Verdünnen Sie jede Plasmaprobe 1:2 und 1:10 mit 1x PBS.
  10. Geben Sie 100 μl jeder Verdünnung in Duplikaten auf eine undurchsichtige 96-Well-Platte.
  11. Führen Sie 1:2-Serienverdünnungen des ursprünglichen 80 mg/ml-FITC-Dextran-Stoffes mit 1x PBS durch, um die folgenden Konzentrationen zu erreichen: 3000, 1500, 750, 375, 187,5, 93,8, 46,9, 23,4 und 0 ng/ml. Geben Sie 100 μl jeder Konzentration in doppelter Ausführung auf die 96-Well-Platte.
  12. Messen Sie die Fluoreszenz bei 485 nm Anregung und 535 nm Emission mit einem Mikroplatten-Reader.

2. Grobpathologische Beurteilung

  1. Nach der Blutentnahme für den FITC-Dextran-Assay wird der gesamte Dünndarm vorsichtig exzidiert.
  2. Entfernen Sie vorsichtig anhaftendes Fett und Bindegewebe.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit dem Gewebe, da erkrankte Regionen brüchig und anfällig für Risse sein können.
  3. Legen Sie den Darm flach auf ein Blatt leeres weißes Papier, um einen optimalen Kontrast zu erzielen. Untersuchen Sie das Gewebe visuell auf makroskopische Krankheitszeichen. Die Entzündung ist bei der SHIP-/-Maus typischerweise in den distalen 10 cm des Dünndarms lokalisiert.
    HINWEIS: Zu den wichtigsten makroskopischen Merkmalen, die beurteilt werden müssen, gehören Farbveränderungen, wobei Regionen im Vergleich zu benachbartem normal erscheinendem Gewebe sichtbare Rötungen oder Hyperämie aufweisen. Untersuchen Sie zusätzlich auf Gewebeverdickungen, da die betroffenen Bereiche bei sanftem Abtasten geschwollen, ödematös oder starr erscheinen können. Achten Sie auf das Vorhandensein von Blut, das sich als sichtbare hämorrhagische Flecken, dunkelrote Verfärbungen oder anhaftendes Blut äußern kann.
  4. Richten Sie den Darm neben einem Lineal als Maßstab aus und machen Sie ein Foto, um die grobpathologischen Befunde zu dokumentieren.

3. Histologische Beurteilung

  1. Entfernen Sie den Darminhalt, indem Sie das Lumen vorsichtig mit einer Spritze mit 1x PBS spülen. Üben Sie nicht zu viel Kraft auf das Gewebe aus, da dies die Zotten- und Kryptenarchitektur verzerren kann.
  2. Identifizieren und entnehmen Sie etwa 1 cm des distalen Ileums, das am repräsentativsten für die grobe Pathologie ist. Schließen Sie sichtbare betroffene Bereiche ein, falls vorhanden. Stellen Sie bei Vergleichen (SHIP+/+ vs. SHIP-/-) sicher, dass Gewebe von übereinstimmenden anatomischen Stellen entnommen werden.
    HINWEIS: Für eine erste Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung wird empfohlen, das Ileum als Schweizer Rolle zuzubereiten. Diese Methode ermöglicht eine globale Visualisierung von Krankheiten und reduziert die Verzerrung der Stichproben.
  3. Legen Sie das Gewebe flach in eine Histologiekassette und legen Sie es zwischen Schwämme, um ein Falten zu verhindern.
  4. Bei Hämatoxylin & Eosin (H&E) und Massons Trichrom-Färbung fixieren Sie das Gewebe über Nacht bei 4 °C in 10% neutralem gepuffertem Formalin, wobei Sie mindestens das 10-20-fache Gewebevolumen (ca. 5 ml pro Kassette) verwenden und sicherstellen, dass alle Kassetten vollständig eingetaucht sind. Übertragen Sie die Kassetten zur Lagerung auf 70 % Ethanol und halten Sie sie bis zur Verarbeitung vollständig unter Wasser.
    HINWEIS: 10 % Formalin, ein Fixiermittel mit 3,7 % Formaldehyd, ist ein starkes Reizmittel für die Atemwege, ein Hautsensibilisator und wird als krebserregend für den Menschen eingestuft. Einatmen, Verschlucken oder Hautkontakt können zu akuter Toxizität führen, während chronische Exposition das Krebsrisiko erhöhen kann. Alle Eingriffe, bei denen Formalin zum Einsatz kommt, sollten in einem zertifizierten chemischen Abzug unter Träger geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) durchgeführt werden, einschließlich eines Laborkittels, chemikalienbeständiger Handschuhe und eines Augenschutzes. Sammeln Sie Abfälle in Behältern, die deutlich mit "Formalinabfällen" gekennzeichnet sind, zur ordnungsgemäßen Entsorgung gemäß den institutionellen Protokollen für gefährliche Abfälle. Alle mit Formalin kontaminierten Materialien (z. B. Pipettenspitzen, Taschentücher, Handschuhe) sollten als chemisch gefährlicher Abfall behandelt und gemäß den lokalen Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsverfahren (EHS) entsorgt werden.
  5. Für die Färbung von Alcianblau/PAS fixieren Sie das Gewebe in Carnoy-Lösung (60 % Ethanol, 30 % Chloroform und 10 % Eisessig) bei 4 °C über Nacht, wobei Sie ca. 5 ml pro Kassette oder das 10- bis 20-fache Gewebevolumen verwenden. Übertragen Sie die Kassetten zur Lagerung bis zur Verarbeitung auf 100 % Ethanol.
    HINWEIS: Die Lösung von Carnoy besteht aus 60 % Ethanol, 30 % Chloroform und 10 % Eisessig. Dieses Gemisch ist leicht flüchtig, brennbar und giftig. Behandeln Sie die Carnoy-Lösung ausschließlich in einem Abzug und lagern Sie sie in dicht verschlossenen Behältern fern von Wärme- oder Zündquellen. Die Abfälle von Carnoy sollten in dafür vorgesehenen Behältern für gemischte organische Lösungsmittel gesammelt und gemäß den Richtlinien für gefährliche Abfälle der Einrichtung entsorgt werden. Alle Materialien, die mit der Carnoy-Lösung kontaminiert sind, sollten als chemisch gefährlicher Abfall behandelt werden.
  6. Gewebe in Paraffin einbetten und 5 μm große Schnitte für die Färbung schneiden.
  7. Bewerten Sie die H&E-gefärbten Ileumabschnitte auf einer 16-Punkte-Skala gemäß den Kriterien in Tabelle 1. Der endgültige histologische Schadenswert wird durch Mittelung der Ergebnisse von 2 Gutachtern bestimmt, die für die experimentelle Bedingung verblindet sind.
  8. Bewerten Sie die trichromgefärbten Querschnitte des Masson anhand einer 6-Punkte-Skala auf der Grundlage der Kriterien in Tabelle 2. Der endgültige Fibrose-Score wird als Median der Scores berechnet, die von zwei unabhängigen Gutachtern vergeben wurden, die für die experimentellen Bedingungen verblindet waren.

4. Bewertung des Zytokins

  1. Nach der Dissektion und Entnahme der Histologieprobe wird der verbleibende Teil der distalen 10 cm des Ileums entnommen.
  2. Tupfen Sie das Taschentuch trocken und notieren Sie das Gewicht. In flüssigem Stickstoff schockfrosten und für die zukünftige Verarbeitung bei -80 °C lagern.
  3. Wenn Sie zur Verarbeitung bereit sind, holen Sie das Gewebe zurück und bewahren Sie es immer auf Eis auf.
  4. Wiegen Sie die Gewebeproben. Bereiten Sie ausreichend Homogenisierungspuffer für alle Proben vor, indem Sie Proteaseinhibitoren zu 1x PBS (Aprotinin und Leupeptin, jeweils 10 μg/ml) hinzufügen. Verwenden Sie 10 μl Puffer pro mg Gewebe (z. B. 100 mg Gewebe erfordern 1 ml Puffer).
    HINWEIS: Der Homogenisierungspuffer muss am Tag der Homogenisierung frisch zubereitet werden, um sicherzustellen, dass die Proteasehemmer wirksam sind.
  5. Homogenisieren Sie das ileale Gewebe in voller Dicke in eiskaltem Homogenisierungspuffer mit einem Tischhomogenisator. Stellen Sie sicher, dass das Homogenat gleichmäßig und frei von sichtbaren Gewebefragmenten ist. Spülen Sie die Homogenisatorspitze zwischen den Proben gründlich mit PBS, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
  6. Zentrifugieren Sie die Gewebehomogenate bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C.
  7. Aliquotieren Sie die geklärten Überstände, um Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden, und lagern Sie sie für zukünftige Analysen bei -80 °C.
  8. Führen Sie Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) an geklärten Überständen durch, um die interessierenden Zytokine gemäß den Anweisungen des Herstellers zu quantifizieren.
    HINWEIS: Die optische Dichte bei 450 nm wurde mit dem Varioskan LUX Mikroplatten-Reader mit der Software Skanlt RE 7.0.2 mit einer Referenzwellenlänge von 570 nm zur Korrektur gemessen. Für die Datenanalyse wurde Microsoft Excel verwendet, und Absorptionswerte im linearen Bereich der Standardkurve wurden interpoliert, um die Zytokinkonzentrationen zu bestimmen.

Ergebnisse

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6 Wochen alte SHIP+/+ und SHIP-/- Mäuse wurden 2 Wochen lang täglich mit 0,5 % β-Cyclodextrin (Vehikelkontrolle; n = 6/Genotyp) oder 3 mg/kg Dexamethason (n = 6/Genotyp) oral versorgt. Der Zeitpunkt und die Dauer der Behandlung sind modellabhängig und sollten den Beginn und die Geschwindigkeit des Fortschreitens der Erkrankung sowie die Frage, ob die Intervention prophylaktisch oder therapeutisch sein soll, berücksichtigen. In Versuchen sollte eine gleiche Anzahl männlicher und weiblicher Mäuse verwendet werden. Obwohl wir keine geschlechtsspezifischen Unterschiede im natürlichen Krankheitsverlauf bei SHIP-/-Mäusen festgestellt haben, können unterschiedliche Behandlungsprotokolle geschlechtsspezifische Reaktionen zeigen. In diesem Modell kann eine prophylaktische Behandlung im Alter von 4-6 Wochen verwendet werden, um das Auftreten von Entzündungen und Fibrose zu verhindern, während therapeutische Schemata, die im Alter von 6-8, 8-10 oder 6-10 Wochen durchgeführt werden, verwendet werden können, um die Wirksamkeit der Behandlung bei etablierter Krankheit zu beurteilen. Die optimale Dosierung und der optimale Zeitpunkt sollten sich an der Literatur und den Titrationsstudien orientieren. Wir haben bereits gezeigt, dass dieses Dosierungsschema für Dexamethason wirksam ist, wenn es verabreicht wird, nachdem sich eine Ileumentzündung entwickelt hat.

Ein empfohlener Zeitplan für den Tag der Ernte ist in Abbildung 1A dargestellt. Dexamethason induzierte bei den SHIP+/+ Mäusen keine Darmpathologie, basierend auf der groben Untersuchung. SHIP-/- Mäuse zeigten sichtbare Rötungen und Verdickungen, die auf eine Entzündung hindeuteten. Diese groben pathologischen Merkmale fehlten bei SHIP-/- Mäusen, die mit Dexamethason behandelt wurden (Abbildung 1B). Zur Beurteilung der intestinalen Barrierefunktion wurden die Plasmakonzentrationen von FITC-Dextran nach oraler Sonde gemessen. Obwohl nicht statistisch signifikant, wiesen SHIP-/- Mäuse im Vergleich zu SHIP+/+ Kontrollen erhöhte Plasma-FITC-Dextran-Konzentrationen auf, was auf eine erhöhte Darmpermeabilität hindeutet. Die Behandlung mit Dexamethason reduzierte die FITC-Dextran-Konzentrationen bei SHIP-/- Mäusen auf ähnliche Konzentrationen wie bei SHIP+/+ Mäusen (Abbildung 1C).

Die histologische Untersuchung von Darmquerschnitten von SHIP-/--Mäusen ergab charakteristische pathologische Merkmale, einschließlich Immunzellinfiltration, gestörter Zotten-Krypten-Architektur, Becherzellhyperplasie/-hypertrophie und Verdickung der Muscularisschicht (Abbildung 2A). Diese Eigenschaften spiegelten sich in signifikant höheren histologischen Schadenswerten im Vergleich zu SHIP+/+ Mäusen wider (p = 0,0005, Abbildung 2B). Bei SHIP+/+ Mäusen, die mit Dexamethason behandelt wurden, wurden keine histologischen Schäden beobachtet. In Übereinstimmung mit den Verbesserungen, die in der groben Pathologie und der Barrierefunktion beobachtet wurden, reduzierte Dexamethason die Histopathologie bei SHIP-/- Mäusen, obwohl der Effekt statistisch nicht signifikant war (p = 0,0981, Abbildung 2A und Abbildung 2B). Die Trichrom-Färbung nach Masson zeigte eine erhebliche Kollagenablagerung im SHIP-/-Darmgewebe, begleitet von signifikant höheren Fibrosewerten im Vergleich zu den SHIP+/+-Kontrollen (Abbildung 2C). Dexamethason schwächte die fibrotischen Merkmale bei SHIP-/- Mäusen effektiv ab und senkte die Fibrosewerte auf Werte, die mit denen der SHIP+/+-Kontrollen vergleichbar waren (Abbildung 2C). Zusätzlich bestätigte die Alcianblau/PAS-Färbung eine Becherzellhyperplasie/-hypertrophie bei SHIP-/- Mäusen, die nach Behandlung mit Dexamethason reduziert war (Abbildung 2D).

Zur Bestimmung der inflammatorischen Zytokinkonzentrationen wurden ELISAs an Homogenaten des Ileumgewebes in voller Dicke durchgeführt (Abbildung 3A). Die IL-1β-Konzentrationen waren bei SHIP-/- Mäusen signifikant höher als bei SHIP+/+ Kontrollen (p = 0,0468), was mit früheren Ergebnissen übereinstimmt, die die IL-1β-Expression mit der Schwere der Erkrankung in diesem Modell korrelieren. Die Behandlung mit Dexamethason reduzierte signifikant die IL-1β-Konzentrationen bei SHIP-/- Mäusen (p = 0,0023). In Übereinstimmung mit früheren Berichten unterschieden sich die IL-6- oder TNF-Konzentrationen nicht zwischen den vier Versuchsgruppen. Wir maßen auch die Konzentrationen der neutrophilen-assoziierten Proteine Myeloperoxidase (MPO) und Lipocalin-2 (LCN-2) in ilealen Homogenaten in voller Dicke als zusätzliche biochemische Marker für Entzündungen (Abbildung 3B). Sowohl die MPO- als auch die LCN-2-Konzentrationen waren bei SHIP-/- Mäusen im Vergleich zu SHIP+/+ Mäusen signifikant höher (p = 0,0031 bzw. p = 0,0002), obwohl der Anstieg von LCN-2 hauptsächlich auf hohe Konzentrationen zurückzuführen war, die bei 2 von 6 Mäusen gemessen wurden. Die Behandlung mit Dexamethason reduzierte MPO und reduzierte leicht LCN-2, die Unterschiede waren nicht signifikant. Diese Daten deuten darauf hin, dass MPO ein nützlicher Marker für Entzündungen bei SHIP-/- Mäusen ist, während die LCN-2-Konzentrationen nicht so konsistent oder zuverlässig sind.

Um den Zusammenhang zwischen entzündlichen und fibrotischen Merkmalen im SHIP-/- Mausmodell zu untersuchen, führten wir Spearman-Korrelationsanalysen unter Verwendung histologischer Schadenswerte, Fibrose-Scores und IL-1β-Konzentrationen aus ilealem Gewebe in voller Dicke durch (Abbildung 4). Die IL-1β-Konzentrationen korrelierten positiv mit den histologischen Schadenswerten (r = 0,6813), was darauf hindeutet, dass eine erhöhte Entzündung mit einer erhöhten Gewebeschädigung verbunden war (Abbildung 4A). Es wurde auch eine moderate Korrelation zwischen IL-1β-Konzentrationen und Fibrose-Scores beobachtet (r = 0,4117), was auf einen Zusammenhang zwischen der Produktion von inflammatorischen Zytokinen und dem fibrotischen Umbau hindeutet (Abbildung 4B). Darüber hinaus korrelierten die histologischen Schadenswerte signifikant mit den Fibrosewerten (r = 0,6241), was darauf hindeutet, dass strukturelle Schädigung und Fibrose bei SHIP-/- Mäusen parallel verlaufen (Abbildung 4C).

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Abbildung 1: Dexamethason reduziert die Pathologie und Permeabilität des Grobdarms bei SHIP-/- Mäusen. SHIP+/+ und SHIP-/- Mäuse wurden im Alter von 6 bis 8 Wochen täglich entweder mit 0,5 % β-Cyclodextrin als Vehikel zur Kontrolle (VC) oder mit Dexamethason (Dex; 3 mg/kg) oral versorgt. (A) Empfohlener Zeitplan für experimentelle Versuche. (B) Die grobe Morphologie des Blinddarms und des distalen Ileums wurde beurteilt, und es werden repräsentative Bilder gezeigt (n = 4-6 Mäuse pro Gruppe). Sternchen kennzeichnen Bereiche mit fleckiger Rötung und Verdickung, die bei der groben Untersuchung beobachtet werden. Die Bilder sollen als repräsentative Beispiele für die gesamte Pathologie dienen und sind nicht für die quantitative Analyse gedacht. (C) Zur Beurteilung der Darmpermeabilität wurden die Mäuse 4 Stunden lang nüchtern und mit 80 mg/ml FITC-Dextran versorgt. Nach weiteren 4 Stunden Fasten wurde Blut mittels Herzpunktion entnommen und die Plasma-FITC-Dextran-Konzentrationen gemessen. Die Daten werden als Mittelwert±SD dargestellt. Der graue Balken stellt den Bereich der Plasma-FITC-Dextran-Konzentrationen dar, die typischerweise bei gesunden C57BL/6-Mäusen vier Stunden nach der Sonde25 beobachtet werden. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Kruskal-Wallis-Test bestimmt, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Dexamethason reduziert histologische Schadenswerte, Kollagen, Muskeldicke sowie Becherzellhyperplasie und -hypertrophie im distalen Ileum von SHIP-/- Mäusen. SHIP+/+ und SHIP-/- Mäuse wurden im Alter von 6 bis 8 Wochen täglich entweder mit 0,5 % β-Cyclodextrin als Vehikel zur Kontrolle (VC) oder mit Dexamethason (Dex; 3 mg/kg) oral versorgt. (A) H&E-gefärbte ileale Querschnitte von Mäusen wurden bei 10-facher Vergrößerung fotografiert; Maßstabsbalken = 200 μm. (B) Histologische Schadenswerte für SHIP+/+ und SHIP-/- Mäuse, ausgedrückt als Median ± IQR. (C) Fixierte ileale Querschnitte wurden mit Massons Trichrom gegen Fibrose gefärbt; Kollagen ist blau gefärbt. Die Bilder wurden mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen; Maßstabsleisten = 200 μm. Fibrose-Scores für SHIP+/+ und SHIP-/- Mäuse, ausgedrückt als medianer ± IQR. (D) Feste ileale Querschnitte wurden mit Alcianblau/PAS gefärbt. Die Bilder wurden mit 10× Vergrößerung fotografiert; Maßstabsleisten = 200 μm. Alle Sektionen sind repräsentativ für n = 6 Mäuse pro Gruppe (außer SHIP+/+ Dex und SHIP-/- Dex, n = 5). Die statistische Signifikanz für den histologischen Schadensscore wurde mit dem Kruskal-Wallis-Test bestimmt, gefolgt von dem Mehrfachvergleichstest nach Dunn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Dexamethason reduziert die IL-1β-Konzentrationen in ilealen Homogenaten in voller Dicke von SHIP-/- Mäusen. SHIP+/+ und SHIP-/- Mäuse wurden im Alter von 6 bis 8 Wochen täglich entweder mit 0,5 % β-Cyclodextrin als Vehikel zur Kontrolle (VC) oder mit Dexamethason (Dex; 3 mg/kg) oral versorgt. (A) Die Konzentrationen von IL-1β, TNF und IL-6 wurden in ilealen Homogenaten in voller Dicke gemessen. (B) Die Konzentrationen von Myeloperoxidase (MPO) und Lipocalin-2 (LCN-2) wurden in Homogenaten des Ileumgewebes in voller Dicke gemessen. Die Daten werden als mittlere ± SD dargestellt. Die statistischen Analysen wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test durchgeführt, gefolgt vom Dunn-Mehrfachvergleichstest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Die IL-1β-Konzentrationen korrelieren positiv mit der histologischen Schädigung und die Fibrose und Fibrose korreliert mit dem histologischen Schadenswert bei SHIP-/- Mäusen. Eine Spearman-Korrelationsanalyse wurde durchgeführt, um die Beziehungen zwischen histologischem Schadens-Score, Fibrose-Score und IL-1β-Konzentrationen in ilealem Gewebe in voller Dicke von SHIP-/- Mäusen zu bewerten. Signifikante positive Korrelationen wurden zwischen (A) histologischem Schadensscore und IL-1β-Konzentrationen (r = 0,6813), (B) Fibrose-Score und IL-1β-Konzentrationen (r = 0,4117) und (C) histologischem Schadens-Score und Fibrose-Score (r = 0,6241) beobachtet. Jeder Datenpunkt steht für eine einzelne Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

SchadenskomponentePunktzahl
Verlust der Crypt-Architektur0 = keine
1 = <25 % Verlust
2 = 25-50% Verlust
3 = 50-75% Verlust
4 = >75 % Verlust
Infiltration von Immunzellen0 = keine
1 = gelegentliche Immunzelle in der Lamina propria
2 = vermehrte Immunzellen in der Lamina propria
3 = konfluente Immunzellen in der Lamina propria und durchbrechende Schleimhaut
4 = Infiltration von Immunzellen in der gesamten Sektion
Becherzellhyperplasie und -hypertrophie0 = keine
1 = <50 % Zunahme der Anzahl und Größe der Becherzellen
2 = >50 % Zunahme der Anzahl und Größe der Becherzellen
Eiterung0 = keine
1 = intermediäre Ulzeration
2 = starke Ulzeration
Ödem0 = keine
1 = <50 % des Abschnitts
2 = >50 % des Abschnitts
Muskelverdickung0 = keine
1 = Zwischenverdickung
2 = starke Verdickung

Tabelle 1: Histologische Schadenswerte. Die histologische Schädigung der ilealen Querschnitte von SHIP+/+ und SHIP-/- Mäusen, die mit H&E gefärbt wurden, wird auf der Grundlage der Schlüsselmerkmale der Ileitis bewertet, die das SHIP-/- Mausmodell charakterisieren, einschließlich Verlust der Architektur (0-4), Infiltration von Immunzellen (0-4), Becherzellhyperplasie und -hypertrophie (0-2), Ulzeration (0-2), Ödeme (0-2) und Muskelverdickung (0-2).

Fibrose-KomponentePunktzahl
Übermäßiges Kollagen0 = Normale Architektur; kein überschüssiges Kollagen
1 = Leichter Anstieg des Kollagens; beschränkt auf Submukosa oder Subserosa
2 = Mäßige Kollagenexpansion in die Submukosa und partielle Muscularis propria, mit unorganisierten Bündeln
3 = Extensives, dichtes Kollagen, das die normale Struktur ersetzt, mit Beteiligung von Submukosa und Muscularis (transmural)
Fibromuskuläre Hyperplasie/Muskelbildung/muskuläre Obliteration der Submukosa0 = Keine, normaler Submukosagehalt der Muskeln
1 = Leichte Erhöhung des Muskelinhalts
2 = Große Menge an Muskeln in der Submukosa, beeinflusst die Morphologie, aber die normale Struktur
3= Der Muskel hat den gesamten submukösen Raum verödet

Tabelle 2: Fibrose-Scoring. Die Fibrose in ilealen Querschnitten von SHIP+/+ und SHIP-/- Mäusen, die mit Massons Trichrom gefärbt wurden, wurde auf der Grundlage von Schlüsselmerkmalen der Darmfibrose bewertet, die im SHIP-/- Modell beobachtet wurden, einschließlich übermäßiger Kollagenablagerung (0-3) und fibromuskulärer Hyperplasie oder muskulärer Obliteration der Submukosa (0-3). Kollagen wird auf Ausdehnung und architektonische Störung untersucht, während muskuläre Veränderungen auf der Grundlage des Grades der Muskelinfiltration und der Verzerrung der submukösen Struktur bewertet werden.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Beurteilung von Ileitis und Darmfibrose bei SHIP-/- Mäusen, einem Mausmodell für Zöliakie-ähnliche Darmentzündungen mit begleitender fibrotischer Pathologie. Das SHIP-/- Mausmodell rekapituliert Merkmale der Zöliakie, die in anderen Mausmodellen der Darmentzündung nicht häufig zu sehen sind, insbesondere die ileale Lokalisation, die fleckige und transmurale Entzündung und die fibrotische Pathologie19,26. In Kombination mit der einfachen Züchtung und der kurzen Zeit bis zur Krankheitsmanifestation ist das SHIP-/-Modell als leistungsfähiges Werkzeug für die translationale Forschung in CD19 gut positioniert.

In dieser Studie wurde die statistische Signifikanz für den FITC-Dextran-Assay und das histologische Scoring mit dem Kruskal-Wallis-Test bewertet, da diese Datensätze nicht den Normalitätsannahmen entsprachen, die für eine unidirektionale ANOVA erforderlich sind, und histologische Scores diskontinuierliche, nicht-parametrische Variablen darstellen. Obwohl unsere Analysen keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den mit Dexamethason behandelten und den mit Vehikeln behandelten Gruppen ergaben, beobachteten wir klare Trends. Dexamethason reduzierte die intestinale Permeabilität und Histopathologie von SHIP-/- Mäusen, und diese Effekte könnten bei größeren Stichprobengrößen signifikant gewesen sein.

Bei der Durchführung dieses Protokolls können mehrere technische Herausforderungen auftreten. In Bezug auf die Gewebehandhabung erfordern SHIP-/- ilea eine schonende Manipulation während der Dissektion, da sie zum Reißen neigen. Dies ist besonders wichtig bei der Vorbereitung von Geweben für die grobe Bildgebung. Die Gewebefixierung ist ein weiterer kritischer Faktor für die histologische Analyse. Formalin-fixiertes Gewebe eignet sich sowohl für die H&E- als auch für die Masson-Trichrom-Färbung, ist jedoch nicht mit der Alcianblau/PAS-Färbung kompatibel. Im Gegensatz dazu ist Carnoy-fixiertes Gewebe für die H&E- und Alcianblau/PAS-Färbung geeignet, nicht jedoch für Massons Trichrom. Die Fixierung von Carnoy führt zu einer intensiven und diffusen dunkelblauen Färbung, die die Visualisierung von Kollagen und Muskelschichten verdeckt. Für die Zytokinanalyse ist es unerlässlich, Proben auf Eis zu verarbeiten, da Zytokine sehr empfindlich auf den Abbau reagieren. Es ist wichtig, geklärte Gewebehomogenate unmittelbar nach der Verarbeitung zu aliquotieren. Wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen können die Integrität der Zytokine erheblich beeinträchtigen und mögliche Unterschiede zwischen Genotypen und/oder Behandlungsgruppen untergraben. Um eine genaue Quantifizierung zu gewährleisten, empfehlen wir schließlich, mehrere Verdünnungen jeder Probe durchzuführen, um zu bestätigen, dass die Messwerte innerhalb des linearen Bereichs der Standardkurve des Assays liegen, und um mögliche Interferenzen durch die komplexe Gewebematrix zu minimieren. Die Berücksichtigung dieser technischen Überlegungen ist unerlässlich, um reproduzierbare und interpretierbare Ergebnisse zu erzielen, aber auch die biologische Variabilität, die SHIP-/- Mäusen innewohnt, muss sorgfältig gehandhabt werden.

Es gibt mehrere kritische Aspekte der SHIP-/--Mäuse, die ebenfalls berücksichtigt und sorgfältig kontrolliert werden sollten, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten und Störvariablen zu minimieren. Das Darmmikrobiom hat einen tiefgreifenden Einfluss auf die Krankheitsentwicklung und das therapeutische Ansprechen in murinen IBD-Modellen27,28. Unsere bisherigen Arbeiten haben gezeigt, dass Darmentzündungen bei SHIP-/- Mäusen mikrobiotaabhängig sind und mit Antibiotika gelindert werden können29. Daher sollten Kontrollen der Wurfgeschwister eingesetzt werden, um die mikrobiombedingte Variabilität zu verringern, und die Behandlungsgruppen müssen hinsichtlich der Käfigherkunftausgewogen sein 30. Darüber hinaus ist ein sorgfältiges Geschlechtsmatching unerlässlich. Obwohl bei SHIP-/- Mäusen keine geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Penetranz oder Schwere der Erkrankung beobachtet wurden, zeigen andere Ileitis-Modelle wie SAMP1/YitFc einen früheren Beginn und eine erhöhte Schwere der Erkrankung bei Weibchen 14,31. Da Sexualhormone auch die mikrobielle Zusammensetzung modulieren können32, ist die Abstimmung nach Geschlecht entscheidend, um potenzielle Störfaktoren in Behandlungsstudien zu minimieren. Darüber hinaus können einzelne Behandlungen, die derzeit untersucht werden, bei männlichen und weiblichen Mäusen eine unterschiedliche Wirksamkeit haben. Obwohl unsere aktuellen Ergebnisse keine geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Erkrankung oder dem therapeutischen Ansprechen auf Dexamethason zeigen, sollte in allen Behandlungsstudien ein Geschlechtsmatching durchgeführt werden.

Zusätzlich zu den oben beschriebenen Überlegungen zum Mikrobiom und zum Geschlecht ist es wichtig, SHIP+/+-Mäuse in Behandlungsstudien einzubeziehen, um die Auswirkungen des Vehikels und der Therapeutika in Abwesenheit von Darmentzündungen zu bewerten. Dadurch wird sichergestellt, dass weder das Medikament noch seine Verabreichungsmethode die Pathologie im gesunden Darm verursachen oder dazu beitragen, wodurch die Interpretation der therapeutischen Wirksamkeit und Sicherheit verbessert wird.

Der Zeitpunkt der Behandlungsintervention ist ebenfalls wichtig und sollte entsprechend den experimentellen Zielen modifiziert werden, da es bei Mäusen im Alter von 4, 8 und 12 Wochen signifikante Unterschiede sowohl in der Entzündung als auch in der Fibrose gibt 19,26. SHIP-/- Mäuse entwickeln bereits im Alter von 4 Wochen eine Darmentzündung, wobei alle Mäuse im Alter von 6 Wochen eine Entzündung aufweisen, und Marker für eine fibrotische Pathologie können bereits im Alter von 6 Wochen gemessen werden und sind im Alter von 8 Wochen gut etabliert19,26. Daher sollten Behandlungen zur Behandlung von Ileumentzündungen im Alter von 6 Wochen beginnen. Antifibrotische Interventionen können prophylaktisch nach 6 Wochen oder therapeutisch nach 8-10 Wochen eingeleitet werden. Der Ausbruch und die Schwere der Erkrankung können jedoch je nach mikrobieller Umgebung variieren, die von Einrichtung zu Einrichtung unterschiedlich ist. Die Forscher müssen zunächst die Krankheitskinetik in ihrer Kolonie bestimmen, bevor sie Behandlungsprotokolle durchführen. Darüber hinaus können SHIP-/- Mäuse eine Gewichtsreduktion von bis zu 17 % um 4-5 Wochen aufweisen, mit weiteren 5 % bis 8-10 Wochen33. Tiere, die einen starken Gewichtsverlust aufweisen, sollten von den Studien ausgeschlossen werden, da dies eine schwere Manifestation der Krankheit widerspiegelt und die Behandlungsergebnisse im Zusammenhang mit der Darmpathologie beeinträchtigen kann.

Ein wichtiger Aspekt bei der Analyse des Krankheitsverlaufs im SHIP-/- Modell ist die Auswahl geeigneter Entzündungsmarker. Basierend auf unserer umfangreichen Erfahrung mit der SHIP-/-Maus konzentriert sich das Zytokin-Profiling in der Regel auf spezifische Mediatoren, wie z.B. IL-1β, von denen bekannt ist, dass sie während des Fortschreitens der Erkrankung hochreguliert werden. Für eine erste Charakterisierung von Entzündungsreaktionen oder bei der Evaluierung neuartiger Therapiestrategien ist jedoch eine Multiplex-Zytokin-Analyse ratsam. Dieser unvoreingenommene Ansatz ermöglicht ein breiteres Profiling des entzündlichen Milieus und kann unerwartete Ziele aufdecken, die für die Pathogenese der Krankheit oder das Ansprechen auf die Behandlung relevant sind.

Das SHIP-/- Mausmodell bietet praktische Vorteile, die Reproduzierbarkeit und Effizienz ermöglichen. SHIP-/- Mäuse entwickeln spontane und konsistente ileale Entzündungen und Fibrosen, ohne dass exogene Auslöser erforderlich sind. Dadurch wird die Variabilität im Zusammenhang mit der Reagenzienvorbereitung und nicht standardisierten Dosierungsprotokollen bei der Induktion von Darmentzündungen eliminiert. Der Krankheitsausbruch ist schnell, wobei die Entzündung im Alter von 4-6 Wochen und die Fibrose im Alter von 8 Wochen offensichtlich ist, was das Modell sowohl zeit- als auch kosteneffizient macht. Darüber hinaus sind SHIP-/- Mäuse einfach zu züchten und zu pflegen, die Genotypisierung ist unkompliziert und es sind keine speziellen Zuchtstrategien erforderlich. Dies vereinfacht das Koloniemanagement, reduziert den technischen Aufwand und senkt das Risiko der Einführung unbeabsichtigter genetischer Variabilität 19,21,26. Die Krankheit kann mit weit verbreiteten Techniken in den meisten Forschungsumgebungen zuverlässig beurteilt werden, einschließlich des FITC-Dextran-Assays, der H&E- und Masson-Trichrom-Färbung sowie des ELISA. Diese kombinierten Funktionen unterstützen ein effizientes Studiendesign, senken finanzielle und technische Barrieren und fördern die konsistente Datengenerierung zwischen Laboren.

Das SHIP-/- Modell bietet zwar einzigartige Vorteile, hat aber auch Einschränkungen. Wie bei allen präklinischen Modellen kann es die komplexe, multifaktorielle Natur der menschlichen CED, die von genetischen, Immun- und Umweltfaktoren beeinflusst wird, nicht vollständig replizieren34. Die Modelle DSS und TNBS sind aufgrund ihrer Einfachheit und Kosteneffizienz nach wie vor sehr beliebt. In Kombination mit genetischen Modifikationen können diese chemischen Modelle als effektive Werkzeuge zum Verständnis genspezifischer Beiträge zur Barrierefunktion dienen35. Ihr Hauptnutzen liegt jedoch in der Modellierung akuter Epithelverletzungen; Sie erfassen nicht die chronische immunvermittelte Pathologie, die die Zöliakie charakterisiert, und ihren Mechanismus der Epithelschädigung, der durch chemische Wirkstoffe induziert wird, denen es an direkter klinischer Relevanz mangelt36. Das ausschließliche Vertrauen auf ein Modell kann zu einer unvollständigen und/oder irreführenden Bewertung des therapeutischen Potenzials führen, und es wird empfohlen, mehrere Modelle zu verwenden, um die Wirksamkeit der Behandlung sicherzustellen.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wird von der Animal Care Facility am BC Children's Hospital Research Institute unterstützt und vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada über das Canadian Glycomics Network (GlycoNet, A Network of Centre of Excellence) und die Canadian Institutes of Health Research (MOP-133607 bis LS) finanziert. K.S. und W.M. sind Empfänger der TRIANGLE-Promotionsstipendien (TRaIning a New generation of researchers in Gastroenterology and LivEr program).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,7 ml Snap Cap Mikroröhre DiamedSPE155-N
1x DPBS (kein Calciumchlorid, kein Magnesiumchlorid)GibcoREF 14190-144
25G x figure-materials-1” Nadeln BDREF 305122Für Herzpunktionen
26G x figure-materials-2” NadelnBDREF 305110Darmspülung
EssigsäureSigma-AldrichA6283Histologie
Säure-Citrat-Dextroselösung (38 mM Zitronensäure, 107 mM Natriumcitrat, 136 mM Dextrose)Millipore SigmaC3821
Tierfutternadel, nicht steril, wiederverwendbar, Typ 304SSMillipore Sigma CAD7900 Für Gavage
Gerade
Größe: 24G,
Lxdiam. 1 rein. x 1,25 mm,
Kugel
AprotininCayman Chemical9087-70-1Homogenisierungspuffer
BD Luer-Lok Spritze steril, Einmal, 5 mlBDREF 309646Darmspülung
BD OptEIA Maus IL-6 ELISA SetBD Biosciences555240
BD OptEIA Maus TNF ELISA Set IIBD Biosciences558534
BD® Luer Slip Tip Spritze steril, Einweg, 1 mlBDREF 309659
Biopsie-Schaumpads quadratisch, 30,2 x 25,4 x 2 mm H.Simport ScientificREF M476-1Histologie
Gepuffertes Formalde-Frisch (Geruchsarm, 10 % Formalin)Fisher ChemicalSF93-4Histologie
Klare, flachboden immun-nichtsterile 96-Well-PlattenThermowissenschaftlich439454
Eppendorf 5415R Kühlzentrifuge Marshall ScientificEP-5415R
Ethylalkohol wasserfreiGreenfield GlobalP016EAANHistologie
Fisherbrand TRU-FLOW GewebekassetteFisher Scientific15-200-403Histologie
FITC-Dextran, 3-5 kDa (1g)Millipore SigmaFD4-1G
CAS-Nummer: 60842-46-8
LeupeptinMillipore Sigma103476-89-7Homogenisierungspuffer
Maus IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet ELISA R& D-SystemeDY401
Multiscreen-96-Well-Platte, massiver BodenMillipore SigmaMSSWNFX40Weiß, nicht steril, nicht behandelt
OmniPur-ChloroformMillipore Sigma3150Histologie
Polytron PT-MR2100 HomogenisatorKinematica AG632081
Varioskan Lux Multimode-MikroplattenleserThermowissenschaftlichVL0L00D0

Referenzen

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