Methodenartikel

Mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell für die In-vivo-Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären

DOI:

10.3791/68939

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21. November 2025

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1Biomedical Engineering and Physics, Amsterdam University Medical Center, University of Amsterdam, 2Amsterdam Neuroscience, neurovascular disorders, 3Amsterdam Cardiovascular Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll enthält eine ausführliche Beschreibung eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes für ein chronisches Schädelfenster- und mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell, das für die in vivo Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären optimiert ist.

Zusammenfassung

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Mikrovaskuläre Verschlüsse im Gehirn sind relativ häufig, sind aber weitgehend wenig erforscht. Die Ereignisrate, langfristige Folgen und mögliche Clearing-Mechanismen sind weitgehend unbekannt. Aktuelle Modelle, die zur Untersuchung dieser Ereignisse verwendet werden, wie Photothrombose und Mikroembolieninjektion, haben jeweils ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen. Diese Studie entwickelte ein detailliertes Protokoll, das die Vorbereitung eines chronischen Schädelfensters mit der Induktion von zerebralen mikrovaskulären Embolismen durch intraarterielle Mikrosphäreninjektion bei Mäusen kombiniert. Dieses Setup ermöglicht eine langfristige In-vivo-Bildgebung der Mikrogefäße und Mikrookklusionen mittels Zweiphotonenmikroskopie. Mikrosphären werden durch einen Katheter in der externen Halsschlagader (ECA) verabreicht, der dauerhaft gebunden ist. Wichtig ist, dass die Arteria common carotis (CCA) und internal carotis arteria (ICA) während und nach dem Eingriff intakt bleiben, wodurch eine Störung des zerebralen Blutflusses minimiert wird. Um eine sofortige In-vivo-Bildgebung zu ermöglichen und Mikrosphärenclustering oder -haftung an Pipettenspitzen und Katheter zu verhindern, werden Mikrosphären in einer Mischung aus FITC-Dextran und 0,1 % Tween 20 suspendiert. Die Injektionstechnik wurde mittels postmortaler 3D-Bildgebung in situ validiert, um die Verteilung der Mikrosphären zu bestimmen. Diese Studie demonstriert ihren Nutzen weiter mit einem Beispiel einer In-vivo-Zweiphotonenmikroskopie . Dieser Ansatz bietet eine konsistente und robuste Methode zur Induktion und Untersuchung mikrovaskulärer Embolismen und ermöglicht die Untersuchung ihrer Auswirkungen und Clearance-Dynamiken mittels hochauflösender in vivo Bildgebung.

Einleitung

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Ein ischämischer Schlaganfall infolge einer Embolie einer großen Großhirnarterie ist ein akutes und oft verheerendes Ereignis1. Embolien können auch in weiter entfernten Gefäßen auftreten. Infolgedessen können sich stille Hirninfarkte (SBIs) entwickeln; Wie der Name schon sagt, bleiben diese symptomatisch und werden typischerweise zufällig während der Bildgebung aus nicht zusammenhängenden Gründen entdeckt 2,3. SBIs sind häufig und gehören zu den am häufigsten beobachteten zerebrovaskulären Erkrankungen bei Autopsien älterer Personen 4,5. Epidemiologische Studien haben eine Prävalenz von 20 % bei Personen ohne Schlaganfallvorgeschichte gezeigt. SBIs tragen zu kognitiven Dysfunktionen und Demenz bei, erhöhen die Gesamtmortalität und sind ein Risikofaktor für zukünftigen Schlaganfall 6,7,8. Die Infarkte sind typischerweise nur wenige Millimeter im Durchmesser und sind mit einer Verschlussfolgerung der penetrierenden Arterien mit Durchmessern von etwa 100 μm verbunden. Diese Penetratoren bilden ein ausgedehntes arterioläres und kapillares Bett. Ein kleiner Mikrothrombus, der durch die durchdringenden Arterien fließt und sich in der nachgeschalteten Mikrozirkulation festsetzt, bleibt auf Angiographie9 wahrscheinlich nicht nachweisbar. Dennoch können viele Mikrothromben durch Vorhofflimmern, atherosklerotische Plaques und aus anderen Quellen freigesetzt werden: 10,11,12,13,14. Neben Mikrothromben können auch andere Mikropartikel (MPs), darunter Fettpartikel, zelluläre Aggregate und sogar Mikroplastik, mikrovaskuläre Embolismen verursachen. Mehrere Studien zeigen das Vorhandensein von plastischem MP im Blut und im Gehirn, das größer ist als der Kapillardurchmesser von 5 μm15,16.

Mikrovaskuläre Verschlüsse sind im Vergleich zu akuten Schlaganfällen und SBI noch relativ wenig erforscht. Über die Ereignisrate, langfristige Folgen und mögliche Clearing-Mechanismen ist wenig bekannt. Das Interesse wächst jedoch rapide nach der erfolgreichen klinischen Einführung der mechanischen Thrombektomie beim Schlaganfall, bei dem mikrovaskuläre Embolismen nach scheinbar erfolgreicher Rekanalisierung der großen Übelarterie17 eine beeinträchtigte mikrovaskuläre Reperfusion verursachen können. Darüber hinaus gibt es einen Anstieg der Forschung zu Mikroplastiken, die teilweise durch mikrovaskuläre Embolismen 18,19,20 beeinflusst werden könnten.

Mikrovaskuläre Okklusionen im Mauskortex können unter anderem mittels Multiphotonenmikroskopie unter Verwendung eines Schädelfensters untersucht werden. Die am häufigsten verwendeten Modelle zur Untersuchung zerebraler mikrovaskulärer Okklusionen sind das photothrombotische und das Mikrosphärenmodell. Das photothrombotische Modell verwendet lichtempfindliche Farbstoffe, um durch Photoaktivierung Embolien in ausgewählten Gefäßen (typischerweise nicht-kapillaren Gefäßen) zu induzieren. Dieses Modell erlaubt jedoch nicht die Untersuchung von Embolien über einen längeren Zeitraum, da das fibrinolytische System aktiviert wird, wodurch die Embolie21,22 aufgelöst wird. Außerdem erzeugt die Aktivierung des lichtempfindlichen Farbstoffs Singlet-Sauerstoffspezies, was Schäden an der Endothel- und Blut-Hirn-Schranke (BBB)verursacht. Für Studien zur Funktion von Endothel- und BBB während zerebraler Embolismen sowie zu den langfristigen Auswirkungen auf den Gehirnkreislauf und die Gehirnfunktion wird daher das Mikrosphärenmodell bevorzugt. Das Mikrosphäreninjektionsmodell verwendet Mikrosphären, die in den zerebralen Kreislauf injiziert werden, um die zerebrale Mikrovaskulaturzu verschließen 9,24,25,26,27,28,29,30. Der mögliche Nachteil dieses Modells liegt darin, dass es im Gegensatz zur photothrombotischenMethode 31,32 nicht möglich ist, den Ort der Embolismen vorab zu bestimmen. Der Vorteil besteht darin, dass Mikrosphären mit klar definierten Durchmessern injiziert werden können, wodurch (Mikro-)Gefäße mit spezifischen Durchmessern 33,34,35 gezielt angesprochen werden.

Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Ansätze zur Injektion von Mikrosphären in den Gehirnkreislauf der Nagetiere entwickelt. Diese Protokolle finden einen Konsens beim Zugang zum Halsschlagaderdreieck, das aus der gemeinsamen Halsschlagader (CCA), der internen Halsschlagader (ICA) und der externen Halsschlagader (ECA) für die intraarterielle Mikrosphäreninjektion besteht. Die Methode der intraarteriellen Mikrosphäreninjektion variiert zwischen den Protokollen in mehreren Punkten. Erstens wurden in den Studien entweder eine Spritze 9,26,27,29,33,34 oder ein Katheter 25,28,30,36 verwendet. Zweitens gibt es eine erhebliche Unterschiede in der Anzahl und Größe der injizierten Mikrokugeln. Die Mikrosphärendurchmesser liegen typischerweise zwischen 10 und 50 μm, wobei die Wahl von der Zielgefäßgröße abhängt. Als Faustregel gilt: Je größer die Mikrosphären, desto niedriger sollte man injizieren, da es weniger Arteriolen als Kapillaren25, 26 und 30 gibt.

Eine konsequente intraarterielle Mikrosphäreninjektion bleibt eine Herausforderung. In der Praxis werden große Mengen von Mikrosphären injiziert, doch nur ein Bruchteil erreicht den Gehirnkreislauf. Dies ist besonders problematisch für die Untersuchung der Auswirkungen festgesetzter Mikrosphären mittels in vivo Zweiphotonmikroskopie-Bildgebung, da der Erfolg dieser Technik vom Vorhandensein von Mikrosphären in den äußeren Schichten des Mauskortex innerhalb der Sicht durch das vorbereitete Schädelfenster abhängt. Die Auswahl geeigneter fluoreszierender Farbstoffe für Mikrosphären ist entscheidend, da die Kombination mit transgenen Mausmodellen und intravaskulärer Färbung aufgrund der intensiven Fluoreszenz der Mikrosphären und überlappender Emissionsspektren schwierig sein kann.

Mikrovaskuläre Verschlüsse werden in Nagetiermodellen untersucht, und synergetische Effekte mehrerer Mikrosphären wurden bereits in ex-vivo Nagerhirn9 sowie die scheinbare Extravasation solcher Partikel gezeigt, ein Prozess namens Angiophagie 33,35,37,38. Um ihre In-vivo-Untersuchung zu ermöglichen, wurden Methoden für die Multiphotonenmikroskopie bei Mäusen mit Schädelfenstern entwickelt. Ziel der aktuellen Studie ist es, ein detailliertes Protokoll für die intraarterielle Injektion von Mikrosphären bei Mäusen zu entwickeln und zu berichten, das die Untersuchung ihrer Auswirkungen auf das Gehirngewebe und deren Schicksal optimiert. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist seine verbesserte Verabreichungseffizienz, wodurch der Verlust der Mikrosphäre minimiert und die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, dass sie im mittleren Bereich der Gehirnarterie (MCA) im Bereich der Bildgebung des Schädelfensters auftreten. Das optimierte Mikrosphäreninjektionsprotokoll wird mittels in vivo Zweiphotonenmikroskopie und postmortaler 3D-Bildgebung in situ mit einem speziellen imaginären Kryo-Mikrotom39 bewertet.

Protokoll

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Alle Verfahren mit Tieren folgten dem Leitfaden zur Pflege und Nutzung von Labortieren. Das Zentralkomitee für Tierversuche der Niederlande erteilte die vollständige Genehmigung (AVD11400202316817).

HINWEIS: Männliche und weibliche Mäuse im Alter zwischen 2 Monaten und 1 Jahr wurden eingesetzt. Nach der Ankunft wurden die Tiere sieben Tage lang akklimatisiert, bevor ein experimenteller Eingriff begann. Die Tiere wurden mit maximal 4 Tieren pro Gitter untergebracht, mit Futter und Wasser ad libitum versorgt und in einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus gehalten. NG2-DsRed- und TIE2-GFP-Mäuse wurden erhalten (siehe Materialtabelle für Details) und intern gezüchtet.

1. Kranialfenster-Implantat

  1. Anästhesie und präoperative Behandlung
    1. Gib 0,06 mg/mL Carprofen 1 Tag vor Beginn der Schädelfenster-Operation ins Trinkwasser.
    2. Wiegen Sie die Maus und verabreichen Sie 30 Minuten vor der Operation subkutan 5 mg/kg Carprofen und 2 mg/kg Dexamethason.
    3. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie ein Heizkissen mit Rückkopplungssystem auf den stereotaktischen Rahmen legen und ihn mit einem sterilen Tuch abdecken.
    4. Legen Sie alle sterilen chirurgischen Instrumente auf ein zweites steriles Tuch.
    5. Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit einem Luftgemisch von 1 L/min (30 % Sauerstoff und 70 % medizinische Luft) und 3–4 % Isofluran, gefolgt von der Aufrechterhaltung der Anästhesie mit 1,5–2 % Isofluran mit einer Gesichtsmaske.
    6. Sichern Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen und führen Sie die Thermometersonde des Heizkissens rektal mit Schmiermittel ein. Trage Augensalbe auf, um ein Austrocknen zu verhindern, und stelle das Heizkissen auf 37 °C.
    7. Subkutan 1,5 mg/kg Ropivacain an der chirurgischen Schnittlinie 5 Minuten vor der Operation verabreichen.
    8. Reinigen Sie die Haut über dem Schädel vom Hals bis knapp hinter den Augen mit Betadin und einer Baumwollspitze.
  2. Chirurgische Vorbereitung für Stirn- und Fensterfixierung
    1. Machen Sie mit steriler Zange und chirurgischer Schere einen ersten Schnitt in der Haut über dem hinteren Schädel. Verlängern Sie den Schnitt von der Lambda-Naht entlang der Mittellinie nach vorne zu den Frontallähten direkt vor dem Bregma (Abbildung 1A). Ziehe vorsichtig die Haut zurück und entferne sie, damit die Temporalismuskeln auf beiden Seiten vollständig freigelegt werden.
    2. Tragen Sie etwa 0,1 ml 1 % Lidocain auf den Schädel auf, um die Blutung zu minimieren.
    3. Entfernen Sie das Periost und kratzen Sie alle Bereiche des Schädels, wo die Kopfstange fixiert wird, mit einer chirurgischen Klinge. Machen Sie die Kratzer senkrecht quer über den Schädel, um eine feste Haftung der Kopfstange zu gewährleisten.
    4. Reinigen Sie das verbleibende Blut mit einer Baumwollspitze und trocknen Sie den Schädel mit Druckluft.
  3. Kopfstangenfixierung
    1. Bereiten Sie eine Dentalklebermischung in einem kalten (4 °C) Keramikbehälter vor, indem Sie 100 μL Monomer zu 0,1 g Polymer hinzufügen und mischen. Gib 1 Tropfen Katalysator zur Mischung, um eine schnelle Verhärtung des Klebstoffs zu initiieren.
    2. Trage den Kleber auf den unteren Rand der Stirnstange auf. Neigen Sie die Kopfstange leicht zur linken Seitenseite vom Sinus sagittalis und drücken Sie auf den Schädel. Tragen Sie zusätzlichen Kleber an den Rändern der Kopfstange auf, um alle Öffnungen abzudichten. Dies sorgt für feste Haftung.
    3. Stellen Sie eine zahnbetonte Zementmischung her, indem Sie 100 μL Zahnbetonflüssigkeit mit 0,1 g Pulver mischen. Trage den Zement auf alle Seiten der Kopfstange auf und verhindern, dass der Zement am Bohrbereich auf den Schädel fließt. Fügen Sie eine zusätzliche Schicht Zahnklement auf die Kopfstange hinzu, um einen Brunnen zu bilden, der das Auftragen von Flüssigkeiten auf das Schädelfenster ermöglicht (Abbildung 1B).
    4. Lass den Zahnkleber und Zement mindestens 10 Minuten trocknen.
    5. Überprüfen Sie die feste Haftung der Kopfstange, indem Sie sanft Druck auf den Schädel ausüben, an dem die Kraniotomie durchgeführt wird. Die Kopfstange ist richtig befestigt, wenn sich der Schädel nicht bewegt und keine Flüssigkeit zwischen dem Zahnzement und dem Schädel entsteht.
  4. Kraniotomie
    1. Befestigen Sie die Maus mit der Kopfstange am Bildhalter oder halten Sie sie im stereotaktischen Rahmen, um den Kopf des Tieres während der Kraniotomie fest zu sichern.
    2. Markiere das Kraniotomie-Bohrziel (4 mm Durchmesser) am Schädel mit einem Feinpunktmarker. Lokalisieren Sie das MCA sichtbar durch den Schädel, um sicherzustellen, dass das Schädelfenster optimal positioniert ist und so viel wie möglich von der MCA bedeckt. Um die korrekte Größe und Platzierung des Bohrziels zu bestätigen, halten Sie das Abdeckglas über dem markierten Bereich und passen die Größe des Bohrziels bei Bedarf an.
    3. Beginne damit, in Kreisen an den Markierungen zu bohren, ohne Druck auf den Schädel auszuüben, um die Wärmebildung zu verhindern (Abbildung 1C). Kühlen Sie den Schädel, indem Sie alle 30 Sekunden Kochsalzlösung auftragen. Während des Abkühlens reinigen und kühlen Sie den Bohrkopf, indem Sie ihn in Wasser tauchen und anschließend mit einem Papiertuch trocknen. Entfernen Sie den gesamten Knochenstaub regelmäßig mit Druckluft. Überprüfen Sie die Größe der Kraniotomie, indem Sie das Deckglas auf den Schädel legen und gegebenenfalls die Bohrung anpassen.
    4. Bohren Sie weiter im Kreis, bis der Knochen ausreichend ausgedünnt ist. Risse entstehen im Bohrbereich, sobald der Schädel fast durchstochen ist. Stellen Sie sicher, dass der Knochen ausreichend verdünnt ist, indem Sie Kochsalzlösung hinzufügen, um den verdünnten Schädel zu weichen, und die Mitte des Schädelbeins sanft im Bohrbereich eindrücken. Die Bohrfläche ist dünn genug, wenn der Schädel unter sanftem Druck gleichmäßig auf allen Seiten des Bohrbereichs nach unten rutscht. Bohren Sie weiter, bis dieser Punkt erreicht ist. Bohren Sie nicht durch den Schädel; Dies birgt das Risiko einer Schädigung der Dura Mater und des Gehirngewebes. Halten Sie den Bohrbereich mit aCSF getränkt, falls die Dura Mater beschädigt ist oder Blutungen auftreten.
      HINWEIS: Bevor Sie den Schädel entfernen, stellen Sie sicher, dass der gesamte Knochenstaub aus dem Bohrbereich entfernt ist. Restknochenpartikel auf der Dura können möglicherweise Knochennachwuchs unter dem Fenster auslösen.
    5. Beseitigen Sie den gesamten Knochenstaub gründlich mit CSF und Druckluft. Tragen Sie das gebohrte Gebiet mit aCSF auf, bis der Schädel vollständig untergetaucht ist. Mit einer 27-Gauge- (0,4 mm x 16 mm) oder 30-Gauge (0,3 mm x 13 mm) Nadel wird der verdünnte Schädel vorsichtig horizontal (~180°) durchstochen, um Schäden an Dura Mater und Gehirn zu vermeiden. Drücken Sie den Knochen vorsichtig nach oben, bis er sich löst, und wenden Sie minimale Kraft aus. Wenn sich der Knochen nicht leicht löst, bohren Sie weiter. Entfernen Sie den abgelösten Schädel mit einer Pinzette, wobei das Gehirn in Hechtfaser untertaucht bleibt (Abbildung 1D).
    6. Spülen Sie das Gehirn mit aCSF und legen Sie dann einen sterilen, absorbierenden Schwein-Gelatine-Hämostatischen Schweinschwamm mit aCSF auf das Gehirn, um die lokale Blutung für 2 Minuten zu kontrollieren. Entfernen Sie den Schwamm vorsichtig und halten Sie das Gehirn im Liquor. Spülen Sie weiterhin mit ACSF, um sicherzustellen, dass kein Knochenstaub oder Blut im Gehirn zurückbleibt. Wenn die Blutung anhält, legen Sie einen frischen, sterilen, saugfähigen hämostatischen Schwamm, der in Liquals getränkt ist, ins Gehirn auf.
      HINWEIS: Leichte Blutungen sind bei der Knochenentfernung häufig. Stellen Sie sicher, dass die Blutung aufgehört hat, bevor Sie das Glas aufstellen, da Restblutungen die Fensterklarheit verringern können.
  5. Platzierung von Abdeckungsglas
    1. Absorbiere das aCSF, das das Gehirn bedeckt, mit einer Baumwollspitze, sodass nur eine dünne Schicht übrig bleibt. Setzen Sie das Deckglas auf das Gehirn und drücken Sie es vorsichtig mit einer gebogenen Mikropinzette in die Schädelöffnung. Stellen Sie sicher, dass das Deckglas etwas unterhalb der Schädelhöhe sitzt und parallel zur Kopfstange positioniert ist.
      HINWEIS: Das Glas sollte fest gegen das Gehirn gedrückt werden, um die Höhlenbildung zu verhindern und die Fensterqualität zu erhalten. Das parallele Deckglas zur Kopfstange stellt sicher, dass es senkrecht zum Mikroskopobjektiv steht und so die Bildqualität verbessert.
    2. Befestigen Sie das Deckglas mit Epoxidkleber am Schädel und Kopf, tragen Sie es an den Seiten auf, während das Glas fest und parallel zur Kopfstange gehalten wird.
    3. Versiegeln Sie alle Kanten des Deckglases mit Kleber, um eine Gehirnbelastung zu vermeiden. Behalten Sie während der Anwendung einen Tropfen aCSF im Gehirn, um zu verhindern, dass Kleber unter das Fenster eindringt oder die Dura Mater berührt (Abbildung 1E).
    4. Lass den Kleber 5 Minuten fest werden.

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Abbildung 1: Überblick über das Kraniotomieprotokoll. Detaillierte Beispielbilder und Schematische Zeichnungen der entscheidenden Schritte während der Kraniotomie und der Platzierung der Kopfstange. (A) Entfernung der Haut (Schritt 2.2). (B) Befestigung der Kopfstange (Schritt 2.3). (C) Bohren der 4-mm-Kraniotomie (Schritt 2.4.3). (D) Entfernung des Schädels (Schritt 1.4.5). (E) Platzierung des Deckglases (Schritt 1.4.7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. Nachsorge nach der Operation
    1. Verabreichen Sie 5 mg/kg Carprofen subkutan.
    2. Bringen Sie das Tier für 30 Minuten in einen 37 °C Erholungskäfig. Dann bringen Sie ihn bis zu 2 Tage nach der Operation mit 0,06 mg/mL Carprofen im Trinkwasser zurück in den Stammkäfig.
    3. Geben Sie Futter, das in 0,06 mg/mL Carprofen getränkt ist, bis das Tier wieder sein Gewicht vor der Operation erreicht hat.
    4. Lassen Sie das Tier sich mindestens 7 Tage erholen, bevor die Mikrovaskulärembolie-Modelloperation durchgeführt wird.

2. Mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell

  1. Kathetermontage
    1. Führen Sie die Spitze eines 20 cm langen Mikrokatheter (ID 0,23114 OD 0,27432 mm) in einen transparenten Katheter (ID 0,31 OD 0,64 mm) ein und versiegeln Sie die Verbindung mit Epoxidkleber und Klebeband. Bestätigen Sie, dass die Gesamtlänge des Katheters ausreichend ist, um mindestens 160 μL zu halten.
    2. Führen Sie eine 27-Gauge-Luer-Lock-Nadel (0,1 mm x 16 mm) in das gegenüberliegende Ende des transparenten Katheters ein. Versiegeln Sie das Ende mit Epoxidkleber und Klebeband.
    3. Fülle eine 1-mL Spritze mit Kochsalzlösung und verbinde sie mit dem Luer-Lock der Katheternadel. Spülen Sie mit 0,7 ml Kochsalzlösung und sorgen Sie dafür, dass keine Undichtigkeiten oder Luftblasen zurückbleiben.
    4. Füllen Sie den Katheter mit 80 μL Kochsalzlösung und markieren Sie den im Katheter erreichten Wert.
  2. Anästhesie und präoperative Behandlung
    1. Geben Sie der Maus einen Tag vor der mikrovaskulären Embolie Trinkwasser mit 0,06 mg/mL Carprofen.
    2. Legen Sie ein Heizkissen mit Rückkopplungssystem unter ein steriles Tuch und stellen Sie es auf 37 °C ein.
    3. Legen Sie alle sterilen chirurgischen Instrumente auf ein zweites steriles Tuch.
    4. Wiegen Sie die Maus und geben Sie 30 Minuten vor der Operation subkutan 5 mg/kg Carprofen.
    5. Betäuben Sie die Maus mit 3–4 % Isofluran in einer Induktionskammer mit einem Gasstrom von 1 L/min, bestehend aus 30 % Sauerstoff und 70 % Operationsluft.
    6. Bringen Sie die Maus auf den Operationstisch und erhalten Sie die Anästhesie mit einer Gesichtsmaske, die 1,5–2 % Isofluran bei 1 L/min abgibt, mit 30 % Sauerstoff und 70 % Luft.
    7. Führen Sie eine befeuchtete Temperaturprobe für das Rektal ein und tragen Sie eine Augensalbe auf, um das Austrocknen zu verhindern.
    8. Setzen Sie eine 2-ml-Spritze unter den Hals der liegenden Maus, um den Zugang zum Operationsbereich zu erleichtern.
    9. Sichern Sie die Vorderpfoten vorsichtig mit Klebeband am OP-Tisch fest.
    10. Rasieren Sie den Operationsbereich ab und tragen Sie Betadin auf, gefolgt von Lidocain.
  3. Einschnitt
    1. Überprüfen Sie die Tiefe der Narkose mit einem Zehenkneifen.
    2. Machen Sie einen Mittellinienschnitt von etwa 0,5 cm über der Luftröhre unterhalb des Unterkiefers mit einer chirurgischen Schere und einer Dissektionszange.
    3. Zersezieren Sie das oberflächliche Bindegewebe zur Halsfaserfaszie mit einer Mikronaht-Binde, um die darunterliegenden sternohyoidealen Muskeln freizulegen.
    4. Trennen Sie die linke und rechte Sternohyoide-Muskulatur, indem Sie das Bindegewebe zwischen ihnen vorsichtig aufreißen. Ziehe den rechten Omohyoidealmuskel kaudallateral mit einem Gewebehaken zurück. Stellen Sie sicher, dass das rechte Halsschlagaderdreieck, einschließlich CCA, ICA und ECA, deutlich sichtbar ist.
  4. Chirurgische Vorbereitung der CCA, ICA, ECA und der hinteren Parietalarterie (PPA)
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, den Vagusnerv zu greifen oder zu kneifen; Bewegen Sie es nur vorsichtig, um negative Auswirkungen auf die Gesundheit des Tieres zu vermeiden. Berühren Sie die Luftröhre nicht, da dies Atemprobleme verursachen kann. Identifizieren Sie die Okzipitalarterie (OA), die sich von der ICA in der Mitte zwischen der Y-förmigen Bifurkation der ICA und dem Ursprung der ECA abzweigt, und die arterie superior thyroid (TA), die von der medialen Seite der ECA abzweigt. Diese Arterien sind empfindlich und sollten mit äußerster Vorsicht behandelt werden.
    1. Entfernen Sie alle verbliebenen Faszien und Fettgewebe rund um das CCA.
    2. Trennen Sie das CCA vorsichtig vom Vagusnerv.
    3. Lege zwei 4/0 1,5-Fäden um den CCA und binde sie locker zu. Stellen Sie sicher, dass die Knoten die Durchblutung des CCA nicht behindern.
    4. Entferne Faszie und Fettgewebe aus ICA und PPA. Verbinde temporär die PPA und alle ICA-Seitenzweige, einschließlich der OA, indem du einen Knoten mit einem 4/0 1,5-Faden bindest.
    5. Entferne Faszie und Fettgewebe aus dem ECA und TA. Setze zwei lose Knoten um ECA und TA mit 4/0 1,5 Gewinden. Positioniere den distalsten Faden so weit wie möglich von der Y-förmigen Bifurkation entfernt und benutze ihn, um ECA und TA dauerhaft zu ligieren. Lass den proximalen Knoten offen.
  5. Mikrosphärenlösungsvorbereitung und Katheterbelastung
    HINWEIS: Bereiten Sie die FITC-Dextran/Mikrosphären-Lösung kurz vor der Injektion vor, um die Haftung der Mikrosphäre am Katheter zu minimieren.
    1. Homogenisieren und sonisieren Sie die 10-μm-Mikrosphären (7,2 x 106 Mikrosphären /mL), um eine gleichmäßige Suspension einzelner Partikel zu erhalten.
    2. Bereiten Sie 140 μL 25 mg/mL 70 kDa FITC-Dextran mit 0,1 % Tween20 vor und fügen Sie dann 20 μL homogenisierte Mikrosphären hinzu, um 160 μL FITC-Dextran/Tween20/Mikrosphären-Gemisch mit 1,44 × 105 Mikrosphären zu erhalten.
    3. Ziehen Sie die Spritze, die mit dem Katheter verbunden ist, kurz zurück, um eine Luftschleuse zu schaffen.
    4. Tauchen Sie die Katheterspitze in die vorbereitete FITC-Dextran/Tween20/microsphere-Mischung ein und ziehen Sie die Spritze langsam zurück, bis die Mischung im Katheter ist.
    5. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Katheter vorhanden sind. Falls vorhanden, entleeren Sie das Gemisch in einen 0,5-mL-Behälter und wiederholen Sie die Schritte 2.5.3 und 2.5.4.
    6. Setzen Sie die Spritze mit dem geladenen Katheter in die Spritzenpumpe. Stellen Sie die Pumpe auf 10 μL/min ein und lassen Sie laufen, bis ein kleiner Tropfen Mikrosphärengemisch an der Katheterspitze erscheint.
  6. Katheterinsertion und Mikrosphäreninjektion
    HINWEIS: Vermeiden Sie das Injizieren von Luftblasen in das Gefäßsystem, da dies schwere Nebenwirkungen oder den Tod verursachen kann. Luftblasen können durch eine falsche Katheterbelastung oder Undichtigkeiten im Schlauch entstehen.
    1. Setzen Sie einen Behälterclip auf den ICA und ziehen Sie einen der zuvor vorbereiteten proximalen Knoten um den CCA fest (siehe Schritt 2.4.3).
    2. Mit einer Mikroschere wird ein kleiner diagonaler Schnitt in der ECA etwa 0,5 mm distal vom Ligaturfaden gemacht. Stellen Sie sicher, dass die Schnittgröße etwas kleiner ist als der Katheterdurchmesser.
    3. Nehmen Sie Blut mit einem sterilen Tuch oder Gewebe auf, damit kein Blut weiter an den Ligationen und dem Gefäßclip vorbeisickert.
      HINWEIS: Das Gefäßdreieck muss nach dem ECA-Schnitt blutfrei bleiben. Restblut kann zur Gerinnselbildung führen, die bei der Wiederherstellung des Karotisflusses zu großen zerebralen ischämischen Ereignissen führen oder die ECA blockieren kann, wodurch die Mikrosphäreninjektion verhindert wird.
    4. Starten Sie kurz die Spritzenpumpe, um an der Katheterspitze einen Tropfen Mikrosphärengemisch zu bilden, um sicherzustellen, dass keine Luft mehr in der Katheterspitze verbleibt.
    5. Öffnen Sie den ECA-Schnitt und führen Sie den Katheter mit feiner Mikropinzette ein. Vermeiden Sie es, beim Einführen andere Oberflächen zu berühren, um den Verlust der Mikrosphärenmischung oder das Eindringen von Luft in den Katheter zu verhindern. Wenn das Einsetzen fehlschlägt oder die Katheterspitze eine Oberfläche berührt, wiederholen Sie Schritt 2.6.4, bevor Sie es erneut versuchen.
    6. Sichern Sie den Katheter im ECA, indem Sie die proximale Naht (siehe Schritt 2.4.5) um die ECA anziehen.
    7. Stellen Sie sicher, dass keine Lecks oder Luftblasen im Gefäß entstehen, indem Sie die Spritzenpumpe mit 10 μL/min starten. Wenn eines davon vorhanden ist, lösen Sie den Katheter ab und kehren Sie zu Schritt 2.6.4 zurück.
    8. Wenn keine Leckage oder Luftblasen festgestellt werden, pumpen Sie weiterhin mit 10 μL/min, um den Druck im Katheter und in der Gefäße allmählich zu erhöhen, bis eine sichtbare Vergrößerung der Arterie festgestellt wird. Um den arteriellen Druck des Tieres anzupassen, stellen Sie vor dem Wiederöffnen von ICA und CCA einen ausreichenden Druck im Katheter und in der Gefäße her. Wenn der Blutfluss im CCA und ICA wiederhergestellt wird, kann etwas Blut in den Katheter gelangen, das anschließend in den ICA injiziert wird. Überprüfen Sie visuell die Injektion der Mikrosphärenmischung in die ECA und den erfolgreichen Druckaufbau, indem Sie beobachten, dass der grüne FITC-Farbstoff die Arterien füllt. Wenn dies nicht beachtet wird, stoppen Sie die Spritzenpumpe, entfernen Sie den Katheter und wiederholen Sie die Schritte 2.6.4 bis 2.6.8.
    9. Entferne den Behälterclip vom ICA und erhöhe dann den Durchfluss der Spritzenpumpe auf 20 μL/min. Bestätigen Sie die erfolgreiche Mikrosphäreninjektion, indem Sie überprüfen, dass das ICA distal zur PPA-Bifurkation mit FITC-Farbstoff gefüllt ist. Wenn bestätigt, fahren Sie mit Schritt 2.6.11 fort; Falls nicht, fahren Sie mit Schritt 2.6.10 fort.
    10. Stoppe die Spritzenpumpe und lockere die PPA-Ligatur. Positioniere die PPA-Ligation weiter distal von der ICA-PPA-Bifurkation und ziehe dann die Ligation fester. Zurück zu Schritt 2.6.9.
    11. Entfernen Sie das Gewinde, das das CCA ligaierte, damit das Mikrosphärengemisch in den ICA fließen kann.
    12. Fehlerbehebung im Falle von Retrogradströmung während der Injektion des Mikrosphärengemischs:
      1. Wenn eine retrograde Strömung des Mikrosphärengemisches in das CCA auftritt, wird der Durchfluss der Spritzenpumpe auf 10 μL/min reduziert.
      2. Wenn der retrograde Fluss anhält, drücken Sie vorsichtig auf ECA, ICA und CCA mit einer Mikropinzette, um sicherzustellen, dass keine Blockade des Flusses durch einen Thrombus vorhanden ist.
      3. Überprüfen Sie visuell, dass kein Luftembolus im Gefäß vorhanden ist. Eine Luftembolie kann als transparenter Schnitt innerhalb der Gefäße erkannt werden.
      4. Wenn eine Luftembolie vorhanden ist, stoppen Sie die Spritzenpumpe und bewegen Sie die Luftembolie zum ECA, indem Sie die Arterie vorsichtig mit einer Mikropinzette zusammendrücken. Ligiere den CCA und setze einen Gefäßclip auf den ECA. Entferne Katheter und Luftembolie und kehre zu Schritt 2.6.4 zurück.
      5. Wenn keine Versperrung vorhanden ist, aber der Retrograd Fluss anhält, schließen Sie den CCA mit einem Behälterclip und kehren Sie zu Schritt 2.6.10 zurück.
        HINWEIS: Ein retrograder Fluss des Mikrosphärengemisch in die CCA sollte nicht auftreten, da dies auf eine unzureichende Wiederöffnung des ICA, eine Luftembolie oder Thrombusbildung hinweisen kann, was potenziell nachteilige Auswirkungen auf das Ergebnis des Experiments hat.
    13. Stoppen Sie die Mikrosphäreninjektion, indem Sie die Spritzenpumpe abschalten, sobald das Gemisch im Katheter die 80-μL-Marke erreicht hat (siehe Schritt 3.1.4). Insgesamt werden 80 μL FITC-Dextran/Tween20 mit 7,2 x 104 Mikrosphären injiziert.
  7. Abschluss des Verfahrens
    1. Ligatiere den CCA mit dem verbleibenden vorbereiteten Knoten (siehe Schritt 2.4.3) und schließe den ICA mit dem Gefäßclip.
    2. Entfernen Sie den Katheter aus dem ECA, während der Faden, der den Katheter im ECA fixiert, in derselben Position bleibt.
    3. Binden Sie das ECA dauerhaft an, indem Sie das Faden, das den Katheter befestigt hat, festziehen.
    4. Entfernen Sie den Gefäßclip und die Fäden um CCA, ICA und PPA, um die Durchblutung wiederherzustellen. Befeuchten Sie den Operationsbereich mit ein paar Tropfen Kochsalzlösung.
    5. Nähen Sie die Haut mit einer umgekehrt schneidenden 3/8 gebogenen Nadel von 12 mm und einer nicht absorbierenden 3-0 (USP) Seidennaht.
  8. Postoperative Versorgung
    1. Subkutan verabreichen Sie 5 mg/kg Carprofen.
    2. Bringen Sie das Tier für 30–60 Minuten in den Erholungs-Käfig (~33 °C). Bringen Sie das Tier nach vollständiger Genesung in seinen Stammkäfig zurück.
    3. In den ersten 2 Tagen werden Sie 10 Minuten in 0,06 mg/mL Carprofen eingeweicht und dem Tier gegeben, sowie das Trinkwasser mit 0,06 mg/mL Carprofen ergänzt. Nach dieser Phase wird weiterhin eingeweichtes Futter ohne Carprofen gegeben, bis das Tier wieder sein Gewicht vor der Operation erreicht hat.
    4. Überwachen Sie das Tier in den ersten zwei Tagen mehrmals täglich, danach dreimal pro Woche. Eliminieren Sie das Tier, wenn ein humanes Ziel erreicht wird.
      HINWEIS: Menschliche Endpunkte sind gemäß der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments definiert. Außerdem sollten Tiere eingeschläfert werden, wenn es Anzeichen einer Ischämie zeigt, wie etwa kreisendes Verhalten oder Lähmung, da das Modell der mikrovaskulären Embolie kein schwerwiegendes ischämisches Ereignis verursachen sollte.

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Abbildung 2: Mikrovaskuläre Embolie-Operation. Detaillierte Beispielbilder und Schaltpläne der entscheidenden Schritte während der Mikrovaskulären Embolie-Operation. (A) Vorbereitung der CCA-Ligaturen (2x), ECA (2x), TA, OA und PPA (Schritt 2.4). (B) (Temporale) Ligation des CCA (1. Stück) und der ECA, gefolgt vom Schließen von OA und PPA sowie vorübergehendem Schließen des ICA mit einem Gefäßclip, wodurch ein Schnitt in der ECA ohne Blutung möglich ist (Schritt 2.6.2). (C) Platzierung des Katheters in die dissektionierte ECA, die mit der zweiten Naht verbunden sind (Schritt 2.6.7). (D) Öffnen der proximalen Naht um die CCA und Entfernen des Gefäßclips aus dem ICA zur Wiederherstellung der Durchblutung, gefolgt von der Injektion des Mikrosphärengemisches in das ICA (Schritt 2.6.10). CCA = Arterie der Halsschlagader; ECA = Arterie der äußeren Halsschlagader; TA = Schilddrüsenarterie; OA = Okzipitalarterie; PPA = Arterie Pterygopalatine; ICA = Arterie der inneren Halsschlagader. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. In-vivo-Bildgebung

  1. Zweiphotonenmikroskopie
    1. Setzen Sie das Tier in den Zwei-Photonen-Bildhalter des Mikroskops für die postoperative in vivo Bildgebung. Halten Sie eine leichte Anästhesie mit 1,2 % Isofluran in einer 1 L/min Mischung aus 30 % Sauerstoff und 70 % Luft und überwachen Sie die Atemfrequenz und -tiefe. Siehe ergänzende Tabelle 1 für Details zur Mikroskop-Einrichtung.
    2. Lokalisieren Sie die festgesetzten Mikrokugeln durch das Schädelfenster mit einem 10x-Objektiv (10x/0,30 TROCKEN) und einer Quecksilberlampenbeleuchtung. Dann wechselt man zur Zwei-Photonen-Bildgebung mit einem 25-fachen Wasser-Immersionsobjektiv (25x/0,95 WASSER). Siehe ergänzende Tabelle 2 für die Bildeinstellungen.
    3. Zeichnen Sie Z-Stacks rund um die interessierte Mikrosphäre auf.

4. Obduktionsanalyse

  1. Experimenteller Endpunkt für die In-situ-Bildgebung
    1. Wenn der experimentelle Endpunkt erreicht ist, wird das Tier durch zervikale Versetzung unter > 4 % Isofluran in einer 1 L/min-Mischung aus 30 % Sauerstoff und 70 % medizinischer Luft eingeschläfert.
  2. In-situ-Hirnbildgebung
    1. Entfernen Sie das Gehirn, legen Sie es in ein 3,0%iges Carboxymethylcellulose-Natriumlösungsmittel (Sigma) mit 0,1% schwarzer Tinte (VWR) ein und frieren Sie es bei −20 °C mindestens 24 Stunden ein.
    2. Bilde das Gehirn mit einem maßgefertigten kleinen 3D-Fluoreszenzbildgebenden Kryomikrotom-System (small-3D-FICS), das zuvor von Juch R.N.S. et al.40 beschrieben wurde. Stellen Sie das System so ein, dass es das Gehirn vertikal in 16 μm-Abschnitte schneidet und mit einer Auflösung von 13,66 × 13,66 μm abbildet. Siehe Ergänzende Tabelle 3 und Ergänzende Tabelle 4 für die Bildeinstellungen und Systemspezifikationen. Analysieren Sie die Bilder mit der Articulus-Software41.
  3. In-situ-Ganzmausbildgebung
    1. Entfernen Sie die Haut, die Zähne und den Schwanz des Tieres.
      HINWEIS: Das Entfernen des Schwanzes ist optional, erhöht aber die Bildbearbeitungsgeschwindigkeit.
    2. Das Tier in ein 3,0%iges Carboxymethylcellulose-Natriumlösungsmittel (Sigma) mit 0,1% schwarzer Tinte (VWR) einbetten und bei −20 °C für mindestens 24 Stunden einfrieren.
    3. Stellen Sie sich das Tier mit einem maßgefertigten großen 3D Fluorescent Imaging Cryomicrotome System (large-3D-FICS) vor, wie zuvor beschrieben 42. Stellen Sie das System so ein, dass es 25,9 μm-Schnitte mit einer Inplane-Auflösung von 26,09 μm schneidet. Siehe Ergänzende Tabelle 5 und Ergänzende Tabelle 6 für die Bildeinstellungen und Systemspezifikationen. Analysieren Sie die Bilder mit der Articulus-Software41.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postmortale In-situ-Bildgebung

Der Erfolg der mikrovaskulären Embolie-Operation wurde durch eine Ganzkörper- und Ganzkörper-Post-Mortem-In-situ-Bildgebung 4 Tage nach der Mikrovaskulären Embolie bestätigt (Abbildung 3A). Der sagittale Schnitt einer Maus zeigt das Eindringen von Mikrosphären im Gehirn. Abbildung 3B,C zeigt ein Beispiel eines extrahierten Mausgehirns, 1 Tag post-mikrovaskuläre Embolie-Operation. Die Mikrosphären befanden sich überwiegend in der ipsilateralen Hemisphäre, im Flussbereich der mittleren und vorderen Großhirnarterien. Die Mikrosphärenzahlen in Gehirnschnitten erhöhten sich signifikant, als Tween20 der Mischung hinzugefügt wurde (Abbildung 3E). Die Überwachung des Gewichts während der Genesung nach der Mikroembolie-Operation zeigt, dass Mäuse weniger Gewicht verloren und sich nach der Operation schneller erholten, wenn sie mit einer Mikrosphärenmischung injiziert wurden, die Tween20 enthielt (Abbildung 3F).

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Abbildung 3: Verteilung der Mikrosphären in der Maus nach einer mikrovaskulären Embolie-Operation. In-situ-Lokalisierung von 10 μm-Mikrosphären in der Maus, visualisiert mit der Articulus-Software41. (A) Sagittalebenen-Beispiel einer ganzen Maus, die nach einer Mikrovaskulärembolie-Operation mit dem großen-3D-FICS abgebildet wurde. (B-D) Repräsentative axiale, koronale und sagittale Bilder eines Mausgehirns, aufgenommen mit dem Small-3D-FICS. (E) Durchschnittliche Anzahl detektierter Mikrosphären pro 50 μm koronalen Gehirnschnitt bei etwa Bregma ± 0,5 mm für die Kontroll- und Tween20-Bedingungen. Balken stehen für Mittelwert ± Standardabweichung. Einzelne Maße werden als Punkte angezeigt. Der statistische Vergleich wurde mit einem ungepaarten t-Test durchgeführt; Der p-Wert ist im Graphen angegeben. Ausreißer wurden mit der Interquartilbereichsmethode (IQR) identifiziert und entfernt (n = 1 für beide Gruppen), was zu einer endgültigen Gruppengröße von n = 3 für Kontrollen und n = 14 für Tween20 führte. (F) Normalisierte Gewichtsänderungen im Zeitverlauf nach einer mikrovaskulären Embolie-Operation zum Zeitpunkt 0. Die Gewichte wurden bei der Operation auf den Ausgangswert jedes Tieres angepasst. Linien zeigen den Mittelwert ± SD pro Gruppe (Kontrolle, n = 4; Tween20, n = 5) mit Control in Blau und Tween20 in dunklem Orange. Die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen zu jedem Zeitpunkt wurde mittels ungepaarter zweiseitiger t-Tests bewertet. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Mikrosphäreninjektion und in vivo Zweiphotonenmikroskopie

Während der Mikrosphäreninjektion zeigten Katheter, die mit 5 % BSA beschichtet waren, dass viele Mikrosphären an der Katheteroberfläche hafteten, und fließende Mikrosphären waren oft gruppiert, was potenziell größere Verstopfungen verursachen kann (siehe Ergänzendes Video 1). Außerdem ist es nicht wünschenswert, 5 % BSA in die Mikrosphärenmischung einzusetzen, um Klebung und Clusterbildung zu verhindern, da eine potenzielle Immunantwort bei der Injektion43,44 möglich ist. Um dies zu umgehen, wurde eine 0,1%ige Tween20-Lösung in der Mikrosphärenmischung verwendet, was zu einer sichtbar höheren Anzahl von Mikrokugeln führte, die durch den Katheter fließen und in der gewünschten Anzahl (> 20) Mikrosphären im Bildgebenden Fenster (Abbildung 4 und ergänzendes Video 2). Abbildung 4A,B zeigt ein Fluoreszenzmikroskopie-Übersichtsbild des Hirnrindes 0,5 Stunden nach der mikrovaskulären Embolie-Operation. Jeder weiße Punkt stellt eine Mikrosphäre dar, die eine Kapillare in der zerebralen Mikrovaskulatur verschließt. Abbildung 4C,D zeigt die 2D-Projektion der zweiphotonigen Z-Stack-Bilder als Beispiel. Mikrosphären verursachen zerebrale mikrovaskuläre Embolien mit beeinträchtigter Perfusion, was sich durch das Fehlen eines intraluminalen Farbstoffs stromabwärts der Mikrosphäre zeigt (Abbildung 4E und ergänzendes Video 3). Zusätzlich verursachen diese Embolien eine Störung des BBB durch die Extravasation des FITC-Dextran-Farbstoffs (Abbildung 4F,G).

Diese Ergebnisse entsprechen der geringen Anzahl an am Katheter haftenden Mikrosphären und der minimalen Mikrosphärenclusterung, die beim Einspritzen der Mikrosphäre-Tween-Mischung im Katheter beobachtet wurde. Eine große Anzahl von Mikrosphären sammelte sich jedoch in den letzten 20 μL des Mikrosphärengemisches im Katheter, das nicht injiziert werden sollte, um ein mögliches Auftreten eines großen Infarkts zu verhindern (siehe Ergänzendes Video 4).

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Abbildung 4: Zwei-Photonen-in-vivo-Mikroskopie festgesetzter Mikrosphären. Beispiele für in vivo fluoreszierende und zweiphotonenbasierte Bilder von festgesetzten Mikrosphären im Mauskortex. (A) Fluoreszierender Überblick durch das Schädelfenster der Mikrosphären der Hütten. (B) Fluoreszierendes Bild des ausgewählten ROI. (C,D) Zwei-Photonen-Mikroskopieaufnahmen von eingeschlossenen Mikrokugeln in der zerebralen Mikrozirkulation mit ausgewähltem ROI für detaillierte Bildgebung. Z-Stack-Bilder werden in 2D dargestellt, indem die Standardabweichung der Pixelintensitäten entlang des Z-Stacks berechnet wird. (E-G) Repräsentative in vivo Zweiphotonenmikroskopie-Aufnahmen, die drei zerebrale mikrovaskuläre Embolismen zeigen. Rote Pfeile markieren Bereiche der FITC-Dextran-Extravasation und weisen auf BBB-Störungen und Farbstoffverlust hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Tabelle 1: Spezifikationen des Zwei-Photonen-Mikroskopsystems. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Zwei-Photonen-Mikroskop-Einstellungen für FITC-dextran und Mikrosphärenbildgebung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Kleine 3D-fluoreszierende Bildgebung Kryomikrotom-Systemeinstellungen für die Gehirnbildgebung von Mausen mit blauen Mikrosphären. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 4: Spezifikationen des Kryomikrotomsystems für kleine 3D-fluoreszierende Bildgebung für Maus-Gehirnbildgebung mit blauen Mikrosphären. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 5: Große 3D-fluoreszierende Bildabbildung mit Kryomikrotom-Systemeinstellungen für Ganz-Maus-Bildgebung mit roten Mikrosphären. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 6: Spezifikationen für das Kryomikrotom-System für große 3D-fluoreszierende Bildgebung für die gesamte Mausaufnahme mit roten Mikrosphären. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzendes Video 1: 5 % BSA-beschichteter Katheter mit Mikrosphärenhaftung an der Katheterwand und Mikrosphärenclustering in den 25 mg/mL des FITC-Dextran-Mikrosphärengemisches während der Injektion. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video 2: 0,1 % Tween20-beschichteter Katheter mit etwas Mikrosphärenhaftung an der Katheterwand, aber ohne Mikrosphärenclustering im 25 mg/mL FITC-Dextran mit 0,1 % Tween20-Mischung mit Mikrosphären während der Injektion. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video 3: 3D-Segmentierung mikrovaskulärer Okklusionen durch Mikrosphären. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video 4: Endvolumen der Mikrosphäreninjektion mit hoher Mikrosphärenkonzentration in 25 mg/ml FITC-Dextran mit 0,1 % Tween20-Mischung. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzende Akte 1: Mikrosphären-Haftung an Pipettenspitzen-Validierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 2: Immunhistochemische Beurteilung der CD45-Abdeckung 1, 7 und 28 Tage nach der Mikroembolie-Operation mit Vergleich der ipsilateralen und kontralateralen Hemisphären. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um mikrovaskuläre Embolismen zu modellieren, wurde ein Protokoll zur Injektion von Mikrosphären in den Gehirnkreislauf von Mäusen beschrieben, das die Untersuchung von Mikroembolien mittels in vivo Zweiphotonenmikroskopie ermöglicht. Diese Methode optimierte die Einklemmung der Mikrosphären im Gehirn, wobei mehrere Mikrosphären innerhalb der ersten 500 μm des ipsilateralen Kortex eingeschlossen wurden, was eine effektive Zwei-Photonen-Bildgebung ermöglichte.

Eine hohe Mikrosphärenzahl im kortikalen Bereich des Gehirns ist entscheidend für die in vivo Zweiphotonenbildgebung. Der Verlust der Mikrosphären wurde bei der Herstellung der Mikrosphärenmischung minimiert, indem die Pipettenspitzen mit 5 % BSA oder 0,1 % Tween20 beschichtet wurden, wodurch die Mikrosphärenadhäsion reduziert wurde (siehe Supplementary File 1). Obwohl die genaue Anzahl der verklebten Mikrosphären nicht quantifiziert werden konnte, zeigten Messungen der mittleren Intensität die Wirkung der Beschichtungen. Außerdem schien Tween20 das Clustern von Mikrosphären im Katheter zu verhindern, was zu einer visuell höheren Anzahl einzelner Mikrosphären führte, die durch den Katheter fließen, obwohl dies nicht quantifiziert ist. Dies verringert das Risiko großer Gefäßverschlüsse und die potenzielle Bildung großer ischämischer und hypoxischer Regionen, was angesichts des Ziels, mikrovaskuläre Embolisationen zu modellieren, unerwünscht ist. Außerdem zeigten Mäuse weniger Gewichtsverlust und erholten sich schneller auf das präoperative Gewicht, wenn sie mit einer Mikrosphärenmischung mit niedrigen Konzentrationen von Tween20 injiziert wurden. Tween20 ist ein häufig verwendetes Dispergiermittel 45,46,47, daher wird nicht erwartet, dass die niedrigen Konzentrationen in dieser Studie Toxizität oder negative Auswirkungen auf die BBB-Integrität verursachen. Außerdem zeigen unsere Daten, dass BBB-Leckage nur in der Nähe (oder nach dem Durchgang von) der Mikrosphären-Anlage und nicht systematisch auftritt, ohne eine signifikante Zunahme der Gesamtabdeckung der Leukozyten zu verursachen (siehe Supplementary File 2), was die Verwendung von 0,1 % Tween20 unterstützt. Insgesamt trägt die Zugabe von Tween20 zu einer Verringerung der Klumpbildung der Mikrosphären und einer Erhöhung der Mikrosphärenlieferung in den Gehirnkreislauf bei, was durch Mikrosphärenzählungen in Gehirnschnitten bestätigt wird, und führt zu genügend sichtbaren Mikrosphären für die Zweiphotonenmikroskopie. Obwohl die Verwendung von Tween20 die Anzahl der im Gehirn eingeschlossenen Mikrosphären erhöht, bleibt die Variabilität bei der Mikrosphäreninjektion bestehen. Mehrere Faktoren können zu dieser Variation beitragen. Erstens kann die Thrombusbildung im Katheter oder Gefäß dazu führen, dass Mikrosphären am Gerinnsel haften. Zweitens kann das Vorhandensein von Luftblasen die reibungslose Abgabe beeinträchtigen. Schließlich kann eine unvollständige Wiederherstellung des Blutflusses im CCA oder ICA die Hämodynamik verändern und potenziell die Verklebung der Mikrosphäre an der Gefäßwand oder eine Clusterbildung im Lumen fördern. Leider können diese Abweichungen während des Injektionsverfahrens nicht erkannt werden.

Polystyrol-Mikrokugeln sind dichter als Wasser, was zu einer ungleichmäßigen Verteilung führt, sobald das Mikrosphärengemisch in den Katheter geladen wird. Die meisten Mikrosphären setzen sich in der Nähe der Katheterwand ab, wo die Reibung der Flüssigkeit ihre Bewegung relativ zum schnelleren zentralen Fluss verlangsamt. Dies führt schließlich zu einer Ansammlung von Mikrosphären innerhalb der letzten 20 μL des Katheters. Die Injektion dieser konzentrierten Portion sollte vermieden werden, da dies große Embolien und ischämische Ereignisse verursachen kann. Um dies zu verhindern, sollte das Mikrosphärengemischvolumen mit doppeltem Injektionsvolumen vorbereitet werden.

Die Mikrovaskuläre Embolie-Operation erfordert umfangreiche Ausbildung und Präzision. Einer der technisch anspruchsvollsten Schritte besteht darin, eine Naht um die PPA, die OA und die Seitenzweige des ICA zu legen, um eine präzise Zuführung der Mikrosphärenmischung in den Kreis von Willis und das MCA-Gebiet sicherzustellen. Dieser Schritt wird durch die enge Nähe des Vagusnervs in der Nähe des CCA, den kleinen Durchmesser der Gefäße und den begrenzten Operationsraum erschwert, die Nähte zu positionieren, ohne Nervenschäden oder Gefäßverletzungen zu verursachen.

Während ein Gefäßclip als Alternative zum vorübergehenden Ligieren des PPA mit einer Naht in Betracht gezogen werden kann, birgt er zusätzliche Risiken. Clips können sich unbeabsichtigt lösen, was dazu führt, dass sich das Gefäß wieder öffnet. Außerdem erhöht die Verwendung eines zweiten Clips am PPA neben dem bestehenden Clip auf dem ICA die Wahrscheinlichkeit, dass sich der ICA-Clip aufgrund des begrenzten Platzes löst. Wenn dies geschieht, führt dies zu einer erheblichen Blutung und ohne sofortiges Eingreifen kann es zu einem vorzeitigen Abbruch des Experiments führen. Daher wird das Verschließen des PPA mit einem Gefäßclip nicht empfohlen.

Das aktuelle Protokoll verwendet einen Katheter statt einerSpritze 33 für die Mikrosphäreninjektion. Dieser Ansatz bietet eine bessere Kontrolle über Injektionsgeschwindigkeit und -volumen und ermöglicht die Injektion der Mikrosphären aus der Ferne (z. B. innerhalb einer bildgebenden Methode wie einem Mikroskop oder MRT-Scanner).

Die Wahl des ECA statt des CCA als Eintrittspunkt ermöglicht es, dass das CCA während des Injektionsverfahrens vollständig geöffnet bleibt, was hilft, während des gesamten chirurgischen Eingriffs eine stärker physiologische zerebrale Perfusion aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus hat die Injektion der Mikrosphären über die ECA statt über die CCA weitere Vorteile:48: i) die Verkürzung der gesamten Betriebszeit während der Reperfusion; ii) ein geringeres Blutungsrisiko während der Injektion und nach Abschluss der Operation; iii) bei der CCA-Entrance-Methode bildet sich nach Entfernung der Nadel49 eine instabile Stenose und Thrombose in der CCA. Dies führt zu gestörter Durchblutung sowie zum Risiko der Bildung von Mikrothrombi, die im Gehirn landen kann. Außerdem birgt das Eintritt über das CCA ein hohes Risiko, die CCA dauerhaft zu schließen, was während der Überlebenszeit nach der Operation zu einer suboptimalen zerebralen Reperfusion führen kann, verschärft durch die hohe Variation im Willis-Kreis bei Mäusen50,51

Obwohl vollständig optimiert, hat das Protokoll einige Einschränkungen. Erstens deutet die Beobachtung darauf hin, dass Mikrosphären langsamer entlang der Katheterwände wandern und während der Injektion nicht gleichmäßig verteilt sind, darauf hin, dass weniger Mikrosphären als erwartet in den ICA eingeliefert werden. Trotz der Verwendung von Tween-20 zur Verringerung der Haftung haften einige Mikrosphären weiterhin an den Pipettenspitzen, dem Eppendorf-Rohr und dem Katheter. Folglich ist die tatsächliche Anzahl der injizierten Mikrokugeln wahrscheinlich geringer als die berechneten 7,2 x 104 Partikel pro Maus. Dennoch erreichen genügend Mikrosphären den zerebralen Kreislauf, um eine Bildgebung mittels Zweiphotonenmikroskopie zu ermöglichen. Das Injektionsprotokoll und die Mischungszusammensetzung sind für 10 μm Polystyrol-Mikrosphären optimiert. Wenn die verwendeten Materialien (Spitzen, Schläuche, Katheter) oder die Größe der Mikrosphären verändert werden, sollten sowohl die Lösung als auch das Injektionsverfahren entsprechend neu bewertet werden. Zweitens haben Studien, die die beste Methode für die Verschluss großer Gefäße mittels intraluminaler Verschluss der MCA untersuchen, gezeigt, dass das Eindringen des Gefäßsystems durch eine permanente Ligierung der ECA zu einer Ischämie der Kau- und Schluckmuskulatur52 führt. Dies kann zu einer verringerten Nahrungsaufnahme von Mäusen führen und damit zu übermäßigem Gewichtsverlust, eingeschränkter motorischer Funktion und einem erhöhten neurologischen Defizit. Diese Aussage wurde jedoch von anderen48 widerlegt. In dieser Studie zeigte die Gewichtsüberwachung einen erwarteten Rückgang nach der Operation, aber eine schnelle Erholung zu den voroperativen Gewichten innerhalb weniger Tage, was darauf hindeutet, dass die Mäuse sich nach der dauerhaften ECA-Ligation normal erholen und fressen und trinken. Obwohl das Gewicht der Tiere überwacht wurde, ist dies nur ein indirekter Indikator für das Wohlbefinden der Tiere und schließt funktionelle Beeinträchtigungen wie lokale Kau- oder motorische Defizite nicht vollständig aus. Es wurden keine direkten Bewertungen zur funktionellen Erholung durchgeführt, was eine Einschränkung dieser Studie darstellt. Eine weitere Studie verglich das Eindringen des Gefäßsystems über das CCA oder ECA und zeigte, dass der Eintritt über das CCA zu einer beeinträchtigten Reperfusion der zerebralen Zirkulation führen kann, wobei die ECA-Eintrittsmethodebevorzugt wird. Drittens erfordert eine korrekte und sichere Einlagerung von Katheter ohne Luftblasen, Blutgerinnsel oder Austritt sowie ohne Behinderung des Durchflusses in CCA und ICA erhebliche Übung. Schließlich kann man im Gegensatz zu anderen Mikrookklusionsmethoden wie der Photothrombose mit Rose-Bengal-Injektion22 nicht vorhersagen, wo die Mikrosphären schließlich im Kreislauf bleiben werden.

Die vorliegende Studie schließt bewusst negative (Schein-) oder positive (Photothrombose) Kontrollgruppen nicht ein, da diese keinen zusätzlichen Wert für das primäre Ziel bieten würden. Der Erfolg dieses Modells wird durch die Anzahl der Mikrosphären innerhalb der zerebralen Mikrozirkulation, insbesondere im Bereich des Schädelfensters, definiert, um eine hochauflösende In-vivo-Mikroskopie zu ermöglichen. Ein Scheinverfahren würde per Definition keine Mikrosphären im Zielbereich ergeben und somit keinen relevanten Vergleich für den in vivo Bildendpunkt bieten. Ebenso würde die Einbeziehung eines Photothrombose-Modells einen grundlegend anderen pathophysiologischen Mechanismus adressieren und liegt daher außerhalb des Rahmens dieser Arbeit, die sich auf die Charakterisierung des mikrovaskulären Embolismus-Modells konzentriert, anstatt Methoden zu vergleichen. Umfassendere histologische Analysen von Embolien und deren potenziellen Auswirkungen auf das BBB oder das lokale neuronale Gewebe wurden nicht durchgeführt, da die Studie darauf ausgelegt war, die 3D-Visualisierung in vivo gegenüber der Validierung auf Gewebeebene zu priorisieren.

Das detaillierte chirurgische Protokoll sowohl für die Vorbereitung des Schädelfensters als auch für das Modell der mikrovaskulären Embolie unterstützt eine zuverlässige und reproduzierbare Untersuchung der mikrovaskulären Veränderungen im Zusammenhang mit mikrovaskulären Embolien und dem Auftreten stiller Hirninfarkte in der ipsilateralen Hemisphäre. Die optimierte Vorbereitung und Injektion der Mikrosphärenmischung verbessert die Konsistenz und Validität dieses experimentellen Ansatzes zusätzlich.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten Dr. Iwan Dobbe ihren aufrichtigen Dank für die Entwicklung der Articulus-Software aussprechen, die für die 3D-Bildrekonstruktionen in situ verwendet wurde. Wir danken außerdem Prof. Dr. Nikolaus Plesnila für die freundliche Bereitstellung von TIE2-GFP-Mäusen (Jackson Laboratory, Stock Nr. 003658), die für die Hauszucht verwendet werden.

Diese Studie wurde von Amsterdam Neuroscience (813294 an I.M.), Amsterdam Cardiovascular Sciences (Geräteanruf 2021 und 2023 an I.M.) und der Niederländischen Herzstiftung (03-006-2021-T019 an I.M.) finanziert.

Diese Forschung wird außerdem von der Dutch Heart Foundation und der Brain Foundation Netherlands finanziert und in Zusammenarbeit mit und unterstützt von der Dutch CardioVascular Alliance, 01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0. Darüber hinaus wurde diese Arbeit teilweise durch uneingeschränkte Mittel von Stryker, Medtronic und Penumbra finanziert. Die Finanzierungsquellen waren nicht in Studienplanung, Überwachung, Datenerhebung, statistische Analysen, Ergebnisinterpretation oder Manuskriptschreiben eingebunden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
27-Gauge-Nadel (0,1x16 mm)Terumo-27-Gauge-Nadel (Schritt 2.1.2.)
Articulus-Software--3D-Analysesoftware (Schritt 4.2.2 & 4.3.3)
Betadin 30 ml (100 mg/ml)Mylan8712207037612Betadin/Jod (Schritt 1.1.8. & 2.2.10.)
C& B-MonomerSun Medical7111Komponente des Sekundenklebers (Schritt 1.3.1.)
Chirurgische Klingen aus Kohlenstoffstahl (Nr. 15)Swann-Morton205Klinge zum Kratzen am Schädel (Schritt 1.2.4.)
Carprofen (50 mg/ml)Zoetis-Schmerzmittel (Schritte 1.1, 1.6, 2.2 & 2.8)
KatalysatorSun Medical7110Komponente des Sekundenklebers (Schritt 1.3.1.)
Katheter (ID 0,31 OD 0,64 mm)Freudenberg228-0661Transparenter Katheter (Schritt 2.1.1.)
Costom stellte einen Taschentissuehaken her--Taschentuchhaken (Schritt 2.3.4.)
Baumwollspitzen--Baumwollspitze (Schritt 1.1.8, 1.2.4 & 1.5.1.)
DeckglasWarner-Instrumente64-0724Schädelfensterverglasung (Schritt 1.4.2.)
Maßgefertigte Maus-Headbar--Headbar für den Bildhalter (Schritt 1.3.2.) 
Maßgefertigter Mausbildgebungshalter --Bildnehmender Maushalter (Schritt 1.4.1. & 3.1.1.)
Maßgefertigter stereotaktischer Rahmen--Stereotaktischer Rahmen (Schritt 1.1.7.)
Zahn-Kament-FlüssigkeitKulzer64707937Bauteil des Zahnbetons (Schritt 1.3.3.)
Zahn-Cemement-PulverKulzer64707945Bauteil des Zahnbetons (Schritt 1.3.3.)
Zahnbohrer Saeshin  L-206Bohren (Schritt 1.4.3.)
Dexamethason (4 mg/ml)Centrafarm-Präoperative Medikation (Schritt 1.1.4.)
SezierzangeBraun-AesculapBD023RPinzette (Schritt 1.2.2. & 2.3.2.)
Bohrbohrer PK/100,5 (0,5 mm)Gute Wissenschaften19007-05Bohrer (Schritt 1.4.3.)
Duratears (3,5 g)Alcon-Augensalbe (Schritt 1.1.8. & 2.2.7.)
Epoxidkleber (1g)Pattex9H PSMG3XEpoxidkleber (Schritt 1.5.2. & 2.1.1.)
Feine Mikro-Pinzette GeradeFeine wissenschaftliche WerkzeugeDumont #5Feine Mikropinzette (Schritt 2.6.6.)
FITC-Dextran (70 KDa)Sigma-AldrichFD70SFITC-Dextran-Lösung (Schritt 2.5.2.)
Isofluran (1000 mg/g)Laboratorios Karizoo S.A.118938Anästhesie (Schritt 1.1.6. & 2.2.5.)
großes 3D-fluoreszierendes Bildgebungs-Kryomikrotom Maßgefertigt-groß-3D-FICS (Schritt 4.3.3)
Lidocain (100 mg/ml)Aspen-Lokalanästhesie (Schritt 1.2.3. & 2.2.10)
Mikro-Schere Vannas 3-3/8 ZollBraun-AesculapOC498RMikroschere (Schritt 2.6.2)
Mikronaht-Bindezange mit rundem GriffBraun-AesculapFD280RMicroforeceps (Schritt 2.3.3.)
Mikronaht-Bindepangen mit rundem GriffBraun-AesculapFD281RMicroforeceps gebogen (Schritt 1.5.1. & 2.3.3.)
Mikrovaskulärer ClipBraun-AesculapFD562RSchiffsclip (Schritt 2.6.1.)
Mikrokatheter (ID 0,23114 mm OD 0,27432 mm)MikrolumenMikrokatheter (Schritt 2.1.1.)
Maus-Heizmatten und rektale SondeStoelting53800RHeizkisse (Schritt 1.1.2. & 2.2.2.)
NG2-DsRote MäuseJackson Laboratory, Bar Harbor, USA, Aktien Nr. 008241
Polyethylenglykol-SorbitanmonolauatSigma-Aldrich9005-64-5Tween20 (Schritt 2.5.2.)
Polystyrol FluorSpheres Blue (365/415)InvitrogenF8829Blaue Mikrosphären (Schritt 2.5.1.)
Polystyrol FluorSpheres rot (580/605)InvitrogenF8834Rote Mikrosphäre (Schritt 2.5.1.)
Erholungskäfig--Erholungs-Käfig (Schritte 1.6.2. & 2.8.2.)
Umgekehrtes Schneiden einer 3/8 gebogenen Nadel (12 mm) mit NahtBbraun0762067Naht (Schritt 2.7.5)
Ropivacaï ne (2 mg/ml)--Medikament  (Schritt 1.1.5.)
kleine 3D-fluoreszierende Bildgebung Kryomikrotom   MaßgefertigtKlein-3D-FICS (Schritt 4.2.2)
SpongostanEthiconMS0005Spongostan (Schritt 1.4.6.)
Chirurgisches MikroskopEuromex Microscopen B.V.NZ.1903-BMikroskop für die Operation (Schritt 1.2. 2.1.1.)
Chirurgische SchereBraun-AesculapBC303RChirurgische Schere (Schritt 1.2.2. & 2.3.2.)
Spritzenpumpe (für 1-ml-Spritzen)Havard-Apparat70-22081 ml Spritzenpumpe (Schritt 2.5.6.)
Thread, 100m,  4/0 1.5   BbraunF11340354/0,15-Threads (Schritt 2.4.3.)
TIE2-GFP-MäuseJackson Laboratory, Bar Harbor, USA, Aktiennummer 003658
Ultra-reiner StaubwedelThorlabsCA6-EUDruckluft (Schritt 1.2.5.)
Universeller Polymer-KlarerSun MedicalT058EKomponente des Sekundenklebers (Schritt 1.3.1.)

Referenzen

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