Aerobe biologische Abbaubarkeitsprüfung von Materialien mit einem natürlichen Meerwasser-Inokulum und einem Respirometer mit geschlossenem Regelkreis

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt ein Standardverfahren für die Prüfung potenziell biologisch abbaubarer Materialien, sowohl synthetischer als auch natürlicher Materialien, unter aeroben Bedingungen unter Verwendung eines natürlichen Meerwasserinokulums und eines automatisierten Respirometriesystems mit geschlossenem Kreislauf.

Zusammenfassung

Die richtige Bewertung biologisch abbaubarer Materialien hängt von der breiten Anwendung von Standardprüfmethoden ab. Obwohl es solche Methoden gibt, sind die Testkapazitäten nach wie vor begrenzt, da sie durch die Kosten und die Anlaufzeit für die Einrichtung neuer Laboratorien begrenzt sind. Dieses modifizierte Screening-Protokoll basiert auf der ASTM International D6691-24a, Standard Test Method for Determining Aerobic Biodegradation of Plastic Materials in the Marine Environment by a Defined Microbial Consortium or Natural Sea Water Inoculum. Es bewertet den biologischen Abbau von Materialien in einer marinen Umwelt, vergleicht die Ergebnisse mit Positiv- und Negativkontrollen und verwendet ein natürliches Meerwasser-Inokulum, das mit Ammonium und Phosphat ergänzt ist, um eine Nährstoffeinschränkung zu verhindern. Die Materialien werden diesem nährstoffangereicherten Meerwasser ausgesetzt und bei 30 °C inkubiert. Ein Micro-Oxymax-Respirometer misst die Produktion von Biogas (Kohlendioxid, CO₂) im Laufe der Zeit. Der Mineralisierungsgrad (biologischer Abbau) wird durch Berechnung des Anteils von stofflichem Kohlenstoff bestimmt, der in Biogas-Kohlenstoff umgewandelt wird. Die prozentuale CO₂ -Produktion, ausgedrückt als Bruchteil des gemessenen oder theoretischen Kohlenstoffgehalts, wird als Funktion der Zeit angegeben. Das Respirometriesystem mit geschlossenem Regelkreis beherbergt eine Reihe von Reaktorbehältern, die für jedes Material in dreifacher Ausfertigung präpariert werden, eine Negativkontrolle (nur Meerwasserinokulum) und eine Positivkontrolle (Dünnschichtchromatographie Cellulose). Diese Methode ist wichtig für die Bewertung von Materialien in der Meeresumwelt und befasst sich mit der globalen Vermeidung von Verschmutzung.

Einleitung

Plastikmüll stellt eine Bedrohung für die marinen Ökosysteme und die menschliche Gesundheit^{dar 1}. Die wachsende Besorgnis über die Verschmutzung durch Plastik und den Müll im Meer sowie durch Meeresmüll aus allen Materialien im Ozean unterstreicht den Bedarf an nachhaltigen Lösungen, wie z. B. eine verbesserte Abfallwirtschaft am Ende des Lebenszyklus und biologisch abbaubare Materialien, die sich in der Meeresumwelt leicht biologisch abbauen. Im Gegensatz zu herkömmlichen synthetischen Kunststoffen, die über Jahrzehnte bis Jahrhunderte bestehen bleiben und Mikroplastik erzeugen, das sich in Nahrungsnetzen anreichert ^2,3,4, können biologisch abbaubare Materialien, organische Bestandteile von Kohlenstoff, zu CO₂ und Methan (CH₄) metabolisiert oder in mikrobielle Biomasse assimiliert werden⁵. Das Verständnis des biologischen Abbaus von Materialien im Meerwasser ist daher der Schlüssel zur Quantifizierung und Minderung der Umweltauswirkungen von Meeresmüll.

Der biologische Abbau in der marinen Umwelt wird durch das Zusammenspiel raumzeitlicher Variablen gesteuert, einschließlich Licht- und Nährstoffverfügbarkeit, Druck, Temperatur, Zusammensetzung der mikrobiellen Spezies sowie physikalisch-chemische Natur und Struktur des Polymers, die alle die Geschwindigkeit, den Grad und den Mechanismus des Abbaus bestimmen⁶. Diese Variablen stellen eine große Herausforderung für laborbasierte biologische Abbaustudien dar, die die Meeresumwelt simulieren. Diese Standardarbeitsanweisung (SOP) verwendet natürliches Meerwasser als Inokulum, erfasst die vorhandene mikrobielle Gemeinschaft in situ und erfasst relevante Variablen wie gelöste Nährstoffe aus dem Meerwasser, partikulären Kohlenstoff und Stickstoff, Chlorophyll, Salzgehalt, pH-Wert und Temperatur. Dieser kontrollierte laborbasierte Ansatz optimiert die Bedingungen für die Förderung der Mineralisierung und ermöglicht direkte Messungen des biologischen Abbaus, die in situ nicht durchführbar sind. Die ASTM International D6691-24a, Standard Test Method for Determining Aerobic Biodegradation of Plastic Materials in the Marine Environment by a Defined Microbial Consortium or Natural Sea Water Inoculum (im Folgenden ASTM D6691), und diese SOP wurden als schnelles, zuverlässiges Screening-Tool zur Bewertung der biologischen Abbaubarkeit von Materialien^entwickelt 7,8,9,10.

In Übereinstimmung mit ASTM D6691, einem Screening-Test für die inhärente biologische Abbaubarkeit von Polymeren, bewertet dieses Protokoll den biologischen Abbau von Materialien unter optimalen Bedingungen, 30 °C, maximaler Oberfläche aus der gemahlenen Probe und überschüssigen anorganischen Nährstoffen (Stickstoff, 130 mg/L; Phosphor, 23 mg/L)⁹, um die Mineralisierung zu fördern und Nährstoffeinschränkungen zu verhindern. Während Screening-Tests wertvolle erste Erkenntnisse liefern, könnten weitere Tests, wie z. B. Küsten- und Tiefseeverankerungen, die den Gewichtsverlust in Abhängigkeit von der Zeit messen, für eine umfassende Bewertung unter natürlichen Meeresbedingungen erforderlich sein. Da diese Verankerungstests an Küsten und in der Tiefsee den biologischen Abbau auf der Grundlage des Gewichtsverlusts in Abhängigkeit von der Zeit abschätzen^10,11, sollten die Forscher zunächst diesen Screening-Test durchführen, der den mikrobiellen Stoffwechsel direkt misst, bevor sie zu einem In-situ-Experiment an der Küste und in der Tiefsee gehen, das ebenfalls teurer ist.

Das Standardprüfverfahren ASTM D6691 beschreibt Verfahren zur Bewertung des aeroben biologischen Abbaus von nicht schwimmenden Kunststoffmaterialien in Meeresumgebungen. Diese Norm bietet zusammen mit Spezifikationsnormen wie ASTM D7081 (Standard Specification for Non-Floating Biodegradable Plastics in the Marine Environment; mit Schwerpunkt auf der biologischen Abbaubarkeit in einem wässrigen Medium, die derzeit aus der ASTM zurückgezogen und neu abgestimmt wird) einen Rahmen für die Zertifizierung experimenteller Polymere als marine biologisch abbaubar ^9,12. Im Allgemeinen ist eine Spezifikation eine Konsensnorm von ASTM International, die Anforderungen festlegt, die ein Material, ein Produkt oder ein System erfüllen muss. Es stellt sicher, dass Materialien, die für den biologischen Abbau in der Meeresumwelt entwickelt wurden, dies innerhalb eines akzeptablen Zeitrahmens tun und keine potenziell giftigen Zusatzstoffe wie Farbstoffe oder Weichmacher freisetzen.

Aufbauend auf ASTM D6691 quantifiziert dieses Protokoll die Geschwindigkeit und den Grad des aeroben biologischen Abbaus von Materialien (experimentelles Substrat) in natürlichem Meerwasser und erweitert die positiven Materialkontrollen (d. h. Zellulose, Kraftpapier, Chitin/Chitosan), die sich in der Vergangenheit als biologisch abbaubar in der Meeresumwelt erwiesen haben ^7,9,10. Ziel dieser Methode ist es, Materialien unter optimierten Bedingungen zu screenen, um zu sehen, ob die Materialien in der Meeresumwelt biologisch abbaubar sind. Das Inokulum nutzt die im Meerwasser vorhandene natürliche mikrobielle Gemeinschaft, die nach spezifischen Richtlinien in ASTM gesammelt wurde. Diese Richtlinien betonen die Verwendung von Meerwasser mit einem Salzgehalt von ca. 32, das an einem Ort gesammelt wird, der frei von Schadstoffen wie Abwässern, Chemikalienverklappungen oder Ölverschmutzungen ist. Der Test verwendet ein automatisiertes Respirometer mit geschlossenem Regelkreis mit 250 mL Reaktorbehältern, die bei 30 °C gehalten werden und jeweils 75 mL Meerwasser und ~20 mg des Versuchs- oder Kontrollsubstrats^{enthalten 8}. Die Mineralisierung (Biodegradation) wird ausgedrückt als der Prozentsatz des produzierten Nettokohlenstoff-Biogases (CO_2-C) im Verhältnis zur ursprünglich hinzugefügten Kohlenstoffmasse. Diese Methode berücksichtigt nicht die Kohlenstoffassimilation in mikrobielle Biomasse.

Protokoll

1. Sammlung und Charakterisierung von Meerwasser

1. Identifizieren Sie eine Meerwassersammelstelle, die nicht von Abwässern, Chemikalien, Ölteppichen oder starken Süßwassereinflüssen beeinflusst wird.
2. Zeichnen Sie am Entnahmeort die Quelle (Standort, Breiten- und Längengrad, Entnahmetiefe, Gesamttiefe und Temperatur), das Datum der Probenentnahme und die beobachteten Wasserbedingungen auf.
3. Sammeln und kombinieren Sie Meerwasserproben aus verschiedenen Tiefen, Standorten und Probenahmeereignissen, um eine vielfältige Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zu fördern.
4. In einer 20-Liter-Ballonflasche mit Säurelaugung werden 10 bis 20 Liter Meerwasser mit einer großen Niskin-Flasche aufgefangen und zurück zum Labor transportiert.
5. Füllen Sie 1 l der gesamten Meerwasser-Teilprobe aus der Ballonflasche in eine säureausgelaugte 1-Liter-Flasche aus bernsteinfarbenem Polyethylen hoher Dichte (HDPE) für die Laboranalyse von partikulärem Kohlenstoff und Stickstoff für die anfänglichen Meerwasserbedingungen. Aus der 1-Liter-Probe filtrieren (0,2 μm; stickstoffarmes Celluloseacetat) und eine 60-ml-Teilprobe in einer säureausgelaugten Polyethylenflasche zur Analyse von gelösten anorganischen und organischen Stickstoff- (N) und Phosphorbestandteilen (P) entnehmen.
6. Beschriften Sie Unterstichproben mit dem Projektnamen, der Beispiel-ID und dem Datum. Die NH₄⁺-Konzentrationen sind nach der Indophenol-Methode (4500-NH3)^13,14 und die PO₄^{3-Konzentrationen} nach der Einzellösungsmethode (4500-P E)^13,15 zu messen. Quantifizierung von partikulärem Stickstoff und Kohlenstoff mit der Elementaranalysemethode¹⁶. Messen Sie die Chlorophyll-a-Konzentrationen gemäß den von Parsons et ^al.17 (10150 A, 10150 C)¹³ beschriebenen Protokollen.
   HINWEIS: Nährstoffbezogene Wasserqualitätsanalysen sind optional. Dieses Protokoll geht davon aus, dass die Analysen von einem externen Labor durchgeführt werden.
7. Decken Sie die Ballonöffnung locker ab, um aerobe Bedingungen zu erhalten, und lagern Sie Meerwasser bei 30 °C im Dunkeln bis zu 7 Tage lang.
   HINWEIS: Meerwasser kann auch mit einer Luftpumpe und einem Sprudlersystem belüftet werden.

2. Vorbereitung des Versuchssubstrats

1. Geben Sie 10-15 g experimentelles Substrat (z. B. natürliche Polysaccharide, Holz, Faserplatten, Polymere), das in Form von Pellets, Fragmenten und Formstücken vorliegen kann, in ein 50-ml-Mahlglas aus Edelstahl mit einer 20-mm-Stahlkugel. Fräsen Sie das Versuchssubstrat vor Beginn des Versuchs auf eine gleichmäßige Partikelgröße (0,10-0,25 mm).
2. Tauchen Sie den Mahlbehälter in flüssigen Stickstoff und verspröden Sie ihn 15 Minuten lang, bis der flüssige Stickstoff nicht mehr kocht.
   ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff ist eine kryogene Flüssigkeit, die Verbrennungen, Verletzungen oder Erfrierungen verursachen kann. Lesen und befolgen Sie vor der Verwendung alle Sicherheitsdatenblätter. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
3. Befestigen Sie den Mahlbehälter in den Kugelmühlenaufsatz, stellen Sie die Geräteparameter auf 30 Hz und 2:30 min ein und drücken Sie Start. Wiederholen Sie den Vorgang 4x mit 30 s Abkühlung in flüssigem Stickstoff zwischen den Versuchen. Wenn es sich bei dem Material um ein Polymer mit einer niedrigen Glasübergangstemperatur handelt, führen Sie bei Bedarf zusätzliche Fräszyklen durch, um eine gleichmäßige Partikelgrößenverteilung zu erzielen.
4. Überprüfen Sie die Größengleichmäßigkeit und charakterisieren Sie die Partikelgrößenverteilung durch Siebanalyse, wie in ASTM D1921-96¹⁸ beschrieben. Montieren Sie Standardsiebe, die den erwarteten Partikelgrößenbereich abdecken, mit der kleinsten Maschenweite auf der Unterseite. Legen Sie die gemahlene Probe auf das obere Sieb und befestigen Sie den Siebstapel in einem mechanischen Schüttler. Rühren, bis die Partikel das Netz passieren. Sammeln und wiegen Sie das zurückgehaltene Material von jedem Sieb, um die Partikelgrößenverteilung zu berechnen. Verwenden Sie bei allen Behandlungen den gleichen Satz Siebe, um die Vergleichbarkeit zu wahren. Notieren Sie die Verteilung auf dem Datenblatt.
5. Bestimmung des Kohlenstoffgehalts pro Teilprobe des Trockengewichts des gefrästen Versuchssubstrats durch Elementaranalyse¹⁶.
   HINWEIS: Bei diesem Protokoll wird davon ausgegangen, dass die Elementaranalyse von einem externen Labor durchgeführt wird.

3. Aufbereitung der zusätzlichen Nährstoffe für das Meerwasser

1. Einen 2-Liter- oder 4-Liter-Messkolben zur Hälfte mit Meerwasser füllen. Das benötigte Gesamtvolumen hängt von der Anzahl der Reaktorbehälter ab, die im Experiment verwendet werden sollen. Jeder Reaktorbehälter wird 75 ml Meerwasser enthalten. Wenn die Meerwasserquelle hohe Konzentrationen an organischen Partikeln enthält, ist das Meerwasser durch ein 20-μm-Netz zu sieben, um eine heterogene Kontamination durch große Partikel zu vermeiden.
2. Mit einer Präzisionswaage mit einer Empfindlichkeit von 0,001 g tarieren Sie eine Waagschale und wiegen 0,5 g/l Ammoniumchlorid (NH₄Cl) und dann 0,1 g/l monobasisches Kaliumphosphat (KH₂PO₄) auf der Grundlage von 2 l oder 4 l Meerwasser ab.
   ACHTUNG: Ammoniumchlorid kann Augenschäden oder -reizungen verursachen. Lesen und befolgen Sie vor Gebrauch alle Sicherheitsdatenblätter und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
   HINWEIS: Entsorgen Sie monobasische Abfälle aus Ammoniumchlorid und Kaliumphosphat in speziellen Behältern für gefährliche Abfälle gemäß den institutionellen Verfahren und den örtlichen Vorschriften. Kleine Mengen verdünnter (<1 %) NH₄Cl- und KH₂PO_4-Lösungen können nach Verdünnung mit reichlich Wasser für die Entsorgung in der Kanalisation in Frage kommen, wenn dies von der Institution und der örtlichen Abwasserbehörde genehmigt wird.
3. Die anorganischen Nährstoffe in den 2-Liter- oder 4-Liter-Messkolben geben, mit Meerwasser auf Volumen bringen, einen Rührstab hinzufügen und auf einer Rührplatte rühren, bis sich alle Salze aufgelöst haben. Die Lösung sollte klar sein und keine sichtbaren Partikel enthalten.
4. Teilprobe 20-30 mL des nährstoffangereicherten Meerwassers zur Messung des pH-Werts und des Salzgehalts. Weitere 60 ml werden durch einen 0,2 μm dicken Celluloseacetatfilter mit niedrigem Stickstoffgehalt in eine säureausgelaugte Polyethylenflasche für die Analyse von gelöstem anorganischem N und P nach den Standardmethoden in Schritt 1.5 filtriert.
5. Messen Sie den pH-Wert und den Salzgehalt auf einem Tischmessgerät gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für Meerwasser in voller Stärke wird aufgrund des Säuregehalts des Nährstoffzusatzes eine pH-Absenkung von etwa einer Einheit erwartet.

4. Vorbereitung für die Inkubation des Reaktorbehälters

1. Alle Glaswaren, einschließlich 250 mL Reaktorgefäße für die Proben und 75 mL volumetrische Pipette in 10 % Salzsäure (HCl) für 24 h mit Säure auslaugen und 3x mit deionisiertem Wasser spülen.
   ACHTUNG: HCl kann schwere Verbrennungen und Augenschäden verursachen. Lesen und befolgen Sie vor der Verwendung alle Sicherheitsdatenblätter. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
   HINWEIS: 10 % HCl-Abfälle können vor der Entsorgung mit Natriumbicarbonat neutralisiert werden, um eine neutrale Lösung zu bilden. Führen Sie die Neutralisation in Übereinstimmung mit den institutionellen Verfahren für gefährliche Abfälle und den geltenden lokalen Vorschriften durch.
2. Die säureausgelaugten leeren 250-ml-Reaktorgefäße, Deckel mit Anschlüssen, O-Ringe mit Silikondichtung und Schraubverschlüsse werden vor dem Tag des Experiments 15 Minuten lang in einem Autoklaven bei 121 °C autoklaviert.
3. Beschriften Sie Probenfläschchen mit der Kanalnummer/ID, die den Gefäßen entspricht, die Proben- oder Kontrollmaterialien aufnehmen.
4. Mit der Analysenwaage wird ein Fläschchen (mit Kappe) tariert, 20 mg (± 0,1 mg) des Versuchs oder der Kontrolle gewogen, das vollständige Ablesungsgewicht aufgezeichnet und beiseite gestellt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Versuchs- und Kontrollreplikate.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Gewichtungen korrekt sind. Es wird empfohlen, alle Substrate am selben Tag und von derselben Person zu wiegen.
5. Schalten Sie den Inkubator am Tag vor dem Hinzufügen von Gefäßen ein und stellen Sie die Temperatur auf 30 °C ein. Schalten Sie das Respirometer mindestens 2 Stunden vor der Systemdiagnose und Sensorkalibrierung gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
   HINWEIS: Die Vorbereitung des Reaktorbehälters kann fortgesetzt werden, sobald die Inkubatortemperatur 30 ± 2 °C erreicht und gehalten hat.
6. Bereiten Sie das Datenblatt vor, indem Sie die Proben-IDs/Replikate und die entsprechende Kanalnummer notieren. Ordnen Sie die Reaktorbehälter und Kappenbaugruppen (Deckel mit Anschlüssen/O-Ring) in der Reihenfolge der Kanalnummer/ID an (stellen Sie sicher, dass jedes Gefäß deutlich beschriftet ist). Überprüfen Sie die O-Ringe und Deckel/Anschlüsse, um sicherzustellen, dass sie sauber, trocken und intakt sind.

5. Einrichten der Reaktorbehälter

1. Verwenden Sie eine mit Säure ausgelaugte volumetrische Pipette von 75 mL und eine motorisierte Pipettiersteuerung, um 75 mL mit Nährstoffen angereichertes Meerwasser in jedes Reaktorgefäß zu dosieren.
2. Nehmen Sie eine Einwegpipette Meerwasser (~3 ml) aus jedem Gefäß und legen Sie es auf eine saubere Oberfläche daneben. Dieses Meerwasser wird verwendet, um die gemahlenen Versuchs- und Kontrollsubstrate aus dem tarierten Fläschchen zu spülen (Abbildung 1).
3. Füllen Sie die Substrate in geeignete Gefäße um.
4. Setzen Sie einen O-Ring auf den Rand des Reaktorbehälters und setzen Sie dann einen Deckel mit zwei Anschlüssen direkt auf den O-Ring. Befestigen Sie den O-Ring und den Deckel mit einem Schraubverschluss.
5. Passen Sie den Reaktorbehälter an die entsprechenden Gas-/Kondensationsleitungen an. Stecken Sie die Gasleitungen fest in die entsprechenden Ein-/Auslassöffnungen im Behälterdeckel.
6. Schalten Sie die Shaker-Plattform auf 0,05 x g (kontinuierlicher Modus) ein. Führen Sie eine Sichtprüfung durch, um sicherzustellen, dass alle Gefäße sicher sind, und schließen Sie dann die Inkubatortür.
7. Erfassen Sie die Temperatur des Inkubators (Anzeige und Thermistorsonde) und den Luftdruck mit einem Barometer.

Abbildung 1: Aufbau und Vorbereitung des Schiffes. (A) Hinzufügen von Meerwasser, (B) Hinzufügen der Probe und (C) Hinzufügen des O-Rings, des Metalldeckels und des Schraubverschlusses. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Starten des Respirometrie-Systems

1. Starten Sie die Software auf dem angeschlossenen Computer. Stellen Sie sicher, dass das System die Hardware über die RS-232-Verbindung erkennt. Wenn die Hardware nicht gefunden wird, wird eine Benachrichtigung angezeigt, dass das Gerät nicht angeschlossen ist und das Programm neu gestartet werden muss.
2. Wählen Sie im Hauptmenü der Software Tools > Diagnose > Grundlegende Operationen. Klicken Sie auf Protokolldatei speichern. Klicken Sie auf Ventile und Sensoren. Die Software zeigt für jeden Test PASS oder FAIL an. Fahren Sie nur dann mit der Zweipunktkalibrierung des CO₂ -Sensors fort, wenn beide Tests erfolgreich sind.

7. Kalibrieren des CO_{2 -} Sensors

1. Schließen Sie eine Kalknatronsäule an den Stickstoffanschluss an der Rückseite der Probenpumpe an, um CO₂ -Fett in der Umgebung für eine Nullkalibrierung zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass Natronkalk kalkweiß und nicht verfärbt (z. B. rosa oder violett) erscheint.
2. Wählen Sie Werkzeuge > Kalibrierung aus. Klicken Sie in der unteren rechten Ecke auf Kalibrierung starten. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, stellen Sie den Probenfluss mit der Steuerung der Probenpumpe auf der Vorderseite auf 0,5 l/min ein. Klicken Sie auf OK.
3. Wenn der Timer Null erreicht, drücken Sie die Aufwärts- und Ab-Offset-Tasten am CO₂ -Sensor, um den Messwert auf dem Bildschirm auf 0,000 (oder so nah wie möglich) einzustellen. Die Werte werden grün, wenn sie sich innerhalb des akzeptablen Bereichs befinden. Klicken Sie auf Nächstes Gas.
4. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, schließen Sie die Kalibriergasflasche an den Kalibrieranschluss auf der Rückseite der Probenpumpe an. Stellen Sie den Ausgangsdruck des Kalibriergases auf 5 PSIG ein. Stellen Sie sicher, dass überschüssiges Gas durch die T-Armatur fließt, sodass der Benutzer das Gas in der Nähe der Armatur hören und fühlen kann, bevor er auf OK klickt.
5. Wenn der Timer Null erreicht, drücken Sie die Aufwärts- und Ab-Span-Tasten am CO₂ -Sensor, um den Messwert auf dem Bildschirm auf 2.700 (oder so nah wie möglich) einzustellen. Die Werte werden grün, wenn sie sich innerhalb des akzeptablen Bereichs befinden. Klicken Sie auf Nächstes Gas, um die Kalibrierung abzuschließen.
   HINWEIS: Die Konzentrationen von Justiergasen werden durch das zertifizierte Primärstandardgasgemisch bestimmt, wie im Analysezertifikat des Lieferanten dokumentiert.

8. Versuchsaufbau in Software

1. Wählen Sie Experiment > Setup aus. Geben Sie Start- und Endkanalnummern aus den Dropdown-Menüs basierend auf den belegten Kanälen ein.
   1. Legen Sie den Aktualisierungsschwellenwert (%) auf 0,50, das Aktualisierungsintervall auf N.A. und das Aktualisierungsfenster (Sek.) auf Auto fest.
   2. Aktivieren Sie unter Sonstiges Setup das Kontrollkästchen für Spülsensoren. Stellen Sie sicher, dass die Optionen Automatische Volumenmessung, Ø_2-Verbrauch positiv und Öffnungsmodus aktivieren nicht ausgewählt sind.
   3. Stellen Sie das Probenintervall (Stunden) auf 8.00 Uhr und die Versuchsdauer (Stunden) auf N.A. Stellen Sie die Gas- und Zeiteinheiten nach Bedarf ein.
   4. Wenn Sie den primären Temperaturfühler für die Korrektur der Inkubationstemperatur verwenden, stellen Sie sicher, dass die Option "Kammertemperaturen manuell eingeben" nicht ausgewählt ist. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Entlüftungsmodus und stellen Sie sicher, dass der Entleerungsmodus nicht ausgewählt ist.
   5. Stellen Sie sicher, dass der anaerobe Entlüftungsmodus nicht ausgewählt ist.
2. Wählen Sie Kammereinrichtung. Geben Sie beschreibende Kanalbeschriftungen ein (z. B. NegCtrl_1, PosCtrl_2 Test_PHA_3).
3. Klicken Sie auf Dienstprogramme. Klicken Sie in der Spalte EN auf Zellen , nur für belegte Kanäle. Klicken Sie auf Einschränkung. Die Software zeigt für jeden Kanal PASS oder FAIL an. Fahren Sie nur fort, wenn alle Einschränkungstests erfolgreich sind.
4. Klicken Sie auf Lautstärke , um das Headspace-Volumen zu messen.
   HINWEIS: Das Headspace-Volumen entspricht dem Volumen der Luft im Probenreaktorbehälter und im geschlossenen Rohrkreislauf. Vergewissern Sie sich, dass die Volumina für die Gefäßgröße und die Schlauchlänge angemessen sind.
5. Klicken Sie auf Leckage. Die Software zeigt für jeden Kanal basierend auf dem Headspace-Volumen PASS oder FAIL an. Wenn ein Kanal ausfällt, führen Sie die folgenden Schritte aus.
   1. Stellen Sie sicher, dass der O-Ring sauber und frei von Partikeln und Fasern ist und richtig zwischen dem Behälterrand und dem Metalldeckel sitzt.
   2. Schraubverschluss festziehen. Überprüfen Sie den Anschluss und die Schläuche an den IN/OUT-Anschlüssen und -Anschlüssen. Schneiden Sie abgenutzte oder verformte Schlauchenden mit einer scharfen Klinge ab, um einen sauberen, geraden Schnitt zu gewährleisten.
   3. Wenn der Kanal weiterhin ausfällt, ersetzen Sie den O-Ring durch einen neuen, kompatiblen O-Ring, der vom Hersteller angegeben wird.
6. Klicken Sie auf Lautstärke , um die Headspace-Volumina erneut zu messen. Klicken Sie auf Beenden. Stellen Sie sicher, dass die Spalte "Lautstärke" auf der Registerkarte "Chamber Setup" für alle belegten Kanäle ausgefüllt ist.
7. Wählen Sie im Hauptmenü Extras > Servicemenü aus. Vergewissern Sie sich, dass der primäre Temperaturfühler, der die Inkubatortemperatur misst, bei 30 °C ± 2 °C liegt und stabil ist.
8. Klicken Sie auf Ausführen. Speichern Sie die Datei mit einem aussagekräftigen Namen, der das Datum enthält (z. B. 030325PositiveControlValidation). Notieren Sie den Dateinamen auf dem Datenblatt.
9. Wählen Sie Experiment > Ansicht > Diagrammerstellung aus, um Echtzeitdiagramme anzuzeigen. Die Biogasproduktion zeigt sich in positiven CO_{2 -} Produktionsraten. Negativkontrollen können um Null schwanken; Ihre durchschnittliche Rate sollte jedoch null oder positiv sein.
10. Wenn das System über Kondensationstrockner verfügt, führen Sie täglich ein Protokoll über das sichtbare Kondenswasser in den Schläuchen. Bewegen Sie die Schläuche vorsichtig, um Verstopfungen zu beseitigen und bei Bedarf eine Drainage zu ermöglichen.
11. Aktualisieren Sie die Datendateien (ASCII-Textdateien) am Ende jedes Sampling-Intervalls. Daten, einschließlich Temperatur, Gas % (Gaszusammensetzung), Rate und Akkumulation, können während des Experiments oder am Ende auf verschiedene andere Softwarepakete heruntergeladen werden.
    1. Um .dat Dateien in einer Tabelle zu öffnen, starten Sie Excel, und wählen Sie Datei > Öffnen aus. Navigieren Sie zu dem Ordner, der die .dat Datei enthält. Wählen Sie im Dropdown-Menü Dateityp die Option Alle Dateien und wählen Sie die gewünschte Datei aus.
    2. Wenn Sie vom Textimport-Assistenten dazu aufgefordert werden, wählen Sie Trennzeichen als Dateityp aus, und klicken Sie auf Weiter.
    3. Aktivieren Sie unter Trennzeichen das Kontrollkästchen für Komma. Stellen Sie sicher, dass keine anderen Trennzeichen ausgewählt sind. Im Vorschaufenster sollten die Daten in Spalten getrennt angezeigt werden. Klicken Sie auf Fertig stellen, um die Daten in die Tabelle zu laden.
    4. Speichern Sie die Datei in einem .xlsx- oder .csv Format zur weiteren Analyse und Archivierung.
12. Analysieren Sie die Daten in regelmäßigen Abständen, um sicherzustellen, dass die Behandlungsreplikate konsistent sind. Der Standardfehler der Behandlungsreplikate sollte weniger als 5 % der mittleren kumulativen CO₂ -Produktion betragen. Wiederholen Sie Tests, bei denen dieser Schwellenwert nicht besteht.
13. Klicken Sie auf Stopp , wenn die Inkubation abgeschlossen ist.
    1. Die Inkubationszeit kann 10-90 Tage dauern. Wenn die Prüfmaterialien in hohem Maße biologisch abbaubar sind, ist die Inkubation zu beenden, wenn die kumulative CO₂ -Produktion ein Plateau erreicht, oder sie zu verlängern, wenn nach 90 Tagen keine Degradation festgestellt wird.
    2. Die Versuche sind abzuschließen, wenn sowohl in den Kontroll- als auch in den Testschiffen mindestens 5 Tage lang keine Nettogasproduktion beobachtet wird. Keine Nettoproduktion ist definiert als weniger als 1 % Veränderung des prozentualen biologischen Abbaus innerhalb von 5 Tagen.
14. Fahren Sie das System herunter oder bereiten Sie sich auf das nächste Experiment vor.

9. Aufschlüsselung des Experiments

1. Aufzeichnen der Inkubatortemperatur (Thermistorsonde und Inkubatoranzeige). Trennen Sie die Schläuche von den Reaktorbehältern vom Respirometer und wiegen Sie jedes Probenreaktorgefäß mit einer Präzisionswaage. Notieren Sie die Gewichte, um festzustellen, ob während der Inkubationszeit ein Gewichts-/Wasserverlust aufgetreten ist.
2. Nehmen Sie eine Teilprobe von 20-30 ml Meerwasser aus jedem Reaktorgefäß, um den pH-Wert und den Salzgehalt zu messen, und vergleichen Sie diese Werte mit den in Schritt 3.4 aufgezeichneten Werten, um die Stabilität während der Inkubation zu überprüfen. Filtrieren Sie weitere 60 ml durch einen 0,2 μm Celluloseacetat-Filter mit niedrigem Stickstoffgehalt in eine säureausgelaugte Polyethylenflasche für die Analyse gelöster anorganischer N und P nach den Standardmethoden in Schritt 1.5.
   HINWEIS: Verbleibende Meerwasserproben können gefiltert werden, um verbleibende Kunststoffe zu entfernen, verdünnt werden, um die Nährstoffkonzentrationen zu reduzieren, und durch Ableitung gemäß den institutionellen und lokalen Vorschriften entsorgt werden.
3. Spülen Sie Gefäße, O-Ringe, Metalldeckel und Schraubverschlüsse mit Leitungswasser. Stellen Sie die Gläser für mindestens 24 Stunden in ein 10%iges HCl-Säurebad. Autoklavieren und mit Alufolie bedeckt für die nächste Inkubation lagern

10. Berechnung des prozentualen biologischen Abbaus

1. Berechnen Sie den Gesamtkohlenstoff im Versuchs-/Kontrollsubstrat wie folgt:
   
   wobei % C (Kohlenstoffgehalt) durch Elementaranalyse bestimmt wird.
   HINWEIS: Der Gesamtkohlenstoff in den Versuchs- und Kontrollsubstraten kann während der aeroben Inkubation die folgende biochemische Umwandlung durchlaufen:
   C + O₂ → CO₂
   Jede mmol (12 mg) organischer Kohlenstoff aus dem Versuchs-/Kontrollsubstrat kann in 1 mmol gasförmiges CO₂ umgewandelt werden. Eine mmol erzeugtes Gas nimmt bei Standardtemperatur und -druck (STP) 22,4 mL ein.
2. Berechnen Sie den prozentualen biologischen Abbau wie folgt:
   
   wobei C_g = Menge an gasförmigem Kohlenstoff, die aus dem Versuchs-/Kontrollsubstrat und der Negativkontrolle (nur Meerwasserinokulum) erzeugt wird, mmoles, und C_i = Menge an Kohlenstoff im zugesetzten Versuchssubstrat, mmoles.
3. Berechnen Sie den Standardfehler s_e des prozentualen Anteils an biologischem Abbau wie folgt:
   
   wobei n1 und n2 = Anzahl der replizierten Behälter für Versuchs-/Kontrollsubstrate bzw. Negativkontrollreaktoren und s = Standardabweichung des gesamten produzierten gasförmigen Kohlenstoffs ist.
4. Berechnen Sie die 95 %-Konfidenzgrenzen (CL) wie folgt:
   
   wobei t = t-Verteilungswert für 95% Wahrscheinlichkeit mit (n1 + n2 − 2) Freiheitsgraden, also n = 3 + 3 − 2 = 4.

11. Ende des Protokolls

1. Nach Abschluss der Berechnungen und Datenanalysen stellen Sie die Ergebnisse im Abschlussbericht zusammen oder geben sie in eine gemeinsame Datenbank ein, gemäß den Projekt- oder institutionellen Datenmanagementplänen. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien gemäß den Richtlinien für gefährliche Abfälle in der Einrichtung entsorgt werden und alle Geräte gereinigt und gelagert werden.

Ergebnisse

Die Ergebnisse von Tests zur biologischen Abbaubarkeit im Meer werden vorgestellt. Der biologische Abbau wurde für jede Probe bewertet, indem der Anteil des in Kohlendioxid umgewandelten Kohlenstoffs gemessen wurde. Diagramme für kumulative, prozentuale und prozentuale biologische Abbaubarkeit weisen in der Regel eine Verzögerungsphase auf, gefolgt von einer Wachstumsphase und schließlich einem Plateau. Der Zeitpunkt und das Ausmaß dieser Phasen hängen vom Probenmaterial, den experimente...

Diskussion

Die Leistung der Positivkontrolle bestimmt die Validität des Tests. Ein biologischer Abbau von mindestens 70 % eines leicht marinen, biologisch abbaubaren Positivkontrollsubstrats (z. B. Zellulose in analytischer Qualität, Kraftpapier usw.), basierend auf seiner theoretischen maximalen Gasausbeute, ist erforderlich. Dieser Benchmark bestätigt günstige Bedingungen und eine ausreichende mikrobielle Aktivität im natürlichen Meerwasser während der Inkubation. Die Nichteinhaltung dieses Schwe...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0.2 &Mikro; M, 47 mm Zelluloseacetatfilter	Geotechnik-Geofilter	83100056	Filtern von Meerwasser
100 mL volumetrische Pipette	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2U	Klasse A; Säure ausgelaugt und mit deionisiertem Wasser abgespült
100-600 mL Glasbecher	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	50-194-5690	Klasse A; Säure ausgelaugt und mit deionisiertem Wasser abgespült
20 mm Fräskugeln	Retsch	53680062	Edelstahl. Verwendet mit dem Fräsglas zum kryogenen Mahlen von Polymeren
50 mL Mahlgläser	Retsch	14620216	Edelstahl. Verwendet mit Mixer Mill 400- und 20-mm-Fräskugeln zur kryogenen Fräsung von Polymeren
75 mL volumetrische Pipette	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2T	Klasse A; Säure ausgelaugt und mit deionisiertem Wasser abgespült
Luftpumpe und Bubbler-System	Tetra	77846	Belüfte Meerwasser während der Vorinkubations-Gleichgewichtung
Alufolie	Fisherbrand	01-213-100	Abdeckung für Autoklavierung und saubere Lagerung
Ammoniumchlorid (NH4Cl)	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A661-500	Nährstoffspitze im Meerwasser
Analytisches Gleichgewicht	Mettler	AT201	Versuchs- und Kontrollsubstrate abzuwägen
Autoklav	Tuttnauer	MFI-TTN-3870EA	Zur Sterilisation von Gefäßen und Deckelbaugruppen
Basis Micro-Oxymax 120VAC Einzelkanal	Columbus-Instrumente	0135-8000	Verwendet zur Speicherung von positiven Kontrollen und Polymeren
Kalibrierungsgas	Luftgas	X03NI92P3000001	Primäre Standardgasmischungen; 2,7 % Kohlendioxid, 4,5 % Methan, Rest Stickstoff
Computermonitor	Dell	210-BMKK	Dell Pro 24 Plus USB-C-Hub-Monitor. Wird mit dem Computer verwendet, um Micro-Oxymax-Software auszuführen.
Kryogene Handschuhe	Thermo Fisher Scientific, Tempshield, Kryohandschuhe	11-394-306	Verwendet zur Verarbeitung von flüssigem Stickstoff
Zifferblattthermometer	Thermo Fisher Scientific, H-B-Instrument Durac	13-201-433	Kalibriertes Thermometer für die Meerwassertemperatur zum Zeitpunkt der Entnahme
Einwegpipetten	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-711-7M	Spülen Sie die Seiten des Gefäßes ab, um Material freizumachen.
ENC52 Temperatur- und Lichtgehäuse	Columbus-Instrumente	4740-4054	Halte Temperatur- und Lichtbedingungen aufrecht
Flaschenzange	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	S07387	Verwendet zum Mahlen von Gläsern in flüssigem Stickstoff
Flaschen, 250 mL	DWK Life Sciences	14395-250	Probenreaktorbehälter
Glasschalen mit Plug-artigen Verschlüssen	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	03-339-26D	Sample-Speicherung
H22PX Handheld-Tiefenmesser	West Marine, Norcross Marine	6849368	Bestimmung der Tiefe des Meerwassersammelstelles
Handkamera GPS 73	Garmin	10-01504-00	Verwendet zur Bestimmung des Standorts des Meerwasser-Sammelstandorts
HDPE Pan	Thermowissenschaftlich, Nalgene	13-359-26	Wurde verwendet, um Glaswaren mit Säure auszulaugen  in 10%-HCl-Lösung
Salzsäure (saure Wasserlösung)	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A144-212	Zertifiziertes ACS Plus, 36,5 bis 38,0 %. CO2 Sensorprüfung und Säureauswaschung von Glaswaren
Laminarer Flusshaube	Luftwissenschaft	FLOW-48-A	Minimieren Sie luftgetragene Schadstoffe während der Probenvorbereitung
Großer Niskin; Beta Plus Nur Flasche – 8,2L horizontal, PVC	Wissenschaft zuerst	3-1980-H65	Zur Meerwassersammlung vom Pier oder Boot
Flüssigstickstoffpfanne	Thermo Fisher Wissenschaftlich, Bel Art Magic Touch 2	11-999-063	Hold Liquid Stick
Flüssigstickstoff-Transfergefäß, 10 l	Thermowissenschaftlich	TY509X2	Flüssigen Stickstoff zum Kryomahlen lagern und dosieren
Flüssigstickstoff, Industriequalität, 22 PSI	Luftgas	NI 180LT22	Verwendet zum Spröden und Mahlen von Polymeren
Mechanischer Siebschüttler	Humbolt, Grainger	5DPL6	Siebanalyse zur Partikelgrößenverteilung
Micro-Oxymax	Columbus Instrumentts	7395-113-D64	Silizium-versiegelter O-Ring, Metallanschluss mit 3 Verschraubungen und GL45-Schraubkappe;
Micro-Oxymax 10-Kanal-Erweiterungsschnittstelle	Columbus-Instrumente	0135-8101	Komponente des Respirometriesystems
Micro-Oxymax-Respirometer (3 % CO2 Sensor)	Columbus-Instrumente	0135-8403	Nicht-dispersives Infrarot
Mischmühle 400	Retsch	207450001	Mischmühle 400. Verwendet für kryogenes Mahlen von Polymeren
Motorisierter Pipettenregler	Eppendorf	4430000018	Übertragen Sie Meerwasser in Probenreaktorbehälter
Schmalmundige Bernstein-HDPE-Laborflasche, 1 L	Thermowissenschaftlich, Nalgene	02-923-5	Diskrete Vollwasser-Meerwasserprobe
Nylon-Mesh 20 Mikron	ELKO Filterfirma.	41718	Wird verwendet, um rohes Meerwasser zu sieben und größere, heterogene Partikel zu entfernen.
Freiluft-Orbitalshaker	Thermo Fisher Scientific	SK4000	Aufrechterhaltung der Orbitalbewegung der Reaktorgefäße während der Inkubation
OptiPlex 5090 Computer mit kleinem Formfaktor	Dell	C0SL03	Desktom-Computer betrieb früher Micro-Oxymax-Software
pH-/Kondensationsmessgerät	Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic	30046252	Tisch-pH-/Leitfähigkeitsmessgerät zur Messung des anfänglichen und finalen Meerwasserinokulums
Polyethylenflasche, 60 ml	Qorpak	PLC-03564	Diskrete gefilterte Meerwasserprobe
Kaliumphosphat-Monobas (KH2(PO4))	Thermo Fisher Scientific, Fisher BioReagenzien	BP362-500	Nährstoffspitze im Meerwasser
Präzisionsbalance	Sartorius	Practum2102-1S	Um das Gesamtgewicht der Gefäße abzuwägen
Runder Ballon, 20 L	Thermo Fisher Scientific	02961A	Säureausgelaugt zur Speicherung von Meerwasser
Schutzbrille	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	19-181-513
Scoopula	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand, Scoopula	01-257-567	Edelstahl-Labor-Scoopula
Siebe	Advantech, Grainger	40PR18-40PR55	Siebe aus Edelstahl. Anzahl der Siebe und Größen hängt vom getesteten Material ab.
Sigmacell-Cellulose, Typ 101	Sigma-Aldrich	435236-250G	Pulver, Positivkontrollsubstrat
Natriumbicarbonat	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	S233-500	CO2 Sensorprüfung
Natriumsulfit, wasserfrei, 98 %	Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific Chemicals	AAA1793336	CO2 Sensorprüfung
Thermometer/Thermistor-Sonde	Fisherbrand	15-079-700	Inkubatortemperatur überprüfen
Traceable Precision Dial Barometer	Fisherbrand	14-648-51	Rekorddruck zu Beginn des Experiments
Victor Mittellichtwasserstoff, Methan-Zweistufen-Regler, CGA - 350	AirGas	VIC0781-3559	Kalibrierungsgasregulator
Volumenkolben, 2 L	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	FB4002000	Klasse A; Säure ausgelaugt und mit deionisiertem Wasser abgespült. Zur Herstellung von nährstoffreichem Meerwasser verwendet.
Wiegpfannen	Thermo Fisher Scientific	02-202-101	Polyethylen