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Methodenartikel

Etablierung und Quantifizierung der de novo lytischen Infektion durch zellfreies Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus

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DOI:

10.3791/68959

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15. August 2025

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1Program in Molecular and Cellular Oncogenesis, The Wistar Institute, 2Section of Infection and Immunity, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro System zur Modellierung der de novo lytischen Infektion des Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus unter Verwendung von BAC16-abgeleiteten Virionen. Die Methode ermöglicht die Untersuchung der frühen Virusreplikation und -verbreitung. Die Produktion infektiöser Viren wird durch GFP-basierte Assays für infektiöse Einheiten und Echtzeit-PCR von verkapselten Virusgenomen quantifiziert.

Zusammenfassung

Das Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV), ein Gammaherpesvirus, das an mehreren menschlichen Malignomen beteiligt ist, kann während der Primärinfektion eine lytische Replikation durchlaufen, ein Prozess, der zur Virusverbreitung, Immunevasion und Krankheitspathogenese beiträgt. Der Mangel an robusten In-vitro-Systemen für de novo lytische Infektionen hat jedoch nur begrenzte Einblicke in das frühe Infektionsgeschehen gegeben. Hier stellen wir ein handhabbares Protokoll vor, das HCT 116-Zellen des menschlichen Darmkrebses als Ziele für die Infektion mit zellfreien Virionen verwendet, die von KSHV-bakteriellen künstlichen Chromosom 16 (BAC16)-reaktivierten iSLK-Produzentzellen stammen. Dieses Modell rekapituliert die wichtigsten Schritte der Primärinfektion, einschließlich des Viruseintritts, der Genomübertragung, der lytischen Genexpression und der Nachkommenproduktion. Die Infektion wird über die Spinokulation synchronisiert und zeitlich überwacht. Die Virusproduktion wird mit Hilfe eines dualen Auslesesystems quantifiziert, das aus Assays auf Basis von Green Fluorescence Protein (GFP)-basierten infektiösen Einheiten (IU) und qPCR von verkapselter viraler DNA besteht. Diese Ansätze ermöglichen eine detaillierte Analyse der Kinetik der viralen Replikation. Während sich das derzeitige Protokoll auf die Erkennung von Ereignissen im Spätstadium konzentriert, ist das System durch modifizierte Probenahmezeitpunkte für die Untersuchung früher Phasen der Infektion anpassbar. Durch das Angebot einer reproduzierbaren, skalierbaren Plattform für produktive De-novo-Infektionen schließt dieses System eine methodische Lücke in der KSHV-Forschung und unterstützt mechanistische Studien der Herpesvirus-Wirt-Interaktion und antiviraler Strategien.

Einleitung

Das Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) ist ein humanes Gammaherpesvirus, das ätiologisch mit dem Kaposi-Sarkom (KS), dem primären Effusionslymphom (PEL), der multizentrischen Castleman-Krankheit (MCD) und dem entzündlichen Zytokinsyndrom KSHV verbunden ist 1,2. Wie alle Herpesviren etabliert KSHV eine lebenslange Persistenz im Wirt, wobei zwischen latenter und lytischer Phase gewechselt wird. Während die Latenz in den meisten infizierten Zellen vorherrscht, kann eine Untergruppe entweder während einer primären (de novo) Infektion oder durch Reaktivierung von der Latenz in den lytischen Zykluseintreten 3. Die lytische Replikation umfasst eine geordnete Kaskade viraler Genexpression, die in der Genomreplikation, dem Virionenassemblierung und der Freisetzung der Nachkommen gipfelt. Dieser Prozess ist entscheidend für die Ausbreitung des Virus und das Fortschreiten der Erkrankung 4,5. Frühe Studien zur lytischen Replikation von KSHV stützten sich oft auf die ektopische Expression einzelner viraler Gene in heterologen Systemen. Obwohl diese Ansätze informativ waren, erfassten sie nicht die koordinierte Genregulation und die Virus-Wirt-Interaktion, die während einer authentischen Infektion vorhanden sind. Die Entwicklung von BAC-16, einem rekombinanten bakteriellen künstlichen Chromosom (BAC), das das KSHV-Genom in voller Länge trägt, ermöglichte die Produktion genetisch manipulierbarer Viren, die ihre Kompetenz für die Replikation und die Produktion infektiöser Virionen behalten6. Dieses System ermöglicht die gezielte Mutagenese und funktionelle Analyse viraler Gene im Kontext des gesamten Genoms. Reaktivierungsmodelle mit latent infizierten iSLK- oder BCBL-1-Zellen mit BAC-16 oder KSHV sind seitdem zum Standard für die Untersuchung der lytischen Replikation von KSHV geworden. Diese Systeme ermöglichen eine synchronisierte Induktion des lytischen Zyklus mit Mitteln wie Doxycyclin (Dox) und Natriumbutyrat 7,8. Da Reaktivierungsmodelle jedoch frühe Infektionsschritte umgehen – einschließlich des Viruseintritts, des intrazellulären Transports und der anfänglichen Entscheidung zwischen Latenz und lytischer Replikation – können sie die Dynamik der Primärinfektion nicht vollständig rekapitulieren.

De-novo-Infektionsmodelle bieten einen ergänzenden Rahmen, um diese Lücken zu schließen. Es wurde gezeigt, dass mehrere primäre Zellmodelle, wie z. B. humane Endothel- und gingivale Epithelzellen, die lytische Replikation nach einer KSHV-De-novo-Infektion unterstützen 3,9,10,11. Ihre begrenzte Lebensdauer, die hohen Kosten und die geringe Zugänglichkeit für genetische Manipulationen schränken jedoch ihre Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit für mechanistische Studien ein. In diesem Protokoll beschreiben wir ein handhabbares und skalierbares Modell der denovolytischen KSHV-Infektion unter Verwendung der humanen kolorektalen Karzinomzelllinie HCT 116. Obwohl HCT116-Zellen kein natürliches Ziel von KSHV sind, weisen sie eine robuste Freizügigkeit gegenüber Infektionen auf und bieten eine stabile und kostengünstige Plattform, die sich für mechanistische Studien und Hochdurchsatzanwendungen eignet. Angesichts der begrenzten Fähigkeit von KSHV, in Kultur Plaque zu bilden, verwenden wir das BAC16-System mit einem GFP-Reporter, um zellfreie Viren für die Infektion zu erzeugen. Dies ermöglicht die direkte Visualisierung infizierter Zellen und die Quantifizierung infektiöser Titer über GFP-basierte Assays der infektiösen Einheit (IU)12. Ergänzend dazu wird die Virion-assoziierte DNA durch quantitative real-time PCR (qPCR) nach DNase-Behandlung gemessen, was eine empfindliche Methode zum Nachweis verkapselter viraler Genome darstellt. Zusammen ermöglichen diese Assays eine zeitlich aufgelöste, quantitative Analyse der lytischen Replikationsdynamik während der Primärinfektion.

Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige und flexible Plattform für die Modellierung von KSHV-De-novo-lytischen Infektionen in vitro, die die Dissektion früher Ereignisse im viralen Lebenszyklus erleichtert und die Bewertung der Genfunktion und der antiviralen Aktivität ermöglicht.

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Protokoll

KSHV ist als humanpathogener Erreger der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) eingestuft. Führen Sie alle Verfahren mit infektiösem Material in einer zertifizierten BSL-2-Biosicherheitswerkbank durch. Dekontaminieren Sie Arbeitsflächen vor und nach jedem Eingriff mit 70 % Ethanol. Entsorgen Sie alle Abfälle in Übereinstimmung mit den institutionellen Biosicherheitsvorschriften und den BSL-2-Richtlinien der WHO. Eine schematische Übersicht über den vollständigen Arbeitsablauf finden Sie in Abbildung 1. Das Verfahren umfasst die Erzeugung von zellfreiem BAC16-abgeleitetem KSHV aus reaktivierten iSLK-Zellen, die De-novo-Infektion von HCT 116-Zellen, die Quantifizierung von Virustitern mittels Infectious Unit (IU)-Assay und die qPCR-Analyse von Virion-assoziierter viraler DNA. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von zellfreiem BAC16-abgeleitetem KSHV

  1. Säen Sie fünf T75-Kolben mit Dox-induzierbaren iSLK-Zellen aus, die Wide-Typ (WT) KSHV BAC 16 (iSLK-BAC16) mit einer Konfluenz von etwa 80 % enthalten. Bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO 2 -Inkubator für 24 h inkubieren.
  2. Induzieren Sie die lytische Reaktivierung durch Zugabe von 1 μg/ml Dox und 1 mM Natriumbutyrat zu jedem Kolben. Die Inkubation für 72-96 h fortsetzen.
  3. Überwachen Sie die Zellen täglich mit Phasenkontrastmikroskopie. Der Überstand ist zu sammeln, sobald >90 % der Zellen eine Rundung, eine Ablösung von der Kolbenoberfläche und/oder eine sichtbare Lyse aufweisen, Merkmale der zytopathischen Wirkung (CPE), die auf eine robuste lytische Reaktion hinweisen. Nach der Entnahme des Überstands werden die lytisch induzierten iSLK-BAC16-Zellen mit 10 % Bleiche dekontaminiert und entsorgt.
  4. Zentrifugieren Sie die gesammelten Überstände bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C, um Schmutz zu entfernen. Filtrieren Sie den geklärten Überstand durch einen 0,45 μm Polyethersulfon (PES)-Membranfilter, ohne das Pellet zu stören.
  5. Die filtrierten Überstände werden in Ultrazentrifugenröhrchen überführt. Pelletieren Sie die Viruspartikel durch Zentrifugation bei 25.000 x g für 3 h bei 4 °C mit einem SW28-Rotor.
  6. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig in 10 % Bleichmittel. Resuspendieren Sie das virale Pellet in 1 mL serumfreiem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  7. Aliquotieren Sie das resuspendierte Virus in sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss. Aliquots bis zur Verwendung bei -80 °C lagern. Bestimmung der infektiösen Titer des Virusbestands mit GFP-basierten Assays der infektiösen Einheit (IU) in SLK-Zellen (siehe Schritt 3).

2. De-novo-Infektion von HCT116-Zellen

HINWEIS: Eine hohe Multiplizität der Infektion (MOI) ist entscheidend, um die lytische Replikation in HCT116-Zellen nach einer de novo KSHV-Infektion effizient zu initiieren. Diese Bedingung ermöglicht eine robuste virale Genexpression und produktive Replikation, ohne dass exogene Stimuli erforderlich sind. Ein repräsentatives Ergebnis, das den MOI-abhängigen Effekt auf die Virionproduktion zeigt, ist in der ergänzenden Abbildung 1A dargestellt.

  1. 1 x 105 HCT116-Zellen pro Well in eine 12-Well-Gewebekulturplatte säen. 24 h bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO 2 -Inkubator inkubieren.
  2. Verdünnen Sie den konzentrierten Virusfond in vorgewärmtem, serumfreiem DMEM auf ein Endvolumen von 250 μl, um eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 zu erreichen.
  3. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus jeder Vertiefung. Geben Sie 250 μl verdünntes Virus direkt in die Zellen.
  4. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.500 x g für 1 h bei 30 °C, um die Infektion (Spinokulation) zu synchronisieren. Stellen Sie die Platte sofort in einen 37 °C heißen Inkubator und setzen Sie die Inkubation für weitere 1 h fort.
  5. Aspirieren Sie das Inokulum und waschen Sie die Zellen dreimal mit vorgewärmtem PBS, um das restliche Virus zu entfernen. Geben Sie 1 ml vollständiges DMEM in jede Vertiefung.
  6. Überwachen Sie die GFP-Expression in infizierten Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie 36 h, 60 h und 96 h nach der Infektion. Entnehmen Sie zu jedem Zeitpunkt 1 ml Kulturüberstand aus jeder Vertiefung.
    HINWEIS: Nach der Überstandsentnahme können KSHV-infizierte HCT116-Zellen für nachgelagerte Anwendungen wie RNA-Extraktion, Proteinanalyse, Immunfluoreszenz oder Durchflusszytometrie aufbewahrt werden, basierend auf experimentellen Zielen.
  7. Die gesammelten Überstände werden bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Geklärte Überstände in frische Röhrchen überführen. In flüssigem Stickstoff einfrieren und zur weiteren Analyse bei -80 °C lagern.

3. Assay für infektiöse Einheiten (IE-Assay)

HINWEIS: SLK-Zellen reagieren permissiv auf den KSHV-Eintritt und unterstützen eine frühe lytische Genexpression. Dieser Assay quantifiziert infektiöse Einheiten basierend auf der GFP-Expression in infizierten SLK-Zellen nach Exposition gegenüber seriell verdünnten virushaltigen Überständen.

  1. 1 x 104 SLK-Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte 24 h vor der Infektion aussäen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind und am Tag der Infektion eine Konfluenz von ~60 % bis 70 % erreichen.
  2. Beschriften Sie neun 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für serielle zweifache Verdünnungen: Röhrchen 1 (unverdünnt, 1:1), Röhrchen 2 (1:2), Röhrchen 3 (1:4), Röhrchen 4 (1:8), Röhrchen 5 (1:16), Röhrchen 6 (1:32), Röhrchen 7 (1:64), Röhrchen 8 (1:128) und Röhrchen 9 (1:256).
  3. 200 μl Virusüberstand in Röhrchen 1 geben. Geben Sie jeweils 100 μl vorgewärmtes, serumfreies DMEM in die Röhrchen 2 bis 9. Um die Verdünnungsreihe zu beginnen, übertragen Sie 100 μl von Röhrchen 1 in Röhrchen 2 und mischen Sie es gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren. Übertragen Sie dann 100 μl von Röhrchen 2 auf Röhrchen 3 und wiederholen Sie diesen Vorgang nacheinander durch Röhrchen 9, wobei Sie bei jedem Schritt gründlich mischen.
    HINWEIS: Jedes Röhrchen sollte ein Endvolumen von 100 μl enthalten. Alle Verdünnungen in dreifacher Ausfertigung durchführen.
  4. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus SLK-Zellen. Geben Sie 100 μl jeder Virusverdünnung in die dafür vorgesehenen Vertiefungen. Verwenden Sie insgesamt 27 Wells (3 Wells pro Verdünnung von 1:1 bis 1:256).
  5. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 1.500 x g für 1 h bei 30 °C, um die Adsorption des Fläschchens zu fördern. Stellen Sie die Platte für weitere 1 h in einen 37 °C CO 2 -Inkubator.
  6. Entfernen Sie das Inokulum und geben Sie vorsichtig 100 μl vollständiges DMEM in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 °C.
  7. Ernten Sie die Zellen und analysieren Sie die GFP-Expression mittels Durchflusszytometrie. Notieren Sie die Anzahl der GFP-positiven Zellen pro Well.
  8. Berechnen Sie infektiöse Einheiten pro ml (IE/ml) mit der folgenden Formel13:
    IE/mL = [(Anzahl der GFP-positiven Zellen pro Well)/ Inokulumvolumen (mL)] x Verdünnungsfaktor. Bestimmung des endgültigen Virustiters anhand der letzten Verdünnung mit nachweisbaren GFP-positiven Zellen

4. Quantifizierung von verkapselten viralen Genomen mittels qPCR

  1. Geben Sie DNase I zu einer Endkonzentration von 100 U/ml bis 400 μl geklärtem Überstand hinzu (siehe Schritt 1 zur Klärung des Überstands und zur Entfernung von Ablagerungen). 15 Minuten bei 37 °C inkubieren, um nicht verkapselte virale und zelluläre DNA zu verdauen. Ein repräsentatives Ergebnis, das die Spezifität und Wirksamkeit der DNase-Behandlung belegt, ist in der ergänzenden Abbildung 1B dargestellt.
  2. Fügen Sie EDTA bis zu einer Endkonzentration von 50 mM hinzu, um die DNase-Reaktion zu stoppen. Inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 75 °C, um DNase I zu inaktivieren.
  3. Extrahieren Sie virale DNA aus dem DNase-behandelten Überstand mit dem DNA Mini Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  4. Eluieren Sie die virale DNA in 30 μl Elutionspuffer. Verwenden Sie 5 μl eluierte DNA für jede qPCR-Reaktion.
  5. Verstärken Sie den KSHV open reading frame 73 (ORF 73) mit den folgenden Primern: Vorwärts: 5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'; Rückseite: 5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3.
  6. Bereiten Sie qPCR-Reaktionen in dreifacher Ausfertigung mit SYBR Green Master SuperMix vor. Stellen Sie die Fahrbedingungen wie folgt ein: Anfängliche Denaturierung: 95 °C für 3 min; Verstärkung: 40 Zyklen von 95 °C für 10 s, 52 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; Analyse der Schmelzkurve: Standardrampe für die Amplikonspezifität.
  7. Generieren Sie eine Standardkurve unter Verwendung von 10-fachen seriellen Verdünnungen von BAC-16-abgeleiteter viraler DNA, die von 109 bis 101 Kopien pro Reaktion reicht. Plotten Sie die Ct-Werte gegen das Protokoll10 der eingegebenen Kopienzahl, um die Linearität des Assays zu bewerten. Eine repräsentative Standardkurve ist in der ergänzenden Abbildung 1C dargestellt.
  8. Bestimmen Sie die Kopienzahl des viralen Genoms, indem Sie die Ct-Werte mit der Standardkurve vergleichen. Normalisieren und melden Sie die Ergebnisse als virale DNA-Kopien pro ml Überstand.

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Ergebnisse

Um den Titer des infektiösen Virus zu quantifizieren, wurden Überstände, die 72 Stunden nach lytischer Reaktivierung von iSLK-BAC16-Zellen geerntet wurden, einer zweifachen seriellen Verdünnung unterzogen und zur Infektion von SLK-Zellen verwendet. Die Anzahl der GFP-positiven SLK-Zellen bei jeder Verdünnung ist in Abbildung 2A dargestellt, und die entsprechenden infektiösen Einheiten (IE) pro ml wurden berechnet und in

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Diskussion

Die Modellierung der de-novo-lytischen Infektion von KSHV wurde lange Zeit durch die starke Neigung des Virus zur Etablierung einer Latenz in den meisten permissiven Zelltypen behindert. Obwohl gezeigt wurde, dass bestimmte Primärzellen, wie z. B. endotheliale und orale Epithelzellen, die lytische Replikation nach einer De-novo-Infektion unterstützen 9,10, verringern ihre begrenzte Lebensdauer, ihre hohen Kosten...

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Offenlegungen

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Jae U. Jung (Cleveland Clinic) für die Bereitstellung der iSLK-BAC16-Zelllinie, die rekombinantes KSHV produziert. Das Grafikdesign wurde unter Verwendung von BioRender.com erstellt, für die die Autoren eine Lizenz besitzen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die NIH-Auszeichnungen R21 DE028256, R01 CA140964 und R01 CA262631 an C. Liang (PI) und den Wistar Science Accelerator Postdoctoral Award an Q. Zhu.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,45 &Mikro; m Polyethersulfom (PES) Filter VWR76479-020
BiorenderBiorenderN/ADie Grafikgestaltung wurde
mit BioRender.com erstellt, für die die Autoren eine Lizenz besitzen
CFX Opus 96 Real-Time-PCR-SystemBio-Rad184-5072
Vollständiges DMEMDulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM; Sigma-Aldrich), ergänzt mit 10%(v/v) fötalem Rinderserum (FBS; Gibco), 2 mM L-Glutamin (Gibco) und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptomycin; GenClone).
DNase INeuengland BiolaboreM0303S
doxycyclinSigma-AldrichNr. D9891
LSR II 18 DurchflusszytometerBD BiowissenschaftenN/A
PerfeCTa SYBR Green Master SuperMixQuantabio95054-02K
QIAamp DNA Mini BausatzQiagen56304
Natriumbutyrat (NaB)Sigma-AldrichNr. B5887
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo Fischer15575020

Referenzen

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