Etablierung und Bewertung eines diabetischen Rattenmodells mit Arteriosklerose obliterans der unteren Extremitäten

Zusammenfassung

Die Arteriosklerose obliterans der unteren Extremitäten ist eine häufige Komplikation bei Diabetes mellitus. Hier stellen wir eine neuartige Tiermodellierungsmethode vor, die das Fortschreiten einer atherosklerotischen Okklusiverkrankung simuliert, indem Ethanol in Blutgefäße injiziert wird, um die Gefäßstruktur zu stören und so eine neue Grundlage für die Behandlung von Gefäßerkrankungen zu schaffen.

Zusammenfassung

Diese Studie hatte zum Ziel, ein neuartiges Rattenmodell der unteren Extremitätenarteriosclerosis obliterans (ASO) bei diabetischen Ratten zu etablieren und zu validieren. Im Gegensatz zur traditionellen Femurarterienligation injizierten wir 95 % Ethanol (0,1 ml) in die äußere Iliakarterie. Postoperativ wurden arterielle Okklusion und Hintergliedmaßenischämie an den Tagen 1, 3, 7 und 14 mittels Doppler-Ultraschall, Wärmebildgebung und Messung des Nassmuskelgewichts untersucht. Eine histologische Analyse von Blutgefäßen und Muskelgeweben wurde durchgeführt, um die Erfolgsrate und Stabilität des Modells zu bewerten. Hochkonzentriertes Ethanol (95 %) induziert Schäden an den vaskulären Endothelzellen, was zu einer Okklusion der Oberschenkelarterie führt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte der Doppler-Ultraschall eine fortschreitende Verringerung des arteriellen Durchmessers und eine erhöhte Flussgeschwindigkeit in der betroffenen Gliedmaße. Die Wärmebildgebung zeigte eine versunkene Gliedmaßentemperatur, während die Muskelgewichtsmessung eine signifikante Verringerung der ipsilateralen Muskelmasse zeigte. Histopathologische Analysen bestätigten eine arterielle Lumenverschluss, eine verringerte mikrovaskuläre Dichte und eine fortschreitende Läsionsexazerbation im Laufe der Zeit. Zusammenfassend repliziert die Injektion von 95 % Ethanol in der Iliakarterie effektiv die pathophysiologischen Eigenschaften der arteriellen Verschluss der unteren Extremitäten und liefert ein neuartiges Modell zur Untersuchung von Arteriosclerosis obliterans bei diabetischen Ratten.

Einleitung

Die diabetische arterielle Okklusion der unteren Extremitäten (DLEAO) ist eine der Hauptursachen für Behinderung und Sterblichkeit bei diabetischen Patienten, beeinträchtigt die Lebensqualität stark und stellt eine erhebliche sozioökonomische Belastung dar. Die Pathogenese der diabetischen Arterienerkrankung umfasst komplexe Wechselwirkungen zwischen Hyperglykämie, Dyslipidämie, chronischer Entzündung und vaskulärer Dysfunktion². Tiermodelle waren maßgeblich daran beteiligt, diese Mechanismen aufzuklären und liefern entscheidende Erkenntnisse für die therapeutische Entwicklung. Tiermodelle dienen als wertvolle Werkzeuge zur Simulation der Pathophysiologie der peripheren arteriellen Erkrankung (PAD) bei menschlichen Diabetikern. Diese Modelle ermöglichen durchsatzfähige, reproduzierbare Studien zur Untersuchung des Krankheitsverlaufs und zur Aufklärung zugrundeliegender Mechanismen. Darüber hinaus liefern präklinische Studien mit Tiermodellen wichtige Daten für neuartige Therapeutika, darunter pharmakologische Wirkstoffe, Gentherapie und regenerative medizinische Ansätze (z. B. Stammzelltherapie)³. Solche grundlegenden Forschungen sind entscheidend, um nachfolgende klinische Studien zu informieren und die translationale Medizin voranzubringen.

Derzeit wird die Methode der Femurarterienligation (FAL) in Laboren weit verbreitet eingesetzt, um Rattenmodelle der Hintergliedmaßenischämie⁴ zu erstellen. Dieser Ansatz induziert schnell ischämische Manifestationen in den unteren Gliedmaßen⁵; die resultierende arterielle Thrombose unterscheidet sich jedoch von dem pathophysiologischen Verlauf, der bei diabetischen Patienten mit arterieller Erkrankung der unteren Extremitäten (LEAD) beobachtet wurde, welche Endothelschädigungen, die Ansammlung von Entzündungsfaktoren und die Proliferation glatter Muskelzellen^{beinhaltet 2,6}. Zusätzlich löst FAL eine schnelle Neovaskularisation und die Bildung von Kollateralgefäßen aus, wodurch kurz nach der Modellierung ^5,7 die Low-Flow-Perfusion wiederhergestellt wird. Dies steht im Gegensatz zum chronischen Fortschreiten diabetischer LEAD-Erkrankungen. Daher besteht die Notwendigkeit, ein Tiermodell zu entwickeln, das die pathophysiologischen Mechanismen der menschlichen Arteriosklerose genauer nachbildet.

In diabetischen Tiermodellen löst eine mechanische Verletzung der Femoralarterie intima mittels Ballonkatheter oder chemischer Induktion (z. B. Eisenchloridstimulation) effektiv pathologische Veränderungen aus, darunter endotheliale Dehudation, entzündliche Zellinfiltration und Migration/Proliferation^glatter Muskelzellen 8. Dieser Ansatz spiegelt die charakteristischen pathologischen Merkmale der menschlichen Arteriosklerose besser wider. Im Vergleich zum traditionellen FAL-Modell liegt der zentrale Vorteil der ethanolinduzierten Methode in ihrer Fähigkeit, den komplexen pathophysiologischen Prozess des diabetischen BLEI genauer zu simulieren. Ethanol stört direkt das vaskuläre Endothel, aktiviert die Thrombozytenaggregation und Thrombose und ahmt so das ursprüngliche Ereignis bei diabetischem LEAD⁹ nach. Noch wichtiger ist, dass Ethanol durch die schrittweise Zerstörung der vaskulären Mikrostruktur effektiv die schnelle Kollateralzirkulationskompensation im FAL-Modell vermeidet und so erfolgreich den typischen chronischen Hypoperfusionszustand des diabetischen LEAD¹⁰ repliziert. Im Gegensatz dazu weist das Modell der durch Femoralarterienligation induzierten Ischämie bemerkenswerte Einschränkungen auf: Nagetiere (z. B. Mäuse, Ratten) kompensieren die akute Ischämie schnell aufgrund ihrer gut entwickelten Kollateralzirkulation, was zu inkonsistenter ischämischer Schwere und einer schlechten Rekapitulation der menschlichen kritischen Extremitätenischämie (CLI^{) führt.} Außerdem resultiert die humane periphere arteriale Erkrankung (PAD) hauptsächlich aus dem chronischen Fortschreiten der Arteriosklerose, während das Modell der Femurarterienligation ein akutes ischämisches Ereignis darstellt – grundlegend unterschiedliche pathophysiologische Mechanismen¹³. Das Hauptziel dieser Studie war es, ein stabiles, langfristiges experimentelles Modell der diabetischen Arteriosclerosis obliterans (LEAOD) der unteren Extremitäten zu etablieren und zu charakterisieren, das den Krankheitsverlauf bei Patienten genau nachahmt. Die ethanolinduzierte Okklusion ist operativ unkompliziert und erfordert nur eine minimal invasive Injektion, die die technische Hürde und die Tiersterblichkeit reduziert. Seine Schlüsselparameter lassen sich leicht standardisieren, was eine hohe Reproduzierbarkeit gewährleistet. Darüber hinaus ist die Methode kosteneffizient, überflüssig für Spezialgeräte und leicht auf verschiedene Labore übertragbar. Derzeit fehlt es weiterhin an dauerhaften Tiermodellen zur Validierung neuartiger therapeutischer Interventionen.

Protokoll

Diese Studie wurde nach einem vom Tierethikkomitee des Yantai Yuhuangding Krankenhauses genehmigten Protokoll durchgeführt. Diese Studie nutzte 40 männliche Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht: 250-300 g, Alter: 6 Wochen), die in einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus untergebracht wurden. Ab dem Alter von 7 Wochen erhielten sie eine fettreiche, saccharosereiche Diät¹⁴^,¹⁵ ad libitum mit freiem Zugang zu Wasser für 8 Wochen. Nach 4 Wochen der Diät wurde der Diabetes durch Streptozotocin-(STZ)-Injektion¹⁶ ausgelöst. Nach 8 Wochen wurde die erfolgreiche Etablierung des diabetischen Modells bestätigt, bevor weitere Experimente durchgeführt wurden. Eine arterielle Okklusionsoperation der Hintergliedmaßen wurde an 14 Wochen alten Ratten wie unten beschrieben durchgeführt.

1. Chirurgische Induktion der Hintergliedmaßenarteriosklerose obliterans bei diabetischen Ratten

1. Bereiten Sie alle chirurgischen Instrumente und Materialien wie in der Materialtabelle aufgeführt und in Abbildung 1 dargestellt vor.
2. Betäuben Sie die Ratte mit einer Anästhesiemaschine, die Isofluran (1,5–2,5 %) und Sauerstoff (O₂, 1–2 L/min) liefert. Halten Sie während der gesamten Phase eine spontane Atmung aufrecht. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie anhand des Zehenknurfreflexes, um eine chirurgische Ebene der Anästhesie sicherzustellen.
3. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf eine Stützplattform. Entfernen Sie Haare vom Bauch bis zu den unteren Gliedmaßen mit Enthaarungscreme und einer Rasierklinge.
4. Sichern Sie die Gliedmaßen. Desinfizieren Sie die Hintergliedmaßenhaut mit Alkohol. Mache einen 2–3 cm langen Schnitt am mittleren rechten Oberschenkel mit gebogener Pinzette und Schere.
   HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe wurden von einem erfahrenen Chirurgen durchgeführt, um die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Tiermodelle sicherzustellen.
5. Unter dem Mikroskop wird das umliegende Gewebe zerlegt, um die äußere Iliakalarterie/Vene sowie den Oberschenkelnerv freizulegen. Isoliere die Gefäße und den Nerv. Verfolgen Sie die äußere Iliakarterie bis zu ihrer Verzweigung in oberflächliche und tiefe Femoralarterien.
6. Klemmen Sie das Mittelsegment der Oberschenkelarterie und die tiefe Femoralarterie mit Gefäßklammern ab. Injizieren Sie langsam 0,1 ml 95 % Ethanol in die distale äußere Iliakalarterie. Nach 60 Sekunden werden die Clips entfernt; Erreichen Sie Hämostase durch Kompression. Schließe die Wunde Schicht für Schicht.
   HINWEIS: Während der Injektion wurden eine sofortige Blassierung der Arterie und ein vorübergehendes Zittern des ipsilateralen Fußes beobachtet, was eine erfolgreiche intravaskuläre Abgabe von Ethanol bestätigte.
7. Immobilisieren Sie das betroffene Gliedmaß nicht postoperativ. Verabreichen Sie eine intramuskuläre Penicillin-Natriuminjektion (400.000 IU), um eine Infektion zu verhindern.
   HINWEIS: In diesem unilateralen arteriellen Okklusionsmodell der unteren Extremität dient die kontralaterale Gliedmaße als Kontrolle. Die Okklusionszeit wird ab 24 Stunden nach dem Eingriff berechnet.

2. Bestimmung der Temperatur der unteren Gliedmaßen

1. Betäuben Sie die Ratte und legen Sie sie in Rückenlage auf die chirurgische Plattform.
2. Rasieren Sie beide Hintergliedmaßen und positionieren Sie sie symmetrisch.
3. Messen Sie die Temperatur beider Hintergliedmaßen mit einem Infrarot-Thermografiesystem.

3. Arterieller Durchmesser und Blutflussgeschwindigkeit

1. Betäube die Ratte.
2. Bereiten Sie das Ultraschallsystem und die Sonde vor.
   1. Schalten Sie das Ultraschallgerät ein, indem Sie den Power-Knopf an der Frontplatte drücken.
   2. Wählen Sie die hochfrequente lineare Array-Sonde (z. B. 40 MHz) aus und schließen Sie sie an das System an.
   3. Tragen Sie eine großzügige Menge akustisches Kopplungsgel auf die Sondenoberfläche auf.
3. Lokalisieren Sie die oberflächliche Oberschenkelarterie.
   1. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf eine Wärmematte, um die Körpertemperatur zu halten.
   2. Rasieren Sie das Fell vom mittleren Oberschenkelbereich beidseitig, etwa 1–2 cm oberhalb des Kniegelenks, mit elektrischen Haarscheren.
   3. Setzen Sie die Sonde vorsichtig senkrecht zur Hautoberfläche über die rasierte Stelle.
   4. Stellen Sie die Sondenposition im B-Modus an, um die Oberschenkelarterie als pulsatile, echofreie röhrenförmige Struktur darzustellen.
4. Arteriellen Durchmesser messen.
   1. Friere das B-Mode-Bild ein, indem du die Freeze-Taste auf der Maschine oder der Softwareoberfläche drückst.
   2. Wählen Sie das Messwerkzeug im Bildschirmmenü aus.
   3. Verwenden Sie die Bremssattelfunktion , um den Innendurchmesser von der nahen bis zur gegenüberliegenden Wand der Arterie zu messen.
   4. Wiederholen Sie die Messung dreimal an derselben Stelle und notieren Sie den Durchschnittswert.
5. Messen Sie die Blutflussgeschwindigkeit.
   1. Schalten Sie in den Doppler-Modus der gepulsten Welle, indem Sie auf das PW-Doppler-Symbol klicken.
   2. Positioniere das Probengatter über der Mitte des Arterielumens.
   3. Stellen Sie den Dopplerwinkel mit dem Winkelkorrekturwerkzeug auf ≤ 60° ein.
   4. Drücken Sie auf Update oder Capture , um die Geschwindigkeitswellenform über mindestens drei Herzzyklen aufzunehmen.
   5. Nutzen Sie die automatisierte Nachverfolgungsfunktion der Software, um die maximale systolische Geschwindigkeit (PSV) und die enddiastolische Geschwindigkeit (EDV) zu berechnen.
   6. Speichern Sie die Daten, indem Sie auf Speichern klicken und die Ergebnisse in eine Tabellenkalkulation (z. B. CSV, Excel) exportieren.

4. Muskelgewicht

1. Nach der Tiefbetäubung wird die Ratte durch eine zervikale Verrenkung eingeschläfert.
2. Schneiden Sie die Gastrocnemius-Muskeln von beiden Hintergliedmaßen auf und erhalten Sie die Achillessehnen (Abbildung 2).
3. Setzen Sie die Muskeln sofort auf eine elektronische Waage, um das Nassgewicht zu messen.
4. Benutze die gegenseitlichen Muskeln als Kontrollen.
5. Vergleichen Sie Messungen aus vier Zeitpunkten und präsentieren Sie sie in einer Kurvengrafik.

5. Histopathologische Analyse

1. An jedem der vier Zeitpunkte können Sie eine Gruppe von Ratten schnell einschläfern.
2. Entnehmen Sie sofort die beidseitigen oberflächlichen Oberschenkelarterien.
3. Beheben Sie das arterielle Gewebe in 4% Paraformaldehyd.
4. Einbetten Sie das Gewebe in Paraffin und schneiden Sie sie mit einer Dicke von 5 μm durch.
5. Führen Sie eine Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) durch, um histopathologische Veränderungen zu untersuchen.

6. Statistische Analyse

1. Drücken Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus. Betrachten Sie statistisch signifikante Unterschiede bei einem p-Wert von <0,05.

Ergebnisse

Diese Studie nutzte intraarterielle Ethanolinjektion, um ein Modell bei diabetischen SD-Ratten zu erstellen (n = 40). Das Modell zeichnete sich durch eine Erfolgsquote von 85 % (33/40) aus, basierend auf ultraschallbasierter Bestätigung eines reduzierten kontralateralen arteriellen Durchmessers und der Blutflussgeschwindigkeit innerhalb von 14 Tagen nach der Injektion. Eine modellbezogene Sterblichkeitsrate von 8 % (5/40) wurde vorwiegend im Anfangszeitraum erfasst. Obwohl die Zytotoxizität von Ethanol ein Risiko für uns...

Diskussion

Zusammenfassend haben wir erfolgreich ein Rattenmodell der progressiven arteriellen Okklusion etabliert, das die klinischen Manifestationen bei Diabetikern genau nachahmt. Konsistente Bewertungen der Hypoperfusion der Hintergliedmaßen wurden durch Ultraschallmessungen und Muskel-Nassgewichtsmessungen über Zeiträume von mehr als zwei Wochen erreicht. Die Ligatur der Oberschenkelarterie verursachte eine oberflächliche Gefäßverschluss, während die Blutzirkulation durch das intakte tiefe Ven...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
GraphPad Version 8.0.1			RRID:SCR_002798
Telefonbasiertes Infrarotthermometer	HIKMICRO		HM-TJP10B-3AMF
Sprague-Dawley-Ratte	Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.		250 g
Ultraschallgerät	Vevo 2100