Anwendung der Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei der Analyse von Lipoprotein-Subfraktionen, die für atherosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen relevant sind

Zusammenfassung

Ziel dieses Protokolls ist es, eine auf der Polyacrylamid-Gelelektrophorese basierende Analysemethode für Lipoprotein-Subfraktionen zu entwickeln, die eine wichtige diagnostische Grundlage für die Risikobewertung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen darstellt. Es kann LDL in sieben Unterfraktionen aufteilen. LDL1 und LDL2 werden als große Partikel charakterisiert, während LDL3 bis LDL7 als kleine Partikel charakterisiert werden.

Zusammenfassung

Low-Density-Lipoprotein-Cholesterin (LDL-C) ist ein Schlüsselfaktor bei der Entwicklung von atherosklerotischen Herz-Kreislauf-Erkrankungen (ASCVD). Erhöhte LDL-C-Spiegel sind eng mit der Bildung von atherosklerotischen Plaques und dem Risiko kardiovaskulärer Ereignisse verbunden. Die Heterogenität von LDL beeinflusst jedoch maßgeblich seine Fähigkeit, Atherosklerose zu fördern. Untersuchungen deuten darauf hin, dass LDL-Partikel (Low-Density-Lipoprotein) weiter in kleine dichte LDL (sdLDL) und große schwimmfähige LDL (lbLDL) unterteilt werden können. Unter diesen dringt sdLDL mit größerer Wahrscheinlichkeit in das vaskuläre Endothel ein und weist eine stärkere oxidative Modifikationsaktivität auf, die insbesondere mit ASCVD assoziiert ist. Bei Patienten mit metabolischem Syndrom, Diabetes und Hypertriglyceridämie können die LDL-C-Spiegel normal sein, aber der Anteil an sdLDL ist erhöht, was zu einer Unterschätzung des kardiovaskulären Risikos führt. Daher ist die genaue Detektion von LDL-Subfraktionen entscheidend für die Stratifizierung des ASCVD-Risikos und die Optimierung von Interventionsstrategien.

Herkömmliche LDL-C-Nachweismethoden, wie die Friedewald-Formel und die direkte Messung, spiegeln nur den Gesamtcholesterinspiegel wider und können nicht zwischen Unterfraktionen unterscheiden. Zu den Methoden zum Nachweis von LDL-C-Subfraktionen gehören Ultrazentrifugation (UC), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Kernspinresonanz (NMR). Diese Methoden haben jedoch hohe technische Anforderungen, komplexe Operationen oder teure Geräte, was sie für einen breiten klinischen Einsatz unpraktisch macht.

Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)-Technologie trennt Lipoproteinpartikel durch den Molekularsiebeffekt und Ladungsunterschiede. Bei dieser Technik werden nicht denaturierende Gradientengelsysteme in Kombination mit speziellen Farbstoffen wie Sudan Black verwendet, die eine hohe Auflösung, hohe Reproduzierbarkeit und einfache Bedienung bieten. Die Lipoproteintypisierung mit der PAGE-Technologie kann eine umfassendere und präzisere Beurteilung des Lipoproteinspiegels der Patienten ermöglichen und so bei klinischen Behandlungsentscheidungen helfen. In diesem Artikel wurden fünf repräsentative Ergebnisse vorgestellt. Die mittlere LDL-Partikelgröße der Proben A, B, C, D, E beträgt 275,3 Å, 266,6 Å, 258,2 Å, 257,4 Å und 252,9 Å, was auf ein geringes, marginales, leichtes, mittleres bzw. schweres Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen aufgrund von Dyslipidämie hinweist.

Einleitung

Laut einem Bericht der Weltgesundheitsorganisation aus dem Jahr 2021 sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) nach wie vor die häufigste Todesursache unter den menschlichen Krankheiten. Der Bericht zeigt, dass im Jahr 2019 weltweit 17,9 Millionen Menschen an Herz-Kreislauf-Erkrankungen starben, was fast einem Drittel der weltweiten Todesfälle entspricht¹. ASCVD, eine Art von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, ist die häufigste Todesursache bei Stadt- und Landbewohnern in China und macht über 40 % aller Todesfälle aus². Atherosklerose ist eine chronisch entzündliche Gefäßerkrankung, die sowohl durch traditionelle als auch durch nicht-traditionelle Risikofaktoren verursacht^{wird 3}. Sie ist gekennzeichnet durch Lipidablagerungen in der Arterienwand⁴, fibröse Gewebewucherung und Verkalkung, die letztlich zu einer Verdickung der Gefäßwand, einer verminderten Elastizität und einer Verengung des Lumens führen. Dyslipidämie ist der bedeutendste Risikofaktor für ASCVD, wobei LDL-C ein pathogener Risikofaktor für ASCVD ist und eine entscheidende Rolle bei der ASCVD-Entwicklung spielt⁵. Zahlreiche epidemiologische Studien, Mendelsche Randomisierungsstudien und randomisierte kontrollierte Studien haben durchweg gezeigt, dass der LDL-C-Plasmaspiegel positiv mit dem Risiko für ASCVD korreliert. Die Senkung des LDL-C-Spiegels kann das Risiko für ASCVD^{senken 6}.

LDL ist das primäre Lipoprotein, das für den Transport von endogenem Cholesterin im Körper verantwortlich ist⁷. Plasma-LDL ist heterogen und besteht aus einer Vielzahl von Partikeln mit unterschiedlichen Größen, Dichten und chemischen Zusammensetzungen⁸. LbLDL-Partikel haben eine geringere Dichte und eine größere Größe, während sdLDL-Partikel eine höhere Dichte und eine kleinere Größe aufweisen. Die Heterogenität des LDL liegt seinen vielfältigen biologischen Wirkungen zugrunde⁹. LbLDL-Partikel haben einen größeren Durchmesser (≥ 25,5 nm), eine geringere Dichte (nahe 1,02 g/ml) und eine lose Morphologie, bestehend aus LDL1 und LDL2. LbLDL-Partikel enthalten einen höheren Anteil an Cholesterinestern. Es ist weniger wahrscheinlich, dass sie oxidieren oder in das vaskuläre Endothel eindringen, was sie relativ sicherer macht. Im Gegensatz dazu haben sdLDL-Partikel einen kleineren Durchmesser (< 25,5 nm)¹⁰, eine höhere Dichte (nahe 1,06 g/ml) und eine dichte Struktur, bestehend aus LDL3 bis LDL7. SdLDL-Partikel enthalten eine geringere Menge an Cholesterinester, aber höhere Triglycerid- und Apolipoprotein B (ApoB)-Spiegel im Vergleich zu lbLDL. Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften ist es wahrscheinlicher, dass sie die arterielle Endothelbarriere durchdringen. Unter dem Subendothel werden sdLDL-Partikel durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) oxidiert, um oxidiertes LDL (ox-LDL) zu ^bilden11. Ox-LDL hemmt die Aktivität der endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS), reduziert die NO-Produktion und induziert die Endothelzellen zur Expression von VCAM-1/MCP-1, wodurch die Adhäsion und Migration von Monozyten gefördert^{wird 12}. Die wandernden endothelialen mononukleären Zellen differenzieren sich zu Makrophagen, die Ochsen-LDL unbegrenzt über die Scavenger-Rezeptoren aufnehmen. Die Ansammlung von intrazellulärem Cholesterinester verwandelt sich in Schaumzellen, die die Kernbestandteile der atherosklerotischen Lipidschlieren sind. Schaumzellen sezernieren Entzündungsfaktoren wie IL-1β und TNF-α, die oxidativen Stress und Endothelschäden weiter ausdehnen und eine positive Rückkopplungsschleife bilden¹³. Es kann die Entzündung von Endothelzellen aktivieren, die Bildung von Schaumzellen fördern und das Fortschreiten von Plaque beschleunigen. Zwei große Kohortenstudien haben gezeigt, dass sdLDL-C bei der Vorhersage und Bewertung der potenziellen Risiken von ASCVD^14-15 einen höheren klinischen Referenzwert als LDL-C hat. Die herkömmliche LDL-C-Nachweismethode kann jedoch aufgrund der Einschränkungen der Methode keine Lipoprotein-Subfraktionen testen.

LDL-Partikel (LDL-P) spiegeln die Anzahl der LDL-Partikel pro Volumeneinheit des Blutes wider und dienen als Träger für LDL-Moleküle, die jeweils ein ApoB-Molekül und mehrere Cholesterinmoleküle enthalten. LDL-C stellt die Gesamtmasse des Cholesterins dar, die von diesen Partikeln transportiert wird. Der LDL-C-Spiegel wird durch die Anzahl der LDL-Partikel und die Cholesterindichte beeinflusst, die das tatsächliche Risiko möglicherweise nicht vollständig widerspiegelt¹⁶. Zum Beispiel können Patienten mit metabolischem Syndrom, Diabetes oder Hypertriglyceridämie normale LDL-C-Spiegel, aber abnormal erhöhte LDL-P-Werte haben (aufgrund kleinerer Partikel und niedrigerer Cholesteringehalt). Selbst wenn der LDL-C-Spiegel den Zielwert erreicht, kann ein hoher LDL-P-Spiegel das verbleibende kardiovaskuläre Risiko erhöhen. Studien haben gezeigt, dass LDL-P prädiktiver ist als jeder andere Parameter, der mit LDL¹⁷ zusammenhängt. Die Analyse von Lipoprotein-Subfraktionen ist entscheidend für das Verständnis der Pathogenese von ASCVD, die Bewertung des Restrisikos und die Steuerung einer präzisen Behandlung. In den letzten Jahren wurden in den nationalen Leitlinien auch LDL-Subfraktionen als Indikatoren für die Risikobewertung von ASCVD oder die Überwachung der Behandlung empfohlen¹⁸.

ASCVD ist weltweit die häufigste Todesursache. Seine Präventions- und Kontrollstrategien hängen stark vom Lipidmanagement ab. Derzeit stützt sich das Screening von Personen mit Dyslipidämie in der klinischen Praxis hauptsächlich auf traditionelle vier Lipidtests, darunter Triglyceride (TG), Gesamtcholesterin (TC), High-Density-Lipoprotein-Cholesterin (HDL-C) und LDL-C. Darüber hinaus werden andere Lipidmarker wie Lipoprotein (a), Apolipoprotein A1 (ApoA1) und ApoB hauptsächlich für Hochrisikopopulationen von ASCVD¹⁹ verwendet, wie z. B. Diabetiker, Bluthochdruckpatienten und Raucher oder solche, deren LDL-C-Spiegel kontrolliert wurde, aber immer noch ein hohes Risiko darstellen.

Im Laufe der Forschung sind die Grenzen traditioneller Lipidtests immer deutlicher geworden, insbesondere bei der Wirksamkeit der Frühwarnung und der Erklärung des Restrisikos. Bei einer beträchtlichen Anzahl von ASCVD-Patienten werden zunächst normale Lipidwerte diagnostiziert, so dass LDL-C für die Primärwarnung unwirksam ist. Epidemiologische Daten zeigen, dass etwa 20 % der Patienten mit akutem Koronarsyndrom bei der Aufnahme LDL-C-Spiegel im normalen Bereich (<3,4 mmol/L) aufweisen, was darauf hindeutet, dass herkömmliche Lipidtests Hochrisikopersonen übersehen können. Darüber hinaus können ASCVD-Patienten auch nach Erreichen der LDL-C-Ziele immer noch einem hohen kardiovaskulären Restrisiko ausgesetzt sein. Bei diesen Patienten können die meisten verbleibenden Koronararterienereignisse nicht durch eine Senkung des LDL-C-Spiegels erklärt werden. Daher erfüllen einfache LDL-C-Tests möglicherweise nicht vollständig die klinischen Anforderungen an die Diagnose und Behandlung von ASCVD, da routinemäßige Lipidtests nicht zwischen lbLDL-C und sdLDL-C unterscheiden können.

Mehrere Studien haben eine klare Korrelation zwischen Lipoprotein-Subfraktionen und ASCVD bestätigt. Abnorme Ergebnisse von Lipoprotein-Subfraktionstests können als Warnung für die Primärprävention von ASCVD bei Personen mit normalen Lipidspiegeln dienen und helfen, versteckte Hochrisikogruppen zu identifizieren. Für die Sekundärprävention von ASCVD, bei der die LDL-C-Spiegel bereits innerhalb des Zielbereichs liegen, können Lipoprotein-Subfraktionstests helfen, das Restrisiko zu bewerten und die weitere Behandlung zu leiten²⁰. Daher wird erwartet, dass der Nachweis neuartiger LDL-Subfraktionen im Vergleich zu herkömmlichen Lipidtests neue Ziele für die Prävention und Behandlung von Dyslipidämie und ASCVD liefern wird.

Das Detektions- und Analysesystem in unserem Labor verwendet PAGE in erster Linie zur Trennung von Lipoprotein-Subfraktionen anhand ihrer Größe und Ladung. Lipoproteinpartikel werden hauptsächlich nach Größe getrennt, da die Polyacrylamidmatrix durch PAGE molekular gesiebt wird. Kleine Moleküle wandern schnell, während große Moleküle durch sterische Obstruktion behindert werden und langsam wandern. Und je mehr Ladung ein Molekül trägt, desto schneller wandert es. Mit dieser Methode können Lipoproteine schnell in zwölf Unterfraktionen unterteilt werden. LDL wird in sieben Unterfraktionen unterteilt, die als LDL1 bis LDL7 bezeichnet werden. Sie alle haben unterschiedliche Größen, Dichten, physikalisch-chemische Eigenschaften, Stoffwechselverhalten und atherosklerotisches Potenzial. LDL1 und LDL2 werden als lbLDL klassifiziert, während LDL3 bis LDL7 als sdLDL kategorisiert werden. Zu den Techniken zum Nachweis von Lipoprotein-Subfraktionen gehören UC, HPLC und NMR. Aufgrund der hohen Anforderungen an die Ausrüstung, der komplexen Bedienung und des Zeitaufwands ist ihre klinische Anwendung jedoch relativ begrenzt²¹. Die PAGE-Methode trennt effizient verschiedene Unterfraktionen von LDL und ist damit im Vergleich zu anderen Techniken benutzerfreundlicher. Die verwendeten Geräte sind kostengünstig und tragbar und eignen sich daher besser für den breiten Einsatz in klinischen Routinelaboren. Diese Studie zielt darauf ab, PAGE als schnelle, kostengünstige Methode für die LDL-Subfraktionsanalyse in Serumproben zu validieren, um die klinische Entscheidungsfindung zu unterstützen.

Protokoll

Alle Proben in dieser Studie werden vom Ethikprüfungsausschuss des Volkskrankenhauses der Provinz Guangdong bewertet und genehmigt (Zulassungsnummer: KY2025-435-01). Alle Teilnehmer unterschrieben vor dem Experiment eine schriftliche Einverständniserklärung.

1. Vorbereitung des Kits

1. Vorbereitung des Gelpuffers
   1. Zubereitung von 30% Acrylamid (ACR): Wiegen Sie 30 g Acrylamid, fügen Sie 80 mL deionisiertes Wasser hinzu, rühren Sie um, um es aufzulösen, und stellen Sie es auf 100 mL ein. Bis zur Verwendung bei 4 °C im Dunkeln lagern.
   2. Zubereitung von 1% Bisacrylamid (BIS): Wiegen Sie 1 g Bisacrylamid, fügen Sie 80 mL deionisiertes Wasser hinzu, rühren Sie um, um es aufzulösen, und stellen Sie es auf 100 mL ein. Bis zur Verwendung bei 4 °C im Dunkeln lagern.
   3. Zubereitung von 25 % Saccharose: 25 g Saccharose abwiegen, 70 mL deionisiertes Wasser hinzufügen, zum Auflösen umrühren und für die Lagerung bei 4 °C auf 100 mL einstellen.
   4. Herstellung von 10% Ammoniumpersulfat (APS): 0,1 g Ammoniumpersulfat in 1 mL entionisiertem Wasser auflösen und sofort verwenden.
   5. Zubereitung von 1M Tris (pH = 6,8): Wiegen Sie 121,14 g Trishydroxymethylaminomethan, fügen Sie 800 mL deionisiertes Wasser hinzu, rühren Sie um, um sich aufzulösen, und stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 ein, dann auf 1000 mL auffüllen.
   6. Zubereitung von 1M Tris (pH = 8,6): Wiegen Sie 121,14 g Trishydroxymethylaminomethan, fügen Sie 800 mL deionisiertes Wasser hinzu, rühren Sie um, um sich aufzulösen, und stellen Sie den pH-Wert auf 8,6 ein, dann auf 1000 mL auffüllen.
      HINWEIS: Tragen Sie beim Umgang mit Acrylamid Butylkautschukhandschuhe, eine Schutzbrille, Schutzkleidung und arbeiten Sie in einem Abzug. Bei Hautkontakt sofort mit Wasser und Seife waschen und dann einen Arzt aufsuchen. Bei Einatmen an die frische Luft gehen.
2. Herstellung des Trenngels
   1. Nehmen Sie ein sauberes Glasröhrchen und versiegeln Sie die untere Schicht mit einer Siegelfolie.
   2. Geben Sie nacheinander 8,29 ml 30 % ACR, 17,76 ml 1 % BIS, 10 ml 25 % Saccharose, 1 ml 10 % APS, 10 ml 1 M Tris (pH = 8,6), 0,1 ml Tetramethylethylendiamin (TEMED) und 32,85 ml deionisiertes Wasser nacheinander in ein sauberes Becherglas. Gut mischen, um 80 mL Mutterlauge (mit einer Polyacrylamidkonzentration von 3,3%) zu erhalten, und mit 1,2 mL pro Wurzel in das Glasröhrchen geben. Polymerisieren Sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur und versiegeln Sie die Flüssigkeit mit gereinigtem Wasser, um eine ebene Flüssigkeitsoberfläche zu gewährleisten.
3. Herstellung von konzentriertem Klebstoff
   1. 4,07 ml 30 % ACR, 3,05 ml 1 % BIS, 5 ml 25 % Saccharose, 0,5 ml 10 % APS, 5 ml 1 M Tris (pH = 6,8), 0,05 ml TEMED und 32,33 ml entionisiertes Wasser nacheinander in ein sauberes Becherglas geben, gut mischen, um 50 ml Mutterlauge (mit einer Polyacrylamidkonzentration von 3,05 %) zu erhalten. In das Glasröhrchen mit 0,2 mL pro Wurzel geben. Polymerisieren Sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur und versiegeln Sie die Flüssigkeit mit gereinigtem Wasser, um eine ebene Flüssigkeitsoberfläche zu gewährleisten.
4. Zubereitung der Konservierungslösung
   1. Wiegen Sie 6,4 g Tris, 75 g Saccharose, 2,5 ml Glycerin und 0,3 ml PC-300 (antibakterielles Konservierungsmittel) und fügen Sie 800 ml deionisiertes Wasser hinzu, rühren Sie um, um es aufzulösen, stellen Sie den PH-Wert auf 6,8 ein und verdünnen Sie es schließlich auf 1000 ml. Die Konzentration von Tris-HCl beträgt etwa 52 mM.
5. Herstellung der Sudan-Schwarzfärbelösung
   1. Wiegen Sie 0,03 g Sudan Black und lösen Sie es in einer Mischung aus 2 mL Ethylenglykol, 6 mL wasserfreiem Ethanol und 2 mL Dimethylsulfoxid auf. Nach der Filtration in 1 mL pro Durchstechflasche aufteilen.
      HINWEIS: Tragen Sie beim Umgang mit Sudan-Schwarz und Dimethylsulfoxid Nitrilhandschuhe und eine Schutzbrille, um direkten Kontakt zu vermeiden. Der Betrieb muss in einer belüfteten Umgebung durchgeführt werden. Haut und Augen nach der Exposition sofort mit Wasser abspülen und gegebenenfalls einen Arzt aufsuchen.
6. Innere Verpackung
   1. Komplette Verpackung gemäß den Anforderungen an die Zusammensetzung des Kits.

2. Zusammenstellung des Kits

1. Stellen Sie sicher, dass das Produkt vorgefertigte Säulen, Konservierungslösung und Sudan-Schwarzfärbelösung enthält. Die vorgefertigten Säulen sollten Acrylamid, Bisacrylamid, Saccharose, Ammoniumpersulfat, Tris und Tetramethylethylendiamin enthalten. Die Länge der vorgefertigten Säule beträgt 75 ± 0,5 mm, der Innendurchmesser 5,5 ± 0,02 mm und der Außendurchmesser 7,0 ± 0,02 mm. Die Konservierungslösung sollte Tris, Saccharose, Glycerin und Konservierungsstoffe enthalten. Die Sudan-Schwarz-Färbelösung sollte Sudan-Schwarz, Ethylenglykol, wasserfreies Ethanol und Dimethylsulfoxid enthalten. Stellen Sie sicher, dass die Verpackungsspezifikationen je nach Anzahl der vorgefertigten Säulen unterschiedlich sind. Eine Portion Reagenz muss eine vorgefertigte Säule haben. Kombinieren Sie keine Reagenzien-Kits mit verschiedenen Chargen, da dies die Versuchsergebnisse beeinträchtigen kann.

3. Vorbereitung der Probe

1. Patientenvorbereitung: Stellen Sie sicher, dass der Patient bei der Entnahme von Blutproben auf nüchternen Magen ist.
2. Verwenden Sie Serumtrenngel-Probenahmeröhrchen und führen Sie die Probenentnahme gemäß der Standardarbeitsanweisung durch. Das Blut muss so bald wie möglich nach der Blutentnahme getrennt werden, um eine Hämolyse zu vermeiden.
3. Testen Sie die Serumproben nach der Trennung so bald wie möglich bei Raumtemperatur. Wenn eine sofortige Untersuchung nicht möglich ist, lagern Sie die Proben bis zu 7 Tage bei 2-8 °C oder bis zu 30 Tage bei -20 °C.
4. Bringen Sie die Proben wieder auf Raumtemperatur und mischen Sie sie vor der Verwendung vollständig, insbesondere bei gefrorenen und aufgetauten Proben. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist nicht zulässig, da dies die Integrität der Probe beeinträchtigen kann. Sowohl Lipämie- als auch Hämolyseproben können die Testergebnisse beeinflussen. Wenn es sich um eine leichte Lipämie oder Hämolyseprobe handelt, wird empfohlen, eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation bei 14.462 x g bei Raumtemperatur für 15 Minuten durchzuführen. Verwenden Sie für Lipämieproben eine Pipette, um die gesamte klare Schicht von unten abzusaugen. Für Hämolyseproben ist der Überstand zu entnehmen. Dann in ein neues Zentrifugenröhrchen umfüllen und färben. Ist die Lipämie oder Hämolyse jedoch sehr stark, empfiehlt es sich, erneut Blut abzunehmen.

4. Schritte zur Bedienung

1. Präparat
   1. Nehmen Sie vorgefertigte Säulen und Proben zum Testen heraus. Verwenden Sie eine Pipette, um die restliche Konservierungsflüssigkeit aus dem Probenanschluss der vorgefertigten Säulen zu aspirieren. Balancieren Sie vorgefertigte Säulen und Proben auf Raumtemperatur und lösen Sie 14,3 g elektrophoretisches Pufferpulver mit 800 mL deionisiertem Wasser auf.
2. Färben
   1. Nehmen Sie saubere Zentrifugenröhrchen und nummerieren Sie sie. Die Anzahl der Röhrchen stimmt mit der Reihenfolge der Blutentnahmeröhrchen überein. Geben Sie die Zentrifugenröhrchen mit einem Verhältnis von 50 μl Probe zu 10 μl Sudan-Schwarzfärbelösung hinzu, mischen Sie sie gut und lassen Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen, um sie zu färben.
      HINWEIS: Das Färbeprinzip von Sudan Black beruht auf seiner lipophilen Eigenschaft. Es kann spezifische chromogene Reaktionen mit Lipidsubstanzen wie neutralen Fetten, Phospholipiden und Steroiden innerhalb der Zellen induzieren, was zu bräunlich-schwarzen oder dunkelschwarzen Partikeln führt. In diesem System haben wir die Färbezeit und -dosierung durch ein einfaktoriges Versuchsdesign mit dem folgenden Protokoll optimiert. Es werden drei LDL-C-Serumproben (hohe, mittlere und niedrige Konzentrationen) mit entsprechenden Färbevolumina von 5 μl, 10 μl, 15 μl bzw. 20 μl ausgewählt. Die Färbedauer ist auf 10 Minuten, 15 Minuten, 20 Minuten, 25 Minuten, 30 Minuten, 35 Minuten, 45 Minuten und 60 Minuten festgelegt. Es werden elektrophoretische Experimente durchgeführt, gefolgt von einer Graustufenanalyse der elektrophoretischen Banden, um die Wirksamkeit der Färbung zu überprüfen. Die optimalen Bedingungen betragen 10 μl Färbevolumen mit 30 min ± 5 min Färbedauer. Ein geringeres Färbevolumen und eine geringere Färbedauer führen zu schwach gefärbtem Lipoprotein-Cholesterin. Während die optimalen Bedingungen ein Gleichgewicht erreicht haben, sind ein höheres Färbevolumen und eine höhere Färbedauer nicht erforderlich.
3. Ionophortische Trennung
   1. Setzen Sie die vorbalancierten Säulen in die Gummibuchse des Elektrophoresebehälters ein. Die Probenöffnung der Gelsäule ist ca. 2 cm vom Gummistopfen entfernt. Stellen Sie sicher, dass es fest verschlossen ist und keine Leckagen auftreten. Wenn die Anzahl der Probengelsäulen nicht voll ist, füllen Sie den leeren Raum mit einem lochlosen Gummistopfen.
   2. Gießen Sie dann Elektrophoresepuffer in den oberen und unteren Tank. Entfernen Sie die Blasen an der Mündung von vorgefertigten Säulen. Geben Sie 25 μl gefärbte Proben in den Probenanschluss der vorgefertigten Säulen.
   3. Decken Sie den Deckel ab, schließen Sie den Netzschalter an und stellen Sie die Parameter für Spannung (U = 100 V), Strom (I = 3 mA/Röhre), Leistung (P = 120 W) und Zeit (T = 70 min) für die Elektrophoresetrennung ein.
      HINWEIS: Spannung, Leistung und Zeit sind feste Parameter. Der Strom muss entsprechend der Anzahl der Prüfmuster eingestellt werden (z. B. 10 Probenröhrchen, I = 3 mA x 10 Rohre = 30 mA).
   4. Schalten Sie nach Abschluss der Elektrophorese das Gerät aus, nehmen Sie den Deckel ab und gießen Sie Elektrophoresepuffer auf den oberen Teil des Elektrophoresegeräts. Nehmen Sie die Gelsäulen der Reihe nach heraus und legen Sie sie auf den Fixierrahmen, gießen Sie den überschüssigen Elektrophoresepuffer auf die Oberseite und analysieren Sie im Scanning-Analysesystem.
4. Scanning-Analyse
   HINWEIS: Der Typ des Analysators ist DY-03 und die Scan-Software ist KBL 3.3.9 GD.
   1. Schalten Sie den Netzschalter des Scan-Analysegeräts ein, doppelklicken Sie auf die Desktop-Systemsoftware, und klicken Sie auf Sammlung , um die Softwareoberfläche aufzurufen. Klicken Sie in der Softwareoberfläche auf Probentablett exportieren und platzieren Sie die Gelsäulen mit dem Probenende zum Inneren des Geräts hin auf das Probenrack. Stellen Sie sicher, dass die Gelsäulen an den entsprechenden nummerierten Positionen platziert sind. Die Positionen 25 und 26 sind nur für die Qualitätskontrolle vorgesehen.
   2. Klicken Sie auf der Softwareoberfläche auf Probenfach importieren , um das Probenfach in das Gerät zu importieren. Klicken Sie auf Scannen , um Beispiel-Scanbilder zu erhalten. Das Gerät verfügt über ein eingebautes Autofokus-System. Es passt automatisch den Fokus zwischen dem Scanmodul und dem Gelröhrchen an, um eine klare Bildgebung zu gewährleisten. Die Software erkennt automatisch die Ausgangsposition (VLDL) und die Endposition (HDL) des Elektrophorogramms. Wenn an diesen Positionen offensichtliche Peaks erkannt werden, sperrt sich die Software auf den vorgesehenen Analysebereich für die spektrale Analyse.
   3. Nachdem Sie die Patienteninformationen eingegeben und den Barcode gescannt haben, klicken Sie in der Softwareoberfläche auf Analyse und Verarbeitung , das System analysiert und generiert automatisch Testberichte. Klicken Sie auf LIS hochladen , um Testberichte an das LIS-System zu übertragen.
   4. Nehmen Sie vorgefertigte Säulen nach dem Scannen und Analysieren heraus und behandeln Sie sie gemäß den Vorgaben für medizinische Abfälle.

5. Qualitätskontrolle

1. Führen Sie vor der täglichen Stichprobenprüfung einen Qualitätskontrolltest in zwei Stufen durch. Die Arbeitsschritte des Qualitätskontrolltests sind die gleichen wie bei einem Stichprobentest. Die Referenz des Typs A ist der durchschnittliche Partikeldurchmesser von mehr als 268 Å. Die Referenz des Typs B ist der durchschnittliche Partikeldurchmesser von weniger als 265 Å.
   HINWEIS: Ergebnisanalyse: TYP A, die mittlere LDL-Partikelgröße beträgt > 268 Å, LDL1 und LDL2 machen mehr aus, was auf ein geringes Risiko für CVD hinweist. TYPE INTERMEDIATE (TYPE INT) beträgt die mittlere LDL-Partikelgröße 265 bis 268 Å, was darauf hindeutet, dass das Verhältnis von LDL3 zu LDL7 über dem kritischen Wert liegt. TYP B, die mittlere LDL-Partikelgröße beträgt < 265 Å, LDL3 bis LDL7 machen mehr aus, was auf ein hohes Risiko für CVD hinweist.

6. Technische Verbesserungen

1. Um genaue diagnostische Ergebnisse zu gewährleisten, sollten die folgenden technischen Verbesserungen implementiert werden.
   1. Voruntersuchung: Stellen Sie sicher, dass die Patienten vor der Blutentnahme vollständig nüchtern sind. Verwenden Sie Serum- oder EDTA-Antikoagulans-Plasma anstelle von Heparin-Antikoagulans-Plasma. Stellen Sie sicher, dass die Pipette genau aufgenommen wird. Vermeiden Sie schwere chyöse oder hämolytische Proben.
   2. Während der Untersuchung: Stellen Sie die Elektrophoreseparameter der Spannung (U = 100 V), des Stroms (I = 3 mA/Röhre), der Leistung (P = 120 W), der Zeit (T = 70 min) gemäß den Standardprotokollen ein. Tragen Sie sterile Handschuhe, um eine Kontamination der Glasröhren zu vermeiden, die die Fähigkeit zum Fotografieren und Scannen beeinträchtigen könnte.
   3. Nach der Untersuchung: Überprüfen Sie bei der Erstellung von Berichten abnormale Chromatogramme auf mögliche Interferenzen und führen Sie eine erneute Analyse durch, um falsche diagnostische Schlussfolgerungen zu vermeiden.
      1. Das Normalchromatogramm: An der Ausgangsposition von VLDL und an der Endposition von HDL haben beide einen deutlichen Peak (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse).
      2. Das Anomalie-Chromatogramm: In der Anfangsposition von VLDL oder der Abschlussposition von HDL gibt es keinen oder mehr als einen Peak.

Ergebnisse

Ziel dieser Studie ist es, eine Methode zu entwickeln, die PAGE zum Nachweis von Lipoprotein-Subfraktionen im Serum der Teilnehmer verwendet. Ziel ist es, festzustellen, ob es sich bei den LDL-C-Subfraktionen primär um große Partikel (LDL1 und LDL2) oder kleine Partikel (LDL3 bis LDL7) handelt. Nach der Färbung mit Sudanschwarz werden die Proben mit dem Elektrophoresegerät in einem Polyacrylamidgel getrennt. Die Lipoproteine werden dann in verschiedene Banden innerhalb der Gelröhrchen getrennt, und die Subfraktionsanalys...

Diskussion

Obwohl die Rolle von sdLDL als kardiovaskulärer Risikofaktor bei der Entwicklung von Atherosklerose durch die Forschung bestätigt wurde, gibt es derzeit keine etablierte Methode zur Identifizierung von LDL-Subfraktionen. In den letzten Jahrzehnten wurden erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung von Nachweismethoden für LDL-Subfraktionen erzielt. UC gilt als Goldstandard. Es kann LDL-Unterfraktionen anhand ihrer Dichteunterschiede trennen und mit hoher Auflösung zwischen sdLDL und lbLD...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Elektrophoretisches Pufferpulver	Guangxi Kangbolai Technologieunternehmen	25030401	Zur Herstellung von Pufferlösungen und zur Bereitstellung von Elektrophoresebedingungen
Hochwertige Produkte für die Qualitätskontrolle	Guangxi Kangbolai Technologieunternehmen	25030301	Zur Überwachung von Genauigkeit und Präzision
Lösung zur Trennung der Lipoprotein-Probendichte (Gradientengelelektrophorese)	Guangxi Kangbolai Technologieunternehmen	LSS60-SB1-A1  25030301	Zur Trennung von Lipoprotein-Subtyp-Komponenten aus Serumproben
Produkte zur Qualitätskontrolle mit geringem Wert	Guangxi Kangbolai Technologieunternehmen	25030301	Zur Überwachung von Genauigkeit und Präzision
Sudan schwarze Färbelösung	Guangxi Kangbolai Technologieunternehmen	LSS60-SB1-A1  25030301	Für die Probenfärbung