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Methodenartikel

Integration der Netzwerkpharmakologie zur Untersuchung der schützenden Wirkung von Cinnamaldehyd gegen Oxaliplatin-induzierte Neurotoxizität

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DOI:

10.3791/69013

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28. November 2025

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1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Medical Oncology, Cancer Hospital of China Medical University, Cancer Hospital of Dalian University of Technology, Liaoning Cancer Hospital & Institute, 2China Medical University, 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht die schützenden Wirkungen von Cinnamaldehyd (CA) gegen durch Oxaliplatin (OXA)-induzierte Schäden in Ratten-Dorsalwurzelganglionzellen (DRG). Der zugrunde liegende Mechanismus besteht in der Unterdrückung des JAK2/STAT3-Signalwegs und der Aktivierung des SLC7A11-GSH-GPX4-Weges, wie durch Netzwerkpharmakologie und experimentelle Validierung nachgewiesen wurde.

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht die schützenden Wirkungen von Cinnamaldehyd (CA) gegen durch Oxaliplatin (OXA)-induzierte Schäden in Ratten-Dorsalwurzelganglionzellen (DRG). Die pharmakologischen Aktivitäten von CA wurden analysiert, und seine potenziellen Ziele sowie die seiner Metaboliten wurden mithilfe der Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), der Integrative Pharmacology-basierten Network Computational Research Platform of Traditional Chinese Medicine (TCMIP) und den PharmMapper-Plattformen identifiziert. Der CCK-8-Test wird verwendet, um die optimalen Konzentrationen von Medikamenten zu bestimmen, während Malondialdehyd-(MDA)-Tests zur Bestimmung des Lipidperoxidationsgehalts eingesetzt werden. Die intrazellulären Spiegel von Fe2+ und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wurden mittels fluoreszierender Sonden quantifiziert. Der Einfluss von CA auf die Proteinexpressionsniveaus, einschließlich p-STAT3, XCT und GPX4, in OXA-behandelten DRG-Zellen wurde mittels Immunoblotting untersucht. Die pharmakologische Analyse des Netzwerks identifizierte 14 sich überlappende Ziele unter "CA-neuropathischen Schmerzen (NP)-Ferroptose". Experimentelle Ergebnisse zeigten, dass eine 24-stündige Behandlung mit 4,0 μmol/L CA optimale Effekte erzielte und die MDA-,Fe-2+- und ROS-Spiegel in DRG-Zellen signifikant reduzierte (P < 0,05). Darüber hinaus senkte die CA-Behandlung die Expression von JAK2, STAT3, p-STAT3, TFRC, ErbB-1 und Nuclear Factor-kappa B (NF-κB) (P < 0,05), während die XCT-, GPX4- und FTH1-Expression (P < 0,05) hochreguliert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CA durch OXA-induzierte Schäden in DRG-Zellen mindert, indem es den JAK2/STAT3-Signalweg hemmt und die SLC7A11-GSH-GPX4-Achse aktiviert.

Einleitung

In den letzten Jahren wurde nachgewiesen, dass Ferroptose als nicht-apoptotischer Zelltodsmodus an den durch verschiedene Chemotherapeutika verursachten Gewebeschäden beteiligt ist. Der Kernmechanismus der Ferroptose ist die Ansammlung eisenabhängiger Lipidperoxidationsprodukte1. Forschungen zu den Mechanismen der Cisplatin-Neurotoxizität zeigen, dass dieses Medikament neuronale Ferroptose über mehrere Wege induziert, wobei dieser Prozess direkt mit der Entwicklung von Neurotoxizität verknüpft ist. Konkret hemmt Cisplatin die Aktivität der Glutathionperoxidase 4 (GPX4). Als kritisches "Bremsmolekül" bei der Ferroptose verhindert die Inaktivierung von GPX4 die Entfernung von Lipidhydroperoxiden (L-OOH) und verursacht dadurch oxidative Schäden an neuronalen Zellmembranen2. Gleichzeitig kann Oxaliplatin die Freisetzung von Ferroptose in Nervenzellen fördern und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) durch die Fenton-Reaktion verstärken, wodurch die Ferroptosikaskade3 weiter verstärkt wird. Diese Belege deuten darauf hin, dass eine gezielte Regulation der Neurodegeneration eine mögliche Strategie sein könnte, um die Neurotoxizität von Oxaliplatin zu lindern.

Oxaliplatin (OXA), ein weit verbreitetes platinbasiertes Chemotherapeutium der dritten Generation bei Darmkrebs, bietet eine starke antitumorale Wirksamkeit, wird jedoch häufig mit erheblicher neurotoxischer Aktivität in Verbindung gebracht. Chronische Verabreichung führt häufig zu OXA-induzierten neuropathischen Schmerzen (OINP) mit einer Inzidenzrate von bis zu 60 %, gekennzeichnet durch mechanische Allodynie, thermische Hyperalgesie und Kälteüberempfindlichkeit5. Trotz seiner Verbreitung bleiben die aktuellen Behandlungsstrategien für OINP unzureichend, was die Lebensqualität der Patienten erheblich verringert. Daher bleiben die Aufklärung der molekularen Mechanismen hinter OINP und die Identifizierung neuartiger therapeutischer Ziele weiterhin zentrale Forschungsbereiche6.

Cinnamaldehyd (CA), der primäre Wirkstoff des ätherischen Zimtöls, ist eine gelbe, zähflüssigeFlüssigkeit 7,8 mit vielfältigen biologischen Aktivitäten, darunter insektizide 9, antimikrobielle10, antimykotische11, antioxidative12, antidiabetische13, krebshemmende14, entzündungshemmende und neurovaskuläre Schutzwirkungen15,16. Neue Hinweise deuten darauf hin, dass CA die Aktivierung des JAK/STAT-Signalwegs17 hemmen könnte. Die chemische Formel von CA ist C9H8O, und ihre chemische Struktur ist in Abbildung 1 dargestellt. Als natürlicher Monomer der traditionellen chinesischen Medizin zeigt CA ein breites Spektrum pharmakologischer Aktivitäten. Im Hinblick auf die Neuroprotektion haben mehrere Studien bestätigt, dass CA über die Blut-Hirn-Schranke ins zentrale Nervensystem gelangen kann, die Expression von antioxidativen Enzymen (wie HO-1 und NQO1) fördern kann, indem es den Nrf2/ARE-Signalweg aktiviert, die Ansammlung von ROS in Nervenzellen reduzieren und somit die neurooxidativen Schäden beim ischämischen Schlaganfall lindern kann. Alzheimer und andere Krankheiten18,19. Gleichzeitig kann CA die Hyperaktivierung der Mikroglia hemmen, die Freisetzung von Entzündungsfaktoren (wie TNF-α, IL-1β) reduzieren und die neuroinflammatoriskeReaktion 20 reduzieren. Es wurde jedoch nicht berichtet, ob CA die durch Oxaliplatin induzierte Neurotoxizität durch die Regulation des Ferroptosiswegs lindern kann.

Der JAK2/STAT3-Signalweg ist ein wichtiger intrazellulärer Signaltransduktionsmechanismus, der Signale, die an der Zellmembran empfangen werden, an den Zellkern überträgt und eng mit wichtigen biologischen Prozessen wie Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose, oxidativem Stress und entzündlichen Reaktionen verbunden ist21. Als ein eng mit entzündlicher Reaktionen verbundener Weg kann der JAK3/STAT3-Signalweg im aktivierten Zustand entzündliche Reaktionen auslösen, was zu entzündlichen Gewebeschäden führt. Studien zeigen, dass die Hemmung des JAK3/STAT3-Signalwegs die Entzündungsreaktion und oxidative Schäden bei Ratten mit vaskulärer Demenz reduzieren kann und so die kognitive Funktion der Ratten verbessert22. Darüber hinaus kann die Hemmung des JAK3/STAT3-Signalwegs auch die Entzündungsreaktion bei epileptischen Ratten lindern, die Rate neuronaler Apoptose verringern und Hirnschädenabmildern. Obwohl Koffeinsäure (CA) eine gewisse schützende Wirkung auf das Nervensystem hat, ist derzeit nicht eindeutig geklärt, ob ihr Verbesserungseffekt mit der Regulation des JAK3/STAT3-Signalwegs zusammenhängt.

Diese Studie zielt darauf ab, zu validieren, ob die in-vitro-Hemmung der JAK2/STAT3-Signalübertragung und die Aktivierung der LC7A11-GSH-GPX4-Achse OXA-induzierte Schäden in Ratten-DRG-Zellen mindern können. Darüber hinaus untersucht es die potenziellen antiferroptotischen Effekte von CA und untersucht die Rolle der durch Netzwerkpharmakologie identifizierten Schlüsselziele bei der Modulation von Entzündungen in DRG-Zellen.

Aktuelle therapeutische Ansätze für Oxaliplatin-induzierte Neurotoxizität konzentrieren sich hauptsächlich auf das Chelatieren freier Platinionen zur Minderung von Nervenschäden, wie zum Beispiel durch die Verwendung von Calcium-Magnesium-Komplexen, mit dem Hauptziel, akute periphere Neuropathien (z. B. Taubheit und Kribbeln in Händen und Füßen) zu lindern24. Die genauen Mechanismen bleiben jedoch unklar. Diese Behandlungen sind nicht in der Lage, chronische Erkrankungen wie axonale Degeneration und durch Oxaliplatin verursachte Nervenfaserverschlechterung rückgängig zu machen, und zeigen nur begrenzte Wirksamkeit bei der Verhinderung kumulativer Neurotoxizität. In diesem Experiment wurde die neuroprotektive Wirkung von 4 μM CA unter 5 μM OXA-Behandlung durch Kombination von entzündungshemmenden und antiferroptose-Mechanismen untersucht. Die Ergebnisse bestätigen, dass die Aktivierung dieses Mechanismus als entscheidender einleitender Schritt bei OINP dient. Die Entdeckung spezifischer Inhibitoren könnte die bestehenden unspezifischen Ansätze ersetzen und somit sowohl die Präzision als auch die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen erhöhen.

Das in vitro verwendete Modell bezieht isolierte Ratten-Dorsalwurzelganglion-(DRG)-Neuronen zur Untersuchung von OINP. Dieses Modell unterscheidet sich jedoch erheblich von menschlichen Primärzellen in genetischem Hintergrund, metabolischen Eigenschaften und Toxizitätssensitivität, was es schwierig machen kann, Forschungsergebnisse klinisch direkt anzuwenden. Darüber hinaus beruht die funktionelle Erhaltung von in vivo neuronalen Geweben auf einer präzisen Regulation der mehrzelligen Koordination und dynamischer Mikroumgebungen – komplexen Faktoren, die in vitro Modellen nur schwer vollständig replizierbar sind.

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Protokoll

HINWEIS: Die Zelllinie wurde von Rattenzelllinien abgeleitet.

1. Netzwerkpharmakologische Analyse

HINWEIS: Die Links sind in der Materialtabelle zu finden.

  1. Mögliche Ziele von CA finden
    1. Strukturelle Informationen aus der PubChem-Datenbank abrufen und die potenziellen biologischen Mechanismen von CA untersuchen. Anschließend führen Sie die Zielvorhersageanalyse mit SwissTargetPrediction durch und nutzen dabei dessen fortschrittliche Rechenfähigkeiten.
    2. Um die Genauigkeit und Vollständigkeit der Analyse zu erhöhen, vergleichen Sie die vorhergesagten Ziele mit spezifischen Datenbanken zur traditionellen chinesischen Medizin, einschließlich TCMSP und TCMIP.
    3. Überprüfen Sie die relevante Literatur, um weitere potenzielle Ziele zu identifizieren. Duplizieren Sie die konsolidierte Zielliste, um einen umfassenden Datensatz zu erstellen, der als wichtige Referenz für weitere biologische Aktivitätsstudien und Arzneimittelentwicklung mit CA dient.
  2. Identifikation potenzieller Ziele neuropathischer Schmerzen (NP)
    1. Führen Sie durch die Nutzung der GeneCards-Datenbank und der TTD-Datenbank eine umfangreiche Suche mit den Schlüsselwörtern "neuropathischer Schmerz" und "Ferroptose" durch. Priorisieren Sie die Genziele aus der GeneCards-Datenbank mit einem "Relevanzscore", der den Median übersteigt, da diese Gene eine höhere Relevanz für den Forschungsschwerpunkt aufweisen.
    2. Integrieren Sie die zuvor ausgewählten Genziele mit Daten, die aus der TTD (Therapeutic Target Database) abgerufen werden. Sicherstellen Sie eine umfassende Identifikation potenzieller Ziele während des Integrationsprozesses, indem alle ausgewählten Genziele mit TTD-Datenbankeinträgen abgeglichen werden. Entfernen Sie systematisch doppelte Einträge aus dem integrierten Datensatz der Genziele. Überprüfen Sie, dass der resultierende Datensatz eine eindeutige Liste potenzieller Ziele enthält.
  3. Identifikation der Schnittziele von "CA-NP-Ferroptosis"
    1. Bestimmen Sie die Schnittmenge von Zielen für CA, NP und Ferroptose mit einem online generierten Venn-Diagramm.
    2. Diese Schnittziele wurden als potenzielle Kandidaten für den "CA-regulierten NP-Ferroptose-Pfad" festgelegt.
  4. Aufbau des Protein-Protein-Interaktions-(PPI)-Netzwerks
    1. Zur weiteren Untersuchung reichen Sie die gängigen Ziele für "CA-NP-Ferroptosis", "CA-NP" und "CA-Ferroptosis" in die STRING-Datenbank ein.
    2. Setzen Sie die Interaktionswertschwelle auf "höchste Konfidenz > 0,4" und beschränken Sie die maximale Anzahl der Interaktoren auf 10 für sowohl die erste als auch die zweite Interaktionsschicht. Setze die Standardeinstellungen für alle anderen Parameter an und baue ein 4,5-PPI-Netzwerk für "CA-NP-Ferroptosis" auf.
  5. GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen
    1. Laden Sie die Schnittziele für "CA-NP-ferroptosis" mit folgenden Parametern auf die DAVID-Plattform hoch: "Identifikator: offizielles Gensymbol", "Listentyp: Genliste" und "Art: Homo sapiens." Die Analyse der Gen-Ontologie (GO) wurde in drei Kategorien durchgeführt: Biologischer Prozess (BP), zelluläre Komponente (CC) und Molekulare Funktion (MF).
    2. Führen Sie die KEGG-Signalanreicherungsanalyse durch und visualisieren Sie die resultierenden Daten mithilfe von Balkendiagrammen, die auf der Hiplot-Plattform erstellt wurden.

2. Molekulare Andockung

  1. Um die Wechselwirkung zwischen aktiven Verbindungen und ihren krankheitsassoziierten Zielen zu erläutern, beziehen Sie strukturelle Informationen für Wirkstoffe aus der PubChem-Datenbank als kleine Moleküle, während die 3D-Strukturen der Zielproteine aus der Protein Data Bank (PDB) als Proteinmodelle abgerufen werden.
  2. Verwenden Sie PyMOL, um die Proteinrezeptorstrukturen vorzuverarbeiten, indem Sie Wassermoleküle und nicht essentielle Liganden entfernen. Anschließend bereiten Sie die Zielproteine und Wirkstoffe für das Andocken mit AutoDock Tools 1.5.7 vor und führen mit AutoDock Vina halbflexibles molekulares Andocken aus.
  3. Analysieren Sie die Bindungsenergien und Bindungsstellen der aktiven Substanzen auf den Rezeptorproteinen. Für das JAK2-Protein wurde seine Struktur (PDB ID: 3e64) aus der PDB-Datenbank basierend auf Röntgenkristallographiedaten und optimaler Auflösung ausgewählt.
  4. Verwenden Sie die PyMOL-Software, um die JAK2-Struktur vorzubereiten, indem Sie Liganden eliminieren, Wassermoleküle entfernen und Wasserstoffe hinzufügen. Die kleinen Molekülstrukturen der aktiven Verbindungen stammen von PubChem.
  5. Laden Sie sowohl Protein- als auch Verbindungsstrukturen in AutoDock Tools 1.5.7, definieren Sie die Andockboxen und führen Sie das molekulare Andocken mit AutoDock Vina durch.

3. Zellkultur

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden im Validierungsexperiment wiederholt verwendet. Halte dich an strenge aseptische Techniken. Dieser Teil des Experiments verwendete eine Horizontalrotorzentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit.

  1. Desinfizieren Sie die äußere Verpackung und Kulturflaschen mit sterilen Zellen, die mit 75 % Alkohol gekauft wurden, und übergeben Sie sie dann in Kulturschalen auf einer supersauberen Werkbank für Subkultur, bis die Zellen auf fünf 10 cm großen Petrischälchen verteilt sind, um ausreichenden Zellbestand sicherzustellen.
  2. Kryokonservieren Sie die Zellen bei -80 °C für spätere Experimente.
    1. Bereite DMEM, Zellkultur-Qualitäts-DMSO, fetales Rinderserum (FBS), 15-mL-Zentrifugenröhrchen, Pipetten, Kryoviale und ein Eisbad vor. Mische 1 ml DMSO, 1 ml FBS und 8 ml DMEM, um ein Gesamtvolumen von 10 ml zu erreichen. Kühle das DMSO 15 Minuten auf Eis. Zuerst das Grundmedium in das Zentrifugenrohr übertragen und dann langsam das vorgekühlte DMSO beim Drehen hinzufügen. Gründlich mit einer Pipette mischen, dann vorsichtig FBS hinzufügen und erneut rühren. Bewahren Sie die Mischung im Eisbad für spätere Verwendung auf.
      HINWEIS: Eine Konzentration von 20–50 % DMSO führte zu einer signifikanten Erhöhung der LDH-Freisetzung, was darauf hindeutet, dass hohe DMSO-Konzentrationen zytotoxisch sind, während 10 % DMSO relativ sicher sind. Das hat unser Experiment25 nicht beeinflusst.
    2. Nimm logarithmisch wachsende Zellen, wasche sie dreimal mit PBS und gib dann 0,25 % Trypsin bei 400 μL/10 cm Schüssel hinzu.
      HINWEIS: Sobald die zytoplasmatische Rückziehung erfolgt, lösen sich die Verbindungen oder, wenn Anzeichen eines großflächigen Schwimmen auftreten, wird der Verdauungsprozess sofort gestoppt.
    3. Vorverdautungsvorbereitung: Vorerhitzen der Schlüsselreagenzien (0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung und DRG-Komplettmedium) auf 37 °C. Entfernen Sie die Zellkulturflasche aus dem Inkubator und entsorgen Sie das alte Medium mit einer sterilen Pipette, um zu verhindern, dass das Restmedium die Verdauungseffizienz beeinträchtigt. Spülen Sie die einschichtigen kultivierten Zellen zweimal vorsichtig mit 5 ml sterilem PBS, um das Restserum zu entfernen und eine Zellelution zu vermeiden.
    4. Fügen Sie 2 ml vorgewärmte 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung in das Kulturgefäß hinzu, sodass die einzelne Zellschicht vollständig bedeckt ist. Inkubiere bei Raumtemperatur 1–3 Minuten. Während dieser Zeit sollten die Zellen alle 30 Sekunden unter einem umgekehrten Mikroskop beobachtet werden. Stoppen Sie die Verdauung sofort, sobald die meisten Zellen sich zusammenziehen, rund werden und deutliche zwischenzelluläre Räume zeigen (um Überverdauung und Zellschäden zu verhindern).
    5. Gib schnell 4 ml vollständig vorgewärmtes Medium in das Kulturgefäß. Die Mischung vorsichtig fünfmal mit einer sterilen Pipette pipetten, um den Zellcluster in eine einzellige Suspension zu verteilen. Übertragen Sie die gesamte Einzelzellsuspension in sterile 15-mL-Zentrifugenröhren und sammeln Sie das Zellpellet durch Zentrifugation bei 300 x g 5 Minuten mit einer langsamen horizontalen Rotorzentrifuge bei 25 °C.
    6. Entsorge das Supernatant und gib 5 ml des vorbereiteten Kryokonservierungsmediums hinzu. Bläse vorsichtig mit einer Pipette die Zellen, um die Zellen gleichmäßig zu mischen. Verteilt sie gleichmäßig auf 5 Phiolen.
    7. Beschriften Sie das Kryovial mit dem Zellnamen, dem Gefrierdatum und dem Operator; Geben Sie es in einen Gefrierbehälter und lagern Sie es in einem Gefrierfach von -80 °C, dann übergeben Sie es nach der Übernachtung in flüssigen Stickstoff.
  3. Zellwiederbelebung
    1. Tragen Sie Handschuhe, nehmen Sie das Fläschchen aus dem flüssigen Stickstoffbehälter und tauchen Sie es sofort in 37 °C warmes Wasser, während Sie es gelegentlich schütteln, um ein schnelles Auftauen (innerhalb von 1 Minute) sicherzustellen.
    2. Nehmen Sie das Fläschchen aus dem 37 °C Wasserbad, öffnen Sie den Deckel, saugen Sie die Zellsuspension mit einer Pipette an, geben Sie sie in ein Zentrifugenrohr, fügen Sie das 10-fache Volumen des Kulturmediums hinzu, mischen Sie gut und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 Minuten (25 °C).
    3. Entsorgen Sie das Supernatant, fügen Sie 5 ml Kulturmedium hinzu, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (das vollständige Medium für diese Zellkulturzustand), inokulieren Sie die Kulturschale und inkubieren Sie statisch ineinem Inkubator mit 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
    4. Ersetze das Kulturmedium am nächsten Tag (um restliche DMSO und abgestorbene Zellen zu entfernen) und beobachte die Kultur weiterhin auf Wachstumsbedingungen. Wenn die Zelldichte hoch ist, führen Sie umgehend Subkulturen für nachfolgende Experimente durch.
  4. Zellzählung
    HINWEIS: Dieser Teil des Experiments verwendete eine Niedergeschwindigkeits-Horizontalrotorzentrifuge.
    1. Bereiten Sie im Voraus 75 % Alkohol vor, um die Zählkammer und den Deckelzettel zu reinigen, und trocknen Sie sie dann für spätere Gebrauch.
    2. Die verdauten und zentrifugierten Zellen werden in 1 mL Medium wieder suspendiert und 50 μL der Zellsuspension mit 150 μL Medium in einem 1,5 mL EP-Rohr verdünnt, um eine 4-fache Verdünnung herzustellen.
    3. Schwinge gleichmäßig, nimm 10 μL und injiziere zwischen Deckschlupf und Zählkammer, um die Kammer vollständig zu füllen und Blasen zu vermeiden. Unter das Mikroskop gelegt zur Beobachtung und Zählung. Zählprinzipien: Nicht auslassen oder erneut zählen; Zähle Zellen, die die oberen und linken Ränder berühren, aber schließe diejenigen aus, die die unteren und rechten Ränder berühren.
    4. Gemäß den experimentellen Anforderungen wird das Zellvolumen basierend auf der gewünschten Zellanzahl für das Anrichten oder die Aussaatung der Schüssel und den Zählergebnissen berechnet und anschließend das gesamte Mediumvolumen mit einem vollständigen Medium ergänzt.

4. Zellviabilitäts-Assay-Protokoll

HINWEIS: Duloxetin wurde als westliches Medikament ausgewählt, da es ein weit verbreitetes und klinisch validiertes Medikament zur Behandlung peripherer neuropathischer Schmerzen ist. Die etablierte Wirksamkeit in dieser Indikation (unterstützt durch klinische Richtlinien und randomisierte kontrollierte Studien) stellt sicher, dass die Kontrollgruppe eine zuverlässige Referenz zur Bewertung der relativen Wirksamkeit der Testintervention bieten kann.

  1. Entsorge zuerst das alte Kulturmedium aus dem Kulturgefäß und spüle die Zelloberfläche mit 5 ml PBS, um das restliche Serum zu entfernen. Dann 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und 1-3 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren. Wenn mikroskopische Beobachtungen Cellschrumpfung, Rundung und Ablösung zeigen, wird sofort 4 mL DRG Complete Medium hinzugefügt, um die Verdauung zu beenden und die Zellen durch Pipettern wieder zu suspendieren.
  2. Die Zellsuspension wird in ein Zentrifugenrohr übertragen und das Zellpellet durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten mit einer langsamen horizontalen Rotorzentrifuge bei 25 °C aufgefangen. Entsorge den Überstandsstoff und suspendiere das Zellpellet in einem 15-mL-Zentrifugenrohr erneut, suspendiere dann gründlich und mische die Suspension.
  3. Nehmen Sie ein 1,5 mL EP-Rohr und geben Sie zunächst 150 μL Kulturmedium hinzu, gefolgt von 50 μL Zellsuspension. Gut mischen, um eine vierfache Verdünnung zu erreichen.
  4. Dann verwende 75 % Alkohol, um die Zählkammer und das Deckglas zu reinigen, trockne sie und schüttle die EP-Tube erneut gleichmäßig.
  5. Nehmen Sie 10 μL Zellsuspension heraus und spritzen Sie sie zwischen das Deckglas und die Zählkammer, sodass die Flüssigkeit die Zählkammer füllt, ohne Blasen zu bilden.
  6. Beobachten Sie unter dem Mikroskop und zählen Sie die Anzahl der Zellen nach dem Zählprinzip, wobei Sie Auslassungen oder Duplikate vermeiden.
    HINWEIS: Wenn die gezählte Anzahl der Zellen n beträgt, beträgt die Zellkonzentration im Zentrifugenrohr n/mL.
  7. Gemäß den experimentellen Anforderungen werden die Zellen in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 2.000 Zellen pro Brunnen ausgesät, wie nötig.
  8. Zuerst wird 200 μL PBS in jede Bohrung des peripheren Kreises einer 96-Well-Platte injiziert und anschließend zellhaltiges Kulturmedium entsprechend der Gruppierung hinzugefügt.
  9. Nach dem Inkubieren bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2-Inkubator für 24 Stunden, aspirieren Sie das alte Medium und waschen zweimal mit 200 μL PBS. Nach dem experimentellen Aufbau wird die CA schrittweise verdünnt (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) und 200 μL zu einer 96-Well-Platte hinzugefügt.
  10. Vorbehandeln Sie die Zellen mit OXA (5 μM) für 24 Stunden und behandeln anschließend DRG-Zellen mit unterschiedlichen CA-Konzentrationen (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) für jeweils 24 Stunden.
    HINWEIS: Dieser Abschnitt des Experiments zielt darauf ab, die optimale Wirkstoffkonzentration für CA zu bestimmen.
  11. Waschen Sie die 96-Well-Platte dreimal mit PBS-Puffer und geben Sie dann 200 μL frisch vorbereitete CCK-8-Arbeitslösung zu jedem Bohrloch. Dieser Schritt wird im Dunkeln durchgeführt, und die Experimentzeit wird so festgelegt, dass sie innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen ist. Inkubieren Sie die Lösung 4 Stunden ineinem Inkubator mit 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2. Missen Sie schließlich die Absorptionswerte mit einem Mikroplattenleser. Wiederhole alle Experimente mindestens dreimal unter identischen Bedingungen.

5. MDA

  1. Säen Sie 10 × 106 DRG-Zellen in einer 15 cm großen Schale und kultivieren Sie über Nacht ineinem Inkubator mit 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2-Intensität. Entfernen Sie das Kulturmedium, fügen Sie Medikamente hinzu und inkubieren Sie 24 Stunden ineinem Inkubator mit 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
  2. Entferne das Kulturmedium und wasche einmal mit 5 ml PBS. Nach der Verdauung sammeln Sie die Zellen in einem konischen Röhrchen mit einem DMEM-Medium.
  3. Fügen Sie die behandelten DRG-Zellen jeweils 5-mL-Mikroröhren hinzu. Zentrifugiere mit 300 x g für 5 Minuten mit einer niedrigen Drehzahl-Horizontalrotorzentrifuge und entferne das Überlagermittel. Dann 1 ml PBS hinzufügen, durch Pipettieren mischen und auf eine neue 1,5-ml-Mikroröhre übertragen. Zentrifugiere mit 300 x g für 5 Minuten mit einer niedrigen Drehzahl-Horizontalrotorzentrifuge und entferne das Überlagermittel.
  4. Fügen Sie 100 μL antioxidative PBS-Lösung hinzu, pipettieren Sie zum Mischen und bereiten Sie die Zellsuspension vor. Bereite die MDA-Standardlösung vor.
    HINWEIS: Siehe die Herstellung der Standard-MDA-Lösung mit der Fluoreszenzmethode; siehe den Abschnitt "Bausatzkomponenten" des Kits für detaillierte Abläufe.
  5. Fügen Sie 100 μL Lysis-Puffer in das Probenröhrchen bzw. das Standardrohr hinzu und mischen Sie gründlich mit einem Vortex-Oszillator. Lass es 5 Minuten bei Zimmertemperatur stehen.
  6. Geben Sie jedem Rohr 250 μL der vorbereiteten Arbeitslösung zu und mischen Sie gründlich mit einem Vortexmischer. Erhitze das Wasserbad auf 95 °C in natürlichem Licht für 15 Minuten und stelle es dann für 5 Minuten ins Eisbad zum Abkühlen. Hochgeschwindigkeits-Drehrotorzentrifuge bei 10.000 x g für 10 Minuten (4 °C).
  7. Nimm 100 μL Supernatant und gib es zu einer schwarzen 96-Well-Platte. Messen Sie die Fluoreszenzintensität mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenleser (z. B. 540 nm, Em: 590 nm). Berechnen Sie die MDA-Konzentration in der Probe anhand der Standardkurve.

6.Fe-2+- Gehalt in Zellen, gemessen mit einem Fe2+- Detektions-Kit

  1. Das Wasserbad im Voraus vorheizen und die Temperatur auf 37 °C erhöhen. Tragen Sie Handschuhe, holen Sie die DRG-Zellen aus flüssigem Stickstoff, wickeln Sie sie in eine Plastiktüte und tauchen Sie sie dann in 37 °C warmes Wasser, während Sie sanft zwischendurch schütteln, um das vollständige Auftauen innerhalb von 1 Minute sicherzustellen.
  2. Nach dem Auftauen wird das Fläschchen aus dem 37 °C Wasserbad genommen, die Kappe geöffnet, die Zellsuspension aspiriert, in ein 15 ml Zentrifugenrohr gegeben und 10 ml Kulturmedium tropfweise hinzugefügt, wobei gründlich gemischt wird. Horizontale Zentrifuge mit niedriger Drehzahl bei 300 x g für 5 Minuten (25 °C).
  3. Nach der Zentrifugation entsorgt man das Überlagerungsmittel, fügt 10 ml frisches Kulturmedium hinzu, pipettiert gründlich und zentrifugiert erneut. Wiederholen Sie dieses Verfahren dreimal, bevor Sie es auf neue Kulturschalen impfen.
  4. Pflanze die Zellen statisch ineinem Inkubator mit 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 auf. Ersetze das Medium am nächsten Tag, um restliche DMSO und abgestorbene Zellen zu entfernen, und setze dann die Kultivierung fort. Wenn die Zelldichte hoch ist, subkulturieren Sie rechtzeitig. Anschließend werden Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase gesammelt, verdaut sie, zentrifugiert und wieder suspendiert. Säen Sie die resuspendierten Zellen in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 70 % bis 80 % aus und setzen Sie die Platten dann wieder inden Inkubator mit 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für weitere Kultivierung.
  5. Am nächsten Tag wird der Zellzustand beobachtet, entsprechende Behandlungen gemäß dem experimentellen Aufbau bereitgestellt und dann wieder in den 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2-Inkubator für die weitere Kultivierung eingesetzt.
  6. Nach 24 Stunden Medikamentengabe entsorgen Sie das ursprüngliche Kulturmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Fügen Sie 300 μL/Bohrloch der FerroOrange-Sonde (1 μM) in HBSS verdünnt hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid für 30 Minuten.
  7. Dann wird die Hoechst 33342 lebende Zellfärbungslösung (100x) im Verhältnis 1:100 zur Zellplatte gegeben und bei Raumtemperatur im Dunkeln 5 Minuten inkubiert, um die Zellkerne zu färben.
  8. Beobachten Sie den Färbungseffekt unter einem Fluoreszenzmikroskop und machen Sie Fotos zur Dokumentation. Anschließend verwenden Sie ImageJ, um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität zu berechnen, wobei das Experiment zur statistischen Analyse dreimal wiederholt wird.

7. ROS-Detektionskit

  1. Nehmen Sie Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase, verdauen, zentrifugieren und resuspendieren Sie, dann säen Sie die Zellen in einer 12-Well-Platte mit einer Dichte (70%–80%). Nach gründlichem Vermischen der Zellen werden sie inden Inkubator mit 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für die weitere Kultivation gelegt.
    HINWEIS: Für die Verdauung, Zentrifugation und Resuspension siehe Schritt 4.1.
  2. Am nächsten Tag beobachten Sie den Zellstatus, führen Sie entsprechende Behandlungen gemäß dem experimentellen Aufbau durch und setzen Sie die Zellen dann wieder in den 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO-2-Inkubator zurück, um die Kultur fortzusetzen. Nach 24 Stunden Medikamentengabe entsorgen Sie das ursprüngliche Kulturmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS.
  3. Fügen Sie 200 μL hochempfindliche DCFH-DA-Farbstoff-Arbeitslösung hinzu und inkubieren Sie dann bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2-Inkubator für 30 Minuten.
  4. Entsorge das Überlagerungsmittel, wasche zweimal mit HBSS und färbe mit 2 μL Hoechst 33342 Live-Cell-Färbelösung (100x) für 5 Minuten, dann unter einem Fluoreszenzmikroskop. Wiederholen Sie das Experiment dreimal mit statistischer Analyse.

8. Mitochondriale Morphologie der mit TEM beobachteten Zellen

  1. Entsorgen Sie das Kulturmedium aus den gut kultivierten Zellen, fügen Sie 1 ml 2,5 % Glutaraldehyd-Fixierungslösung bei Raumtemperatur hinzu und fixieren Sie die Zellen für etwa 5 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Kratze die Zellen vorsichtig in eine Richtung mit einem Zellschaber ab.
  2. Die Zellsuspension wird in ein Zentrifugenrohr übertragen und bei 25 °C, 600 x g für 3 Minuten mit einer langsamen horizontalen Rotorzentrifuge betrieben.
  3. Nach dem Entsorgen des Überlagers der fixierenden Lösung wird frisches Elektronenmikroskopie-Fixativ hinzugefügt (1 ml pro Bohrloch für eine 12-Well-Platte) und bei Raumtemperatur abseits des Lichts für 30 Minuten fixiert, dann auf 4 °C zur Lagerung übertragen.
  4. Dehydrationsinfiltration: Führen Sie die Probe in die Einbettplatte ein und legen Sie sie über Nacht in einen 37 °C Ofen.
  5. Polymerisiere das Einbettmedium in einem 60 °C Ofen für 48 Sekunden. Schneide ultradünne Schnitte von 60–80 nm mit einem Ultramikrotom.
  6. Färben Sie die Schnitte 15 Minuten mit 2% Uranylacetat-Sättigungsalkohollösung, dann weitere 15 Minuten mit Bleicitrat. Trockne die gefleckten Bereiche über Nacht bei Zimmertemperatur. Beobachten und fotografieren Sie die Schnitte unter einem Transmissionselektronenmikroskop.

9. Western-Blotting

  1. Extrahiere das gesamte Protein der Zellen
    1. Behandle und inokuliere die Zellen in eine 6 cm große Petrischale, bis sie eine Dichte von 70 % erreichen.
      HINWEIS: Siehe Schritt 3.3 für Anweisungen zur Zellbelebung und Impfung.
    2. In der Kulturschale 3 ml OA (5 μM) hinzufügen und nach 4 Stunden CA (4 μM) hinzufügen.
    3. Bereiten Sie im Voraus eine Schachtel Eis, vorkühlende PBS, Zellschaber vor, vorbereiteten Lysepuffer und mehrere beschriftete EP-Röhrchen vor.
    4. Nach der medikamentösen Behandlung werden das Kulturmedium aus den Zellen entfernt und zweimal mit vorgekühltem PBS gewaschen. Führen Sie diesen Vorgang auf Eis durch und aspirieren Sie eventuelle Rest-PBS mit einer Vakuumzentrifuge.
    5. Beschrifte jede Petrischale, gib dann 300 μL Lysepuffer hinzu und lass sie 5 Minuten lang mit ständigem Rühren auf Eis stehen, um eine unvollständige Lyse und Einfrieren zu verhindern.
    6. Anschließend wird mit einem vorgekühlten Zellschaber die haftenden Zellen getrennt und nach jedem Abkratzen 300 μL in ein EP-Rohr gesammelt. Verwenden Sie für jede Scraping einen neuen Zellschaber und verwenden Sie ihn nicht wieder.
    7. Halte die Oberseite der EP-Röhre fest und mische gründlich auf einem Vortex-Mixer, dann lege es 25 Minuten lang weiter auf Eis. Zu diesem Zeitpunkt wird die 4 °C Hochgeschwindigkeits-Drehrotorzentrifuge im Voraus eingeschaltet, da die Vorkühlung der Zentrifuge eine bestimmte Zeit benötigt.
    8. Nach Ablauf des Timers wird erneut vortexiert, dann wird mit einem Hochgeschwindigkeits-Drehrotor 15 Minuten lang mit 4500 x g in einer 4 °C-Zentrifuge betrieben.
    9. Jetzt schalten Sie die Trockenbadheizung ein und stellen Sie die Temperatur auf 100 °C ein.
    10. Nimm das BCA-Proteinquantifizierungs-Kit heraus, gib Proben und Reagenzien auf die 96-Well-Platte, vermische gut und reagiere in einem 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2-Inkubator für 30 Minuten. Missen Sie den extrahierten Proteingehalt mit einem multifunktionalen Mikroplattenleser und passen Sie dann mit dem verbleibenden Lysepuffer basierend auf den Ergebnissen an, um sicherzustellen, dass die Konzentration jeder Probe konstant bleibt.
    11. Schließlich fügen Sie basierend auf dem Gehalt jedes Supernatanten ein Fünftel des 6× Ladepuffers hinzu, um das Protein-Ladesystem vorzubereiten. Saugen Sie vorsichtig 150 μL Supernatant in ein neues EP-Rohr. Fügen Sie 30 μL 6× Ladepuffer zum Supernatant hinzu und mischen Sie gründlich (typischerweise im Verhältnis 1:5). Lagere die Mischung auf Eis.
    12. Dann 6 Minuten auf einem Heizkörper bei 100 °C erhitzen und dabei darauf achten, den Deckel der EP-Tube zu halten, damit sie nicht aufspringt. Nach dem Erhitzen kühlen Sie es in einem Eisbad ab.
  2. Bereite ein Proteingel mit 10 % Konzentration vor.
    1. Spülen Sie die Gelplatte mit reinem Wasser, lassen Sie sie an der Luft trocknen, wischen Sie überschüssige Feuchtigkeit ab und vermeiden Sie so viel wie möglich Wasserflecken und Staub.
    2. Nehmen Sie den Gel-Gießstand heraus, mit den kurzen Platten der beiden Glasplatten vorne und den langen Platten hinten, richten Sie die Unterseiten aus, damit der Spalt zwischen den Glasplatten eng mit dem Dichtungsstreifen am unteren Rand des Standes passt, um Undichtigkeiten zu verhindern, und klemmen Sie die Platten dann fest, um das Gelgießen vorzubereiten.
    3. Bereiten Sie das untere Gel mit 6 mL reinem Wasser, 3,75 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,15 mL 10% SDS, 5 mL 30% Acry/bis, 75 μL 10% APS und 7,5 μL TEMED vor.
    4. Sanft kreisen, um Schäum zu vermeiden, und dann schnell und gleichmäßig zwischen die beiden Glasplatten geben, wobei Platz für das obere Gel bleibt. Anschließend wird die flüssige Oberfläche mit 1 ml Isopropanol abgeflacht und etwa 30 Minuten stehen.
    5. Spülen Sie den Kamm für die Gelvorbereitung mit reinem Wasser ab, lassen Sie ihn an der Luft trocknen und beiseitelegen. Nachdem das untere Gel vollständig erstarrt ist, gieße das Isopropanol aus, spüle vorsichtig 2-3 Mal mit reinem Wasser, sauge die Flüssigkeit auf und drehe die Gelplatte um, um die restliche Flüssigkeit abzulassen.
    6. Bereiten Sie das obere Stapelgel mit 6 ml reinem Wasser, 2,5 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,1 ml 10% SDS, 1,34 ml 30% Acry/bis, 50 μL 10% APS und 10 μL TEMED vor.
    7. Füllen Sie die obere Schicht und legen Sie vorsichtig einen 15-Wellen, 1,5 mm dicken Kamm ein. Nach 1–2 Minuten füllen Sie die Lücken wieder auf und achten Sie darauf, die Blasenbildung während dieses Vorgangs zu minimieren. Verwende ein vollständig polymerisiertes Gel.
  3. Proteingel-Elektrophorese
    1. Vorkonfigurieren Sie den laufenden Puffer und den Übertragungspuffer, wobei der Übertragungspuffer in einem 4 °C-Kühlschrank vorgekühlt ist.
    2. Spülen Sie das Proteingel mit ultrareinem Wasser ab, nehmen Sie einen sauberen Elektrophoresetank, klemmen Sie die beiden kurzen Platten des Proteingels nach innen und gegenüber, gießen Sie den Running Buffer ein und prüfen Sie auf Undichtigkeiten.
    3. Entfernen Sie den Kamm vorsichtig, laden Sie 10 μL pro Bohrloch mit insgesamt 4 Probengruppen auf. Laden Sie 3 Probengruppen pro Gel, getrennt durch einen 4-μL-Proteinmarker zwischen jeder Gruppe, insgesamt 15 Bohrungen.
    4. Nach dem Laden der Proben gießt man den gesamten verbleibenden Running Buffer in den Elektrophoresetank, deckt ihn mit dem Deckel ab, stellt die Spannung auf 140 V ein und führt eine konstante Elektrophorese für 20 Minuten durch.
    5. Wenn die Proteinbänder nach der Konzentration in das Trenngel eintreten, stellen Sie die Spannung auf 120 V für eine elektrophorese mit konstanter Spannung ein. Während dieses Prozesses wird die NC-Membran in Transfer Buffer eingeweicht. Beenden Sie die Elektrophorese, wenn das Bromphenolblau anzeigt, dass die Probe den unteren Rand des Gels erreicht hat, und bereiten Sie den Membrantransfer vor.
    6. Fülle eine Schaumstoffbox halb mit Eis, entferne die Transferklemme, den vorgekühlten Transfer Buffer und die eingeweichte NC-Membran. Gießen Sie die Hälfte des Transfer Buffers in einen flachen, quadratischen Behälter.
    7. Nimm das Proteingel heraus, spüle es gründlich mit ultrareinem Wasser ab, lege die schwarze Seite nach unten und die transparente Seite nach oben. In der Mitte eine Schicht Schwamm, eine Schicht Filterpapier, das Proteingel, die NC-Membran und dann eine weitere Schicht Filterpapier und Schwamm anlegen.
    8. Nach dem Drücken, um Luftblasen zu entfernen, klemmen Sie die Transferkassette ab und legen Sie sie in den Transferbehälter. Sobald beide Proteingele vollständig eingesetzt sind, gießt man den gesamten Transfer Buffer in den Transfertank, fügt dann zwei Eispacks zum Abkühlen hinzu und deckt mit dem Deckel ab.
    9. Umgeben Sie die Übertragungskassette mit Eis und übertragen Sie sie mit einer konstanten Spannung von 120 V für 90 Minuten. Der Transferprozess erzeugt erhebliche Wärme, sodass ein Eisbad zur Kühlung erforderlich ist.
    10. Nehmen Sie die NC-Membran heraus, tauchen Sie sie in und färben Sie sie in 20 ml Ponceau S-Färbelösung, markieren Sie die Markergröße mit einem Bleistift und schneiden Sie die Membran mit einem Bleistift entsprechend der Größe des zu detektierenden Zielproteins.
    11. Holen Sie die Ponceau S Färbelösung wieder. Waschen Sie die Färbungslösung mit PBS ab und inkubieren Sie die NC-Membran mit 20 ml Blockpuffer, dann blockieren Sie 1-2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Shaker mit niedriger Geschwindigkeit.
    12. Entsorgen Sie die Blocklösung, spülen Sie die Membran schnell zweimal mit PBS auf einem Entfärbungsshaker, um die Blocklösung gründlich zu entfernen, geben Sie dann die entsprechenden Antikörper entsprechend den Western-Blot-Nutzungsverhältnissen jedes Antikörpers in der Antikörper-Inkubationsbox hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C.
    13. Die primären Antikörper werden separat gewonnen und bei -20 °C gelagert. Die Membranen wurden schnell viermal mit TBST auf einem Entfärbungsshaker gewaschen, jeweils 5 Minuten, um die primären Antikörper gründlich zu entfernen. Dann werden 4 ml des Blockpuffers mit sekundären Antikörpern hinzugefügt und die Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem langsamen Shaker inkubiert.
    14. Wasche den sekundären Antikörper jeweils viermal mit einem TBST-Puffer für jeweils 5 Minuten und ersetze dann durch einen PBS-Puffer, um die NC-Membran vollständig zu befeuchten.
    15. Laut dem ECL-Handbuch für das Cheminilumineszenzreagenz bereiten Sie die lumineszente Lösung vor, lassen Sie sie auf die Membranoberfläche fallen und inkubieren Sie dann 1–2 Minuten, bevor sie mit einem Gelbildgebungssystem entwickelt wird.
    16. Verarbeiten Sie die Rohdaten im Bild-J-Bildsystem und übertragen Sie sie dann in die Photoshop-Software zur Figurenerstellung.

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Ergebnisse

Netzwerkpharmakologie und molekulares Andocken
Identifikation potenzieller Ziele von CA: Bei der umfassenden Untersuchung der pharmakologischen Aktivität von CA wurden 60 potenzielle Ziele sorgfältig aus einer umfangreichen Literaturübersicht ausgewählt. Um den Umfang der Analyse weiter zu erweitern, wurden über die TCMSP-Datenbank weitere 12 potenzielle Ziele identifiziert, die mit CA verbunden sind. Für eine verbesserte Genauigkeit und Gründlichkeit wurden die forts...

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Diskussion

Ferroptose, eine kürzlich identifizierte Art des Zelltods, ist gekennzeichnet durch eine übermäßige intrazelluläre Eisenansammlung und Lipidperoxidation. Morphologisch äußert sich Ferroptose als Mitochondrienschrumpfung, Verlust oder Reduktion von Cristae-Strukturen und erhöhter Membrandichte, während die Zellmembran und die Kernmorphologie unbeeinträchtigt bleiben26. Mechanistisch wird die Ferroptose durch Glutathion- (GSH)-Depletion und eine beeinträchtigte GPX4...

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Offenlegungen

Es gibt keine finanziellen Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen

Danksagungen

Wir sprechen unseren herzlichen Dank für die hervorragenden Bedingungen aus, die das Krankenhaus und seine Abteilungen geboten haben, sodass wir diese Ergebnisse erreichen konnten. Gleichzeitig richten wir auch unseren aufrichtigen Dank an die vielen Mitglieder des Labors für ihren unermüdlichen Einsatz und ihre wertvollen Beiträge über die Jahre hinweg. Die harte Arbeit jedes Teilnehmers ist ein unverzichtbarer Teil unseres Erfolgs, und auch in Zukunft werden wir weiterhin zusammenarbeiten, um den Fortschritt im medizinischen Bereich voranzubringen. China National Natural Science Foundation (82104838), China Promotion Foundation Spark Program (XH-D001), Liaoning Provincial Key Research and Development Programme (2024JH2/102500062) und Liaoning Provincial Natural Science Foundation (2025-MSLH-490).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
  GlycinBiofroxx1275KG001
  Tris-BaseBiofrooxx1115KG001
0.5  M  Tris-HCl-Puffer (pH  6,8)Biorad1610799
1 M Tris-Hcl (pH 7,5)BeyotimeST775
1.5  M  Tris-HCl-Puffer (pH  8,8)Biorad1610798
APSBeyotimeST005
Grundlegende Elektrophorese-StromversorgungBIO-RAD PowerPac Basic
BCA-Proteinquantifizierungs-KitBeyotimeP0012
Beta-Aktin-Rekombinanter AntikörperHuabio81115-1-RR
Kohlendioxid-InkubatorThermo150L
CCK-8 Assay-KitApexbioK1018
Zellaktivitäts- und Zytotoxizitäts-Assay-KitBeyotimeC2015M
Zinnamaldehyd (CA)MacklinC805134Reinheit 98 %
EntfärbungsschüttlerKylin-BellTS-100
DMEM (Dulbeccos modifizierter Eagle Medium)BasalMediaL110KJ
DMSOSigmaD2650
Dorsalwurzelganglion (DRG)Fuheng BioFH165Seriennummer: 20211227-1
DRG Complete MediumFuheng BioFH-DRG
ECL-lumineszente LösungThermo34580
ErbB-1Proteintech06-8471:2000
Fetal  Bovine  SerumMacklinFO193
Ferro-Ionen-Detektionssonde – FerroOrangeDojindoF374
FTH1Zell-Signaltechnik4393S1:1000
GelbildgebungssystemBIO-RAD ChemiDoc Touch
Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS)SolarbioH1025
Hochgeschwindigkeits-KühlzentrifugeEppendorf5804R
Hoechst 33342 Live-Cell-FärbelösungBeyotimeC1028
Immunhistochemie-KitBiosharpBS-24-PB
Invertiertes FluoreszenzmikroskopsystemLeicaLeica DMI 8
JAK2 Rekombinanter Kaninchen-Monoklonaler Antikörper [SY0245]HuabioET1607-351:2000
Labor-InvertiertphasenkontrastmikroskopLeicaLeica DMI 1
Zentrifuge mit niedriger GeschwindigkeitEppendorf5804
MDA-Inhaltserkennungs-KitSangonD799762
Mikroplatten-LeserSUNRISE TECAN
Multifunktionaler MikroplattenleserBMGLABTECH PHERAstar FS
NF-κ B p65 Polyklonaler AntikörperProteintech10745-1-AP1:1000
ParaformaldehydMacklinP804536
Ponceau-FärbungslösungBeyotimeP0022
ProteinmarkerThermo26617
P-STAT3 (Ser727)Zell-Signaltechnik9134S1:1000
P-STAT3 (Tyr705)Zell-Signaltechnik9145S1:2000
Rekombinanter Anti-Glutathion-Peroxidase-4-Antikörper[EPNCIR144]abcamab1250661:1000
Rekombinanter Anti-XCT-Antikörper[EPR27115-64]abcamab3076011:1000
ROS-Assay-KitDojindoR252
SDS-PAGE Proteinladepuffer (6X)BeyotimeP0289
MagermilchpulverBiosharpBS102-500g
Natriumdodecylsulfat SDSBiofrooxx3250GR500
STAT3 (F-2)Santa CruzSc-80191:200
TEMEDSolarbio    T8090   
TFRCInvitrogen13-68000,5 & Mikro; g/mL
Tween80SelleckS6702
Ultra-saubere WerkbankHDLDL-CJ-2NDI
Vertikales MikroskopOlympusCX 31
Vertikale ElektrophoreseBIO-RAD Mini-Protean-Tetra
Nass-TransfertankBIO-RAD Mini Trans Blot
α-Tubulinα-TubulinER130905
GraphPad-PrismaStatistische Analyse
ImageJ-SoftwareErhalten Sie den Grauwert des Protein-Blot

Referenzen

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