Präzise Phagenmutagenese mit NgTET-assistierten CRISPR-Cas-Systemen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um DNA-Modifikationen in Bakteriophagen mit Hilfe des NgTET-Enzyms zu reduzieren, das eine effiziente und narbenfreie CRISPR-Cas-Mutagenese ermöglicht. Diese Methode ermöglicht die Gentechnik von Phagen für Anwendungen in der Biotechnologie und Phagentherapie.

Zusammenfassung

Bakteriophagen, Viren, die spezifisch auf ihre bakteriellen Wirte abzielen, bergen ein erhebliches Potenzial für Biotechnologie und Medizin, insbesondere bei der Bekämpfung multiresistenter Infektionen. Die molekularen Mechanismen, die der Phageninfektion zugrunde liegen, sind jedoch noch weitgehend unerforscht. Die präzise, ortsspezifische Mutagenese von Phagen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Genfunktionen und Phagen-Wirt-Interaktionen aufzuklären.

Eine große Herausforderung bei der Mutagenese des Phagengenoms ist jedoch das Vorhandensein von Phagen-DNA-Modifikationen, die herkömmliche Genom-Editing-Tools wie CRISPR-Cas beeinträchtigen.

Während CRISPR-Cas-Systeme bereits erfolgreich für die gezielte Mutagenese in verschiedenen Organismen eingesetzt wurden, wird ihre Wirksamkeit bei der Phagen-Mutagenese oft durch DNA-Modifikationen wie die Cytosin-Glykosylierung eingeschränkt. Um diese Barriere zu überwinden, haben wir eine effiziente Methode entwickelt, die die Häufigkeit von Phagen-DNA-Modifikationen vorübergehend reduziert und so ein effizientes CRISPR-Cas-Targeting und eine präzise Mutationseinführung in das Phagengenom ermöglicht. Konkret verwenden wir die Ten Eleven Translocation (TET) Methylcytosin-Dioxygenase aus Naegleria gruberi (NgTET), die methylierte und hydroxymethylierte Cytosine in der DNA iterativ demodisiert. Durch die Oxidation von hydroxymethylierten Cytosinen in der Phagen-DNA verhindert NgTET nachfolgende Cytosin-Modifikationen wie die Glykosylierung und erhöht die Effizienz der Cas-vermittelten DNA-Spaltung erheblich.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der hier vorgestellte narbenfreie und präzise Genom-Editing-Ansatz die effiziente Einführung von Punktmutationen unter Beibehaltung der nativen Genarchitektur in Phagengenomen ermöglicht. Durch die Beibehaltung intakter transkriptioneller und translationaler Gerüste minimiert diese Methode unbeabsichtigte Störungen komplexer regulatorischer Netzwerke. Dies ist besonders wichtig für die Untersuchung essentieller oder multifunktionaler Phagenproteine. Die Möglichkeit, gezielte genetische Modifikationen zu erzeugen, ohne fremde Sequenzen einzuführen, erweitert den experimentellen Werkzeugkasten für die Phagenbiologie erheblich. Diese Strategie ermöglicht nicht nur detaillierte funktionelle Studien, sondern erhöht auch das Potenzial für ein rationales Engineering von Phagen für therapeutische und biotechnologische Anwendungen.

Einleitung

Bakteriophagen sind Viren, die es spezifisch auf Bakterien abgesehen haben. Aufgrund ihres immensen Potenzials in der Biotechnologie und Medizin, insbesondere im Kampf gegen multiresistente Bakterien, haben sie großes Forschungsinteresse geweckt ^1,2,3. Trotzdem ist die Phagenbiologie noch relativ wenig erforscht. Ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen der Entführung ihrer bakteriellen Wirte ist unerlässlich, um ihr therapeutisches und biotechnologisches Potenzial voll auszuschöpfen⁴. Um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der effizienten Phageninfektion zugrunde liegen, und um die Phagen für spezifische Anwendungen zu entwickeln, ist die Fähigkeit, Phagengenome genetisch zu modifizieren, unerlässlich. Dennoch bleibt es eine der größten Herausforderungen auf dem Gebiet der Phagenbiologie ^3,5,6.

Phagen-DNA wird oft durch spezifische chemische Veränderungen der Purin- und Pyrimidinbasen modifiziert, z. B. Cytosin-Glykosylierung und Methylierung. Diese Modifikationen schützen das genetische Material der Phagen vor der Erkennung und dem Abbau durch die Nukleasen des Wirts⁶. Während diese Modifikationen für die Fitness der Phagen entscheidend sind, stellen sie ein erhebliches Hindernis für Phagengenom-Engineering-Ansätze dar, die auf DNA-Targeting-Systemen beruhen ^2,3,7.

Bestehende Mutagenese-Strategien, einschließlich Restriktions-Modifikations-Systeme und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-CRISPR-assoziierte (Cas) Protein-basierte Technologien, stehen bei der Modifikation von Phagen-DNA aufgrund von schützenden epigenetischen Modifikationen wie der Cytosin-Glykosylierung vor erheblichen Herausforderungen⁸. Die CRISPR-Cas-vermittelte Genom-Editierung, die in bakteriellen und eukaryotischen Zellen hochwirksam ist, beruht auf zwei Schlüsselschritten: der präzisen Spaltung der DNA an bestimmten genomischen Loci durch die Cas-Nuklease, gefolgt von der DNA-Reparatur durch homologe Rekombination mit Spender-DNA, die die gewünschte Mutation^{trägt 1}. In Phagen verhindern DNA-Modifikationen jedoch oft, dass Cas-Nukleasen das Genom binden oder effizient spalten können. Darüber hinaus kann die schnelle und vorübergehende Natur der Phagenreplikation die Effizienz der homologen Rekombination weiter einschränken. Diese Barrieren machen es besonders schwierig, die DNA-gerichtete CRISPR-Cas-Technologie für die Phagenmutagenese anzuwenden. Es wurde gezeigt, dass Phagen-DNA-Modifikationen das Targeting von Phagen-DNA mit CRISPR-Cas sowohl in vitro als auch in vivo beeinträchtigen ^6,7.

Um die Herausforderungen zu bewältigen, die sich aus protektiven DNA-Modifikationen in Phagen ergeben, führen wir eine Genom-Mutagenese-Strategie ein, die sich die Aktivität der Zehn-Eleven-Translokation (TET) Methylcytosin-Dioxygenase, insbesondere NgTET, zunutze macht. In Eukaryoten katalysieren TET-Enzyme die schrittweise Oxidation von methyliertem Cytosin durch iterative Prozesse: Methylcytosin (5mdC) wird zunächst in Hydroxymethylcytosin (5hmdC), dann in Formylcytosin (5fdC) und schließlich in Carboxycytosin (5cadC) umgewandelt (Abbildung 1).

In unserem Phagen-Mutagenese-Ansatz wird NgTET verwendet, um die Häufigkeit schützender DNA-Modifikationen vorübergehend zu reduzieren und dadurch die Zugänglichkeit der Phagen-DNA für Genom-Editing-Werkzeuge wie Cas-Enzyme zu verbessern⁹. NgTET wurde für die Modulation des Bakteriophagengenoms ausgewählt, da zuvor über seine erfolgreiche Expression in aktiver löslicher Form in einem heterologen bakteriellen Wirt, insbesondere E. coli, berichtet wurde. Diese Eigenschaft ist essentiell, da NgTET während einer Phageninfektion aktiv bleiben muss¹⁰.

Abbildung 1: Schrittweise Oxidation von 5-Methylcytosin durch TET-Dioxygenase¹. Die TET-Dioxygenase katalysiert die sukzessive Oxidation von 5-Methyl-2'-Desoxycytidin (5mdC) zu 5hmdC, 5-Formyl-2'-Desoxycytidin (5fdC) und schließlich zu 5-Carboxyl-2'-Desoxycytidin (5cadC). Das Endprodukt, 5cadC, kehrt entweder spontan oder enzymatisch zu unmodifiziertem Cytosin (dC) zurück und trägt so zur dynamischen epigenetischen Regulation bei. Dieser mehrstufige Prozess ist für die aktive DNA-Methylierung in Eukaryoten von zentraler Bedeutung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Da Methylcytosin und Hydroxymethylcytosin häufige Vorläufer von Phagen-DNA-Hypermodifikationen sind, einschließlich sperriger Schutzstrukturen wie Glykosylierungen, kann die oxidative Aktivität der TET-Dioxygenase genutzt werden, um die Bildung dieser DNA-Hypermodifikationen zu verhindern⁹. In diesem TET-basierten Genommutagenese-Ansatz exprimieren wir NgTET heterolog rekombinant in E. coli, um hydroxymethylierte Cytosine im Phagengenom nach einer Infektion zu oxidieren und dadurch die Bildung einer sperrigen Glykosylierung zu verhindern. Durch die Verringerung der Häufigkeit dieser sperrigen DNA-Modifikationen kann unser Ansatz die Zugänglichkeit der Phagen-DNA zu CRISPR-Cas-Nukleasen erhöhen. Diese verbesserte Zugänglichkeit ermöglicht eine effiziente Zielerkennung, eine präzise DNA-Spaltung und die Einführung narbenloser Punktmutationen in das Phagengenom und unterscheidet es von herkömmlichen Phagenmutagenesemethoden, die auf Gendeletionen, Reportergen-Insertionen oder der Integration künstlicher Verbindungen für die PCR-basierte Mutantenselektion beruhen ^1,11. Diese konventionellen Strategien waren bisher die einzigen verfügbaren Werkzeuge für die gezielte Mutagenese im Phagengenom und stellen daher eine wichtige Grundlage für die hier vorgestellte Methode dar. Einzelne Phagenproteine können jedoch mehrere Funktionen besitzen. Die Deletion des gesamten Gens, das für ein Protein von Interesse kodiert, stört alle damit verbundenen Funktionen. Im Gegensatz dazu ermöglicht die gezielte Einführung von Punktmutationen die selektive Inaktivierung spezifischer Funktionen, die eine detaillierte Analyse ihrer Rolle ermöglichen. Bisher sind die Funktionen vieler Phagenproteine weitgehend uncharakterisiert; So können wir zusätzliche Aktivitäten übersehen, die mit einem bestimmten Gen verbunden sind. Daher wird ein minimalistischer Ansatz bevorzugt, der darauf abzielt, nur eine einzige Funktion zu entfernen und gleichzeitig minimale Veränderungen am Gesamtprotein zu verursachen^12,13. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht präzise genetische Modifikationen, ohne die gesamte genomische Organisation oder Funktion zu stören. Eine weitere große Herausforderung früherer Phagen-Mutagenese-Methoden war ihre geringe Effizienz, die typischerweise zu Mutationsraten von etwa 0,1 %^1,11 führte. Mit dieser Technik stellen wir die erste Mutagenese-Strategie vor, die in der Lage ist, Single-Codon-Veränderungen einzuführen und so eine bemerkenswerte siebenfache Steigerung der Targeting-Effizienz zu erzielen. Durch die Kombination mit einer ONT-basierten Hochdurchsatz-Screening-Methode wird der Nachweis von Punktmutationen vereinfacht, wodurch die Notwendigkeit entfällt, große Phagenpopulationen zu screenen, um eine Mutante zu isolieren. Die hier beschriebene TET-basierte Mutagenese-Strategie behebt eine seit langem bestehende Einschränkung in diesem Bereich und ermöglicht eine zuverlässigere Genom-Editierung¹⁴.

Insgesamt kann diese Methode nicht nur dazu beitragen, unser Verständnis der Infektionsmechanismen von Bakteriophagen zu verbessern, sondern ist auch vielversprechend für die synthetische Biologie. Durch die Ermöglichung eines präzisen und effizienten Phagen-Genom-Engineerings ebnet es den Weg für die Anpassung der Phagen an spezifische Anwendungen und erhöht so ihr Potenzial für biotechnologische und medizinische Anwendungen.

Protokoll

Ein Schema, das die Erzeugung von NgTET-behandelten T4-Phagen zeigt, ist in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2: Schematischer Überblick über den etablierten Arbeitsablauf für die T4-Phagen-Mutagenese und das Mutanten-Screening. Der Arbeitsablauf umfasst die Generierung des hypomodifizierten T4-Phagen mittels NgTET, der entweder durch LC-MS-Analyse oder alternativ durch CRISPR-Cas-Spaltassay validiert werden kann. Anschließend wird die interessierende Mutation durch CRISPR-Cas-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese in das Phagengenom eingeführt und durch Gegenselektion identifiziert. Das Vorhandensein der gewünschten Mutation kann dann mit Hilfe der Nanoporen-Sequenzierung bestätigt werden. Nach der Validierung kann der mutierte Phagen vermehrt werden, um DNA-Hypermodifikationen wiederherzustellen. Dies ermöglicht den Einsatz des gentechnisch veränderten Phagens in nachgelagerten Anwendungen, einschließlich der Analyse von Infektionsphänotypen durch Lyseassays und Burstgrößenmessungen. Jeder Schritt in der Abbildung ist mit der entsprechenden Protokollnummer in Klammern versehen, um die Verknüpfung der Protokollschritte mit den jeweiligen Teilen der Abbildung zu erleichtern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Reduzierung von Phagen-DNA-Modifikationen durch NgTET-Vorbehandlung (~2 Tage)

HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um ein effizientes Cas-Nuklease-Targeting während der Mutagenese zu ermöglichen, indem die Häufigkeit von Phagen-DNA-Modifikationen reduziert wird.

1. Inokulieren Sie den mit pET28a_NgTET transformierten E. coli BL21 (DE3)-Stamm, indem Sie Material aus einem Glycerinstamm in 10 ml LB-Medium übertragen, das mit 30 μg/ml Kanamycin versetzt wird. Über Nacht bei 37 °C inkubieren und bei 160 U/min schütteln.
2. Am nächsten Tag verwenden Sie die Übernachtkultur, um eine Hauptkultur mit einem anfänglichen OD₆₀₀ von 0,1 in 50 ml LB-Medium zu impfen, das 30 μg/ml Kanamycin enthält. Induzieren Sie die Kultur mit 50 μM IPTG, wenn ein OD₆₀₀ von 0,4 erreicht ist.
3. Wachsen Sie die Kultur bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 160 U/min, bis sie einen OD₆₀₀ von 0,8 erreicht.
4. Infizieren Sie die Kultur mit dem interessierenden Phagen bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,1 und inkubieren Sie sie 4 Stunden lang bei Raumtemperatur und Schütteln bei 120 U/min.
5. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4000 × g für 20 min bei 4 °C.
6. Der Überstand wird durch einen 0,45-μm-Filter geleitet, um NgTET-behandelte Phagen mit hypomodifizierter DNA zu erhalten. Lagern Sie die filtrierten Phagen für die zukünftige Verwendung bei 4 °C.
   HINWEIS: (PAUSE-PUNKT) Filtrierte Phagen sind mehrere Monate bei 4 °C stabil, wenn sie in LB-Medium in einer Glasflasche gelagert werden.

2. Validierung

HINWEIS: Das Ziel dieses Schritts ist es, die reduzierte Häufigkeit von Phagen-DNA-Modifikationen experimentell zu verifizieren.

1. Validierung der Behandlung mittels LC-MS (~ 2 Tage)
   1. Phagenreinigung über Saccharosegradient
      1. Um die restliche Nukleinsäure aus dem Lysat zu entfernen, behandeln Sie 500 μl der Phagensuspension (>10¹⁰ PFU/ml) mit 20 μl DNase I und 2 μl RNase A/T1 Mix (4 μg RNase A, 10 U RNase T1).
      2. Die Mischung bei 37 °C 30 min inkubieren.
      3. Bereiten Sie einen Saccharosegradienten von 0-45 % in TM-Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, pH 7,5) vor. Bereiten Sie den Verlauf mit einem Verlaufsmixer oder manuell vor.
         HINWEIS: Für die manuelle Vorbereitung pipettieren Sie zunächst 5 ml TM-Puffer in ein Gradientenröhrchen. Pipettieren Sie dann mit einer stumpfen Kanüle langsam 5 ml der 45%igen Saccharoselösung vom Boden des Röhrchens, so dass die 0%ige Lösung allmählich aufsteigen kann.
      4. Laden Sie 500 μl der behandelten Phagenlösung auf den Gradienten.
      5. Zentrifugieren Sie bei 70.000 × g für 20 min bei 4 °C.
      6. Zünden Sie das Zentrifugationsröhrchen von unten an. Dies ermöglicht die Visualisierung des Phagen, der als trübe Bande im Gradienten erscheint. Die phagenhaltige Fraktion vorsichtig mit einer stumpfen Kanüle entfernen.
      7. Die extrahierte Phagenfraktion wird in ein neues Ultrazentrifugationsröhrchen überführt.
      8. 30 ml eiskalten TM-Puffer zugeben und bei 100.000 × g 1 h bei 4 °C zentrifugieren.
      9. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 500 μl TM-Puffer resuspendieren.
      10. Lagern Sie die resuspendierten Phagen über Nacht in einem Glasfläschchen bei 4 °C.
   2. Isolierung von Phagen-DNA
      1. Geben Sie 1 μg Proteinase K zu den resuspendierten Phagen.
      2. 30 min bei 37 °C inkubieren.
      3. 1 Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (P/C/I) Gemisch zugeben. Durch Inversion mischen. Trennen Sie die Phasen durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 1 min bei 4 °C. Die wässrige Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführen. Wiederholen Sie die Extraktion dreimal.
         ACHTUNG: Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (P/C/I) ist hochgiftig, ätzend und flüchtig. Greifen Sie immer in einem Abzug und tragen Sie geeignete Schutzausrüstung, einschließlich eines Laborkittels, einer Schutzbrille und doppelter Nitrilhandschuhe. Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt und lagern Sie es in einem dicht verschlossenen Behälter in einem dafür vorgesehenen Chemikalienschrank. Entsorgen Sie Abfälle über zugelassene Gefahrmüllkanäle. Bei Kontakt sofort mit Wasser abspülen und einen Arzt aufsuchen.
      4. Um Restphenol zu entfernen, führen Sie dreifache Chloroform-Rückextraktionen mit 1 Volumen Chloroform durch.
      5. Die DNA wird über Nacht mit 0,1 Volumenprozent 3 M NaOAc (pH 5,5) und 2,5 Volumenvolut Ethanol bei -20 °C gefällt.
      6. Am nächsten Tag wird die DNA durch Zentrifugation bei 15.000 × g für 1 h bei 4 °C pelletiert.
      7. Waschen Sie das DNA-Pellet zweimal mit 200 μl 70%igem Ethanol, schütteln Sie es leicht, zentrifugieren Sie es 15 Minuten lang bei 4 °C bei 15.000 × g und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
      8. Resuspendieren Sie die gereinigte DNA in Reinstwasser.
      9. Lagern Sie die DNA bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.
         HINWEIS: (PAUSEPUNKT) Ausgefällte DNA kann mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden.
   3. Aufbereitung von Phagen-DNA für die LC-MS-Analyse
      1. Verdauen Sie die gereinigte DNA mit einem Nukleosid-Aufschlussmix in einzelne Nukleoside.
      2. Analyse der DNA-Zusammensetzung mittels LC-MS.
         HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht die Validierung der Wirksamkeit der NgTET-Behandlung. Das Protokoll ist an die spezifischen Geräte und Säulen im Labor angepasst, kann aber je nach verfügbaren Ressourcen und Bedingungen angepasst werden.
      3. Verwenden Sie verdaute DNA, die aus gereinigten Phagen isoliert wurde (Schritt 2.1.10).
      4. Für die Messungen sind folgende handelsübliche Normale anzugeben: dA, dT, dG, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC. Falls verfügbar, geben Sie den Standard der Cytosin-Hypermodifikation an, die auf der Phagen-DNA vorhanden ist.
      5. Verwenden Sie ein HPLC-System, das mit einer C18-Säule (150 × 2,1 mm, 100 Å, 3 μm) und einer 20 × 2,1 mm Vorsäule ausgestattet ist.
      6. Stellen Sie die Säulentemperatur auf 40 °C und die Eluentenflussrate auf 0,2 mL/min ein.
      7. Bereiten Sie die Eluenten wie folgt vor:
         Eluent A: 10 mM Ammoniumacetat in Wasser (pH 4,5).
         Eluent B: 0,1 % Ameisensäure in Methanol.
         ACHTUNG: 0,1 % Ameisensäure in Methanol ist brennbar und kann Haut, Augen und Atemwege reizen. Immer in einem gut belüfteten Bereich oder Abzug verwenden. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung, einschließlich eines Laborkittels, einer Schutzbrille und Nitrilhandschuhen. Von Hitze, Funken und offenem Feuer fernhalten. In einem brennbaren Vorratsschrank aufbewahren. Entsorgen Sie über zugelassene Protokolle für gefährliche Abfälle.
      8. Wenden Sie das folgende mobile Phasenprofil an: 0-1 min: Konstant bei 5 % B; 1-5 min: Steigung von 5 % auf 90 % B; 5-7 min: Konstant bei 90% B; 7-7,1 min: Steigung von 90 % auf 5 % B; 7,1-12 min: Konstant bei 5% B.
      9. Verwenden Sie ein Massenspektrometer im negativen und positiven Ionisationsmodus (getrennte Injektionen) mit einer Hochtemperatur-Elektrospray-Ionisationsquelle (H-ESI) unter folgenden Bedingungen:
         H-ESI-Sprühspannung: 3400 V (+), 2400 V (-), Mantelgas: 35 beliebige Einheiten, Hilfsgas: 7 beliebige Einheiten, Sweep-Gas: 0 beliebige Einheiten, Temperatur des Ionentransferrohrs: 300 °C, Temperatur des Verdampfers: 275 °C, Detektionsmodus: Vollständiger Scan mit dem Orbitrap-Massenanalysator, Massenauflösung: 120.000, Massenbereich: 200-450 (m/z).
      10. Extraktion von Ionenchromatogrammen der Formen [M-H]^- (dA, dT, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC) und [M+H]⁺ (5ghmdC) mit der Tracefinder-Software.
      11. Berechnen Sie die relative Häufigkeit jeder Modifikation, indem Sie den Peakbereich jedes Signals auf den dG-Peakbereich innerhalb der Probe normieren, wobei dG als probenspezifischer interner Standard verwendet wird.
2. Validierung mit CRISPR-Cas Spaltungsassay (~2,5 Tage)
   HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht die phänotypische Beurteilung des Erfolgs der NgTET-Behandlung und ihrer Auswirkungen auf die CRISPR-Cas-Spaltung. Wenn NgTET aktiv ist, sollten sich keine Plaques aus der behandelten Phagen-DNA bilden, oder der Phagentiter sollte reduziert werden, da die Entfernung von schützenden DNA-Modifikationen das Genom anfällig für die Spaltung von CRISPR-Cas12 oder 9 macht. Im Gegensatz dazu entspricht die Anzahl der gebildeten Plaques bei unbehandelter Phagen-DNA dem Titer der Phagen, was darauf hindeutet, dass das hypermodifizierte T4-Phagengenom resistent gegen die Spaltung von CRISPR-Cas12 oder 9 ist.
   1. E. coli BL21 (DE3) wird aus einer Übernachtkultur inokuliert, die sowohl mit dem pET28a_NgTET Plasmid als auch mit einem Cas12- oder Cas9-Expressionsplasmid (z. B. DS-spCas oder pCpf1 ohne Spacer) transformiert wurde. Alle Plasmide mit zusätzlichen Informationen finden Sie in Tabelle 1.
      1. Züchten Sie die Zellen in LB-Medium, das mit den entsprechenden Antibiotika bei 3 °C unter Schütteln ergänzt wird, beginnend mit einem OD₆₀₀ von 0,1. Sobald die Kultur einen OD₆₀₀ von etwa 0,4 erreicht, induzieren Sie die NgTET-Expression durch Zugabe von 0,05 mM IPTG und inkubieren Sie weitere 2 Stunden bei 3 °C.
      2. Vergleichen Sie als Kontrolle E . coli BL21 (DE3)-Stämme mit und ohne NgTET-Überexpression. In Abwesenheit von NgTET-Aktivität wird eine höhere Anzahl von plaquebildenden Einheiten erwartet, was auf eine verminderte CRISPR-Cas-Effizienz aufgrund des Vorhandenseins von glykosyliertem 5ghmdC in der Phagen-DNA hinweist.
   2. 300 μl der E. coli-Kulturen in ein steriles Röhrchen überführen.
   3. Infizieren Sie die Kultur mit T4 WT oder NgTET-behandelten Phagen mit MOI 0,01. Wenden Sie für dieses Experiment einen niedrigen MOI an, um sicherzustellen, dass Bakterien jeweils nur von einem Phagen infiziert werden. Dies maximiert die Effizienz des CRISPR-Cas-Spaltscreenings und vereinfacht die Interpretation der Ergebnisse. Vorsichtig mischen, um eine gleichmäßige Verteilung der Phagen zu gewährleisten.
   4. Inkubieren Sie die Bakterien-Phagen-Suspension bei 37 °C für 7 min.
   5. Geben Sie die Bakterien-Phagen-Mischung in 4 ml LB-Weichagar (0,75%), ergänzt mit Antibiotika. Gründlich, aber vorsichtig mischen, um Blasenbildung zu vermeiden.
   6. Gießen Sie die weiche Agarmischung auf eine vorgewärmte LB-Agarplatte.
   7. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur kurz erstarren. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C.
   8. Zählen Sie am nächsten Tag die resultierenden Plaques, um die plaquebildenden Einheiten (PFU) zu bestimmen.

3. CRISPR-Cas-Mutagenese (~ 1 Woche)

HINWEIS: Die CRISPR-Cas-Mutagenese basiert auf dem Prinzip, dass eine bestimmte Stelle innerhalb des Phagengenoms während einer Phageninfektion von einer Cas-Nuklease angegriffen wird, was zu einem Doppelstrangbruch führt. Dieser Bruch wird durch homologe Rekombination unter Verwendung von Spender-DNA repariert, die während der Mutagenese auf einem zweiten Plasmid im infizierten Wirtsstamm bereitgestellt wird. Das Plasmid, das die Spender-DNA enthält, kodiert auch für NgTET, das essentiell ist, um die Zugänglichkeit der Phagen-DNA für die Cas-Nuklease aufrechtzuerhalten, indem es die Häufigkeit modifizierter Cytosine reduziert, wie zuvor beschrieben. In diesem Schritt werden Zielmutationen nach einer Infektion mit E. coli¹⁵ in das Genom von NgTET-behandelten T4-Phagen eingeführt. Um ein gleichbleibend niedriges Maß an DNA-Modifikationen im T4-Genom zu gewährleisten, wird die NgTET-Dioxygenase durch Zugabe von 50 μM IPTG (analog zu Schritt 1.2) während des gesamten Mutageneseprozesses exprimiert.

1. Erzeugung von pET28a_NgTET_donor DNA-Plasmiden mittels Golden Gate Klonierung¹⁵
   1. Für die Erzeugung der Spender-DNA bestellen Sie die gewünschte Sequenz als ganzes Gen oder amplifizieren aus einem Genom, zum Beispiel aus dem Phagengenom, und führen die gewünschte Mutation ein.
      HINWEIS: Für das Design der Spender-DNA sind homologe Regionen zu berücksichtigen, die die Zielstelle flankieren (≈200 bp auf jeder Seite für Punktmutationen; längere Regionen für größere Inserts). Das lineare Donorfragment sollte BsaI-Erkennungsstellen tragen, die bei der Spaltung kompatible Überhänge mit dem Plasmid erzeugen. In-silico-Klonierung wird empfohlen, um das Konstruktdesign zu überprüfen. In den repräsentativen Ergebnissen werden an einem Beispiel alle kritischen Komponenten für die Spender-DNA veranschaulicht.
   2. Führen Sie das Spender-DNA-Fragment stromabwärts der NgTET-kodierenden Sequenz und des Terminators in das pET28a_NgTET Rückgrat ein, indem Sie die Golden-Gate-Assemblierung verwenden.
      1. Bereiten Sie die Assemblierungsreaktionen vor, indem Sie 70 μmol pET28a_NgTET Plasmid, 140 μmol Donor-DNA-Insert, 1 μl BsaI (20 μμl), 5 μl T4-DNA-Ligase und 2 μl 10× Ligasepuffer kombinieren, wobei nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 20 μl hinzugefügt wird.
      2. Führen Sie Reaktionen in 25 Zyklen in einem PCR-Cycler mit den folgenden Einstellungen durch: 1) Restriktion, 37 °C für 1,5 min, 2) Ligation, 16 °C für 3 min, 3) Endrestriktion, 37 °C für 5 min und 4) Denaturierung, 60 °C für 10 min.
   3. 6 μl des Reaktionsgemisches (aus Schritt 3.1.2) mit 100 μl chemisch kompetentem E. coli DH5α zugeben, 10 min auf Eis inkubieren und 45 s lang bei 42 °C einen Hitzeschock setzen. Legen Sie die Zellen sofort für 1 Minute auf Eis und fügen Sie dann 750 μl LB Medium hinzu. Wiederherstellung bei 37 °C durch Schütteln (500 U/min) für 1 h. Platte auf LB-Agar mit Kanamycin (30 μg/ml) aufsetzen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   4. Wählen Sie eine einzelne Kolonie und beimpfen Sie 20 ml LB-Medium, das mit Kanamycin (30 μg/ml) ergänzt wird. Über Nacht bei 37 °C inkubieren und bei 160 U/min schütteln.
   5. Aus 5 ml der Übernachtkultur werden die Zellen pelletiert und die Plasmid-DNA mit einer Standard-Plasmidextraktionsmethode isoliert. Eluieren Sie das Plasmid in 40 μl nukleasefreiem Wasser.
   6. Bestätigen Sie die korrekte Klonierung, indem Sie die Insertionsstelle des Plasmids mit Hilfe der Sanger-Sequenzierung sequenzieren.
2. Aufbau von spacerhaltigen CRISPR-Cas-Plasmiden (pCpf1-sp als Modell)¹⁵
   HINWEIS: Das in diesem Kapitel beschriebene Plasmid ermöglicht den ersten Schritt der Mutagenese, indem es einen ortsspezifischen Doppelstrangbruch im Phagengenom einführt. Während das Verfahren hier mit dem CRISPR-Cas12-System (pCpfl-sp-Plasmid) demonstriert wird, können auch alternative Nukleasen wie CRISPR-Cas9 (DS-spCas-Plasmid) eingesetzt werden¹⁵ .
   1. Entwerfen Sie einen 20-nt-Spacer, der auf die Mutagenesestelle abzielt (PAM: TTTV). Identifizieren und entwerfen Sie geeignete Protospacer und entsprechende Spacer mit bioinformatischen Werkzeugen.
   2. Synthetisieren Sie zwei 5'-phosphorylierte Oligonukleotide. Es ist sicherzustellen, dass jeder 10 nt der gewünschten Spacersequenz (zusammen bildet er den vollständigen 20 nt Spacer) und eine zusätzliche 10 nt Region trägt, die zur Insertionsstelle innerhalb des pCpf1-sp-Plasmids komplementär ist.
   3. Setzen Sie den designierten CRISPR-Cas-Spacer durch PCR-Amplifikation mit den Primern aus Schritt 2 in das pCpf1-sp-Plasmid ein. Richten Sie die Reaktion wie folgt ein (Endvolumen 50 μl): 5 μl 10× GC-Puffer, 1 μl 10 mM dNTPs, 1 μl Forward-Primer (10 μM), 1 μl Reverse-Primer (10 μM), 2,5 μl DMSO, Plasmid-Template entsprechend 2 fmol, 1 μl Phusion-DNA-Polymerase (2 U/μl) und nukleasefreies Wasser bis 50 μl.
   4. Die Reaktionsgefäße in einen Thermocycler stellen und folgendes Programm durchführen: Erstdenaturierung bei 98 °C für 30 s; 25 Zyklen bei 98 °C für 10 s, Glühen bei der entsprechenden Temperatur (X °C) für 30 s und Verlängern bei 72 °C für 6 min; gefolgt von einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 10 min. Die Proben werden bis zur weiteren Verarbeitung bei 4 °C gehalten.
   5. Mischen Sie 5 μl der PCR-Reaktion mit DNA-Ladepuffer (10×) und laden Sie sie auf ein 1%iges Agarosegel. Lassen Sie das Gel 20 Minuten lang bei 130 V laufen und visualisieren Sie die DNA-Banden mit UV-Trans-Beleuchtung. Wenn die Amplifikation erfolgreich ist, reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem geeigneten Aufreinigungskit und eluieren Sie es in 20 μl nukleasefreiem Wasser.
   6. Das Plasmid wird durch Ligation mit 100 ng des amplifizierten Produkts, gemischt mit 1× T4-DNA-Ligase-Puffer und 60 U T4-DNA-Ligase, in einem Gesamtreaktionsvolumen von 15 μl zirkularisiert. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. 100 μl chemisch kompetente E. coli werden mit dem Ligationsprodukt wie in Schritt 3.1.3 beschrieben transformiert. Die Zellen werden auf LB-Agar mit 50 μg/ml Streptomycin aufgesetzt und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
   7. Nehmen Sie eine einzelne Kolonie von der Platte und inokulieren Sie sie in 20 ml LB-Medium, das mit 50 μg/ml Streptomycin ergänzt wird. Über Nacht bei 37 °C inkubieren und bei 160 U/min schütteln. Ernten Sie aus 5 ml der Nachtkultur die Zellen durch Zentrifugation und isolieren Sie die Plasmid-DNA mit einer Plasmidextraktionsmethode Ihrer Wahl. Eluieren Sie das Plasmid in 40 μl nukleasefreiem Wasser.
   8. Bestätigen Sie die erfolgreiche Klonierung, indem Sie das Plasmid an der Insertionsstelle mit Hilfe der Sanger-Sequenzierung sequenzieren.
3. Phagen-Mutagenese
   1. Transformieren Sie E . coli BL21 (DE3)-Zellen mit zwei Plasmiden: pET28a_NgTET_donor-DNA und pCpf1-sp (Cas12)/DS-SPcas (Cas9)-Spacer (erzeugt in den Schritten 3.1 und 3.2). Mischen Sie 1 μl jedes Plasmids mit 100 μl chemisch kompetentem E. coli BL21 (DE3). Befolgen Sie das in Schritt 3.1.3 beschriebene Protokoll. Die transformierten Zellen werden auf Agar mit 50 μg/ml Streptomycin und 30 μg/ml Kanamycin aufgetragen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
   2. Der transformierte E. coli-Stamm (E. coli BL21 (DE3) pET28a_NgTET_donor-DNA und pCpf1-sp(Cas12)/DS-SPcas(Cas9)_spacer) wird in 10 ml LB-Medium geimpft, ergänzt mit 30 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Streptomycin. Über Nacht bei 37 °C inkubieren und bei 160 U/min schütteln.
   3. Am nächsten Tag verdünnen Sie die Übernachtkultur auf einen anfänglichen OD₆₀₀ von 0,1 in 50 ml LB-Medium, das 30 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Streptomycin enthält.
   4. Wachsen Sie die Kultur bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 160 U/min, bis ein OD₆₀₀ von 0,8 erreicht ist. Senken Sie die Temperatur auf Raumtemperatur (RT) und reduzieren Sie die Rührgeschwindigkeit auf 130 U/min.
      1. Um die Phagenadsorption und DNA-Injektion zu verbessern, fügen Sie MgCl₂ und CaCl₂ zu Endkonzentrationen von jeweils 1 mM hinzu, da diese zweiwertigen Kationen effiziente Phagen-Wirt-Interaktionen ermöglichen.
      2. Infizieren Sie die Kultur mit NgTET-vorbehandelten T4-Phagen und als Negativkontrolle mit NgTET-unbehandelten T4-Phagen bei einem MOI von 0,1. Die Inkubation bei RT für 4 Stunden fortsetzen.
   5. Nach der Inkubation werden die Kulturen in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt und 20 Minuten lang bei 4000 × g bei 4 °C zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Filtern Sie die Überstände durch einen 0,45 μm Filter, um alle verbleibenden Bakterienzellen zu entfernen. Verwenden Sie die filtrierten Überstände für Plaque-Assays (beschrieben in Schritt 2.2), um die Phagenkonzentration zu bestimmen oder eine Gegenselektion durchzuführen.

4. Identifizierung von Mutanten

HINWEIS: Der Zweck der Gegenselektion besteht darin, den Anteil der nach der Mutagenese in der Population verbleibenden Wildtyp-Phagen zu verringern. Zu diesem Zweck werden Phagen, die aus dem Mutageneseschritt (Schritt 3.3) gewonnen wurden, verwendet, um E. coli zu infizieren, die das gleiche CRISPR-Cas13-System tragen, das von einem anderen Plasmid pBA560 (zusätzliche Informationen in Tabelle 1) und der gleichen Spacersequenz kodiert wird, die während der Mutagenese angewendet wurde. In diesem Aufbau erkennen und spalten Cas-Nukleasen selektiv Wildtyp-Phagen-DNA, während Phagen, die die gewünschten Mutationen tragen, davon unberührt bleiben. Dieser Selektionsdruck unterdrückt die Wildtyp-Replikation und reichert die Population für mutierte Phagen^{an 14}.

1. Gegenselektion mit Cas13
   1. Infizieren Sie E. coli Cas13a_spacer (Plasmid pBA560) mit den Phagen für die Gegenselektion. Dieser Schritt erleichtert die Gegenselektion, indem Phagen-RNA abgebaut wird, die nicht die beabsichtigte Mutation durchlaufen hat.
   2. Führen Sie die Zählerauswahl unter den gleichen Bedingungen durch, die während der Mutagenese verwendet werden (siehe Schritte 3.3.1-3.3.5). Verwenden Sie E. coli , die einen nicht zielgerichteten Cas13a-Spacer exprimieren, als Negativkontrolle, um zu bestätigen, dass die Plaquereduktion spacerspezifisch ist.
   3. Nach der Inkubation wird der Überstand mit gegenselektierten Phagen durch einen 0,45-μm-Filter filtriert, um bakterielle Ablagerungen zu entfernen.
      HINWEIS: (PAUSE-PUNKT) Filtrierte Phagen sind mehrere Monate bei 4 °C stabil, wenn sie in LB-Medium in einer Glasflasche gelagert werden.
   4. Verwenden Sie die gegenselektierten und gefilterten Phagen für einen Plaque-Assay an einem E. coli B-Stamm , um einzelne Plaques für die nachgelagerte Validierung zu isolieren.
2. Next Generation Sequencing (~ 1 Woche)
   HINWEIS: Die Methode für den hochmultiplexierten Sequenzierungsansatz umfasst einen zweistufigen PCR-Prozess zur Erzeugung von gemultiplexter Amplikon-DNA, die für die Long-Read-Sequenzierung der nächsten Generation geeignet ist¹⁶.
   1. Trennen Sie die Phagen von der Mutagenese, indem Sie sie wie in Schritt 2.2 beschrieben ausplattieren. Geeignete Kontrollen sind durch die Verwendung von Phagen aus der Mutagenese einzubeziehen, die sowohl in Gegenwart als auch ohne NgTET-Expression durchgeführt wurden. Als Kontrolle sollte das Targeting von CRISPR-Cas9 und Cas12 ohne NgTET nicht zur Einführung von Punktmutationen führen. Im Gegensatz dazu wird erwartet, dass die Co-Expression von NgTET eine erfolgreiche Editierung ermöglicht, was zu einer höheren Mutagenese-Effizienz führt.
   2. Um die einzelnen Phagen zu isolieren, entnehmen Sie einzelne Plaques aus der Platte und überführen Sie sie in ein Röhrchen mit 100 μl Pi-Mg-Puffer (26 mM Na₂PHO₄, 68 mM NaCl, 22 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, pH 7,5) und 1 μl CHCl₃.
      ACHTUNG: Chloroform ist giftig, flüchtig und steht im Verdacht, auch in kleinen Mengen krebserregend zu sein. Handhaben Sie nur in einem Abzug und tragen Sie vollständige Schutzausrüstung, einschließlich eines Laborkittels, einer Schutzbrille und Nitrilhandschuhen. Vermeiden Sie Einatmen und Hautkontakt. In einem dicht verschlossenen Behälter in einem belüfteten, brennbaren Chemikalienschrank lagern. Entsorgen Sie Chloroform-Abfälle über die Sammlung gefährlicher Abfälle.
   3. Verwenden Sie 1 μl isolierten Phagen T4 in Pi-Mg-Puffer als Vorlage für das Screening.
   4. Bereiten Sie die Reaktionsmischung mit 0,125 μM jedes Primers (um die Einführposition) und 1x hochpräzisen Polymerase-Mastermix vor und stellen Sie das Gesamtvolumen der Amplifikationsreaktion auf 10 μl ein. Führen Sie eine PCR-Reaktion mit 30 Amplifikationszyklen durch.
   5. Führen Sie eine zweite PCR durch, um die Barcodes anzuhängen. Verwenden Sie daher 1 μl einer 1:10-Verdünnung des Produkts aus der ersten PCR als Vorlage.
   6. Bereiten Sie den Reaktionsmix mit 0,3 μM Barcoding-Primern und einem High-Fidelity-Hot-Start-Polymerase-Mix in einem Gesamtvolumen von 7 μl vor. Führen Sie die PCR mit 20 Amplifikationszyklen durch.
      HINWEIS: (PAUSE-PUNKT) PCR-Produkte können mehrere Wochen bei -20 °C gelagert werden.
   7. Bündeln Sie alle barcodierten PCR-Produkte und reinigen Sie sie mit magnetischer Bead-basierter Aufreinigung gemäß Standardprotokollen für die Erstellung von Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation.
   8. Die DNA mit magnetischen Kügelchen einfangen, zweimal mit 80 % Ethanol waschen und in 100 μl Elutionspuffer (5 mM Tris-HCl, pH 8,5) eluieren.
   9. Messen Sie die DNA-Konzentration mit spektrophotometrischen und fluorometrischen Methoden, wobei je nach Bedarf entweder ein Breitbereichs- oder ein hochempfindlicher Assay angewendet wird.
      HINWEIS: (PAUSE-PUNKT) DNA kann mehrere Wochen bei -20 °C gelagert werden.
   10. Generieren Sie Sequenzierungsbibliotheken mit einem ligationsbasierten Protokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers, beginnend mit 1 μg Eingangs-DNA.

5. Rückgewinnung von DNA-Modifikationen durch Mutantenvermehrung und Nachweis

HINWEIS: Sobald die gewünschte Phagenmutante identifiziert ist, wird sie in Wildtyp-E. coli vermehrt, um DNA-Modifikationsniveaus wiederherzustellen, die denen des WT-Phagen ähneln. Dadurch wird sichergestellt, dass der mutierte Phage in nachfolgenden biologischen Experimenten, abgesehen von der eingeschleppten Mutation, ohne Kompromisse verwendet werden kann.

1. Eine 10-ml-Kultur des Stammes E. coli B in LB-Medium vorbereiten und über Nacht bei 37 °C und Schütteln bei 160 U/min inkubieren.
2. Beimpfen Sie am nächsten Tag ein frisches 50-ml-LB-Medium mit der Übernachtkultur, um einen anfänglichen OD₆₀₀ von 0,1 zu erreichen.
3. Lassen Sie die Kultur bei 37 °C und Schütteln bei 160 U/min wachsen, bis sie einen OD₆₀₀ von 0,8 erreicht.
4. 50 μl des mutierten Phagenbestands (4.2.2) werden in die Kultur gegeben. Entfernen Sie die Phase vorsichtig, um eine Übertragung von CHCl₃ zu vermeiden.
5. Inkubieren Sie die infizierte Kultur über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln bei 120 U/min.
6. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Kultur bei 4000 × g , um Bakterienzellen zu entfernen. Filtrieren Sie den Überstand durch einen 0,45 μm Filter, um den Phagen aufzufangen.
7. Den filtrierten mutierten Phagen in einen Glasbehälter umfüllen und bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: (PAUSE-PUNKT) Filtrierte Phagen sind mehrere Monate bei 4 °C stabil, wenn sie in LB-Medium in einer Glasflasche gelagert werden.
8. Als optionale Validierung der Regeneration von DNA-Modifikationen, insbesondere von glykosylierten Cytosinen, ist eine LC-MS-Analyse durchzuführen, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
   1. Zu diesem Zweck wird die gewonnene Phagen-DNA aus den Phagen-Nachkommen wie in Schritt 2.1.1 beschrieben, aufgereinigt, wie in Schritt 2.1.2 isoliert, und anschließend für die LC-MS-Analyse vorbereitet, wie in Schritt 2.1.3 beschrieben.
   2. Analysieren Sie Ionenchromatogramme und berechnen Sie die relative Häufigkeit jeder Modifikation, indem Sie den Peakbereich jedes Signals auf den dG-Peakbereich innerhalb der Probe normieren, wobei dG als probenspezifischer interner Standard verwendet wird, wie in den Schritten 2.1.3 beschrieben.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, T4-Wildtyp-Phagen, T4-Phagen, die mit NgTET behandelt wurden, und T4-Phagen, die mit der inaktiven NgTET D234A-Variante behandelt wurden, als Kontrollen einzuschließen, um die Abundanz von 5ghmdC¹⁰ direkt zu validieren und zu vergleichen.

Ergebnisse

Identifizierung der Phagenbande im Gradienten.
Die Sichtbarkeit der Phagenbande im Gradienten hängt von der Phagenkonzentration in der Ausgangsprobe ab, die auf dem Gradienten geladen ist. Wenn der Phagen ausreichend konzentriert ist (~>1 × 10¹¹ PFU/ml), kann die Bande deutlich gesehen werden, indem der Gradient von unten mit einer Lichtquelle beleuchtet wird (siehe Abbildung 3).

Bei niedrigen Phagenkonzentrationen kann es jedoch ...

Diskussion

Diese Studie stellt eine robuste und anpassungsfähige Strategie zur Einführung präziser Punktmutationen in Bakteriophagengenome vor, einschließlich Einzelnukleotidveränderungen. Ein zentrales Element des Workflows ist die Integration strenger Validierungsschritte in jeder Phase, die sowohl für die Genauigkeit als auch für die Effizienz der Genom-Editierung unerlässlich ist. Dies ist besonders wichtig angesichts der mehrstufigen Natur des Arbeitsablaufs und der dynamischen Wechselwirkunge...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Reaktionsgefäße	Sarstedt	72.690.001
15 mL Kanonialröhrchen	Sarstedt	62.554.502
15 mL Dünnwandige Polypropylen-Röhrchen mit offenem Oberkörper	Beckman Coulter Biowissenschaften	361706	16 mm x 95 mm (für Ultrazentrifugation)
50 mL kanonische Röhrchen	Sarstedt	62.547.254
5x GC-Puffer	Thermo Fisher Scientific	F519L
6x TriTrack DNA-Ladefarbstoff	Thermo Fisher Scientific	Nr. R1161
Agarose	Meridian BIOSCIENCE	BIO-41025	Molekulare Qualität
Avanti J-30I Zentrifuge	Beckman Coulter Biowissenschaften	kein Katalog  Zahl	Serien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
Borsäure	Merck	10043-35-3
BsaI-HF v2	SCHNABEL	Nr. R3733S
Calciumchlorid-Hexahydrat	ACROS ORGANICS	7774-34-7	97 %, extra rein
Zelldichte-Messgerät	Harvard Biochrom	80211630
ChemiDoc MP	Biorad	12003154
Chloroform	VWR	650498
Küvetten	Sarstedt	67.742
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma Aldrich	Nr. D4540
Di-Natriumhydrogenphosphat	neoFroxx GmbH	7558-79-4	Pharma-Qualität
Einweg-Pasteur-Pipetten aus Glas	VWR	612-1702	ca. 230 mm
DNase I	Roche	4716728001	10 U/µ L
dNTP-Mix (10 mM pro dNTP)	Sigma-Aldrich	72004
DS_SPcas_ModA	Hauseigenes Produkt.	https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps	Plasmidkonstrukt, das CRISPR-Cas12/ModA sgRNA enthält
DS-spCas (CRISPR-Cas9-System)	Addgene	48645 (Addgene-Zubehörnummer)	Plasmid zur Konstruktion von spacerhaltigen CRISPR-Cas Plasmiden (CRISPR-Cas9 System) für die Phagenmutagenese (Schritt 3.2)
E. coli B-Stamm Stamm wurde für T4-Infektionen verwendet	DSMZ	kein Katalog  Zahl	Escherichia coli (Migula 1895) Castellani und Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)
E. coli BL21 (DE3) Expressionsstamm, kompetente Zelle	Invitrogen	C600003	Expressionsstamm, kompetente Zellen.
E. coli DH5α Klonierungsstamm, kompetente Zellen	Invitrogen	18265017	Klonierender Stamm, kompetente Zellen.
EDTA	Roth	8043.2
Ethanol (absolut)	VWR	200-578-6
Flongle-Durchflusszelle	Oxford Nanopore Technologies	kein Katalog  Zahl	R10.4.1. Chemie, https://nanoporetech.com/document/flongle
Gene JET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Fisher Scientific	10242490
GeneRuler 1 kb Plus DNA-Leiter	Thermo Fisher Scientific	Nr. SM1331
GeneRuler ULR DNA-Leiter	Thermo Fisher Scientific	Nr. SM1213
Gradient Master 108	BIOCOMP	kein Katalog  Zahl	https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
Heraeus Pico 17 Zentrifuge	Thermo Scientific	75002410
Infors HT Inkubator Minitron	Infors AG	kein Katalog  Zahl	https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)	Sigma-Aldrich	367-93-1
Kanamycin	Carl Roth	Nr. T832.1
LB-Agar	Carl-Roth	X969.1
LB-mittel (Luria/Miller)	Carl-Roth	X968.1
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Sigma-Aldrich	7791-18-6
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	7487-88-9
MinION-Gerät	Oxfrod Nanoporen-Technologien	kein Katalog  Zahl	https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
ModA-E165A_fw	IDT	GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT	Forward Primer zur Einführung der Punktmutation für ModA E165A und zur Einführung von Sticky Ends für die Golden Gate Klonierung (Schritt 3.1)
ModA-E165A_rev	IDT	CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC	Reverse Primer zur Einführung der Punktmutation für ModA E165A und zur Einführung von Sticky Ends für die Golden Gate Klonierung (Schritt 3.1)
ModA_sgRNA_Cas12_fw	IDT	TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTAA GTTCTTAGACCCG	Forward Primer zur Generierung von Spacer für CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 Systeme zur Phagenmutagenese und Gegenselektion (Schritt 3.2 und Schritt 4.1)
ModA_sgRNA_Cas12_rev	IDT	AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC	Reverse Primer zur Erzeugung von Spacer für CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 Systeme zur Phagenmutagenese und Gegenselektion (Schritt 3.2 und Schritt 4.1)
NanoDrop ND-1000 Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific	AZY2019944
NucleoMag Bausatz	Machery Nagel	REF 744970.50
Nukleosid-Aufschluss-Mix	Neuengland Biolabore	M0649S
pBA560 (CRISPR-Cas13-System)	Addgene	186236 (Addgene-Zubehörnummer)	Plasmid-kodierendes CRISPR-Cas13-System für die Gegenselektion (Schritt 4.1)
pCpfl-sp-Plasmid (CRISPR-Cas12-System)	Addgene	122186
pCpfl-sp-Plasmid (CRISPR-Cas12-System)	Addgene	122186 (Addgene-Zubehörnummer)	Plasmid zur Konstruktion von spacerhaltigen CRISPR-Cas-Plasmiden (CRISPR-Cas12-System) für die Phagenmutagenese (Schritt 3.2)
PCR-Reaktionsgefäße	Sarstedt	72.991.002
PeqGREEN	VWR	732-3196
pET28a_NgTET	Hauseigenes Produkt.	kein Katalog  Zahl	Plasmid ist auf Anfrage erhältlich, die Plasmidkarte finden Sie unter den folgenden https://zenodo.org/records/10615143
pET28a_NgTET	Hauseigenes Produkt.	kein Katalog  Zahl	Plasmid für die Konstruktion von pET28a_NgTET_donor DNA mittels Golden Gate Klonierung (Schritt 3.1), Plasmid  ist auf Anfrage erhältlich, die Plasmidkarte finden Sie unter den folgenden https://zenodo.org/records/10615143
Petriplatten	Sarstedt	82.1473.001	92 x 16 mm mit Nocken
Phusion DNA-Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F-530XL	2 U/&Mikro; L
Kaliumphosphat	Sigma Aldrich	7778-77-0	Monobasic
PowerPac Universal-Netzteil	Bio Rad	1645070
Proteinase K	Carl Roth	7528.1	100 mg/ml
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	QIAGEN	28506
Quantus Fluormeter, QuantiFluor dsDNA-System	Promega	Nr. E2670
RNase A/T1	Thermo Fisher Scientific	EN0551	mischen Sie 2 mg/ml RNase A 5000 U/ml RNase T1
Roti-Aqua P/C/I für die DNA-Extraktion	Carl Roth	Nr. X985.1
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	127-09-3
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	7647-14-5
SQK-LSK109 Ligations-Sequenzierungskit	Oxford Nanopore Technologies	kein Katalog  Zahl	https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109
Steritop Filter, 0,22 &Mikro; M Porengröße	Millipore	S2GPT05RE	250 mL und 500 mL
Streptomycin 50 mg/L	Carl Roth	HP66.1
Saccharose	NeoFroxx GmbH	57-50-1	für Molekularbiologie
Schwingschaufel Aluminiumrotor	Beckman Coulter Biowissenschaften	JS[1]24.15
T4 DNA Ligase 5 U/µ L	Thermo Fisher Scientific	EL0011
T4-DNA-Ligase-Puffer	Thermo Fisher Scientific	Nr. B69
Reagenzgläser, dickwandig, randlos	Karl Hecht GmbH	42775054	100 mm x 18 mm
Thermocycler, T100	Biorad	1861096
Thermomixer comfort	Eppendorf	5382000015
Trizma Basis	Sigma Aldrich	77-86-1
Wasserbad, VWB2	VWR	462-0557	12 L Volumen