Methode für selektiven REM-Schlafmangel mit dem selektiven Nasenschnippen zum Vergessen von REM (SNiFFer)

Summary

Wir stellen ein neuartiges Protokoll für die selektive Deprivation des Rapid Eye Movement (REM)-Schlafs bei Nagetieren vor.

Abstract

Schlaf wird grob in Rapid Eye Movement (REM) und Non-REM-Phasen unterteilt, und verschiedene Schlafentzugstechniken wurden entwickelt, um deren Funktionen zu untersuchen. Traditionelle Methoden – wie mechanische Stimulation oder das Fallen des Tieres während des REM-Schlafs – führen oft zu schneller Gewöhnung und unbeabsichtigtem Stress, was die Interpretation erschwert. Hier stellen wir eine neuartige, milde und sanfte Methode für REM-Schlafmangel bei Nagetieren vor: SNiFFer. Nagetiere sind dafür bekannt, sehr empfindlich auf Nasenreize zu reagieren. Bei dieser Methode streicht ein sanfter Pinsel während des REM-Schlafs sanft über die Nase des Tieres und löst so zuverlässig die Erregung aus. Um diese Technik während des REM-Schlafs gezielt anzuwenden, nutzten wir ein KI-basiertes Echtzeit-Elektroenzephalographie-(EEG)-Schlafstufenklassifikationssystem. Die Intervention wurde nur während REM-Episoden ausgelöst, und eine gelenkte Kontrollgruppe wurde einbezogen, die unabhängig vom Schlafzustand das gleiche Stimulationsmuster erhielt. Wir haben SNiFFer zudem in einem Trace Fear Conditioning-Paradigma angewandt, um zu testen, ob REM-Schlafmangel innerhalb von 6 Stunden nach dem Lernen die Gedächtniskonsolidierung beeinträchtigt. Im Vergleich zu Kontrollgruppen zeigten mit SNiFFer behandelte Tiere eine signifikante Verringerung der Gesamt-REM-Episode und der REM-Episodendauer, was auf die Spezifität und Wirksamkeit der Methode hinweist. Zusammenfassend bietet die SNiFFer-Technik einen hochselektiven, minimalinvasiven taktilen Ansatz für REM-Schlafmangel bei Mäusen. Sie ermöglicht eine präzise Kontrolle experimenteller Bedingungen und eröffnet neue Möglichkeiten, die Rolle des REM-Schlafs im Gedächtnis und in der Kognition zu untersuchen – mit einem kitzligen Twist.

Introduction

Der Schlaf mit schneller Augenbewegung (REM) spielt eine entscheidende Rolle bei kognitiven Prozessen wie der Gedächtniskonsolidierung ^1,2. Um die funktionelle Bedeutung des REM-Schlafs im Gehirn zu untersuchen, wird REM-Schlafdeprivation häufig als experimenteller Ansatz eingesetzt. Derzeit werden vier Hauptmethoden häufig eingesetzt, um REM-Schlafmangel bei Nagetieren zu induzieren: die rotierende Scheibenmethode¹, die Blumentopfmethode³, die Luftpuff-Methode⁴ und die körperlichen Stimulationstechniken ^5,6. Obwohl die rotierenden Scheiben- und Blumentopfmethoden sehr effektiv sind, um REM-Schlaf zu beseitigen, verursachen sie oft erheblichen Stress für das Tier, wie etwa Wasserbelastung oder körperliche Erschöpfung⁷, was die Interpretation von Verhaltens- und physiologischen Ergebnissen beeinträchtigen kann. Ähnlich neigen die Air-Puff- und konventionellen physischen Stimulationsmethoden dazu, breite, unspezifische Reize an den Körper zu liefern, was zu einer Variabilität der Reizintensität und einer begrenzten Auswahl an Kontrollgruppen^{führt 4,8}.

Wir führten einen umfassenden Literaturvergleich über mehr als sechs Jahrzehnte Forschung zum REM-Schlafmangel durch, der in Supplementary File 1 und Supplementary Table 1 bereitgestellt ist. Wir integrierten grundlegende historische, mechanistische, neurochemische, hormonelle und verhaltensbezogene Studien aus den wichtigsten Forschungslinien, darunter Jouvet, Rechtschaffen, Bergmann, Tufik, Andersen und Borbély. Ergänzende Tabelle 1 ordnet die wichtigsten Arbeiten chronologisch. Es verfolgt die methodologische Entwicklung von REM-Schlafdeprivationstechniken und fasst deren wichtigste biologische, neurochemische, hormonelle, immune, thermoregulatorische und verhaltensbezogene Ergebnisse zusammen. Da das vorliegende Manuskript als Methodenartikel und nicht als umfassende historische Übersicht strukturiert ist, wurde dies als ergänzende Information hinzugefügt.

Um diese Einschränkungen zu beheben, entwickelten wir eine neuartige Methode, die eine hohe Selektivität für REM-Schlafmangel bietet. Diese Technik ist darauf ausgelegt, Nagetiere gezielt den REM-Schlaf zu entziehen. Bei diesem Ansatz begrenzen wir den Reiz auf die Nase des Tieres – einen der empfindlichsten Bereiche bei Nagetieren⁹. Zusätzlich verwenden wir ein KI-basiertes Echtzeit-Schlafstufenklassifikationssystem, um REM-Schlafepisoden mit zeitlicher Spezifität¹⁰ zu erkennen und zu unterbrechen. Dieses KI-System bezieht sich auf das EEG-Signal in den letzten 4 Sekunden von einem einzelnen Kanal und bewertet die aktuellen Schlafphasen der Maus. Dieses Setup ermöglicht auch die Implementierung von gekoppelten Kontrollgruppen, was zeitlich abgestimmte Interventionen ermöglicht. Obwohl unser Protokoll als physikalisch-stimulationsbasierte REM-Schlafdeprivationstechnik kategorisiert wird, unterscheidet es sich von herkömmlichen Methoden. Zunächst haben wir eine Echtzeit-Schlafphasenanalyse mit KI für eine genaue und konsistente REM-spezifische Intervention angewandt. Zweitens beschränkt sie den Stimulationsbereich auf nur die Oberseite der Nase, die einer der empfindlichsten Bereiche bei Mäusen⁶ ist, was zu minimalen Variationen in der Stimulationsdauer und -stärke führt. Schließlich haben wir neu eine Kontrollgruppe eingerichtet, die identische Stimulation erhielt, um Störfaktoren zu kontrollieren. Dieses Protokoll schlägt eine Methode zur Untersuchung von Funktionen vor, die spezifisch für den REM-Schlaf sind.

Um den Nutzen dieser Methode zu bewerten, haben wir sie angewandt, um die Rolle des REM-Schlafs bei der Konsolidierung von Spurenangst-Erinnerungen zu untersuchen. Frühere Studien berichteten, dass REM-Schlafmangel die hippocampusabhängige Angstgedächtniskonsolidierung beeinträchtigt, einschließlich der verzögerten Angsterinnerungen^11,12. Es gibt jedoch widersprüchliche Belege hinsichtlich der Auswirkungen von REM-Schlafmangel auf Gedächtnisprozesse, die verteilte und komplexe Gehirnschaltkreise^{aktivieren 5,13}. Die Konsolidierung von Spurenangst-Gedächtnissen erfordert die Verbindung eines Fußschocks (unkonditionierter Reiz), eines auditiven Hinweises (konditionierter Reiz) und des Spurintervalls zwischen ihnen – ein Prozess, der dafür bekannt ist, mehrere Gehirnregionen zu rekrutieren, darunter den Hippocampus, den medialen präfrontalen Kortex und Amygdala¹⁴. Deshalb haben wir Mäuse unmittelbar nach der Spurenangstkonditionierung¹⁵, einem Zeitfenster, das für die Gedächtniskonsolidierung¹⁶ als entscheidend gilt, 6 Stunden REM-Schlaf vorenthalten. Mit diesem Protokoll bewerteten wir die Wirkung des REM-Schlafmangels auf die Konsolidierung von Gedächtnisspuren, die von der koordinierten Aktivität verteilter neuronaler Systeme abhängen. Dieser Artikel stellt eine neuartige Methode vor, die ein detailliertes experimentelles Protokoll beschreibt, das die Effekte testet.

Protocol

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Tsukuba genehmigt. Männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse (11–13 Wochen alt, 20–35 g) wurden in dieser Studie verwendet. Die vollständige Liste der in dieser Studie verwendeten Materialien und Instrumente findet sich in der Materialtabelle.

1. Chirurgische Einpflanzung von EEG-Elektroden¹⁷

1. Anästhesie und Vorbereitung des Tieres
   1. Anästhesie mit 4 % Isofluran gemischt mit Luft in 3 Minuten einleiten. Eine ausreichende Anästhesie wurde durch das Fehlen des Pedalrückzugsreflexes und des Muskeltonus sowie durch stabile Atemmuster bestätigt.
   2. Rasieren Sie den dorsalen Kopf- und Halsbereich vom Nacken bis zum Bereich zwischen den Augen mit einem elektrischen Rasierer. Wenn eine Maus Wachheit anzeigt, wie z. B. die Bewegung des Schnurrhauts, wird erneut eine Anästhesie induziert.
2. Kopffixierung und Schädelexposition
   1. Sichern Sie das Tier in einem stereotaxischen Rahmen und sorgen Sie für Nasen- und Schädelausrichtung. Von diesem Zeitpunkt bis zum Ende des gesamten chirurgischen Eingriffs wurde die Anästhesie kontinuierlich über ein Isofluran-Verdampferpumpensystem aufrechterhalten.
   2. Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Entfernen Sie restliche Haare mit einer Enthaarungscreme.
   3. Machen Sie einen Schnitt auf der Kopfhaut in der Mitte und ziehen Sie die Haut vorsichtig zurück, um den Schädel von der hinteren Ohrlinie bis zur vorderen Augenlinie freizulegen. Entfernen Sie das Schleimhautgewebe mit einem Wattestäbchen.
3. Kennzeichnung und Nivellierung von Wahrzeichen
   1. Identifizieren Sie Bregma und Lambda; Stellen Sie den stereotaxischen Arm so ein, dass diese Punkte innerhalb von ±0,05 mm waagerecht sind. Überprüfen Sie, dass die seitlichen Koordinaten ±3,0 mm vom Bregma entfernt ebenfalls waagerecht sind (±0,05 mm).
4. Bohren und Schraubenplatzierung
   1. Markiere folgende Koordinaten relativ zu Bregma. Bohren Sie vier Pilotlöcher als diese Koordinaten. Vordere–Hintere / Medial–Seitenweite: +1,5 mm / ±1,5 mm, –3,0 mm / ±1,7 mm.
   2. Implantieren Sie EEG-Aufzeichnungsschrauben in jedes Loch und sichern Sie sie mit cyanoacrylatbasiertem Gelkleber. Bündeln und bedecken Sie den freiliegenden Schädel und die Leitungen mit einer dünnen Schicht Zahnbeton.
5. Postoperative Versorgung
   1. Verabreichen Sie 0,5 ml 5%ige Glukoselösung und 0,13 ml Ibuprofen (oder ein gleichwertiges Analgetikum).
   2. Bringen Sie die Maus zurück in ihren Stammkäfig, einen zylindrischen Plexiglaskäfig (21,9 cm Durchmesser, 31,6 cm Höhe), der in einer isolierten Kammer (45,7 x 50,8 x 85,4 cm) platziert ist. Die Kammer wird bei einer Temperatur von 23,5 ± 2,0 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50,0 % ± 10,0 % und einem 12-stündigen Hell-/Dunkelzyklus (Lichtphase: 9:00 Uhr bis 21:00 Uhr) gehalten.
   3. Setze das Tier in einen erwärmten Erholungs-Käfig. Warte vor dem Korb, bis eine Maus aufwacht. Nach der Operation wurden die Tiere in Einzelunterkünften untergebracht und während des gesamten Experiments nicht in Gruppenunterkünfte zurückgebracht.

2. Handhabung und Gewöhnung

1. Zeitplan für Experimente
   1. Beginnen Sie mit der Handhabung während der Lichtphase 24–48 Stunden nach der Operation. Fahren Sie vier Tage in Folge weiter.
2. Operatives Verfahren
   1. Am ersten Tag eine Maus für 2 Minuten zur Hand für 2 Minuten. Legen Sie die Maus mit ausgestreckten Fingern und nach oben gezeigter Handfläche auf die offene Handfläche des Experimentatoren. Positioniere die Handfläche etwas höher als den Unterarm, da Mäuse von Natur aus auf erhöhte Flächen klettern. Erlaube der Maus, sich frei und uneingeschränkt zu bewegen; Wenn die Maus versucht, auf den Unterarm zu klettern, bringen Sie ihn sanft zurück in die Handfläche, indem Sie die Basis des Schwanzes leicht halten. Jedes Intervall dauert mehr als 20 Minuten. Dies sollte während der Lichtphase erfolgen.
      HINWEIS: Wenn eine Maus aus der Hand springt oder sie beißt, verwenden Sie am ersten Tag Stoff oder Seidenpapier, um die Hand zu bedecken. Kleidung kann wiederverwendet werden und sollte alle zwei Wochen gereinigt werden.
   2. An Tag 2–4 hast du eine Maus für 2 Minuten zur Hand für 3x. Jedes Intervall und die durchgeführte Phase sind identisch mit Tag 1. Verhaltensmessig bewerten: Nicht gewohnte Mäuse versuchen typischerweise durch Springen oder heftiges Beißen zu entkommen, während gewöhnte Mäuse die Handfläche aktiv erkunden, mit minimalen Fluchtversuchen und wenig bis keinem kräftigen Beißen.
   3. Am Ende der letzten Handling schließen Sie die Maus an das EEG-Aufnahmekabel an.
      HINWEIS: Wenn das Einstreumaterial zu stark ist, um die Nase einer Maus zu behindern, nehmen Sie einige davon manuell und entfernen Sie sie während der Handhabung oder beim Verbinden.

3. Baseline-EEG-Aufzeichnung

1. Beginnen Sie mit den postoperativen Tagen 5 und 6. Nehmen Sie täglich von 11:00 bis 17:00 Uhr kontinuierliches EEG auf. Wenn das Einstreu den Zugang zur Mausnase versperrt, entfernen Sie schrittweise überschüssige Einstreu, um einen klaren Zugang zur Nase zu gewährleisten und gleichzeitig die Störung des Tieres für den weiteren Prozess zu minimieren.

4. Angstkonditionierung^18,19

1. Beginnen Sie am postoperativen Tag 7 (oder 8) zwischen 10:00 und 11:00 Uhr. Zur Vorbereitung wird 70 % Ethanol in die Konditionierungskammer (30 x 25 x 24 cm) gesprüht, die aus klaren Acrylwänden und einem Edelstahlgitterboden (2,0 mm Durchmesser Stäbe im Abstand von 6,0 mm) besteht.
2. Trainingsprotokoll (Gesamteinheit 1.100 S)
   1. Senden Sie fünf akustische Hinweise (20 Sekunden aufsteigender Klang, 5–20 kHz bei 1,25 Hz, 0,8 Sekunden Dauer) bei 180 Sekunden, 400 Sekunden, 620 Sekunden, 840 Sekunden und 1060 Sekunden. Kombinieren Sie jeden Sound-Cue mit einem Fußstoßdämpfer (1,0 mA, 2 s), der bei 218 s, 438 s, 658 s, 878 s und 1098 s geliefert wird.

5. REM-Schlafmangel

1. REM-Schlafdeprivationsgruppe (RSD-Gruppe)
   1. Unmittelbar nach der Angstbedingung (ZT2-ZT8) überwachen Sie das EEG in Echtzeit, indem Sie das KI-basierte Schlafstufenklassifikationssystem aktivieren, das eine Echtzeiterkennung des REM-Schlafs ermöglicht. Bei der Erkennung des REM-Schlafs kitzeln Sie sanft mit einem sanften Pinsel die Nase des Tieres, bis es wieder erwacht, mit einer durchschnittlichen Latenz vom Beginn des Reizes bis zur Erregung von 0,89 ± 0,063 s (mittlerer ± SEM).
   2. Während des Experiments wurde Erregung als Verhaltensreaktion auf den taktilen Reiz definiert, insbesondere auf die Bewegung eines Schnurrhauts nach der Stimulation. Notiere den Zeitstempel jedes Kitzels für eine spätere Analyse.
      HINWEIS: Die kitzelnde Bewegung wurde ohne festes Richtungsmuster (z. B. hin und her, aufwärts oder kreisförmig) ausgeführt, während eine konstante leichte taktile Stimulation auf die Nasenspitze beschränkt war. Wenn die Nase verstopft ist, richten Sie die Stimulation auf den vibrissalen (Schnurrhaar-)Bereich, der typischerweise freiliegt. Wenn die Maus vom Pinsel weggedreht ist, drehen Sie den Käfig bei Bedarf, um ungehinderten Zugang zum Nasenbereich zu gewährleisten. Bei Verwendung eines Käfigs mit offenem Oberteil kann auch eine Stimulation von oben angewendet werden, um einen gleichmäßigen Zugang zu Nase oder Vibrissal zu gewährleisten.
2. Gejüdelte Kontrollgruppe (Gejüdelte Gruppe)
   1. Koppele jede geknutschte Maus mit einem REM-entzogenen Gegenstück. Wenden Sie Nasenkitzeln auf die geknutschte Maus in Synchronität zu den REM-Episoden ihres Partners an, wobei sowohl der Beginn als auch die Dauer abgestimmt werden. Jede Maus verwendet während des REM-Schlafdeprivations-Experiments denselben speziellen Pinsel. Nach jeder Anwendung sprühen Sie die Bürste mit schwach saurem Wasser und wischen Sie sie mit Taschentuch ab. Lassen Sie mindestens 24 Stunden zwischen den Gebrauchszeiten ein, um sicherzustellen, dass der gereinigte Pinsel vollständig trocken ist.

6. Gedächtnisabruftests

1. Kontextueller Rückruftest (Test A)
   1. Beginnen Sie mit 24 Stunden (±3 Stunden) nach Schlafmangel. Bring die Maus zurück in die ursprüngliche Konditionierungskammer (mit 70% Ethanolgeruch). Aufzeichnung des Einfrierverhaltens für 5 Minuten.
2. Klanggelenkter Rückruftest (Test B)
   1. Führen Sie die Sitzung 3 Stunden nach Test A durch.
   2. Kontextvorbereitung: Sprühwasser im Kontext B (dreieckiges Prisma (30 cm Höhe)) bestehend aus drei Wänden mit Seitenlängen von 31 cm, 24 cm und 24 cm. Zwei der Wände sind mit weißem Papier bedeckt, und die dritte Wand besteht aus transparentem Acryl, durch das im Hintergrund ein blaues Rechteck sichtbar ist. Die Struktur hat einen Kunststoffboden und eine transparente Acryldecke.
   3. Rekordgefrierverhalten für 6 Minuten. Gib ein einziges 180-Sekunde-Hörsignal, das dem Training bei 180 Sekunden entspricht.

7. Datenanalyse

1. Schlafstadium-Scoring (Abbildung 1C-G)¹⁷
   1. Für jedes Wake/NREM/REM Berechnen Sie die Gesamtmenge, die Anzahl der Episoden, die mittlere Episodendauer und die Schlafübergangszahl basierend auf von einem menschlichen Experten bewerteten Daten. Kriterien jeder Stufe und folgendes.
      Wake: Niederamplitude, Hochfrequenz (β/γ)
      NREM: Hochamplitude, Niederfrequenz (δ)
      REM: Niedrigamplitude, Theta-dominant
2. Deprivationsqualität (Abbildung 1B)
   1. Bewerten Sie die Schlafphase, in der jeder Kitzelreiz angewendet wird, indem Sie seinen Zeitstempel mit EEG-Daten vergleichen, die von einem menschlichen Experten annotiert wurden.
3. Einfrierverhalten (Abbildung 1H, J-K)
   1. Verwenden Sie FreezeFrame4 (Actimetrics), um Immobilität (ohne Atmung) während der Angstkonditionierung und Rückruftests zu quantifizieren.
      1. Starte die FreezeFrame 4 Software und wähle den Recorder-Modus . Im Dateimenü (oben links) geben Sie den Zielordner zum Speichern der Aufnahmedateien an. In den vier weißen Eingabefeldern im linken Panel geben Sie eindeutige Kennungen ein, die zu jeder Maus gehören, um die Ausrichtung mit den vier Dateifenstern auf der rechten Seite des Bildschirms sicherzustellen.
      2. Klicken Sie auf das Protokoll-Panel am unteren Rand der Schnittstelle und definieren Sie die Aufnahmeparameter, einschließlich der gesamten Aufnahmedauer sowie des Timings der akustischen Hinweise und Fußschocks gemäß dem experimentellen Design.
      3. Klicken Sie in der Mitte des Bildschirms auf Referenz, um das Hintergrundreferenzbild zu erhalten. Platziere die Maus in die Konditionierungskammer und klicke dann auf Start, um mit der Aufnahme zu beginnen.
4. Diskriminierungsindexanalyse (Abbildung 1L)
   1. Berechnen Sie den Diskriminierungsindex nach folgender Formel:
      Frost im 5-Minuten-Durchschnitt in Test A – Einfrieren in den ersten 3-Minuten-Durchschnitt in Test B) / maximales Einfrieren im 5-Minuten-Durchschnitt in Test A, Einfrieren in Test B in den ersten 3 Minuten.
5. Analyse des Schockreaktivitätsindex (Abbildung 1I)
   1. Verwenden Sie die Strecke von Hand, um die zweidimensionale Bewegung von Tier 2 vor und nach dem Schockbeginn in der Angstkonditionierungssitzung zu messen. Berechnen Sie den Schockreaktivitätsindex nach folgender Formel:
      Bewegung während des Schocks – Bewegung vor dem Stoß / Bewegung während des Schocks + Bewegung vor dem Stoß

Results

Chirurgische Implantation von EEG-Elektroden
Mäuse sollten während der Operation vollständig betäubt werden. Wenn sie Anzeichen eines Versagens der Anästhesie zeigen, wie z. B. Schwierigkeiten, sollten sie aus dem Protokoll entfernt werden. Ebenso kann eine Blutung, die länger als 10 Sekunden anhält, schwere Schäden am Gehirn der Maus verursachen, und es wird empfohlen, die Experimente zu beenden. Nach der Operation wachen die meisten Mäuse normalerweise innerhalb ein...

Discussion

Dieses Protokoll ermöglicht selektiven REM-Schlafmangel bei Mäusen mit geknallten Kontrollmäusen. Im Gegensatz zu traditionellen Methoden wie Blumentopf- und rotierenden Scheibentechniken ermöglicht dieses System die Implementierung fein abgestimmter Kontrollgruppen, bei denen Tiere zur gleichen zirkadianen Zeit identische Stimulation erhalten. Darüber hinaus minimiert dieser Ansatz die Variabilität des Stimulationsstandorts, eine häufige Einschränkung herkömmlicher sanfter Handhabung un...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 % Glukose	Otsukba	35061410
6-Pin-Header	Hirose	172-0989
Klebstoff	Konishi	16351
Anästhesiemaschine	Shinano Seisakusho	SN-487-0T
Crimpengehäuse	Hirose	688-9095
Crimpfassung	Hirose	688-8982
Freezeflame4	Med Associates	RRID:SCR_014429	Version 4.104
GraphPad-Prisma	GraphPad	RRID:SCR_002798	Version 10.5.0
Ibuprofen	Tokioter Chemieindustrie	I0415
Isoflurane	Viatris	901036504
Loctite454	Henkel	UFI:  MAK2-7WRP-G202-F235
Maus (C57BL/6J)	Das Jackson-Labor	RRID: IMSR_JAX:000664	11,0 - 13,0 Woche bei der Angst-Konditionierungssitzung
Pinsel	Namurataiseidou	4943668000448	SDflat Nr. 8, Spitzenlänge: 8,2 mm; Breite: 18,8 mm
Provinice-Flüssigkeit	Shofu	21400BZZ00451000	250 mL
Provinice-Pulver	Shofu	21400BZZ00451000	250 g
SleepSignRecorder	KISSEI COMTEC	RRID:SCR_018200	Version 1.2.10
Edelstahlschraube	Yamazaki	N/A	φ 1.0 & Times; 2.0
Standard-Stereotaxische Instrumente	ALA Scientific	68038
Sonnenblumenöl	Sigma-Aldrich	S5007-250ML
Weißes Petrolatum	Taiyo Pharmaceutical	K09-TS