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Thermische Präkonditionierung bei der ex-vivo Lungenperfusion zur Rehabilitation geschädigter Lungentransplantate vor der Transplantation

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DOI:

10.3791/69084

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31. Oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Service of Thoracic Surgery, Department of Surgery and Anesthesiology Services, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University, 2Service of Adult Intensive Care Medicine, Department of Interdisciplinary Centers and Logistics, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein ex-vivo-Lungenperfusionsmodell von Ratten vor, das eine vorübergehende Exposition gegenüber einer kalibrierten thermischen Belastung beinhaltet und endogene Schutzmechanismen für die therapeutische Rekonditionierung geschädigter Lungentransplantate fördert. Der Ansatz ist skalierbar und reproduzierbar und unterstützt die Entwicklung nicht-medikamentöser Therapien zur Verbesserung des Erfolgs von Lungentransplantationen.

Zusammenfassung

Die Ex-vivo-Lungenperfusion (EVLP) hat sich als Durchbruch in der Lungentransplantation erwiesen und ermöglicht sowohl die funktionelle Beurteilung der Spenderlunge als auch therapeutische Eingriffe zur Rehabilitation marginaler Transplantate. Zu den Rekonditionierungsstrategien gehören pharmakologische und nicht-pharmakologische Ansätze. Unter den letzteren haben wir gezeigt, dass vorübergehender, kontrollierter Hitzestress ("Thermal Preconditioning", TP) ein wirksames Mittel zur Wiederherstellung geschädigter Lungen ist, indem eine endogene schützende Hitzeschockreaktion induziert wird. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für ein EVLP-Modell der Ratte vor, das TP zur Rekonditionierung von Lungen enthält, die einer warmen Ischämie ausgesetzt sind, und die Spende nach dem Kreislauftod (DCD) simuliert. Das Protokoll beschreibt die Lungenvorbereitung, die Kanülierung, die Perfusion und die Induktion der Hitzeschockreaktion. TP besteht aus einem 30-minütigen Anstieg der Perfusattemperatur auf 41,5 °C zu Beginn der EVLP, gefolgt von einer schnellen Rückkehr auf 37 °C für den Rest der Perfusion. In einem 6-stündigen EVLP-Modell zeigten TP-behandelte Lungen (n = 30) im Vergleich zu Kontrollen eine erhöhte Expression des Hitzeschockproteins 70, eine verbesserte statische pulmonale Compliance, ein reduziertes Ödem, eine geringere Freisetzung des von-Willebrand-Faktors (ein Biomarker für endotheliale Verletzungen) und eine abgeschwächte histologische Schädigung (n = 30). Das Protokoll ermöglicht die Echtzeitüberwachung des Gefäßwiderstands, des Atemwegsdrucks, der pulmonalen Compliance und der Oxygenierung und unterstützt molekulare und morphologische Analysen sowohl im Perfusat als auch im Gewebe. Dieses reproduzierbare, skalierbare Protokoll ist an größere EVLP-Systeme von Tieren oder Menschen anpassbar und bietet eine praktische translationale Plattform für die Untersuchung nicht-pharmakologischer Interventionen zur Verbesserung der Transplantationsergebnisse.

Einleitung

Die Ex-vivo-Lungenperfusion (EVLP) stellt einen großen Fortschritt auf dem Gebiet der Lungentransplantation dar. Seine wichtigste Wirkung liegt in der Erweiterung des Pools verfügbarer Spender-Lungentransplantate, indem die funktionelle Beurteilung der marginalen Lunge ermöglicht wird, um die Verwendung von Organen zu ermöglichen, die andernfalls für eine Transplantation verworfen würden 1,2. Marginale (oder erweiterte Kriterien) Spenderlungen beziehen sich auf eines oder mehrere der folgenden Kriterien: Alter des Spenders über 55 Jahre, PaO2/FiO2 von weniger als 300, Ischämiezeit von mehr als 6 h, positive Sputummikrobiologie, abnormale Röntgenaufnahme3. Neben der physiologischen Bewertung kann EVLP als Plattform für die Anwendung verschiedener therapeutischer Interventionen dienen, die darauf abzielen, die Transplantatqualität vor der Transplantation zu verbessern (Konzept der therapeutischen Rekonditionierung)4. Als solche bietet die EVLP die einzigartige Möglichkeit, geschädigte (marginale) Lungen zu rehabilitieren und das Risiko einer primären Transplantatdysfunktion (PID) zu verringern, eine schwerwiegende Komplikation, die sowohl die frühen als auch die langfristigen Ergebnisse nach einer Lungentransplantation beeinträchtigt 5,6. Die PID ist der klinische Ausdruck des Prozesses der Ischämie-Reperfusions-Schädigung (IRI), dessen Pathophysiologie auf oxidativem Stress, Entzündungen, der Aktivierung der Komplement- und Gerinnungskaskaden und der Induktion von Zelltodprozessen beruht 7,8,9. Letztendlich tragen diese Mechanismen dazu bei, die normalen Funktionen des Lungenendothels und des Lungenepithels zu stören, was zu nicht-kardiogenen Lungenödemen mit verminderter Sauerstoffversorgungskapazität führt, den beiden Hauptmerkmalen der PID 6,10,11,12.

Eine wachsende Zahl von experimentellen Studien, sowohl präklinisch als auch klinisch, hat die Wirksamkeit verschiedener ex-vivo-therapeutischer Strategien zur Linderung von IRI während der Lungentransplantation gezeigt. Beispiele hierfür sind pharmakologische Wirkstoffe, die auf Oxidantien und freie Radikale abzielen, Zelltodwege, Entzündungsmediatoren sowie zellbasierte und Gentherapien, um nur einige zu nennen 13,14,15,16,17,18,19,20. Über solche therapeutischen Ansätze hinaus kann EVLP auch als Plattform für die direkte Anwendung von physiologischem Stress auf das Lungentransplantat dienen, um intrinsische Schutzmechanismen hervorzurufen, die eine adaptive Toleranz gegenüber nachfolgenden pathophysiologischen Insulten bieten. Eine dieser Strategien beinhaltet die Anwendung von vorübergehendem, nicht-letalem Hitzestress auf das Lungentransplantat während der EVLP. In der Tat ist seit langem bekannt, dass Hitzestressbedingungen eine adaptive Hitzeschockreaktion begünstigen, die sich aus der Expression einer Reihe von Hitzeschockproteinen (HSPs) ergibt, die als molekulare Chaperone fungieren und Widerstand gegen weitere Exposition gegenüber verschiedenen Stressreizen verleihen21. Neben der HSP-Induktion wurden einige zusätzliche zelluläre Anpassungen nach Hitzeeinwirkung identifiziert, darunter (a) der antioxidative und zytoprotektive Signalweg des NF-E2-verwandten Faktors 2 (NRF2), dessen Aktivierung bei Hitzestress das zytoprotektive Gen Häm-Oxygenase22,23 deutlich hochreguliert; b) die entfaltete Proteinantwort (UPR), die mit proteotoxischem Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER-Stress) zu tun hat und deren Aktivierung durch Hitze je nach Intensität des thermischen Stresses entweder schützend oder schädlich sein kann 24,25,26; c) Autophagie, ein zytoprotektiver Prozess, der den lysosomalen Abbau geschädigter Organellen und Makromoleküle fördert und durch Hitze temperatur- und zeitabhängig aktiviert oder gehemmt werden kann27,28.

Wir haben gezeigt, dass eine solche "thermische Präkonditionierung" große Vorteile in Bezug auf reduzierten oxidativen Stress, Entzündungen, Zelltod und endotheliale Dysfunktion bietet, was zu einem signifikanten Schutz vor Lungen-IRI führt. Daher schlugen wir vor, dass die thermische Präkonditionierung eine neuartige, nicht-pharmakologische Methode zur ex-vivo therapeutischen Rehabilitation von geschädigten Lungentransplantaten vor der Transplantation darstellenkönnte 29,30,31. Die thermische Vorkonditionierung kann mehrere Vorteile gegenüber bestehenden pharmakologischen und nicht-pharmakologischen Strategien bieten. Durch das Auslösen einer integrierten zellulären endogenen Reaktion kann es gleichzeitig Schutz vor unterschiedlichen pathophysiologischen Signalwegen bieten, die mit IRI verbunden sind, während andere Strategien im Allgemeinen auf einen einzigen Signalweg abzielen. Darüber hinaus vermeidet es das Risiko möglicher Nebenwirkungen, die mit der Verwendung pharmakologischer Verbindungen verbunden sind. Das Ziel des vorliegenden Artikels ist es, ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll der thermischen Vorkonditionierung während der ex-vivo-Lungenperfusion geschädigter Rattenlungen vorzustellen, das in verschiedenen Umgebungen angewendet werden kann, insbesondere auf größere Tiermodelle oder menschliche Lungen zu Forschungszwecken.

Wir verwenden das rattenisolierte perfundierte Lungensystem IPL-2 für EVLP. Der Aufbau ist in Abbildung 1 beschrieben und umfasst Folgendes: Perfusat-Reservoir (Abbildung 1-1); zwei Rollenpumpen für die Perfusatzirkulation (Abbildung 1-2A) und die Perfusatprobenahme (Abbildung 1-2B); ein thermostatisches Wasserbad (Abbildung 1-3) zur Aufrechterhaltung der Perfusattemperatur; ein Membrangasaustauscher (Abbildung 1-4), der mit einem Gastank (nicht dargestellt) verbunden ist, der ein Gemisch aus 6 %O2, 10 % CO2 und 84 %N2 enthält, um das einströmende Perfusat sauerstofffrei zu machen und zu carboxylieren; zwei Drucksensoren (Abbildung 1-5) zur Überwachung des Drucks in der linken Vorhof- und Lungenarterie (PA) (der PA-Drucksensor ist in der Abbildung nicht sichtbar); eine beheizte und abgedichtete Kammer (Abbildung 1-6), in der sich der Herz-Lungen-Block befindet, mit speziellen Anschlüssen für PA-, LA- und Trachealkanülen; ein Beatmungsgerät (Abbildung 1-7), das mit der Trachealkanüle zur Lungenventilation und zur Messung des Atemwegsdrucks und der statischen Lungencompliance verbunden ist; ein elektronisches Thermometer (Abbildung 1-8) zur Anzeige der Perfusattemperatur auf Höhe des PA-Zuflusses. Eine Verbindungsplattform (Figur 1-9), deren Elemente in Figur 2 detailliert dargestellt sind: Verbindung für die Kanülen PA (Figur 2-1), LA (Figur 2-2) und Tracheal (Figur 2-3); Anschluss an ein Gewichtsmodul (Abbildung 2-4) zur kontinuierlichen Überwachung des Gewichts des Herz-Lungen-Blocks; Ein Temperatursensor (Abbildung 2-5) zur Überwachung der Perfusattemperatur am PA-Zufluss. Eine detaillierte schematische Beschreibung der Schaltung findet sich an anderer Stelle18.

Protokoll

HINWEIS: Für diese Studie wurden adulte männliche Sprague-Dawley-Ratten verwendet (n = 60; Alter, 8-11 Wochen alt; Gewicht, 300-450 g). Die Tiere wurden (2 Ratten/Käfig) in unserer örtlichen Tieranlage untergebracht, die unter einem 12-stündigen Licht-/12-Stunden-Dunkelzyklus mit unbegrenztem Zugang zu Futter und Wasser gehalten wurden. Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den "Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (NIH-Veröffentlichung Nr. 96-23) behandelt, und alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit dem Versuchsprotokoll durchgeführt, das von unserem lokalen Tierschutzausschuss (Direction Générale de l'Agriculture, la Viticulture et Affaires Vétérinaires de l'Etat de Vaud (Genehmigungen 3456a und 3456x1)) genehmigt wurde. Die Größe und das Gewicht der Tiere wurden auf der Grundlage unserer früheren Studien im EVLP-Modell der Ratte und aus Gründen der anatomischen Bequemlichkeit (Größe der Lunge und der Gefäße) ausgewählt. Der Sprague-Dawley-Stamm wurde gewählt, da andere Stämme (insbesondere Wistar-Ratten) Überempfindlichkeitsreaktionen auf die in der Perfusatlösung enthaltene Dextranlösung zeigen können 1,32.

1. Allgemeine Beschreibung der EVLP-Schaltung

HINWEIS: Die Einrichtung wird in Abbildung 1 beschrieben, und die Elemente der Verbindungsplattform (Abbildung 1-9) sind in Abbildung 2 detailliert dargestellt. Eine detaillierte schematische Beschreibung der Schaltung ist früher18 beschrieben worden.

  1. Verwenden Sie eine azelluläre gepufferte extrazelluläre Lösung für die Ex-vivo-Perfusion . Stellen Sie sicher, dass das Perfusat aus dem Reservoir durch den Gasaustauscher fließt und durch die PA-Kanüle zur Lungenperfusion geleitet wird und dann durch die LA-Kanüle wieder in das Reservoir austritt. Überwachen Sie kontinuierlich den Zu- (PA) und Abflussdruck (LA).
  2. Schließen Sie alle Messumformer (PA-Druck, LA-Druck, Lungengewicht, Pumpendrehzahl) an die Analog/Digital-Wandlerbox an (Abbildung 3). Öffnen Sie die Basic Data Acquisition Software (BDAS). Kalibrieren Sie Drucksignale mit Hilfe einer Zweipunktkalibrierung (0; 10 cm H2O) unter Verwendung einer Wassersäule. Kalibrieren Sie das Gewichtsmodul mit Hilfe der Zweipunktkalibrierung (0 g und 1 g). Kalibrieren Sie die Pumpendrehzahl mit einer 1-minütigen Perfusatprobenahme bei 10 mL/min. Kontrollieren Sie die Qualität der Signale, indem Sie bekannte Drücke und Pumpendrehzahlen anwenden und die Angemessenheit der Ergebnisse beurteilen (ein detailliertes Protokoll und ein Video zur Signalkalibrierung finden Sie in den ergänzenden Materialien).
  3. Erfassen Sie alle wichtigen Parameter (PA, LA-Druck, Lungengewicht und Fluss) in Echtzeit durch die Systemsoftware und beobachten Sie deren visuelle Anzeige auf einem PC.
    HINWEIS: Physiologische Signale, die vom BDAS aufgezeichnet werden, werden mit dem Befehl Dateiexport in der Menüleiste in eine Textdatei exportiert. Daten, die zu ausgewählten Zeitpunkten (alle 60 Minuten) extrahiert werden, werden in eine Tabelle übertragen und dann zur statistischen Analyse in die Software kopiert und eingefügt.
  4. Berechnen Sie den pulmonalen Gefäßwiderstand (PVR) mit Hilfe von Gleichung (1):
    figure-protocol-1(1)
  5. Entnahme von Proben (1-2 ml) des Perfusats zu bestimmten Zeitpunkten für die Messung verschiedener biologischer Marker.

2. Anwendung der thermischen Vorkonditionierung

  1. Schließen Sie ein thermostatisches Wasserbad an (Abbildung 4-1), um eine konstante, präzise und einstellbare Wassertemperatur für die Perfusatheizung zu gewährleisten. Verwenden Sie eine integrierte Motorpumpe im Wasserbad, um das erhitzte Wasser zu zirkulieren.
  2. Verwenden Sie einen doppelwandigen Glasbehälter als Behälter (Abbildung 4-2), um die Perfusattemperatur aufrechtzuerhalten, indem Sie erhitztes Wasser zwischen den Wänden des Behälters zirkulieren lassen.
  3. Verwenden Sie eine Heizspirale mit Serpentinenschlauch in einem beheizten Wasserbehälter (Abbildung 4-3), um das Perfusat anzutreiben, wodurch ein Wärmeaustausch vom Wasser zum Perfusat unmittelbar vor dem Eintritt in die Ex-vivo-Lungenpräparation möglich ist.
  4. Bringen Sie den Herz-Lungen-Block in der Organkammer (Abbildung 4-4) unter, einem doppelwandigen Behälter, der mit Wasser gefüllt ist, das aus dem thermostatischen Wasserbad zirkuliert, um eine warme Umgebung zu erhalten.
  5. Setzen Sie für den Temperatursensor und das Thermometer (Abbildung 2-5 und Abbildung 4-5) einen Luft-/Oberflächensensor vom Typ K sicher und fest gegen die Zulaufkanüle an, um die tatsächliche Perfusattemperatur, die in die Lungenarterie (PA) eintritt, kontinuierlich zu überwachen. Die Temperatur wird auf einem digitalen Thermometer angezeigt.
  6. Um die Temperatur des Zuflusses auf 37 °C zu halten, stellen Sie das Wasserbad auf 38-38,5 °C ein.
    HINWEIS: Um die Wärmeverluste durch das Perfusat entlang seines Verlaufs in den Rohren auszugleichen, haben wir unter unseren Bedingungen festgestellt, dass die Temperatur des Wasserbads auf 38-38,5 °C eingestellt werden musste, um 37 °C am Zufluss zu halten. Abhängig von den Wärmeverlusten des Perfusats müssen diese Einstellungen ggf. angepasst werden, um die gewünschte Temperatur am Zufluss zu gewährleisten.
  7. Starten Sie das Ex-vivo-Heizprotokoll nach 60 min EVLP, indem Sie die Wasserbadtemperatur auf bis zu 43 °C erhöhen, um eine Zulauftemperatur von 41,5 °C zu erreichen, die über 5 min erreicht und über 30 min gehalten wird.
    HINWEIS: In unserer vorherigen Arbeit29 haben wir die optimale Temperatur für die thermische Vorkonditionierung (TP) unter Verwendung eines Temperaturbereichs von 40 °C bis 43,5 °C und eines EVLP-Protokolls von 3 h bestimmt, wie in Abbildung 5 dargestellt. Die Heiztemperatur, die einen optimalen Schutz ohne schädliche Auswirkungen bietet (wie in Abbildung 5B zusammengefasst), lag bei 41,5 °C. Diese Temperatur wurde daher in allen unseren nachfolgenden Experimenten verwendet, mit EVLP-Dauern von bis zu 6 h29,30,31.
  8. Nach dieser vorübergehenden Erwärmung fügen Sie dem Wasserbad Eis hinzu, um die Temperatur im Wasserbad schnell (in 5 Minuten) wieder auf 38 °C zu senken, um die Perfusattemperatur in der Zulaufkanüle wieder auf 37 °C zu bringen und diese Temperatur bis zum Ende des EVLP-Protokolls zu halten.
  9. Bestimmung physiologischer Variablen (Lungencompliance), Ödembildung und molekularer Endpunkte (Expression von Hitzeschockproteinen, antioxidativen Enzymen, inflammatorischen Zytokinen und Biomarkern für Apoptose, Autophagie, Stress des endoplasmatischen Retikulums und Schädigung von Endothelzellen).

3. Detailliertes EVLP-Protokoll für die thermische Vorkonditionierung

  1. Zubereitung von Tieren
    1. Bereiten Sie die erforderlichen Materialien vor, einschließlich Kanülen und chirurgische Instrumente (Abbildung 6A, B und Materialtabelle).
    2. Wiegen Sie das Tier, um die geeigneten Dosierungen für alle verabreichten Substanzen, den Perfusatfluss und die Beatmungsparameter zu berechnen.
    3. Bereiten Sie die Anästhesiemischung vor: 80 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin in derselben Spritze.
      HINWEIS: Die Anästhetika müssen in einem sicheren Schrank aufbewahrt werden.
    4. Bereiten Sie Heparin, 1,7 U/g Körpergewicht in isotonischer Kochsalzlösung (1 mL Spritze) vor.
    5. Betäuben Sie das Tier mit 5% Isofluran (verdampft in einer speziellen Induktionskammer), gefolgt von einer intraperitonealen Injektion der vorbereiteten Anästhesiemischung. Halten Sie die Narkose mit 1-2% Isofluran über eine Gesichtsmaske aufrecht.
      HINWEIS: Es ist wichtig, eine tiefe Anästhesie aufrechtzuerhalten, um ein Keuchen während der Blutung zu vermeiden.
      Verwenden Sie ein Setup mit einem Isofluran-Extraktionssystem, um den Bediener zu schützen.
      Entsorgen Sie alle Nadeln und Spritzen in geeigneten Behältern für biologische Gefahrstoffe und scharfe Abfälle. Versiegelte Behälter für scharfe Gegenstände und biologische Gefahrstoffe werden dann über ausgewiesene Abfallströme entsorgt.
    6. Rasieren Sie das Tier von der Kehle bis zum Penisbereich und entfernen Sie das restliche Fell mit feuchtem, warmem Papier.
    7. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Hinterpfote einklemmen; Erhöhen Sie die Isoflurankonzentration, wenn Reflexe vorhanden sind.
    8. Legen Sie das Tier in Rückenlage und sichern Sie alle vier Gliedmaßen mit Klebeband.
  2. Extraktion des Herz-Lungen-Blocks für die EVLP
    HINWEIS: Das Verfahren erfordert ein intensives Training, um die verschiedenen Schritte zeitnah, atraumatisch und hochgradig reproduzierbar durchzuführen. Der heikelste Schritt ist die Kanülierung der Lungenarterien, die unter Vergrößerung mit einem chirurgischen Spiegelmikroskop durchgeführt werden sollte, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Der gesamte Eingriff kann von einem einzigen, gut ausgebildeten Prüfarzt durchgeführt werden. Um eine solche experimentelle Unabhängigkeit zu erreichen, sind mindestens 15 vollständige Verfahren unter der Aufsicht eines erfahrenen Prüfarztes erforderlich.
    1. Heben Sie die Haut an der Mittellinie des Rachens vorsichtig an und machen Sie mit einer kleinen Schere einen 5 cm langen Schnitt entlang der kaudalen bis zur Kopfachse.
    2. Trennen Sie die Speihelpappen und präparieren Sie vorsichtig die Faszie über den Sternohyoideusmuskeln mit einer gebogenen Pinzette, bis der Kehlkopf und die Luftröhre deutlich freiliegen.
    3. Führen Sie eine 4-0-Seidennaht unter die Luftröhre und bereiten Sie einen vorgebundenen Knoten vor, wobei Sie die Pinzette unter der Luftröhre an Ort und Stelle lassen.
    4. Berechnen Sie das Tidalvolumen (Vt) für die in-vivo-Beatmung und Lungenbeschaffung mit der Stahl-Formel33:
      figure-protocol-2× figure-protocol-3
    5. Stellen Sie das Beatmungsgerät für die In-vivo-Beatmung und Lungenbeschaffung (siehe Materialtabelle) auf das berechnete Atemzugvolumen mit einer Atemfrequenz von 70 Atemzügen/min, einem eingeatmeten Sauerstoffanteil (FiO2) von 0,5 und einem positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) von 3 cm H2O ein.
      HINWEIS: Um den PEEP auf 3 cm H2O einzustellen, schließen Sie den Exspirationsarm des Beatmungsgeräts an einen platingehärteten Silikonschlauch an, der 3 cm unter der Oberfläche eines mit Wasser gefüllten Behälters eingeführt wird.
    6. Legen Sie einen Querschnitt zwischen zwei Knorpelringen an, führen Sie eine Kanüle mit einem Außendurchmesser von 2 mm (14 mm Länge, EVLP-Beatmungskanüle, Abbildung 6B) zur Beatmung ein und sichern Sie diese durch Festziehen der Naht.
    7. Schließen Sie die Kanüle an das Beatmungsgerät an und bestätigen Sie die effektive Beatmung durch das Vorhandensein von Blasen in dem mit Wasser gefüllten Behälter, der mit dem exspiratorischen Arm des Beatmungsgeräts verbunden ist.
    8. Mit einer stumpfen Schere die Haut entlang des Bauches einschneiden und in die Bauchhöhle eindringen, dann die Bauchwandmuskulatur in der Mittellinie bis zum Zwerchfell einschneiden.
    9. Schieben Sie den Darm vorsichtig mit Wattestäbchen zur Seite, um die untere Hohlvene freizulegen.
    10. Injizieren Sie die vorbereitete Heparinlösung in die Vene und lassen Sie sie 5 Minuten lang zirkulieren. Durchschneiden Sie dann die Hohlvene und die Aorta zur Ausblutung.
    11. Sobald das Tier vollständig ausgeblutet und tot bestätigt ist, stoppen Sie die Beatmung und trennen Sie das Beatmungsgerät von der Trachealkanüle, damit die Lunge entleert werden kann, was den Beginn der warmen Ischämie markiert. Halten Sie die gesamte warme ischämische Zeit (WIT) auf 1 h.
      HINWEIS: Obwohl die berichtete mediane WIT bei klinischer DCD-Lungenspende 33 Minuten beträgt, wurden keine nachteiligen Auswirkungen von WIT-Dauern von bis zu 60 Minuten auf das 1-Jahres-Überleben berichtet. Daher einigen sich die meisten Zentren derzeit auf 60-90 min als akzeptable Obergrenze von WIT34. Wie bereits beschrieben, ist die Verwendung von 1 h WIT in unserem Rattenmodell daher für das klinische Szenariorelevant 35.
    12. Eine Viertelstunde vor Ablauf der gesamten warmen ischämischen Zeit von 1 h (d. h. nach 45 Minuten warmer Ischämie) wird eine 60-ml-Spritze (auf einem Halter befestigt) mit kalter Konservierungslösung (4 °C, im Kühlschrank gelagert) gefüllt (siehe Zusammensetzung in Tabelle 1).
      HINWEIS: Der Boden der Spritze befindet sich in einem Abstand von 20 cm über dem Tier. Verbinden Sie die Spritze mit einem Silikonschlauch, der in Eiswasser getaucht ist, mit der PA-Kanüle (Abbildung 6C).
    13. Führen Sie eine mediane Sternotomie mit einer stumpfen Lister-Schere durch, um eine Beschädigung des Gewebes zu vermeiden, und ziehen Sie die Brustwand vorsichtig zurück, indem Sie stumpfe Retraktoren verwenden, die an elastischen Bändern befestigt sind, und einen Mikromücken-Hämostaten, der am Zwerchfell befestigt ist, um die Lunge freizulegen. Vermeiden Sie jeden direkten Kontakt mit dem Lungenparenchym.
      HINWEIS: Um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern, tragen Sie bei Bedarf eine kleine Menge physiologischer Kochsalzlösung auf die Lungenoberfläche auf.
    14. Machen Sie einen "X"-Schnitt an der Spitze des linken Ventrikels des Herzens und schieben Sie die Schere im Inneren des Herzens bis zum linken Vorhof, um das spätere Einführen der LA-Kanüle zu erleichtern.
    15. Führen Sie eine 5-0-Seidennaht unter die HauptPA und bereiten Sie einen vorgebundenen Doppelknoten vor und halten Sie die Naht mit einem selbstgemachten Halter auf einer Seite fest (Abbildung 6D und Abbildung 7A).
    16. Bereiten Sie eine zusätzliche Naht um das Herz vor, um die LA-Kanüle später zu befestigen (Abbildung 7B).
    17. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haupt-PA und führen Sie die PA-Kanüle ein, um sicherzustellen, dass keine Luftblase eingeführt wird.
    18. Perfundieren Sie die Lunge sofort mit 25 ml der Kältekonservierungslösung über die PA-Kanüle und leiten Sie die Zeit der kalten Ischämie ein.
      HINWEIS: Üben Sie für diese Perfusion passiven Druck aus der Höhe der Spritze auf den oben beschriebenen Halter aus.
    19. Befestigen Sie die Kanüle mit der vorgebundenen Naht.
    20. Unmittelbar nach der PA-Kanülierung die Trachealkanüle wieder an das Beatmungsgerät anschließen und die Beatmung mit den Anfangseinstellungen fortsetzen, wobei die Atemfrequenz auf 25 Atemzüge/min reduziert wird.
    21. Führen Sie die LA-Kanüle durch den Schnitt in der linken Herzkammer in den linken Vorhof ein.
    22. Sichern Sie die Kanüle mit der zweiten vorgebundenen Naht (um das Herz herum), achten Sie darauf, dass der Fluss aus dem linken Vorhof nicht behindert wird, und lassen Sie das gesamte Volumen von 25 ml der Kältekonservierungslösung passieren (dauert ~15 Minuten).
    23. Am Ende der Perfusion der Konservierungslösung klemmen Sie die PA-Kanüle mit einer Bulldog-Klemme (Abbildung 7C, blauer Kreis) und trennen Sie sie vom Schlauch.
    24. Präparieren Sie vorsichtig die Luftröhre und das umgebende Gewebe, um die Lunge zu mobilisieren.
    25. Klemmen Sie die Luftröhre mit einem Aneurysmaclip fest (Abbildung 7C, roter Kreis), während die Lunge vollständig aufgeblasen ist (ein Atemzugvolumen).
    26. Präparieren Sie die absteigende Aorta und andere Stützgefäße, um den Herz-Lungen-Block zu befreien, und heben Sie ihn an, indem Sie die Luftröhre sanft greifen.
    27. Den Herz-Lungen-Block in Bauchlage in eine Schale mit Konservierungslösung legen und bei 4 °C für eine Gesamtzeit der kalten Ischämie von 1 h lagern.
      HINWEIS: Legen Sie am Ende der Operation biologische Rückstände in Abfallentsorgungsbeutel, damit sie von einem zuständigen Dienst weiter entfernt werden können.
  3. Ex-vivo Lungenperfusion und thermische Vorkonditionierung
    HINWEIS: Beziehen Sie sich auf das Flussdiagramm, in dem die wichtigsten Schritte aufgeführt sind, um den Fortschritt durch die verschiedenen Phasen des Protokolls zu leiten (Abbildung 8).
    1. Stellen Sie einen Eiskübel in das thermostatische Wasserbad, um die Perfusattemperatur auf 15 °C zu senken.
    2. Füllen Sie das Reservoir mit 100 mL Perfusat und lassen Sie es durch das System zirkulieren. Verwenden Sie die humane Albumin-basierte Perfusionslösung (siehe Zusammensetzung in Tabelle 1) als azelluläre gepufferte extrazelluläre Lösung für die Ex-vivo-Perfusion .
    3. Messen Sie den pH-Wert des Perfusats und halten Sie ihn auf einem physiologischen Niveau (7,35-7,45), fügen Sie entsprechend Tris(hydroxymethyl)aminomethan (THAM)-Puffer hinzu.
    4. Wiegen Sie den Herz-Lungen-Block und montieren Sie ihn auf das EVLP-System, beginnend mit der Beatmungskanüle, während Sie den Aneurysmaclip an Ort und Stelle an der Luftröhre halten.
    5. Schließen Sie die PA-Kanüle an und vermeiden Sie dabei sorgfältig das Einbringen von Luftblasen in das Lungengefäßsystem (stellen Sie sicher, dass die Blasenfalle gefüllt ist).
    6. Lassen Sie einige Tropfen Perfusionslösung austreten und verbinden Sie die LA-Kanüle.
    7. Stellen Sie den linken Vorhofdruck auf 3 mm Hg ein, indem Sie die Höhe der an den Entwässerungskreislauf angeschlossenen Abflussleitung einstellen.
    8. Stellen Sie das Gewichtsmodul auf Null und überwachen Sie die Gewichtsänderung des Herz-Lungen-Blocks während der gesamten EVLP.
    9. Berechnen Sie das theoretische Herzzeitvolumen (CO) nach der von Lindstedt und Schaeffer entwickelten Formel:
      figure-protocol-4
    10. Beginnen Sie mit der Perfusion (2 % des theoretischen CO) und erhöhen Sie allmählich den Perfusatfluss (7,5 % des theoretischen CO) und die Temperatur gemäß den angegebenen Parametern, wie in Tabelle 2 dargestellt.
      HINWEIS: Während der EVLP wird der Perfusatfluss zwischen 2 % und 7,5 % des berechneten theoretischen CO eingestellt. Dieser niedrige Perfusatfluss ermöglicht es, den pulmonalarteriellen Druck im normalen Bereich zu halten und das Risiko eines frühen Lungenödems zu verringern, insbesondere bei warmen, ischämisch geschädigten Lungen. Dies ermöglicht es den Benutzern, das Präparat über längere Zeiträume aufrechtzuerhalten. Andere Forscher verwendeten vergleichbare Durchflüsse für die EVLP von Ratten, während andere Durchflüsse von bis zu 20 % des theoretischen CO38 verwendeten.
    11. Passen Sie die Temperatur des Perfusats an, indem Sie die Temperatur des Wasserbades schrittweise erhöhen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Hände von allen Heizgeräten fernzuhalten, um mögliche Verletzungen zu vermeiden.
    12. Sobald die Perfusattemperatur 35 °C erreicht, leiten Sie die mechanische Beatmung ein, indem Sie den Aneurysmaclip aus der Luftröhre entfernen und das Beatmungsgerät für die Ex-vivo-Beatmung starten (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Die Druckkalibrierung wird alle 14 Tage mit einer Zweipunktkalibrierung (0 und 30 cm H2O) durchgeführt. Die Kalibrierung der Röhrchen wird bei jeder Verwendung nach einem programmierten Protokoll durchgeführt, um externe Faktoren zu korrigieren, die mit dem Widerstand der Schläuche und Kanülen zusammenhängen.
      1. Verwenden Sie die referenzierte Software für die Einstellungen des Beatmungsgeräts und die Datenerfassung, da sie kontinuierliche Aufzeichnungen der Atemsignale und der Lungencompliance zu bestimmten Zeitpunkten (siehe Flussdiagramm, Abbildung 8) gemäß einem programmierten Protokoll der schrittweisen Erhöhung des Lungenvolumens bei gleichzeitiger Messung des Atemwegsdrucks ermöglicht.
      2. Die Compliance wird dann automatisch durch eine Gleichung berechnet, die an den Deflationsteil der Druckvolumenschleife angepasst ist (Salazar-Knowles-Gleichung).
      3. Zeigen Sie alle Beatmungsdaten an, speichern Sie sie auf einem dedizierten PC und exportieren Sie sie in eine Tabelle. Extrahieren Sie Daten zu ausgewählten Zeitpunkten, übertragen Sie sie in eine andere Tabelle und kopieren Sie sie dann und fügen Sie sie in die statistische Analysesoftware ein.
    13. Stellen Sie die Atemfrequenz und das Atemzugvolumen 10 Minuten lang auf 7 Hübe/min bzw. 3 ml/kg ein und erhöhen Sie sie dann auf 15 Hübe/min und 6 ml/kg für 10 Minuten und schließlich 30 Hübe/min und 6 ml/kg bis zum Ende der EVLP. Stellen Sie den positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) während der gesamten EVLP auf 3 cm H2O ein (Tabelle 2).
    14. Wenden Sie alle 30 min der EVLP ein Rekrutierungsmanöver an, um eine Atelektase zu verhindern, indem Sie den Atemwegsdruck für 6 s auf 15 cm H2O einstellen.
    15. Bei 1 h, 2 h, 3 h, 4,5 h und 6 h EVLP wird die Lunge schrittweise bis zu einem Gesamtlungenvolumen von 10 ml/kg Körpergewicht aufgeblasen, um die Lungencompliance und den maximalen inspiratorischen Druck (Pmax) zu bestimmen.
      HINWEIS: Compliance-Messungen werden im Anschluss an ein oben beschriebenes Rekrutierungsmanöver durchgeführt.
    16. Erhöhen Sie die Perfusattemperatur auf 37 °C an der PA-Kanüle im Inflow nach 60 min EVLP.
    17. Starten Sie das Ex-vivo-Heizprotokoll nach 60 Minuten EVLP.
    18. Erhöhen Sie die Temperatur des Wasserbads auf bis zu 43 °C auf 41,5 °C an der PA-Kanüle im Zulauf (dies dauert ~ 5 min), wie in Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4-5 dargestellt.
    19. Halten Sie diese Temperatur von 60 min bis 90 min EVLP (insgesamt 30 min).
      HINWEIS: In unserer früheren Arbeit haben wir gezeigt, dass 41,5 °C für 30 Minuten keine thermische Schädigung auf der Ebene der gesamten Lunge förderten29. Wir führten keine spezifischen in vitro Zellviabilitätstests durch, um unter solchen Bedingungen auf thermische Schädigung zu testen.
    20. Nach 30 min Erhitzen Eis in das Wasserbad geben, um die Temperatur an der Zulaufkanüle schnell (5 min) wieder auf 37 °C einzustellen.
      HINWEIS: In der Kontrollgruppe wird die Perfusattemperatur während der gesamten EVLP ohne thermische Vorkonditionierung bei 37 °C gehalten (siehe Tabelle 2). Wir verzichtet auf eine "Scheinheizung"-Gruppe (z.B. durch Einstellung der Wasserbadwärme ohne Temperaturanstieg).
    21. Halten Sie die Perfusattemperatur an der PA-Kanüle im Zulauf bis zum Ende der EVLP auf 37 °C.
    22. Entnehmen Sie Proben der Perfusatlösung nach 1 h, 2 h, 3 h, 4,5 h (1-2 mL zu jedem Zeitpunkt) und 6 h (10 mL) EVLP aus einem der Probenahmeanschlüsse, die mit dem Kreislauf verbunden sind (vor oder hinter der Lungenvorbereitung), wie in Abbildung 1-2B gezeigt. Verwenden Sie die Proben sofort für Gasanalysen (Messung von pH, PCO2 und PO2 mit der CG4+-Kartusche). Für weitere biochemische Messungen zentrifugieren Sie die Proben (500 × g, 10 min bei 4 °C) und halten Sie den klaren Überstand bis zur Verwendung bei -80 °C.
    23. Nach 6 h EVLP legen Sie den Aneurysmaclip erneut auf die Luftröhre an (sobald die Lunge vollständig aufgeblasen ist) und klemmen Sie die PA-Kanüle mit einer Bulldoggenklemme ein.
    24. Wiegen Sie den Herz-Lungen-Block, um sein Endgewicht zu erhalten.
      HINWEIS: Die Gewichtszunahme während der EVLP kann als Differenz zwischen dem End- und dem Anfangsgewicht bewertet oder während der EVLP mit dem oben beschriebenen Gewichtsmodul kontinuierlich überwacht werden.
    25. Präparieren Sie die Lunge vorsichtig und trennen Sie die einzelnen Lappen.
    26. Konservieren Sie das Gewebe für nachgelagerte Anwendungen: Schockfrosten Sie es in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bei -80 °C für biochemische Analysen oder fixieren Sie es in Paraformaldehyd (PFA) für die histologische Auswertung. Die linke Lunge kann aufbewahrt und für die Lungentransplantation vorbereitet werden.

4. Statistik

  1. Zuordnung der Tiere zu spezifischen Behandlungsgruppen (Kontrolle versus thermische Vorkonditionierung, n = 5/Gruppe für jeden experimentellen Endpunkt).
    HINWEIS: Wir ordnen die Tiere nicht zufällig der einen oder anderen Gruppe zu, sondern die Gruppen wechseln sich jeden Tag ab. Das Protokoll (Hitze vs. Kontrolle) kann nicht verblindet durchgeführt werden, da die Temperatur des Perfusats während der Experimente genau bekannt sein muss. Im Gegensatz dazu werden biologische und histologische Analysen verblindet durchgeführt, ohne dass die zugewiesene Behandlungsgruppe identifiziert wird.
  2. Analysieren Sie die Daten.
  3. Äußern Sie die Ergebnisse als Mittel ± SEM.
  4. Überprüfen Sie die Normalverteilung der Daten mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test.
  5. Bewerten Sie für Zeitpunktexperimente die Auswirkungen der Zeit- und Gruppenzuordnung mit Hilfe der bidirektionalen ANOVA, gefolgt von Sidaks Post-hoc-Test für Gruppeneffekte und der Bonferroni-Korrektur für Zeiteffekte, wobei 1 h als Referenz verwendet wird. Betrachten Sie einen p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant. Erwägen Sie die logarithmische Transformation der Daten im Falle einer nicht normalverteilten Verteilung, bevor Sie die ANOVA anwenden.
  6. Bestimmen Sie für histologische Analysen (verblindet) den Lungenverletzungs-Score jeder Probe, indem Sie das perivaskuläre Ödem in 10 Feldern/Schnitt quantifizieren.
    1. Verwenden Sie die relative Anzahl der Gefäße mit perivaskulärem Ödem (A): 0: nicht vorhanden; 1: mild (<25%); 2: mäßig (25-50%); 3: schwer (>50%).
    2. Verwenden Sie die Dicke des perivaskulären Ödems (B), berechnet als Prozentsatz der inneren Gefäßdurchmesser (0: kein Ödem; 1: <25%; 2: 25-50%; 3: >50%).
    3. Verwenden Sie die Summe von A + B in den 10 untersuchten Abschnitten, um die Punktzahl31 zu berechnen.
    4. Führen Sie statistische Vergleiche mit dem nichtparametrischen Mann-Whitney-Test durch (aufgrund einer nicht normalverteilten Daten) mit einer Signifikanz von p < 0,05.

Ergebnisse

Die physiologischen Variablen der Lunge werden während des gesamten Eingriffs kontinuierlich überwacht, einschließlich des Lungenarteriendrucks (PAP), des berechneten pulmonalen Gefäßwiderstands und der Beatmungsparameter, einschließlich der statischen pulmonalen Compliance (SPC) und des maximalen Atemwegsdrucks (Pmax). Darüber hinaus ermöglicht das Gewichtsmodul die Beurteilung der Ödembildung, indem es ein indirektes Maß für die Flüssigkeitsansammlung in der Lunge liefert. Zu den Vorteilen der thermischen Vorkonditionierung (TP) in Bezug auf die Kontrolllunge (Strg) gehören eine Verbesserung der SPC (Abbildung 9A, ausgedrückt als Verhältnis der SPC zu jedem Zeitpunkt zum anfänglichen SPC-Wert, n = 5/Gruppe) und eine Verringerung der Gewichtszunahme der Lunge (Abbildung 9B, n = 5/Gruppe) während der EVLP. Die Daten werden als Mittel ± REM dargestellt.

Perfusatflüssigkeit kann auf verschiedene Biomarker untersucht werden. So ist die thermische Vorkonditionierung mit einer signifikant reduzierten Freisetzung von von Willebrand (vWF), einem Biomarker der Endothelzelle, am Ende der EVLP verbunden (Abbildung 9C, n = 5/Gruppe, bedeutet ± REM).

Morphologische Analysen des Lungengewebes, die am Ende der EVLP durchgeführt werden, umfassen Histologie und Immunhistochemie. Beispiele für Hämatoxylin- und Eosin (H & E)-gefärbte Schnitte sind in Abbildung 9D dargestellt, die eine reduzierte histologische Schädigung in der Lunge zeigt, die einer thermischen Vorkonditionierung ausgesetzt war, ausgedrückt als Lungenverletzungsscore (Abbildung 9E, n = 5/Gruppe). Der Score wurde durch Quantifizierung des perivaskulären Ödems in 10 Feldern/Abschnitt ermittelt (siehe Protokollschritte 4.6.1 und 4.6.2). Die Summe von A + B in den 10 untersuchten Abschnitten wurde zur Berechnung der Punktzahl31 verwendet.

Molekulare Analysen im Lungengewebe am Ende der EVLP umfassen die Erstellung von RNA- oder Proteinexpressionsprofilen. Als Beispiel können die Proteinexpressionsniveaus des induzierbaren Hitzeschockproteins HSP70 mittels ELISA gemessen werden, um die Entwicklung der Hitzeschockreaktion in Lungen zu zeigen, die einer thermischen Vorkonditionierung ausgesetzt waren (Abbildung 9F, zeigt ein Zeitverlaufsexperiment mit unterschiedlichen Dauern der EVLP, n = 5/Gruppe zu jedem Zeitpunkt). Die Expression von HSP70 in der TP-Gruppe erreichte nach 3 Stunden EVLP, d.h. 90 Minuten nach dem Ende der TP, ihren Höhepunkt und blieb danach bis zum Ende der EVLP stabil. Die Daten werden als Mittel ± REM dargestellt.

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Abbildung 1: Beschreibung der EVLP-Plattform. (1) Doppelwandiger Behälter für Perfusat. (2A) Rollenpumpe für die Perfusatzirkulation. (2B) Rollenpumpe für die Perfusatprobenahme (biochemische Messungen und Gasanalysen). (3) Thermostatisches Wasserbad. (4) Membrangasaustauscher, der an einen Gastank angeschlossen ist (nicht abgebildet). (5) Linker Vorhofdrucksensor. (6) Beheizte und abgedichtete Kammer. (7) EVLP-Beatmungsgerät. (8) Temperaturfühler und Thermometer. (9) Verbindungsplattform für den Herz-Lungen-Block, dessen Elemente in Abbildung 2 dargestellt sind. (Hinweis: Der PA-Drucksensor ist nicht sichtbar). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Verbindungsplattform für den Herz-Lungen-Block. (1) Zuflusskanüle zur Lungenarterie. (2) Abflusskanüle aus dem linken Vorhof. (3) Anschluss für die Trachealkanüle. (4) Gewichtsmodul. (5) Eigenentwickelter Temperaturfühler, der fest an der Zulaufkanüle befestigt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Signalwandler/-verstärker und Analog/Digital-Wandlerbox. (A). Druckwandler/Verstärker für die Lungenarterien. (B). Durchflussregler für die Pumpendrehzahl. (C). Druckmessumformer/Verstärker für den linken Vorhof. (D). Lungengewichtsmodul. (E). Analog/Digital-Wandler. (F). PC zur Datenanzeige und -aufzeichnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Temperaturerhaltung des Perfusats während der EVLP. (1) Thermostatisches Wasserbad. (2) Perfusatbehälter mit doppelwandigem Glasbehälter, in dem Wasser aus dem thermostatischen Wasserbad zirkuliert. (3) Heizspiralschlauch in einem beheizten Wasserbehälter, der mit dem thermostatischen Wasserbad verbunden ist. (4) Organkammer mit doppelwandigem Glasbehälter für die Zirkulation von warmem Wasser aus dem Wasserbad. (5) Elektronisches Thermometer und hauseigener Temperaturfühler, die fest an der Zulaufkanüle befestigt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Identifizierung der optimalen Temperatur für die thermische Vorkonditionierung. (A) EVLP-Protokoll zur Bewertung verschiedener Heiztemperaturen. Von 60 min auf 90 min EVLP wurde die Perfusattemperatur bei den angegebenen Temperaturen erhöht. Nach 90 min EVLP wurde die Temperatur für 90 min bis zum Ende der EVLP auf 37 °C zurückgesetzt, wobei verschiedene physiologische und molekulare Messungen durchgeführt wurden. (B) Zusammenfassung der Ergebnisse der Auswirkungen der unterschiedlichen Heiztemperaturen auf physiologische und molekulare Parameter (grün steht für günstige Effekte, rot für ungünstige Effekte und orange für gemischte Effekte). Die Heiztemperatur von 41,5 °C sorgte für die meisten Schutzwirkungen. Abkürzungen: EVLP = ex-vivo Lungenperfusion; TP = thermische Vorkonditionierung. Diese Abbildung wurde von Ojanguren et al.21 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Chirurgisches Material. (A) Instrumente für die Extraktion des Herz-Lungen-Blocks: Aneurysma-Clip-Halter und Aneurysma-Mikroclip (Yasargil-System), Bulldoggenklemme, Schere, Mikroschere, Retraktoren, die an Gummibändern befestigt sind. (B) EVLP-Kanülen für die Lungenarterie (PA), den linken Vorhof (LA) und die Luftröhre. (C) Hausgemachtes Perfusionssystem zur Kaltperfusatspülung der Lunge. Der Abstand zwischen der Höhe der PA im Tier und dem Boden der Spritze ist auf 20 cm eingestellt. (C) Hausgemachter Halter. (Nicht abgebildet: Operationsmikroskop, Beatmungsgerät und Anästhesie-Setup). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Repräsentative Bilder der chirurgischen Vorbereitung (A) Vorgebundener Knoten um die Lungenarterie. (B) Vorgebundener Knoten um die Herzspitze. (C) Bulldoggenklemme (blauer Kreis) an der PA-Kanüle und Aneurysmaclip (roter Kreis) an der Luftröhre. Abkürzung: PA = Lungenarterie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Flussdiagramm. Wichtige Schritte, um den Fortschritt durch die verschiedenen Phasen des Protokolls zu führen. Der Zeitraum zwischen 1 h und 1,5 h EVLP wird vergrößert, um das Behandlungsprotokoll entsprechend der Gruppenzuordnung (Kontrolle vs. thermische Vorkonditionierung) anzuzeigen. Abkürzungen: CI = kalte Ischämie; EVLP = ex-vivo Lungenperfusion; PA = Lungenarterie; SPC = statische pulmonale Compliance; TP = thermische Vorkonditionierung; WI = warme Ischämie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 9: Repräsentative Ergebnisse der Auswirkungen der thermischen Vorkonditionierung in geschädigten Rattenlungen. Lungen, die durch 1 h warme Ischämie geschädigt worden waren, wurden in einem EVLP-System für 6 h perfundiert. Von 60 bis 90 min EVLP wurde eine Gruppe von Lungen einer thermischen Vorkonditionierung bei 41,5 °C unterzogen (TP-Gruppe). Eine Kontrollgruppe von Lungen wurde während der gesamten EVLP bei 37 °C gehalten. (A) Statische pulmonale Compliance (SPC), ausgedrückt als Verhältnis des Anfangswerts, in der Kontroll- (Strg, n = 5) und TP-Lunge (n = 5). SPC war in der TP-Lunge besser konserviert. (B) Gewichtszunahme der Lunge während der EVLP in der Kontroll- (n = 5) und TP-Lunge (n = 5). In der TP-Gruppe kam es zu einer signifikanten Verringerung der Ödembildung. (C) Die Freisetzung des Endothelzell-Biomarkers von-Willebrand-Faktor im Perfusat war in der TP-Gruppe (n = 5) im Vergleich zu Kontrollen (n = 5) unterdrückt. (D) Makroskopisches und mikroskopisches Erscheinungsbild der Lunge (Hämatoxylin-Eosin-Färbung) am Ende der EVLP in der Kontroll- (n = 5) und TP-Lunge (n = 5). (E) Der Lungenverletzungs-Score (für die Quantifizierung der histologischen Schädigung) war in der TP-Gruppe niedriger (n = 5) als in der Kontrollgruppe (n = 5). (F) Proteinspiegel des induzierbaren Hitzeschockproteins HSP70 in Lungengewebeextrakten, gemessen nach 1, 2, 3, 4,5 und 6 h EVLP in Kontroll- und TP-Gruppen (n = 5/Gruppe zu jedem Zeitpunkt), die eine ausgeprägte Hitzeschockreaktion in der TP-Gruppe zeigen. Die Expression von HSP70 in der TP-Gruppe erreichte nach 3 h EVLP (90 min nach Ende der TP) ihren Höhepunkt und blieb danach bis zum Ende der EVLP stabil.
Alle Diagramme zeigen die Mittelwerte ± SEM. Für Zeitverlaufsexperimente (A-C,F) wurden statistische Vergleiche mit bidirektionaler ANOVA durchgeführt, gefolgt von Sidaks Test für den Gruppeneffekt und Bonferroni's Anpassungen für den Zeiteffekt (mit Zeit 1 h als Referenz). Für den Lungenverletzungs-Score (E) wurden statistische Vergleiche mit dem Mann-Whitney-Test durchgeführt. * p < 0,05 (Unterschiede zwischen den Gruppen), † p < 0,05 vs 1 h EVLP. Abkürzungen: Strg = Steuerung; EVLP = ex-vivo Lungenperfusion; HSP70 = Hitzeschockprotein 70; SPC = statische pulmonale Compliance; TP = thermische Vorkonditionierung. Modifiziert von Parapanov et al.23. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zusammensetzung der im Protokoll verwendeten Lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: EVLP-Einstellungen für Perfusionsfluss, Zuflusstemperatur (auf Höhe der Pulmonalarterienkanüle) und Beatmung im Zeitverlauf. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Fehlerbehebung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Materialien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Entwicklung eines reproduzierbaren und physiologisch relevanten EVLP-Modells für Ratten stellt einen bedeutenden Schritt in der Lungentransplantationsforschung dar. Trotz signifikanter Speziesunterschiede zwischen der Ratten- und der menschlichen Lunge (kürzlich in1 überprüft), insbesondere der größeren Vulnerabilität der Rattenlunge, bietet das Ratten-EVLP-Modell pharmakologische und nicht-pharmakologische Interventionen mit hoher Reproduzierbarkeit und niedrigen Kosten. EVLP bietet eine einzigartige Plattform zur Bewertung der Lungenfunktion von Spendern, zur Simulation klinischer Verletzungsszenarien wie Ischämie-Reperfusionsschäden und zur Durchführung therapeutischer Interventionen vor der Transplantation 2,39,40. In diesem Zusammenhang ermöglicht das Ratten-EVLP-Modell mechanistische Untersuchungen mit hohem Durchsatz unter streng kontrollierten Bedingungen33. In den letzten Jahren haben mehrere Gruppen zur Verfeinerung der EVLP-Techniken von Ratten beigetragen. Nelson et al. lieferten grundlegende Verfahrensleitlinien39. Wang et al. schlugen einen modularen EVLP-Aufbau vor, der auf die Simulation der Spende nach dem Kreislauftod (DCD) zugeschnitten ist41. Gouchoe et al. untersuchten neuartige Perfusatformulierungen unter Verwendung künstlicher Sauerstoffträger42 und Oliveira et al. konzentrierten sich auf Entzündungen nach langer Erkältungsischämiekonservierung38. Aufbauend auf diesem vorhandenen Wissen führt unser aktuelles Protokoll eine neuartige, nicht-pharmakologische Strategie ein, nämlich die thermische Präkonditionierung, die endogene Schutzmechanismen für die Rekonditionierung von Rattenlungentransplantaten aktivieren soll, die durch warme Ischämie geschädigt wurden. Unser geschädigtes Lungenmodell, das DCD-Bedingungen simuliert, wurde an männlichen Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt33.

Die Etablierung dieses Protokolls erforderte eine sorgfältige Beachtung mehrerer technisch anspruchsvoller Schritte, die die Lebensfähigkeit und Reproduzierbarkeit der Lunge entscheidend beeinflussen. Die Lungenentnahme muss mit minimaler Manipulation durchgeführt werden, um eine Parenchymverletzung zu vermeiden. Die Tiefe der Anästhesie ist von größter Bedeutung, um eine durch Keuchen verursachte Lungenstauung und eine schlechte Entblutung zu verhindern. Die strikte Vermeidung von Luftblasen während der Kanülierung und des Circuit-Primings ist unerlässlich, da bereits kleine Embolien Ödeme auslösen können43. Spezifische Ratschläge zur Fehlerbehebung für häufige Protokollprobleme sind in Tabelle 3 aufgeführt. Während die Beatmungs- und Perfusionseinstellungen innerhalb sicherer Grenzen angepasst werden können, müssen lungenprotektive Strategien beibehalten werden, um ein Barotrauma oder Volutraumazu verhindern 44. Der Perfusatfluss kann bei Ratten auf bis zu 20 % des geschätzten Herzzeitvolumens erhöht werden, verglichen mit 40 % bei größeren Modellen wie Schweinen und Menschen, muss aber sorgfältig titriert werden45. In unserem Protokoll verwenden wir einen niedrigeren Perfusatfluss (7,5 % des theoretischen Herzzeitvolumens), um einen Anstieg des Lungenarteriendrucks und die Entwicklung eines frühen Lungenödems in warmen, ischämisch geschädigten Lungen zu verhindern und so eine verlängerte Vorbereitung zu ermöglichen. Obwohl einige Laboratorien Kortikosteroide während der Perfusion verabreichen, um Entzündungen zu reduzieren46,47, könnten ihre bekannten entzündungshemmenden Wirkungen einige experimentelle Ergebnisse verwirren, und wir verwenden sie daher nicht in unserem Modell, um die Fähigkeit zur Untersuchung von Lungenschäden und Entzündungsprozessen zu erhalten.

Die thermische Vorkonditionierung erfordert eine präzise Temperaturregelung. Da Wärme entlang des Schlauchs vom Reservoir zur Lunge verloren geht, muss die Perfusattemperatur an der Zulaufkanüle überwacht und die Wasserbadeinstellung leicht über der gewünschten Zulauftemperatur gehalten werden, um das Ziel innerhalb der Präparation zu erreichen. Die Sensoren werden jährlich mit einem Mehrkanal-Digitalthermometer PCE-T 1200 kalibriert, um die Genauigkeit zu gewährleisten.

Unsere Ergebnisse gehen auch auf die wichtigsten Einschränkungen der konventionellen Wärmetherapie ein. Die systemische Wärmeanwendung wird durch eine ungenaue Temperaturregelung, systemische Nebenwirkungen und mangelnde Organspezifität eingeschränkt. EVLP umgeht diese Barrieren, indem es eine kontrollierte, lokalisierte Umgebung bereitstellt, die eine präzise Abgabe von thermischem Stress direkt an das Lungengewebe ermöglicht29. Diese Methode ermöglicht eine rigorose Modulation sowohl des Ausmaßes als auch der Dauer der thermischen Spannung, zwei kritische Parameter für die Optimierung der schützenden zellulären Reaktion, ohne eine thermische Schädigung auszulösen. Darüber hinaus ermöglicht unsere EVLP-Plattform mehrere nachgelagerte Auswertungen, einschließlich molekularer, histologischer und funktioneller Analysen. Wichtig ist, dass Lungen, die einer EVLP-Behandlung unterzogen wurden, auch transplantiert werden können, was eine direkte Bewertung der Funktion der Transplantat nach der EVLP-Transplantation in vivo ermöglicht 29. Somit unterstützt das Modell die Beurteilung sowohl auf der Ebene der isolierten Organe als auch nach der Transplantation. In diesem Zusammenhang erweist sich die Integration der thermischen Vorkonditionierung, einer transienten Exposition gegenüber 41,5 °C während der EVLP, als vielversprechende Intervention. Durch die Stimulierung einer Hitzeschockreaktion und anderer stressadaptiver Signalwege verbessert diese Methode die Resilienz des Transplantats ohne pharmakologische Störfaktoren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die thermische Präkonditionierung die Physiologie der Lungentransplantate verbessert, die Bildung von Ödemen und die Freisetzung von Entzündungsmediatoren und Biomarkern zellulärer Schädigung reduziert (wie z.B. die reduzierten Spiegel des von-Willebrand-Faktors im EVLP-Perfusat wärmebehandelter Lungen zeigen). Morphologische Analysen unterstützen die schützende Wirkung dieses Eingriffs mit reduzierten strukturellen Schäden und Erhalt der Gewebeintegrität. Die meisten experimentellen EVLP-Daten von Ratten wurden bei Männchen generiert, was die geschlechtsspezifischen Erkenntnisse einschränkt. Zwei Studien berichteten über unterschiedliche Ergebnisse bei Frauen - reduzierte Reperfusionsschäden bei einer und erhöhte Entzündungen bei einer anderen48,49. Obwohl in unserer Studie Männchen verwendet wurden, haben wir zuvor TP-Vorteile in einem EVLP-Modell von Schweinen mit Weibchen beobachtet29, was auf eine Relevanz für alle Geschlechter hindeutet.

Wichtige Einschränkungen und Nachteile unserer Methode müssen hervorgehoben werden. Um zu gewährleisten, dass die Lunge mit der tatsächlich gewünschten Temperatur durchblutet wird, muss diese zunächst an der Zulaufkanüle durch festes Anbringen des Temperatursensors überwacht werden. Zweitens ist es zwingend erforderlich, dass die Temperaturänderungen innerhalb sehr kurzer Zeiträume erreicht werden, was die Verwendung eines schnell reagierenden Thermalwasserbades zum Erhitzen und die Zugabe von Eis zum Wasserbad zur schnellen Abkühlung erfordert. Drittens kann die physiologische Reaktion auf Hitzestress je nach verwendeter Spezies unterschiedlich sein und hängt stark vom Ausmaß und der Dauer des Stresses ab. Daher ist es zwingend erforderlich, Pilotversuche mit verschiedenen Heiztemperaturen für unterschiedliche Zeiträume durchzuführen, falls dieses Protokoll auf verschiedene Tierarten oder die menschliche Lunge angewendet wird, und spezifische Endpunkte zu bewerten, die sich sowohl auf schützende als auch auf mögliche schädliche Auswirkungen des angewendeten Hitzestresses beziehen. Viertens hängen die Auswirkungen der thermischen Vorkonditionierung aufgrund der kinetischen Expression von auf Hitze reagierenden Genen von der Erholungszeit nach der Anwendung von Hitzestress ab. Experimente mit unterschiedlichen Belastungsdauern nach der Hitze (d.h. mit unterschiedlichen Dauern der EVLP) sind erforderlich, um solche zeitabhängigen Effekte der Wärmeanwendung zu bewerten, wie in unserer jüngsten Veröffentlichung zu diesem Themagezeigt wurde 30.

Insgesamt etabliert unsere aktuelle Studie ein detailliertes, reproduzierbares EVLP-Protokoll für Ratten, das die thermische Vorkonditionierung als praktikable Strategie zur Verbesserung der Lungenqualität von marginalen Spendern beinhaltet. Das Protokoll ist skalierbar und an größere EVLP-Systeme von Tieren oder Menschen anpassbar, was seine translationale Relevanz unterstreicht. Indem es sowohl methodische Strenge als auch physiologische Genauigkeit bietet, eröffnet dieses Modell neue Wege für die Erforschung nicht-pharmakologischer Interventionen, die darauf abzielen, Ischämie-Reperfusionsschäden zu reduzieren und die Ergebnisse von Lungentransplantaten nach der Transplantation zu verbessern.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Gefördert durch ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (Nr 310030_212252) an TK und LL).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Allgemeine Ausrüstung
Aneurysma-Clip B. BraunFE762K
Luft-/Oberflächenwälle-WärmesensorTES Electrical Electronic Corp/Distrelec AGTP01/176-67-162
Stumpfe RetraktorenFeine wissenschaftliche Werkzeuge18200-09
Bulldoggen-SerafinesFeines wissenschaftliches Werkzeug18051-50
Gaze Compresss Promedical25404
Verbindungsset für die AnästhesieHugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3076
WattestäbchenAngewandte SA6001109
Zerschneidende SchereB. Braun BC165R
Gesichtsmaske für RatteTem SegaPFM0006
Heparin 5000 U/mLB. Braun3522430
Induktionskammer für die AnästhesieHugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus50-0116
Iris-Dissektions-Zange, voll gebogenAesculap  OC022R
IsofluranProvet AG2222
Isofluran-Dampf 19.3Rothacher-MedizinCV30-310 O2/Luft
iSTAT4-PatroneAxon lab AG03P85-25
Ketasol 100 (100 mg/mL)Dr. E. Graeub AGQN01AX03
Lister Scissors B. BraunBC876R
Mikro-Schere, gebogener Stumpf/StumpfAesculap FM011R
Micro-Adson-TangetteFeines wissenschaftliches Werkzeug11018-12
Mikro-MückenhämostateFeines wissenschaftliches Werkzeug13011-12
Microscop OPMI MDUZeiss267067
NaCl 0,9 % B. Braun534534
Nadel 23 G x 25 mmBD Microlance 4300800
Nadel 25 G x 25 mmBD Microlance 3300400
Perfadex (Erhaltungslösung)Xvivo-Perfusion AB19811
Perfusionsspritze 60 ml Luer LockBD-Plastik300865
RasorAesculap GT-421
MaßstabMettler toledoPB602-L
Seidennaht 4-0B. BraunF1134035
Seidennaht 5-0B. BraunF1134027
Steen (Perfusionslösung)Xvivo-Perfusion AB19004
Chirurgische HandschuheAnsell93-843
Spritze 1 mL, Omnifix-FB. Braun9161406V
BandLeukofix02136-00
ThermometerTES Elektrische Elektronikkorporation1303
Röhren mit Formol Biosystems Switzerland AG87-0960-00-10113
Beatmungsgerät (EVLP) (Gezeitenvolumen gemäß EVLP-Protokoll eingestellt)FlexiventFX3
Beatmungsgerät (Lungenbeschaffung)  (Gezeitenvolumen eingestellt als: 7,69*(Körpergewicht (kg))^1,04)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus683
WEITLANER-RetraktorB. BraunBV073R
Xylasol (1 mg/mL)Dr. E. Graeub AGQN05CM92
Yasargil ApplierB. BraunFE502T
IPL-2 EVLP-System
Adapter für ÜberdruckHugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3635
AME 14 – SC0062 Pumpenschlauch (Tygon) 3-Stufen-Halsband, Packung mit 12Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-0126
AME 24 - SC0072 Pumpenschlauch (Tygon) 3-Stop-Halsband, Packung mit 12Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-0155
Basiseinheit für die isolierte perfundierte Lungengröße 2 (IPL-2) Typ 829/2Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-2266
Verbindungsset für den Glasfaser-Oxygenator D150Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3765
EBM-Ödem-Ausgleichsmodul (EBM) mit SensorHugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-4626
Faser-Oxygenator Typ D150, Packung mit 5Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3762
Halter zum Klemmen der Aorten- oder Tracheenkanüle für OP-Tabellen Größe 5Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3855
Halter für OxygenatorenHugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3061
HSE-GewichtsmesssystemHugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-4604
HSE-BDAS grundlegende Datenerfassungssoftware für Windows 2000, XP, Windows 7Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-1712
HSE-USB-Datenerfassungshardware, eigenständige USB-Box für Windows 10 oder 11Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3330
ISM 827/230 V Walzenpumpen-Regelo-Analog, 4 Kanäle, 0,003–35 ml/min (2 x)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-0114
Linke Vorhofkanüle (DD 4,0 mm)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-0712
Mini-Durchfluss-Sauerstoffelektrode mit 1/16" Anschlüssen (optional)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-4189
Montagekit für den Faser-Oxygenator Typ D150 auf den HalternHugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3759
Einweg-Absperrhahn Typ 9500 (einer für PA, einer für LA)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-0097
OPPM plugsys Sauerstoff-Partialdruckmodul Typ 697  (Optional)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-0210
Plugsys Basic System Gehäusetyp 603Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-0045
pO2 Nulllösung 20 Pakete à 20 ml  (Optional)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3812
Druckwandler P75 Typ 379/HSE, Bereich -75 bis + 75 mm Hg (PA, LA)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-0020
Pulmonalarterienkanüle (OD 2,0 mm, Kopfdurchmesser 2,5 mm)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-0711
Reservoir (ummantelt) für PufferlösungHugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3496
SCP plugsys Servo-Controller für Perfusionstyp 704Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-2806
Abschirmungsgehäuse für einen pO2 oder pCO2 Mini-Sensor  (Optional)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-4196
Kleine Montageplatte für einen einzelnen O2 oder CO2 Sensor  (Optional)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3000
TAM-A plugsys Transducer-Verstärkermodul Typ 705/1 (eins für PA, eines für LA)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-0065
Thermostatischer Zirkulator E 103 (3 L)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-0125
Dreifach-Absperrhahn Typ 9560 R (einer für PA, einer für LA)Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-0096
Rohr-Set für den Pufferbehälter mit Absperrventilen für die FlüssigkeitsleitungHugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3456
Belüftungskanüle (Tracheal) OD 2,0 mm, L 14 mmHugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus73-3384
Computersoftware
HSE-BDAS grundlegende Datenerfassungssoftware für Windows 2000, XP, Windows 7Hugo Sachs Elektronik – Harvard ApparatusV2.0
ExcelMicrosoft2502, Microsoft 365
FlexiwareScireq8
GraphPad-PrismaGraphPad Software Inc.10.0.1
Sprague-Dawley-Ratten Charles River Laboratories (Saint-Germain-Nuelles, Frankreich) & nbsp;

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