Methodenartikel

Standardisierter SDS-PAGE-Workflow für personalisiertes Protein-Corona-Profiling bei der frühen Krebserkennung

DOI:

10.3791/69090

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19. Dezember 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NanoDelivery Lab, Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll standardisiert die SDS-PAGE-Analyse für personalisierte Protein-Koronaprofilierungen auf Nanopartikeln und ermöglicht so eine reproduzierbare, skalierbare und kostengünstige Detektion krebsspezifischer Signaturen. Konzipiert für die frühzeitige Diagnose eines pankreatalen ductalen Adokarzinoms, bietet es eine praktische, BERUHIGT ausgerichtete Alternative zu komplexen proteomischen Methoden sowohl in Forschung als auch in klinischen Umgebungen.

Zusammenfassung

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Die Bildung einer personalisierten Protein-Korona (PC) auf Nanopartikeln (NPs) nach Kontakt mit biologischen Flüssigkeiten hat sich als vielversprechende, minimalinvasive Strategie zur frühzeitigen Krebserkennung erwiesen. Diese Studie führt ein standardisiertes Protokoll zur Profilierung der Proteinkorona unter Verwendung der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ein, optimiert zur Sicherstellung von Robustheit, Reproduzierbarkeit und Automatisierung. Die Methode wurde rigoros auf verschiedenen Nanopartikelplattformen (NP), Plasmaquellen und experimentellen Bedingungen validiert und zeigte konsistent reproduzierbare Profile mit minimaler operatorabhängiger Variabilität. Im Vergleich zu herkömmlichen Proteomik-Techniken bietet dieser Ansatz eine schnellere und kostengünstigere Lösung, die die REASSED-Kriterien der Weltgesundheitsorganisation für Diagnostik erfüllt. Bei Anwendung auf das pankreatale duktale Adenokarzinom (PDAC), eine hochaggressive Malignität mit begrenzten frühen Biomarkern, erreichte dieser Workflow Klassifikationsgenauigkeiten von bis zu 90 %, selbst bei Patienten im Frühstadium. Diese standardisierte Plattform stellt einen bedeutenden Fortschritt hin zu skalierbaren, klinisch übertragbaren und erschwinglichen diagnostischen Werkzeugen für das Krebsscreening dar.

Einleitung

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Nanopartikelprotein-Korona (NP-PC)

Die Charakterisierung des PC, die sich bei NPs nach ihrer Exposition gegenüber biologischen Flüssigkeiten bildet, hat sich als kraftvolle Strategie für Krankheitsdiagnostik und personalisierteMedizin erwiesen. Diese adsorbierte Proteinschicht, dynamisch und krankheitsspezifisch in ihrer Zusammensetzung, verändert die synthetische Identität der NPs und treibt ihre biologischen Interaktionenvoran. Die Zusammensetzung des PC ist nicht zufällig, sondern stark abhängig sowohl von den physikochemischen Eigenschaften der NPs als auch von der biologischen Umwelt, in dersie eingeführt werden. Faktoren wie NP-Größe, Form, Oberflächenladung und -zusammensetzung können die Affinität, Kinetik und strukturelle Anordnung adsorbierter Proteine maßgeblich beeinflussen. Ebenso spielen die biologische Flüssigkeit, ihre Quelle, Komplexität und der Krankheitszustand eine Schlüsselrolle bei der Bestimmung der endgültigen Zusammensetzung der Korona 4,5,6.

Die dynamische Natur der Korona erschwert die Analyse zusätzlich, da sich ihre Struktur im Laufe der Zeit von einer weichen, locker gebundenen Außenschicht zu einem stabileren und enger adsorbierten inneren Kern 7,8 entwickelt. Diese sich entwickelnde Architektur, die aus kompetitiven Proteinadsorptionsereignissen resultiert, erfordert zeitaufgelöste und standardisierte Ansätze, um sinnvoll charakterisiert zuwerden 9. Trotz dieser Komplexität ist heute weithin anerkannt, dass der PC kein bloßes Artefakt, sondern eine biologisch informative Schicht ist, die systemische Krankheitsänderungen auf nicht-invasive Weise erfassen kann. Das Ziel der in diesem Artikel beschriebenen Methode ist es, die Verwendung von SDS-PAGE für die robuste, reproduzierbare und zugängliche Profilierung des personalisierten PCs zu standardisieren, insbesondere für die frühe Krebserkennung durch Flüssigbiopsie-Ansätze10.

Der personalisierte PC und seine Bedeutung für die Krebserkennung

Die wissenschaftliche Grundlage dieser Methode liegt im Konzept des personalisierten PC. Bei der Inkubation mit Patientenplasma adsorbieren NPs einen einzigartigen Protein-Fingerabdruck, der den physiologischen oder pathologischen Status der Person widerspiegelt11,12. Dieses Konzept wurde durch Studien bestätigt, die signifikante Veränderungen der PC-Zusammensetzung im Vorhandensein einer Erkrankung zeigen, darunter pankreatales Adenokarzinom (PDAC), Lungenkrebs13, Meningeom14 und Glioblastom multiforme15. Insbesondere unterscheiden sich bei PDAC PCs, die aus Patientenplasma gewonnen wurden, erheblich von denen gesunder Spender. Diese Unterschiede wurden in Klassifikatormodellen genutzt, die eine diagnostische Genauigkeit von bis zu 90 % erreichen. Der PC dient somit als nanoskaliger Konzentrator krankheitsspezifischerSignale 16.

Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass PCs von Krebspatienten mit Proteinen angereichert sind, die an Entzündung, Gerinnung, Komplementaktivierung und extrazellulärem Vesikeltransport beteiligt sind – biologischen Wegen, die bei Malignität17 als dysreguliert gelten. Diese Proteinmuster sind innerhalb einzelner Patientenklassen sehr reproduzierbar, unterscheiden sich jedoch deutlich zwischen verschiedenen Krankheitszuständen, was darauf hindeutet, dass das Coronavirus nicht nur als allgemeiner Krankheitssensor, sondern auch als krankheitsspezifischer Klassifikator fungieren kann. Im Kontext von PDAC, einer der tödlichsten und heimtückischsten Malignitäten, hat unsere Gruppe NP-gestützte Bluttests (NEB) auf Basis der PC-Charakterisierung 18,19,20 entwickelt. Dieser minimalinvasive Ansatz nutzt die Fähigkeit von NPs, Plasmaproteine mit geringer Häufigkeit und krankheitsveränderten Proteinen selektiv zu bereichern, sodass sie durch einfache, elektrophoretische Trennung auf der Laborbasis nachweisbar sind.

Vorteile gegenüber herkömmlichen proteomischen Techniken

Die Begründung für die Entwicklung dieses Ansatzes beruht auf den Einschränkungen konventioneller proteomischer Techniken wie der Massenspektrometrie (MS), die zwar eine tiefe Proteomabdeckung bieten, aber teuer, zeitaufwendig und für Hochdurchsatz-Screenings oder Point-of-Care-Diagnostik ungeeignetsind. Eine weitere zentrale Herausforderung liegt in der intrinsischen Komplexität von MS, bei der Unterschiede in der Probenvorbereitung, Instrumentkalibrierung, Erfassungsparametern und Datenanalyse-Workflows zu erheblichen zwischenlaboralen Unterschieden in der berichteten PC-Zusammensetzungbeitragen. Im Gegensatz dazu bietet die SDS-PAGE-Analyse des PCs eine schnelle und kosteneffiziente Möglichkeit, krankheitsbedingte proteomische Muster zu erfassen. Entscheidend ist, dass die SDS-PAGE-Ausgabe nicht auf der absoluten Identifikation einzelner Biomarker basiert, sondern auf der Erkennung systematischer Veränderungen im globalen Proteinprofil, die durch Densitometrie und multivariate Statistiken analysiert werden können.

Im Gegensatz zu antikörperbasierten Assays, die auf bekannte Ziele beschränkt sind und zu Kreuzreaktivität neigen, bietet SDS-PAGE eine unvoreingenommene Sicht auf die Proteinlandschaft, bewahrt die Integrität der ursprünglichen Probe und ermöglicht eine nachgelagerte Integration mit komplementären Plattformen wie LC-MS/MS zur Proteinidentifikation. Da SDS-PAGE zudem keine Probenfraktionierung oder -depletion benötigt, eignet es sich besonders für die Analyse von biologischen Proben mit geringem Volumen, eine wesentliche Funktion für Anwendungen mit frühzeitiger Diagnose oder Screening fragiler Populationen23. Aus all diesen Gründen entspricht dieses Protokoll mehreren der WHO-REASSED-Kriterien (Echtzeit-Konnektivität, einfache Probenentnahme, erschwinglich, sensibel, spezifisch, benutzerfreundlich, robust, gerätefrei und lieferbar), was es zu einem praktischen Werkzeug für skalierbareDiagnosen rund um 24 macht. Auf Grundlage dieser Evidenz wurde die Hypothese aufgestellt, dass NPs mit Patientenplasma inkubierten, ein reproduzierbares, krankheitsspezifisches PC, das systematisch mit SDS-PAGE profiliert werden kann. Wir schlagen außerdem vor, dass eine standardisierte elektrophoretische Analyse dieser personalisierten Koronan Krebspatienten von gesunden Personen unterscheiden und so ein robustes und klinisch übersetzbares diagnostisches Werkzeug bieten kann.

Arbeitsablauf und klinische Anwendbarkeit

Das auf SDS-PAGE basierende Korona-Profilierungsprotokoll systematisiert jeden Schritt: von der Vorbereitung und Inkubation der NPs mit verdünntem Plasma bis hin zur Koronaisolation, Gelelektrophorese und quantitativer densitometrischer Analyse (Abbildung 1). Wichtige Parameter wie Inkubationszeit, Plasmaverdünnung und NP-Typ25 sind fein abgestimmt, um eine optimale Proteinaufnahme und Gelbildauflösung sicherzustellen. Das Protokoll adressiert auch praktische Bedenken wie Sample-Durchsatz, Speicherstabilität und Batch-zu-Batch-Konsistenz26. Außerdem kann SDS-PAGE, da es sich um eine nicht-destruktive Technik handelt, nahtlos mit komplementären proteomischen Ansätzen wie MS kombiniert werden, um die molekulare Zusammensetzung einzelner Proteinbänder15 zu bestimmen. Der Arbeitsablauf wurde auf eine hohe interoperatorische Reproduzierbarkeit optimiert, einschließlich Kompatibilität mit manuellen und automatisierten Pipettierungsplattformen, und ist robust über verschiedene NP-Chemikalien und Plasmakonzentrationen hinweg. Diese Funktionen stellen sicher, dass die Methode in verschiedenen Laborumgebungen angewendet werden kann, was sie sowohl für zentrale Diagnosezentren als auch für dezentrale Forschungslabore geeignet macht. Daher eignet sich diese Technik besonders gut für Forscher und Kliniker, die an früher Diagnostik, Biomarker-Entdeckung und translationaler Nanomedizin beteiligt sind. Sie ist auf eine Vielzahl von Pathologien anwendbar und an verschiedene biologische Flüssigkeiten jenseits des Plasmas, einschließlich Speichel oder Urin, anpassbar. Die Flexibilität und Robustheit dieses Protokolls machen es zu einem starken Kandidaten für die Integration in klinische Validierungspipelines, groß angelegte Screening-Studien und Point-of-Care-Plattformen.

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Protokoll

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Dieses Protokoll bietet einen detaillierten und standardisierten Arbeitsablauf für die Vorbereitung, Inkubation mit menschlichem Plasma (HP), Isolierung und Analyse des auf verschiedenen NP-Typen gebildeten PC. Abbildung 2 ist eine grafische Darstellung des gesamten Protokolls und skizziert die sequentiellen experimentellen Schritte von der NP-Synthese bis zur multivariaten SDS-PAGE-Analyse von Proteinprofilen. Wichtig ist, dass die Methodik von unserer Gruppe standardisiert wurde, wie in früheren Arbeiten18,26 gezeigt, um Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung und Charakterisierung von NPs

  1. GO-Nanoblätter
    1. Verdünnen Sie eine 4 mg/ml-Lagerlösung in ultrareinem Wasser auf die gewünschte Konzentration. Sonikieren Sie 2 Minuten bei 28 % Amplitude (Puls: 0,8/0,6 s), um eine ordnungsgemäße Verteilung sicherzustellen.
    2. Quantifizieren Sie die Konzentration mittels UV-Vis-Spektroskopie
    3. Hydrodynamische Größe und Zeta-Potenzial werden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) mit einem 633 nm He-Ne-Laser gemessen. Stellen Sie Proben durch Verdünnung in ultrareinem Wasser basierend auf Cuvette-Detektionsgrenzen vor (z. B. 1:100-Verdünnung für 1-ml-Cuvetten). Zeichnen Sie den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von drei Replikaten auf.
  2. Goldene NPs
    1. Verwenden Sie citratstabilisierte 100 nm Gold-NPs (Konzentration aus dem Lager: 3,8E+9 Partikel/mL) ohne weitere Modifikationen.
    2. Hydrodynamische Größe und Zeta-Potenzial werden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) mit einem 633 nm He-Ne-Laser gemessen. Stellen Sie Proben durch Verdünnung in ultrareinem Wasser basierend auf Cuvette-Detektionsgrenzen vor (z. B. 1:100-Verdünnung für 1-ml-Cuvetten). Rekordmittelwert ± SD von drei Replikaten.
  3. DOTAP-Liposomen
    1. Lösen Sie 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan (DOTAP)-Pulver in Chloroform in einer zertifizierten chemischen Damphaube auf, während Sie geeignete PSA (Laborkittel, Handschuhe, Schutzbrille) tragen. Verdampfen Sie 2 Stunden unter Vakuum, suspendieren Sie den Lipidfilm mit ultrareinem Wasser, um eine Endkonzentration von 1 mg/mL zu erreichen, und hydratieren Sie über Nacht bei 4 °C. Schließlich wird die Liposomenlösung 20 Mal durch einen 0,1 μm Polycarbonatfilter extrudiert.
    2. Hydrodynamische Größe und Zeta-Potenzial werden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) mit einem 633 nm He-Ne-Laser gemessen. Stellen Sie Proben durch Verdünnung in ultrareinem Wasser basierend auf Cuvette-Detektionsgrenzen vor (z. B. 1:100-Verdünnung für 1-ml-Cuvetten). Rekordmittelwert ± SD von drei Replikaten.
      VORSICHT: Chloroform in einer Abzugshaube mit kompletter PSA behandeln. Entsorgung organischer Lösungsmittelabfälle gemäß institutionellen Chemikaliensicherheitsverfahren.
      HINWEIS: Für GO mit Größenverteilungen, die etwa bei 300 nm zentriert sind, sonikate 10 Minuten bei 125 W, zentrifugiere bei 7.700 x g für 30 Minuten bei 4 °C, sammle Supernatant, zentrifugiere erneut bei 18.620 x g für 30 Minuten und suspendiere das Pellet wieder. Für GO mit Größenverteilungen zentriert etwa bei 100 nm, sonikieren Sie 3 × 180 Minuten bei 4 °C, zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 30 Minuten, nach jeder Runde bei 4 °C und sammeln Sie das endgültige Supernatant.

2. Herstellung menschlichen Plasmas

  1. Kommerzielles menschliches Plasma (HP)
    1. Verdünnen Sie kommerzielles lyophilisiertes Plasma bei Bedarf mit ultrareinem Wasser.
    2. Zentrifugieren Sie das rekonstituierte Plasma bei 18.620 x g für 15 Minuten bei 4 °C, sammeln Sie das Überlagerungsmittel und lagern Sie es bis zur Nutzung bei -80 °C.
  2. Patientenabgeleitete HP
    1. Zentrifugieren Sie Blutproben bei 1216 x g für 10 Minuten bei 4 °C und sammeln Sie den Überstandsstoff zur Plasmatrennung.
    2. Aliquot 450 μL Plasmaproben in 0,5 mL Protein-Low-Bind-Röhren und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.
      HINWEIS: Alle menschlichen Plasmaproben werden gemäß institutionellen ethischen Richtlinien entnommen, und von allen Teilnehmern wurde eine informierte Zustimmung eingeholt.
      VORSICHT: Menschliches Plasma ist biologisch gefährdet. Führen Sie in einem Biosicherheitsschrank (BSC) mit Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrillen. Entsorgen alle plasmahaltigen Materialien gemäß institutionellen Vorschriften zur Biosicherheit und Abfallentsorgung.

3. Gründung des PC

  1. Manueller Umgang mit Flüssigkeiten
    1. Bestimmen Sie das optimale NP: Plasma-Verhältnis durch Quantifizierung der Proteinkonzentration mittels eines Bicinchoninsäure-(BCA)-Tests zur Anpassung der Plasmaverdünnung.
    2. Fügen Sie 100 μL NP-Suspension zu 100 μL Plasma hinzu, um die gewünschten Plasmakonzentrationen zu erreichen.
    3. Inkubieren Sie bei 37 °C für 1 Stunde.
      HINWEIS: Für den BCA-Test mischen Sie die Reagenzien A und B (50:1), bereiten Sie BSA-Standardverdünnungen vor, fügen Sie 10-25 μL Probe/Standardprobe + 200 μL Reagenz hinzu, inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 °C und messen Sie die Absorption bei 562 nm. Die Plasmakonzentrationen werden typischerweise zwischen 0,5 % und 50 % v/v relativ zum NP-Volumen angepasst, abhängig vom NP-Typ. Für GO verwenden Sie niedrigere Konzentrationen (von 0,5 % bis 5 % empfohlen); für DOTAP/Gold-NPs verwenden Sie höhere Konzentrationen (bis zu 50 %). Verwende Protein-1,5-mL-Schwachbindungsröhren.
  2. Automatisiertes Inkubationsprotokoll
    1. Laden Sie das Flüssighandhabungssoftware-Protokoll auf die automatisierte Pipettierungsplattform (20 μL + 200 μL Kopfe)
    2. Geben Sie 100 μL jedes NP-Typs in niedrigbindende 1,5-mL-Röhren ab.
    3. Fügen Sie rekonstituiertes Plasma hinzu, das wie in 2.1 und 2.2 hergestellt wurde, gemäß folgender Formel:
      wobei VNP das NP-Aufhängungsvolumen ist. Für 100 μL NP:
      figure-protocol-1
      5%: 5,3 μL PS
      20 %: 25 μL PS
      50%: 100 μL PS
    4. Fügen Sie ultrareines Wasser hinzu, um 200 μL zu erreichen:
      5%: 94,7 μL
      20%: 75 μL
      50%: keine
    5. Mix-Samples:
      5 %: 15 μL Zyklen
      20 %: 50 μL Zyklen
      50 %: 100 μL Zyklen 3,2,6. Inkubieren bei 37 °C für 1 Stunde
      HINWEIS: Ergänzende Abbildung 1 zeigt die grafische Benutzeroberfläche des automatisierten Setups, das zur Herstellung von NP-HP-Gemischen bei drei Endplasmakonzentrationen (5 %, 20 % und 50 % v/v) verwendet wird, jeweils in dreifacher Form. Das Decklayout umfasst Tip-Racks, ein Abfallreservoir und ein 3-×-4-Low-Bind-Tube-Rack, das NP-Suspensionen (GO, Goldnanosphären und DOTAP-Liposom) (NP), HP und ultrareines Wasser (H2O) enthält. Verwenden Sie Protein-Low-Bind-Tuben.

4. PC-Analyse durch SDS-PAGE

  1. PC-Isolation
    1. Zentrifugieren Sie die NP-HP-Proben bei 18.620 x g, 4 °C, für 15 Minuten. Eine sichtbare Kugel sollte am Boden des Röhrchens vorhanden sein. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstandsmittel, der vor dem Fahren klar erscheinen sollte (siehe ergänzende Abbildung 2).
    2. Wasche das Pellet mit 200 μL ultrareinem Wasser, suspendiere es neu und zentrifugiere es erneut. Wiederhole diesen Schritt zweimal. Nach der Endwäsche sollte noch ein kompaktes Pellet sichtbar sein, was die erfolgreiche Isolierung der NP-Proteinkomplexe bestätigt (siehe ergänzende Abbildung 2).
    3. Bereite den Ladepuffer vor (LB):
    4. Berechnen Sie das gesamte LB-Volumen basierend auf dem Plasmazustand und dem Mischreduktionsmittel (1:10), SDS-Puffer-Denaturproteinen (1:2) und Wasser.
    5. Pellet in einem geeigneten Volumen von 1x LB neu aufhängen und 10 Minuten bei 100 °C kochen.
    6. Zentrifugiere bei 18.620 x g, 4 °C, für 15 Minuten. Sammle das Supernatant.
  2. SDS-PAGE-Beispiel-Laden
    1. Bereiten Sie die Leiter vor, indem Sie den Molargewichtsstandard (MW) mit dem Ladepuffer verdünnen.
    2. Verdünne 10x Tris/Glycin/SDS im laufenden Puffer auf 1x.
    3. Bauen Sie die Elektrophoresekammer mit 4%-20% fließfreiem Farbverlaufsgel zusammen und fügen Sie einen laufenden Puffer hinzu, bis der vom Hersteller empfohlene Wert erreicht wird.
    4. Laden Sie 10 μL-Proben und 7 μL-Leitern in jedem Bohrloch. Lasse Gel bei 150 V ~90 Minuten bei Zimmertemperatur laufen.
      HINWEIS: Das LB-Volumen sollte anhand der in 3.1.1 gewählten Plasmakonzentration berechnet werden, um eine optimale Proteinvisualisierung im Gelbild zu gewährleisten (typischerweise 10 μg Proteine in 20 μL LB).
      VORSICHT: Für optimale Reproduzierbarkeit führen Sie eine SDS-PAGE-Analyse mit frisch präparierten NP-Plasmaproben durch. Die Lagerung gewaschener Pellets bei -80 °C für 24 Stunden führte zu nachweisbaren Veränderungen sowohl physikochemischer Eigenschaften (nach Resuspensions- und DLS/Zeta-Potenzialmessungen) als auch der Proteinkorona-Fingerabdrücke (wenn die Pellets ab Schritt 4.3.1 des Protokolls verarbeitet wurden; siehe ergänzende Abbildung 3).

5. Analyse von Proteinmustern

  1. Bildverarbeitung
    1. Bildgel mit einem Chemilumineszenz-Imager.
    2. Verarbeiten Sie das Gelbild wie folgt:
      1. Importiere das Gel-Bild und speichere es als TIFF-Datei, korrigiere es bei unerwünschten Effekten, z. B. schrägen Lane-Verzerrungen, die besonders periphere Spuren betreffen. Alle Gel-Lanes erkennen. Subtrahiere das Hintergrundsignal aus dem Bild.
      2. Kalibrieren Sie die vertikalen Verschiebungen, indem Sie Pixeleinheiten in Molekulargewichtseinheiten umwandeln, basierend auf einer doppeltermigen Exponentialanpassung der Markierungsspur. Erzeugen Sie grafische Ausgaben, um Intensitätsprofile und spurspezifische Signalverteilungen zu visualisieren.
    3. Exportieren Sie die verarbeiteten Daten, also die berechneten eindimensionalen Profile.
    4. Berechnen Sie die Molekulargewichtsverteilungen durch Normalisierung der Profile und berechnen Sie ganzzahlige Flächen über die gewünschten MW-Bereiche für jede Spur.
    5. Exportieren Sie die Ausgabedaten, also die Integralflächen innerhalb der angegebenen Molekulargewichtsbereiche.
  2. Multivariate Analyse zur Diagnostik
    1. Wenden Sie lineare Diskriminantenanalyse (LDA) oder andere multivariate Methoden für die Klassifikationsanalyse an.
    2. Berechnen Sie Genauigkeit, Empfindlichkeit, Spezifität und führen Sie ROC-Analysen durch.
      HINWEIS: Die verwendeten Skripte für Bildverarbeitung, Profilnormalisierung, Anpassung und Klassifikation sind ab27 verfügbar, wo auch das entsprechende Benutzerhandbuch bereitgestellt wird.
      VORSICHT: Befolgen Sie Biosicherheitsprotokolle beim Umgang mit menschlichem Plasma.

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Ergebnisse

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Eine der größten Herausforderungen bei der Standardisierung von PC-Experimenten besteht darin, die technische und bedienerabhängige Variabilität zu minimieren, wie bereits in dieser Studie26 hervorgehoben wurde. Offene Fragen bestehen weiterhin bezüglich des Einflusses experimenteller Variablen wie Operator Bias und der Auswirkungen automatisierter Werkzeuge auf die Reproduzierbarkeit18,28

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Diskussion

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Methoden-Vielseitigkeit und Reproduzierbarkeit über NP-Typen hinweg

Das hier vorgestellte Protokoll bietet einen standardisierten und reproduzierbaren Workflow zur Isolierung und Charakterisierung des auf NP gebildeten PC beim Inkubieren mit HP. Wie in früheren und aktuellen Studien33 gezeigt wurde, ermöglicht die Methode die Erzeugung von SDS-PAGE-basierten molekularen Fingerabdrücken, die biologisch und diagnostisch r...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

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Die Forschung wurde teilweise vom MUR, National Plan for Complementary Investments to the NRRP, finanziert von der Europäischen Union-NextGenerationEU, Projekt "D3 4 HEALTH-Digital Driven Diagnostics, Prognostics and Therapeutics for sustainable Health care" finanziert. PNC0000001, Spoke 3 Linea tematica 2, Mission 4, Komponente 2 CUP: B53C22006120001. Diese Arbeit wurde auch von der AIRC Foundation im Rahmen des Projekts IG 2020-ID. 24521, P.I. Pozzi Daniela, unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 ml Protein LoBind TUBEEppendorf22431081
10x Tris/Glycin/SDSBiorad1610732
ZentrifugeLabortechnikZ 216 MK HermleVerwendet bei 18.620 RCF für 20 Minuten bei 4 & Grad; C
ChemiDoc-BildgebungssystemBio-Rad12003153Verwendet für die Gel-Bildaufnahme
ChloroformSigma AldrichC2432-1LLösungsmittel für DOTAP
Corning 1-200 & Mikro; L Universal Fit Bulk Packed Pipet TipsCorning4845
Criterion TGX Stain-Free Precast GelsBiorad5678095
Destilliertes Wasser 6 x 1 LiterThermofischer15230001
DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan)Avantipolare Lipide890890P-200mgZur Herstellung kationischer Liposomen verwendet; in Chloroform gelöst, verdampft, hydratisiert und extrudiert
Enduro 300V Netzteil Labnet E0303-230V
GloMax Discover Mikroplatten-LeserPromegaGM3000
Goldnanopartikel (citrat-stabilisiert)Sigma-Aldrich742031-25MLAls Nanomaterial verwendet; ohne weitere Reinigung verwendet
Gradienten-Polyacrylamid-Gel (4 & Strich; 20% TGX)Bio-Rad5678095Verwendet für SDS– PAGE
Grant Instrument  Thermoshaker HC24N (24 x 1,5 mL Mikroröhren)Fisher ScientificPHMT-PSC24N
Graphenoxid (GO)-LösungGrapheneaGO-4-1000Als Nanomaterial verwendet; verdünnt auf 0,25 mg/mL und sonikiert
Menschliches Plasma (HP)Sigma-AldrichP9523-5MLVerwendet für die Nanopartikel-Inkubation
ImageLab-SoftwareBio-Rad. Version 6.1.0.07/Verwendet zum Exportieren von Gel-Bildern als TIFF-Dateien
Laemmli Ladepuffer 2xBiorad1610737Verwendet zum Resuspendieren von Pellets
MATLABMathWorks. Version R2022a/Verwendet für Bildverarbeitung, Datenanalyse und Profilberechnung
Mini-ExtruderAvantipolare Lipide610020Verwendet zur Liposomenpräparation
NuPAGE Beispielreduktionsmittel (10X)ThermowissenschaftlichNP004
Phosphatsalz-PufferCorning 21-031-cmVerwendung für DOTAP-HP-Samples
Pierce BCA Protein-Assay Kit, 1 Kit (1 L)ThermoFisher23225
Pipetspitzen 0,5-10 μl klarAxygenT-300-STK
PIPETMAN L P10L, 0,5-10 & Mikro; L, MetallauswurfGilsonFA10002M
PIPETMAN P20, 2-20 & Mikro; L, MetallauswurfGilsonF144056M
PIPETMAN P200, 20-200 & Mikro; L, MetallauswurfGilsonF144058M
PIPETMAX automatisiertes PipettsystemGilsonGSYS0021Verwendung für die automatisierte Probenbehandlung
Polycarbonatfilter (0,1 & Mikro; m)Avantipolare Lipide610005-1EAVerwendet zur Liposomenextrudion
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein StandardsBiorad1610373
Precision Plus Protein Unfärbte Standards Biorad1610363EDU
Vibra-Zell-Sonikator VC505Sonics and Materials Inc.VC505
ZetaSizerMalvernZS90Verwendet für Messungen der dynamischen Lichtstreuung (DLS) und Mikroelektrophorese (ME)

Referenzen

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