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Methodenartikel

CD8+CD103+ Tregs mildern die trockene Augenerkrankung durch Unterdrückung der CD4+-T-Zell-vermittelten Entzündung und Schutz der Augenoberflächenintegrität bei Mäusen ab

316 Ansichten

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DOI:

10.3791/69110

⸱

21. November 2025

 , 
1Department of Ophthalmology, Jinan Second People's Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das den adoptiven Transfer von CD8+CD103+-regulatorischen T-Zellen als immuntherapeutische Intervention demonstriert, um stressbedingte trockene Augenerkrankungen durch umfassende Modulation pathogener CD4+-T-Zellantworten zu mildern.

Zusammenfassung

CD8+CD103+ regulatorische T-Zellen stellen eine spezialisierte immunsuppressive Population mit nachgewiesenem therapeutischem Potenzial bei Autoimmunerkrankungen dar; ihre Rolle bei der Entzündung der Augenoberfläche bleibt jedoch unerforscht. Dieses Protokoll beschreibt einen systematischen Ansatz zur Isolierung von CD8+CD103+ T-Zellen von Mäusen, die austrocknendem Stress ausgesetzt sind, und zur Bewertung ihrer therapeutischen Wirksamkeit durch adoptiven Transfer bei experimentellen Trockenaugenerkrankungen. Die Methodik umfasst magnetisch aktivierte Zellsortierung für CD8+CD103+ T-Zellreinigung, standardisierte Austrocknungsspannungseinduktion und umfassende funktionelle Bewertungen, einschließlich Messung der Tränenproduktion, Hornhautbarrieredurchlässigkeitstests und molekularer Analyse entzündlicher Mediatoren. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die CD8+CD103+ T-Zelltherapie die Tränenproduktion signifikant wiederherstellte, die Populationen der konjunktivalen Kelchzellen bewahrte und die Integrität der hornhautepithialen Barriere aufrechterhielt. Die Behandlung erreichte eine erhebliche Unterdrückung der Matrix-Metalloproteinase-Expression, reduzierte den apoptotischen Zelltod und modulierte die Zytokinprofile von pro-inflammatorischen zu gewebeschützenden Mustern. Das Protokoll reduzierte effektiv die CD4+-T-Zellinfiltration in Augengeweben, unterdrückte gleichzeitig die Produktion pathogener IL-17A- und IFN-γ und erhöhte die schützenden IL-13-Spiegel. Dieser Ansatz bietet einen robusten experimentellen Rahmen zur Untersuchung der CD8+CD103+ T-zellvermittelten Immunmodulation bei Erkrankungen der Augenoberfläche und etabliert eine grundlegende Methodik zur Entwicklung neuartiger zellbasierter Therapeutika zur Behandlung von Trockenaugenerkrankungen.

Einleitung

Die Erkrankung der trockenen Augen (DED) stellt eine weit verbreitete und lähmende Erkrankung der Augenoberfläche dar, die sich als bedeutendes globales Gesundheitsproblem etabliert hat, 10–30 % der Weltbevölkerung betrifft und die Lebensqualität, Arbeitsproduktivität und das psychische Wohlbefinden der Patienten erheblich beeinträchtigt(1,2,3). Die Pathophysiologie der DED umfasst ein komplexes Zusammenspiel zwischen Tränenfilminstabilität, Entzündung der Augenoberfläche und neurosensorischen Anomalien, die zusammen einen Teufelskreis aus Gewebeschäden und funktionellen Beeinträchtigungen aufrechterhalten4. Auf molekularer Ebene dient die Rissenhyperosmolarität als zentraler pathogener Mechanismus, der kaskadenhafte Entzündungsereignisse auslöst, die Stressreaktionswege aktivieren, proinflammatoriske Mediatorfreisetzung auslösen und letztlich das empfindliche homöostatische Gleichgewicht der Mikroumgebung der Augenoberflächebeeinträchtigen 5,6,7.

Die immunologische Landschaft der DED wird von adaptiven Immunantworten dominiert, wobei die CD4+-T-Zell-vermittelte Immunität eine entscheidende Rolle bei der Orchestrierung des Verfalls der Augenoberfläche und der Aufrechterhaltung chronischer Entzündung8 spielt. CD8+ T-Zellen bilden einen wesentlichen Bestandteil der normalen homöostatischen Immunzellpopulation innerhalb des Augengewebes und erhalten die Immunüberwachung und Gewebeintegrität unter physiologischen Bedingungen9. Bahnbrechende Untersuchungen haben gezeigt, dass austrocknender Stress (DS) antigenpräsentierende Zellen aktiviert und anschließend CD4+-T-Zellen auf pathogene Phänotypen vorbereitet, die bei der adoptiven Übertragung auf T-zell-defiziente nackte Mäuse autonom autoimmune Tränen-Keratokonjunktivitis (KCS) induzieren können, wodurch die wichtigsten Merkmale menschlicher DED10,11 wiederholt werden.

Angesichts der zentralen Rolle dysregulierter CD4+-T-Cell-Antworten in der Pathogenese von DED haben sich therapeutische Strategien zur Modulation der pathogenen T-Zell-Immunität als vielversprechende Ansätze für das Management dieser Krankheit erwiesen. In diesem Zusammenhang haben CD8+-regulatorische T-Zellen (Tregs), insbesondere die CD8+CD103+-Teilgruppe, aufgrund ihrer starken immunsuppressiven Fähigkeiten und gewebeschützenden Funktionen bei verschiedenen Autoimmun- und Entzündungserkrankungen erhebliche Aufmerksamkeit erregt. Diese spezialisierten regulatorischen Populationen modulieren die Immunantworten über mehrere Mechanismen, darunter zytokinvermittelte Suppression, direkte Zell-zu-Zell-Kontakthemmung und metabolische Regulation der Funktion der Effektorlymphozyten 12,13,14. Integrin αEβ7 (CD103) dient als kritischer Homing-Rezeptor, der die Positionierung intraepithelialer Lymphozyten über schleimhautige Gewebe erleichtert und CD8+CD103+ Tregs lokalisierte immunregulatorische Effekte an Entzündungsstellen15 ermöglicht.

Es gibt zunehmende Hinweise darauf, dass CD8+CD103+ Tregs ein signifikantes therapeutisches Potenzial zur Abschwächung schädlicher Immunreaktionen bei einer Reihe von autoimmunen Schleimhauterkrankungenhaben 16,17,18. Diese Zellen zeigen einzigartige Transportmuster, die ihre bevorzugte Ansammlung an Schleimhautstellen ermöglichen, wo sie wirksam gewebezerstörerische Immunreaktionen entgegenwirken und gleichzeitig Heilung und Homöostase fördern können. Jüngste Untersuchungen haben begonnen, die Rolle von CD8+CD103+ T-Zellen in der Immunität der Augenoberfläche zu erläutern, indem sie ihre numerische Expansion in zervikalen Lymphknoten nach DS-Exposition sowie ihre Fähigkeit zur Migration in konjunktivales Gewebezeigen 19,20,21,22. Trotz dieser faszinierenden Beobachtungen sind die spezifischen funktionellen Beiträge von CD8+CD103+ T-Zellen zur Pathogenese trockener Augen und ihr therapeutisches Potenzial zur Modulation von CD4+-T-Zell-vermittelten Augenflächenschäden weiterhin unvollständig verstanden.

Der adoptive Transfer von CD8+CD103+ Tregs stellt einen deutlichen Fortschritt gegenüber herkömmlichen DED-Therapieansätzen dar, darunter künstliche Tränen, entzündungshemmende Mittel und immunsuppressive Medikamente, indem sie die zugrunde liegenden pathogenen Immunmechanismen anspricht, anstatt nur symptomatische Manifestationen zu behandeln23. Im Gegensatz zu systemischen immunsuppressiven Therapien, die die Immunfunktion weitgehend unterdrücken, bietet die CD8+CD103+-Treg-basierte Intervention eine gezielte Modulation pathogener CD4+-T-Cellantworten bei gleichzeitiger Erhaltung der schützendenImmunität 24. Dieser Ansatz ergänzt bestehende zellbasierte Therapien wie mesenchymale Stammzellanwendungen und CD4+CD25+Treg-Transfer, indem er durch CD103-vermittelte Homing-Mechanismeneine verbesserte mukosale Gewebespezifität bietet.

Die entscheidende Wissenslücke über die regulatorischen Mechanismen, durch die CD8+CD103+ T-Zellen die Pathogenese der trockenen Augen beeinflussen könnten, stellt eine bedeutende Hürde für die Entwicklung gezielter immuntherapeutischer Interventionen für diese schwächende Erkrankung dar. Darüber hinaus erfordert das komplexe Zusammenspiel zwischen regulatorischen und Effektor-T-Zellpopulationen bei der Entzündung der Augenoberfläche eine systematische Untersuchung, um neuartige therapeutische Ziele zu identifizieren und Behandlungsstrategien zu optimieren. Diese Studie zielt darauf ab, CD8+CD103+ T-zellvermittelte Regulation von CD4+-T-Zell-getriebenen pathogenen Prozessen in einem gut etablierten Mausmodell der Trockenaugenerkrankung umfassend zu charakterisieren. Die zentrale methodologische Innovation umfasst die sequentielle Isolierung von CD8+CD103+-regulatorischen Zellen, gefolgt von einem adoptiven Transfer und umfassender Bewertung funktioneller, histologischer und molekularer Ergebnisse, um die therapeutische Wirksamkeit festzustellen und zugrundeliegende Mechanismen aufzuklären. Das ultimative Ziel war es, unser Verständnis der Immunantworten auf der Augenoberfläche zu verbessern und mögliche Behandlungsstrategien zur Behandlung von DED beim Menschen zu entdecken.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren mit Tieren wurden strikt gemäß der ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt und vom Ethischen Ausschuss für experimentelle Tiere des Jinan Second People's Hospital genehmigt. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um Tierleiden zu minimieren und die Anzahl der eingesetzten Tiere gemäß dem 3R-Prinzip (Ersatz, Reduzierung und Verfeinerung) zu reduzieren.

1. Tiervorbereitung und experimentelles Design

  1. Beziehen Sie weibliche C57BL/6 Mäuse im Alter von 6-8 Wochen aus einer zugelassenen Labortieranlage (Stammcode: 027) mit einem spezifischen krankheitserregerfreien Gesundheitsstatus.
  2. Haustiere in einer kontrollierten Umgebung mit 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklen (Lichter auf 06:00–18:00), Temperatur von 22 ± 2 °C und relative Luftfeuchtigkeit von 50–60 % mittels Umweltüberwachungssystemen.
  3. Lassen Sie die Tiere eine Woche lang vor den experimentellen Verfahren akklimatisieren, während Sie standardmäßiges Laboressen und Wasser ad libitum bereitstellen.
  4. Randomisieren Sie 32 Mäuse in vier experimentelle Gruppen (n = 8 pro Gruppe) mittels computergenerierter Randomisierung: nicht-gestresste Kontrollen (NS), ausschließlich austrocknende Spannung (DS), austrocknende Belastung mit Fahrzeugsteuerung (DS + VC) und Austrocknung mit CD8+CD103+ T-Zellbehandlung (DS + CD8+CD103+).
    HINWEIS: Überwachen Sie die Tiere täglich auf Anzeichen von Belastung, wie etwa weniger Aktivität oder Gewichtsverlust von über 10 %.

2. Austrocknende Spannungseinduktion

  1. Scopolamin-Hydrobromid-Lösung wird hergestellt, indem 0,5 mg unmittelbar vor der Anwendung in 0,2 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst wird, wobei eine Endkonzentration von 2,5 mg/mL erreicht wird.
  2. Verabreichen Sie Scopolamin subkutan in einer Dosis von 0,5 mg/kg Körpergewicht (ca. 0,04 ml pro 20 g Maus) viermal täglich um 8:00, 12:00, 15:00 und 18:00 Uhr an fünf aufeinanderfolgenden Tagen mit 27-G-Nadeln.
  3. Positionieren Sie Ventilatoren mit variabler Drehzahl, um einen kontinuierlichen Luftzug mit einer standardisierten Geschwindigkeit von 15 m/s zu erzeugen, gemessen auf Käfigniveau mittels einer digitalen Anemometer-Kalibrierung.
  4. Halten Sie die Umgebungsluftfeuchtigkeit unter 40 % mit Trockenkammern mit aktiviertem Siliziumgel (Grad 40, 6-12 Gitter) und überwachen Sie gleichzeitig kontinuierlich die Umweltbedingungen mit digitalen Hygrometern (Genauigkeit ±2 % RH).
  5. Halten Sie die Temperatur während des gesamten Expositionszeitraums bei 22 ± 1 °C unter Verwendung präziser Umweltkontrollsysteme mit kontinuierlicher Überwachung.
  6. Überwachen Sie Tiere zweimal täglich auf Anzeichen von Dehydrierung, Gewichtsverlust (>15 % Rechtfertigung des Ausschlusses) oder Stressverhalten, einschließlich übermäßiger Pflege oder verminderter Aktivität.

3. CD8+CD103+ T-Zellisolierung und -reinigung

  1. Opfert Spendermäuse, die zuvor Austrocknungsstress durch CO₂-Erstickung und anschließend eine zervikale Verrenkung ausgesetzt waren, gemäß genehmigten Euthanasieprotokollen.
  2. Entnehmen Sie Milzen und oberflächliche zervikale Lymphknoten unter sterilen Bedingungen mit sterilen Instrumenten in einem biologischen Sicherheitsschrank, wobei Gewebe in eiskaltes RPMI-1640-Medium mit 10 % fetalem Rinderserum untergebracht wird.
  3. Bereite Einzelzell-Suspensionen vor, indem Gewebe mechanisch durch 70-μm-Zellsiebe mit sterilen Spritzenstempeln zerstört werden, Zellen zweimal mit PBS mit 2 % FBS und 1 mM Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA) gewaschen werden.
  4. Isolieren Sie CD8+ T-Zellen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung mit anti-CD8-antikörperkonjugierten magnetischen Mikroperlen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  5. Bewertung der Zelllebensfähigkeit mit dem Trypan-Blue-Ausschlusstest (0,4 % Lösung), wobei lebensfähige und nicht-lebensfähige Zellen mit einem automatisierten Zellzähler gezählt werden und nur bei Präparationen mit über 95 % Lebensfähigkeit durchgeführt werden.
  6. Anreicherung für CD103+-Expression durch sequentielle Inkubation mit Anti-CD103-APC-Antikörper bei 1:100 Verdünnung für 30 Minuten bei 4 °C im Dunkeln.
  7. Durchführung einer sekundären magnetischen Trennung mit Anti-Allophycocyanin (Anti-APC) Mikroperlen mit LS-Säulen, um CD8+CD103+ doppelt positive Zellen gemäß den Protokollen des Herstellers zu erhalten.
  8. Validieren Sie die Zellreinheit mittels Durchflusszytometrie, indem Sie Aliquoten mit Anti-CD8-FITC- und Anti-CD103-APC-Antikörpern färben, um eine Population von >90 % CD8+CD103+ doppelt positiven Zellen sicherzustellen, bevor Sie fortfahren.

4. Adoptionsübertragungsprotokoll

  1. Bereiten Sie CD8+CD103+ T-Zellsuspensionen mit einer Konzentration von 5 × 106 Zellen /mL in steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung vor, indem Sie Zellen bei 300 × g für 5 Minuten zentrifugieren und in einem geeigneten Volumen wieder suspendieren.
  2. Injizieren Sie 1 × 106 Zellen in 200 μL steriles PBS intraperitoneal an den Tagen -2, 0 und +2 im Vergleich zur Austrocknungsstresseinleitung, um vor jeder Injektion eine sanfte Mischung sicherzustellen.
  3. Verabreichen Sie gleichwertige Mengen steriler PBS an Kontrollgruppen im Fahrzeug mit einem identischen Injektionsplan und -technik, um experimentelle Konsistenz zu gewährleisten.
  4. Zellpräparate auf Eis halten und die Übertragungen innerhalb von 2 Stunden nach Isolation durchführen, um optimale Lebensfähigkeit und Funktion zu erhalten.
  5. Drehen Sie die Injektionsstellen zwischen dem linken und rechten Unterbauch, um lokale Entzündungen zu minimieren, und überwachen Sie die Tiere 24 Stunden nach der Injektion auf Nebenwirkungen.

5. Funktionsbewertungsverfahren

  1. Messung der Trénenproduktion
    1. Führen Sie regelmäßig um 20:00 Uhr Messungen durch, um zirkadiane Schwankungen in der Tränenproduktion zu berücksichtigen.
    2. Fixieren Sie die Maus vorsichtig mit geeigneten Fixiergeräten ohne Betäubung, um Störungen der natürlichen Tränenentstehungsmechanismen zu vermeiden.
    3. Lege den mit Phenol rot durchdrungenen Baumwollfaden genau 15 Sekunden lang mit einer feinen Zange in den unteren Bindehaut.
    4. Messen Sie die benetzte Gewindelänge sofort mit präzisen digitalen Bremssätteln (Genauigkeit ± 0,01 mm) unter standardisierten Leuchtstoffröhrenbedingungen.
  2. Bewertung der Funktion der Hornhautbarriere26
    1. Betäuben Sie die Maus kurzzeitig mit 2 % Isofluran-Inhalation während der Anwendung des Tracers, um eine präzise Instillation sicherzustellen.
    2. Gib 0,5 μL 50 mg/mL Oregon Green-Dextran-Lösung mit einer Präzisionsmikropipette mit positiven Verdrängungsspitzen auf die zentrale Hornhautoberfläche.
    3. Spülen Sie die Hornhäute nach 1-minütiger Inkubation fünfmal gründlich mit steriler Kochsalzlösung, um überschüssiges Tracer zu entfernen und die Oberflächenfluoreszenz vollständig zu entfernen.
    4. Fotografieren Sie Hornhäute sofort mittels Fluoreszenzmikroskopie mit einem Fluorescein-Isothiocyanat-(FITC)-Filtersatz (Anregung 490 nm, Emission 525 nm) und standardisierten Belichtungsparametern.
    5. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität mit der ImageJ-Software und konsistenter Interessensregionsauswahl und Hintergrundsubtraktionsprotokollen.
      1. Konvertiere Bilder in 8-Bit-Graustufen, definiere einen standardisierten kreisförmigen Bereich von Interesse (ROI), der den zentralen 3 mm Durchmesser der Hornhaut abdeckt.
      2. Messen Sie den mittleren Grauwert, subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz aus einer benachbarten nicht-hornhautbezogenen Region und drücken Sie die Ergebnisse als korrigierte Gesamtfluoreszenz (CTF) aus, berechnet als: CTF = Integrierte Dichte - (Bereich der ROI × mittlere Hintergrundfluoreszenz)22.

6. Histologische Verarbeitung und Analyse

  1. Entfernen Sie Augen und umliegende Strukturen unmittelbar nach der Euthanasie, fixieren Sie dann 24 Stunden lang 4 % Paraformaldehyd oder legen Sie in eine optimale Schneidetemperatur (OCT) Substanz für gefrorene Schnitte ein, um eine korrekte Ausrichtung für die sagittale Schnitte sicherzustellen.
  2. Bereite serielle sagittale Schnitte vor (6 μm für gefrorene, 5 μm für Paraffin) unter Verwendung standardisierter anatomischer Orientierungspunkte (Sehnerv als Referenzpunkt) für konsistente Schnittflächen über alle Proben.
  3. Führen Sie periodische Säure-Schiff (PAS)-Färbung zur Quantifizierung von Becherzellen mit standardisierten Protokollen mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen durch.
  4. Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung mit primären Antikörpern durch: Anti-MMP-3 (1:200), Anti-MMP-9 (1:100), anti-aktivierte Caspase-3 (1:300), anti-aktivierte Caspase-8 (1:200) und Anti-CD4 (1:100) mit nächtlicher Inkubation bei 4 °C.
  5. Quantifizieren Sie Becherzellen pro Millimeter der Bindehautlänge mit systematischen Stichprobenmethoden, zählen Sie Zellen in fünf nicht überlappenden Hochleistungsfeldern pro Schnitt und mitteln die Ergebnisse.

7. Molekulare Analyse

  1. Extraktion der gesamten RNA aus zusammengefassten Bindehaut- und Hornhautgeweben mithilfe validierter Extraktionsprotokolle27.
  2. cDNA-Synthese und quantitative Echtzeit-PCR28
    1. Bereite Reverse-Transkriptions-Reaktionsmischungen vor, die 1 μg Gesamt-RNA, Oligo-dT-Primer (50 μM), zufällige Hexamerprimer (100 μM), Reverse-Transkriptase-Enzym, Reaktionspuffer und nukleasefreies Wasser in einem Endvolumen von 20 μL enthalten.
    2. Inkubieren Sie Reaktionsmischungen in einem thermischen Zyklus bei 37 °C für 15 Minuten, um die Erststrang-cDNA-Synthese zu ermöglichen.
    3. Inaktivieren Sie das Umkehrtranskriptase-Enzym, indem Sie es 5 Sekunden lang bei 85 °C erhitzen, dann auf 4 °C abkühlen und cDNA bis zur Anwendung bei -20 °C lagern.
    4. Verdünnte synthetisierte cDNA 1:10 mit nukleasefreiem Wasser zur Verwendung als Schablat in nachfolgenden PCR-Reaktionen.
    5. Bereite Echtzeit-PCR-Reaktionsmischungen (20 μL Endvolumen) vor, die 1 μL verdünnte cDNA-Schablone enthalten, Vorwärts- und Rückwärtsprimer (jeweils 0,2 μM Endkonzentration), SYBR Green Mastermischung und nukleasefreies Wasser.
    6. Laden Sie die Proben dreifach in 96-Well-optische Reaktionsplatten, einschließlich Kontrollmechanismen ohne Vorlage für jedes Primerpaar.
    7. Programmieren Sie den Thermozyklus mit folgenden Bedingungen: Erstdenaturierung bei 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen (95 °C für 15 S), Glühen (60 °C für 30 S) und Verlängerung (72 °C für 30 S).
    8. Fügen Sie unmittelbar nach der Verstärkung eine Dissoziationskurvenstufe ein: 95 °C für 15 Sekunden, 60 °C für 1 Minute, dann allmählicher Temperaturanstieg auf 95 °C mit einer Rate von 0,3 °C/s, um die Verstärkung eines einzelnen Produkts zu überprüfen.
    9. Analysieren Sie Amplifikationskurven und Zyklusschwellenwerte (Ct) mit Instrumentensoftware, um eine Amplifikationseffizienz von 90–110 % für alle Primer-Paare zu gewährleisten.
    10. Normalisieren Sie die Zielgenexpression (IL-17A, IFN-γ, IL-13, MMP-3 und MMP-9) auf das Housekeeping-Gen GAPDH mit der 2-ΔΔCt-Methode .
    11. Verwenden Sie Primer-Sequenzen wie in Tabelle 1 angegeben für alle Ziel- und Referenzgene.
  3. Quantifizieren Sie die Zytokinproteinwerte in Gewebeextrakten mit kommerziell erhältlichen ELISA-Kits mit geeigneten Standardkurven und Qualitätskontrollen.

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Ergebnisse

Die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls führt zu einer umfassenden Verbesserung der austrocknenden, stressinduzierten Augenoberflächenpathologie durch CD8+CD103+ T-Zell-vermittelte Immunmodulation. Positive Ergebnisse zeigen eine signifikante Wiederherstellung der Tränenproduktion, wobei typischerweise eine Erholung von 60–80 % im Vergleich zu nicht-gestressten Kontrollpersonen erreicht wird, während mit Vehikel behandelte Tiere anhaltende Lacrimatio...

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Diskussion

Diese Untersuchung etabliert CD8+CD103+ regulatorische T-Zellen als wirksame therapeutische Wirke, die stressinduzierte Trocken-Augen-Erkrankungen durch umfassende Modulation von CD4+-T-Zell-vermittelten pathogenen Reaktionen austrocknen. Die Ergebnisse zeigen, dass der adoptive Transfer von CD8+CD103+ T-Zellen einen facettenreichen Schutz der Integrität der Augenoberfläche erreicht, einschließlich der funktionellen Wiederherstellung der Tränenproduktion, Erhaltung der schleimhautigen Ar...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben, weder finanziell noch anderweitig, die das in diesem Manuskript beschriebene Werk unangemessen beeinflussen könnten.

Danksagungen

Wir würdigen die technische Unterstützung durch das Laborpersonal des Jinan 2. Volkskrankenhauses und das Personal der Tierpflegeeinrichtungen, die während des gesamten Versuchszeitraums optimale Wohnbedingungen gewährleistet haben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-CD103-APC-AntikörperBiolegendeKlon 2E7Durchflusszytometrie und Zellsortierung
Anti-CD8 magnetische MikroperlenMiltenyi Biotec-Magnetische Zelltrennung
Corneal Oregon Green-DextranInvitrogenD7172Molekulargewicht 70.000
ELISA-Kit IFN-γeBioscienceBMS606Zytokinquantifizierung
ELISA-Kit IL-13eBioscienceBMS6015Zytokinquantifizierung
ELISA-Kit IL-17AeBioscienceBMS6001Zytokinquantifizierung
ImageJNationale GesundheitsinstituteVersion 1.53k
Phenolrote BaumwollfädenZone-Schnell, Yokota-Messung der Trénenproduktion
ScopolaminhydrobromidMelonepharmaMB5860Muskarinischer Antagonist

Referenzen

  1. Tang, Q., et al. Selective decrease of donor-reactive T(regs) after liver transplantation limits T(reg) therapy for promoting allograft tolerance in humans. Sci Transl Med. 14 (669), eabo2628(2022).
  2. Harrell, C. R., Feulner, L., Djonov, V., Pavlovic, D., Volarevic, V. The molecular mechanisms responsible for tear hyperosmolarity-induced pathological changes in the eyes of dry eye disease patients. Cells. 12 (23), 2755(2023).
  3. Britten-Jones, A. C., et al. Epidemiology and risk factors of dry eye disease: considerations for clinical management. Medicina (Kaunas). 60 (9), 1458(2024).
  4. Bhujbal, S., Rupenthal, I. D., Steven, P., Agarwal, P. Inflammation in dry eye disease-pathogenesis, preclinical animal models, and treatments. J Ocul Pharmacol Ther. 40 (10), 638-658 (2024).
  5. Nieto-Aristizabal, I., Mera, J. J., Giraldo, J. D., Lopez-Arevalo, H., Tobon, G. J. From ocular immune privilege to primary autoimmune diseases of the eye. Autoimmun Rev. 21 (8), 103122(2022).
  6. Sheppard, J., Shen Lee, B., Periman, L. M. Dry eye disease: identification and therapeutic strategies for primary care clinicians and clinical specialists. Ann Med. 55 (1), 241-252 (2023).
  7. Rolando, M., Merayo-Lloves, J. Management strategies for evaporative dry eye disease and future perspective. Curr Eye Res. 47 (6), 813-823 (2022).
  8. Vereertbrugghen, A., et al. CD4+ T cells drive corneal nerve damage but not epitheliopathy in an acute aqueous-deficient dry eye model. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (48), e2407648121(2024).
  9. Yaman, E., et al. Mouse corneal immune cell heterogeneity revealed by single-cell RNA sequencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (12), 29(2024).
  10. Niederkorn, J. Y., et al. Desiccating stress induces T cell-mediated Sjogren's syndrome-like lacrimal keratoconjunctivitis. J Immunol. 176 (7), 3950-3957 (2006).
  11. Ogawa, Y., Takeuchi, T., Tsubota, K. Autoimmune epithelitis and chronic inflammation in Sjogren's syndrome-related dry eye disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11820(2021).
  12. Flippe, L., Bezie, S., Anegon, I., Guillonneau, C. Future prospects for CD8+ regulatory T cells in immune tolerance. Immunol Rev. 292 (1), 209-224 (2019).
  13. Olson, K. E., Mosley, R. L., Gendelman, H. E. The potential for Treg-enhancing therapies in nervous system pathologies. Clin Exp Immunol. 211 (2), 108-121 (2023).
  14. Boonpiyathad, T., Sozener, Z. C., Akdis, M., Akdis, C. A. The role of Treg cell subsets in allergic disease. Asian Pac J Allergy Immunol. 38 (3), 139-149 (2020).
  15. Xu, W., Bergsbaken, T., Edelblum, K. L. The multifunctional nature of CD103 (αEβ7 integrin) signaling in tissue-resident lymphocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C1161-C1167 (2022).
  16. Zhang, X., et al. CD8+CD103+ iTregs inhibit chronic graft-versus-host disease with lupus nephritis by the increased expression of CD39. Mol Ther. 27 (11), 1963-1973 (2019).
  17. Liu, Y., et al. Phenotypic and functional characteristic of a newly identified CD8+ Foxp3- CD103+ regulatory T cells. J Mol Cell Biol. 6 (1), 81-92 (2014).
  18. Chen, Q., et al. CD8+ CD103+ iTregs protect against ischemia-reperfusion-induced acute kidney injury by inhibiting pyroptosis. Apoptosis. 29 (9-10), 1709-1722 (2024).
  19. Kaneko, N., et al. Cytotoxic CD8+ T cells may be drivers of tissue destruction in Sjogren's syndrome. Sci Rep. 12 (1), 15427(2022).
  20. Kudryavtsev, I., et al. Circulating CD8+ T cell subsets in primary Sjogren's syndrome. Biomedicines. 11 (10), 2778(2023).
  21. Heidari, M., Noorizadeh, F., Wu, K., Inomata, T., Mashaghi, A. Dry eye disease: emerging approaches to disease analysis and therapy. J Clin Med. 8 (9), 1439(2019).
  22. Ibiayo, A. G., Varinthra, P., Nagarajan, M., Liu, I. Y. Coniferaldehyde reverses 3-nitropropionic acid-induced Huntington's disease pathologies via PKM2 restoration and JAK2/STAT3 inhibition. Mol Med. 31 (1), 271(2025).
  23. Loi, J. K., et al. Corneal tissue-resident memory T cells form a unique immune compartment at the ocular surface. Cell Rep. 39 (8), 110852(2022).
  24. Kennedy-Batalla, R., et al. Treg in inborn errors of immunity: gaps, knowns and future perspectives. Front Immunol. 14, 1278759(2023).
  25. Suffia, I., Reckling, S. K., Salay, G., Belkaid, Y. A role for CD103 in the retention of CD4+CD25+ Treg and control of Leishmania major infection. J Immunol. 174 (9), 5444-5455 (2005).
  26. De Paiva, C. S., et al. IL-17 disrupts corneal barrier following desiccating stress. Mucosal Immunol. 2 (3), 243-253 (2009).
  27. Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), (2010).
  28. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−ΔΔC(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  29. Zareh, H., et al. Doxycycline versus curcumin for inhibition of matrix metalloproteinase expression and activity following chemically induced inflammation in corneal cells. J Ophthalmic Vis Res. 19 (3), 273-283 (2024).
  30. Yang, X., et al. IFN-gamma facilitates corneal epithelial cell pyroptosis through the JAK2/STAT1 pathway in dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (3), 34(2023).
  31. Lollett, I. V., Galor, A. Dry eye syndrome: developments and lifitegrast in perspective. Clin Ophthalmol. 2018, 125-139 (2018).
  32. Zhang, X., et al. CD8+ cells regulate the T helper-17 response in an experimental murine model of Sjogren syndrome. Mucosal Immunol. 7 (2), 417-427 (2014).
  33. Zhou, H., Yang, J., Tian, J., Wang, S. CD8+ T lymphocytes: crucial players in Sjogren's syndrome. Front Immunol. 11, 602823(2020).
  34. Lu, Z., et al. Rapid and quantitative detection of tear MMP-9 for dry eye patients using a novel silicon nanowire-based biosensor. Biosens Bioelectron. 214, 114498(2022).
  35. Burgalassi, S., et al. Functionalized hyaluronic acid for "in situ" matrix metalloproteinase inhibition: a bioactive material to treat the dry eye syndrome. ACS Macro Lett. 11 (10), 1190-1194 (2022).
  36. Chen, X., et al. Tc17/IL-17A up-regulated the expression of MMP-9 via NF-kappaB pathway in nasal epithelial cells of patients with chronic rhinosinusitis. Front Immunol. 9, 2121(2018).
  37. Alam, J., et al. IL-17 producing lymphocytes cause dry eye and corneal disease with aging in RXRalpha mutant mouse. Front Med (Lausanne). 9, 849990(2022).
  38. Flores-Pliego, A., et al. Matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) is an endogenous activator of the MMP-9 secreted by placental leukocytes: implication in human labor. PLoS One. 10 (12), e0145366(2015).
  39. You, Y., et al. Investigation of conjunctival goblet cell and tear MUC5AC protein in patients with Graves' ophthalmopathy. Transl Vis Sci Technol. 12 (10), 19(2023).
  40. Tukler Henriksson, J., Coursey, T. G., Corry, D. B., De Paiva, C. S., Pflugfelder, S. C. IL-13 stimulates proliferation and expression of mucin and immunomodulatory genes in cultured conjunctival goblet cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4186-4197 (2015).
  41. Fang, Z., et al. Clinical ocular surface characteristics and expression of MUC5AC in diabetics: a population-based study. Eye (Lond). 38 (16), 3145-3152 (2024).
  42. Garcia-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-gamma with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunol. 9 (1), 206-217 (2016).
  43. Volpe, E. A., et al. Interferon-gamma deficiency protects against aging-related goblet cell loss. Oncotarget. 7 (40), 64605-64614 (2016).
  44. Gustafsson, J. K., Hansson, G. C. Immune regulation of goblet cell and mucus functions in health and disease. Annu Rev Immunol. 43 (1), 169-189 (2025).
  45. Lin, N., et al. Ectoine enhances mucin production via restoring IL-13/IFN-gamma balance in a murine dry eye model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (6), 39(2024).
  46. Ogawa, Y., Shimizu, E., Tsubota, K. Interferons and dry eye in Sjogren's syndrome. Int J Mol Sci. 19 (11), 3548(2018).
  47. Zhang, X., et al. Interferon-gamma exacerbates dry eye-induced apoptosis in conjunctiva through dual apoptotic pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6279-6285 (2011).
  48. Hassan, M., Elzallat, M., Mohammed, D. M., Balata, M., El-Maadawy, W. H. Exploiting regulatory T cells (Tregs): cutting-edge therapy for autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 155, 114624(2025).

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