Methodenartikel

Patientenabgeleitetes dreidimensionales Tumororganoid-Modell für das in vitro chimerische Antigenrezeptor-T-Zell-Screening

DOI:

10.3791/69113

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30. Dezember 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll etabliert ein in-vitro-Kokulturmodell , das patientenabgeleitete Tumororganoide und chimerische Antigenrezeptor-T-Zellen (CAR-T)-Zellen verwendet, um die spezifische zytotoxische Aktivität von CAR-T-Zellen gegenüber soliden Tumorzellen zu bewerten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die chimerische Antigenrezeptor-T-(CAR-T)-Zelltherapie hat eine spannende klinische Wirksamkeit bei hämatologischen Malignitäten erzielt, aber die CAR-T-Zelltherapie für solide Tumore ist noch eine weitere Entwicklung erforderlich. Patientenabgeleitete Tumororganoide sind In-vitro-Erkrankungsmodelle, die die Heterogenität der Patienten bewahren und zur Überprüfung der Wirksamkeit und Sicherheit von Chemotherapie und gezielten Medikamenten verwendet wurden. Diese Methode beschreibt ein in-vitro-Wirksamkeitstestmodell bei der Kokultivierung von Tumororganoiden mit CAR-T-Zellen. Kolorektalkrebsproben von Patienten werden zu Tumororganoiden mit einer dreidimensionalen (3D) Struktur in einer Basalmembranmatrix konstruiert. Die Tumororganoide können stabil wachsen und kontinuierlich durchgeführt werden. Reife Tumororganoide werden durch Waschen und Zentrifugation von der Matrix getrennt, und CAR-T-Zellen werden mit unterschiedlichen Effektor-Ziel-(E:T)-Verhältnissen hinzugefügt, um ein Immun-Organoid-Kokultursystem zu bilden. Nach 6–24 Stunden werden die Morphologie und interzellulären Strukturen der Organoide durch Hellfeldbildgebung beobachtet. Dieses Experiment führt außerdem eine Färbung toter Zellen im Kokultursystem durch, was die Lebensfähigkeit der Organoide widerspiegeln und die zytotoxische Wirkung von CAR-T-Zellen auf Tumororganoide bewerten kann. Dieses Experiment kann die Wechselwirkung zwischen CAR-T-Zellen und 3D-Tumororganoiden effektiv beobachten, und die Ergebnisse können genutzt werden, um die tumortötende Aktivität von CAR-T-Zellen zu bewerten.

Einleitung

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Die Zelltherapie mit chimerischem Antigenrezeptor T (CAR-T) hat bemerkenswerte klinische Erfolge bei der Behandlung hämatologischer Malignitätengezeigt 1. Seine Anwendung bei soliden Tumoren bleibt jedoch aufgrund mehrerer großer Hindernisse begrenzt, darunter Tumorheterogenität und Antigenverlust, physikalische und chemische Barrieren innerhalb der Tumormasse sowie das immunsuppressive Tumormikromilieu 2,3. Diese Herausforderungen tragen zur begrenzten Wirksamkeit der CAR-T-Zelltherapie in soliden Tumorsituationen bei.

Die In-vitro-Bewertung der Wirksamkeit von CAR-T-Zellen ist ein entscheidender Schritt während der präklinischen Entwicklung. Die am häufigsten verwendeten Modelle sind Tumorzelllinien, die entweder spezifische tumorassoziierte Antigene exprimieren oder so konstruiert werden können, dass sie Reportergene wie Luciferase 4,5 tragen. Folglich können herkömmliche zelllinienbasierte Assays die klinischen Ergebnisse oft nicht vorhersagen. Patientenabgeleitete Tumormodelle bieten eine vielversprechende Alternative, um die CAR-T-Funktion im Kontext solider Tumoren genauer zu beurteilen.

Obwohl mehrere Studien begonnen haben, PDTOs für die Bewertung von CAR-T-Zellen zu nutzen, bestehen weiterhin Herausforderungen bei der Etablierung standardisierter, robuster und zugänglicher Kokulturprotokolle, die die Erhaltung der 3D-Tumorarchitektur mit einer effizienten Immunzell-Tumor-Interaktion effektiv ausbalancieren. Patientenabgeleitete Tumororganoide (PDTOs) sind dreidimensionale (3D) ex-vivo Krankheitsmodelle, die aus Tumorgeweben oder -zellen des Patienten erzeugt werden. PDTOs wurden erfolgreich für eine Vielzahl von Tumorarten etabliert, darunter Darm-, Brust-, Bauchspeicheldrüsen- und Lungenkrebs. Diese Strukturen bewahren die histologische Architektur, molekularen Profile und funktionelle Heterogenität des ursprünglichen Tumors6. Neben primären Tumorzellen und patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) stellen PDTOs eine wertvolle Plattform zur Modellierung patientenspezifischer Krankheitsmerkmaledar 7. Im Vergleich zu herkömmlichen Tumorzelllinien oder Primärkulturen replizieren PDTOs die in vivo Tumorumgebung näher und zeigen komplexe zelluläre Zusammensetzungen und strukturelle Organisation8. Sie erhalten außerdem genomische Stabilität und bewahren Genexpressionsmuster über längere Durchgänge hinweg, was eine genauere Bewertung therapeutischer Antwortenermöglicht. PDTOs wurden erfolgreich in Studien zur Tumorbiologie, Arzneimittelscreening und Präzisionsmedizin eingesetzt und werden zunehmend für ihre Nützlichkeit in Immuntherapietests anerkannt, einschließlich der Identifikation neuartiger CAR-Ziele, der Optimierung des CAR-Designs und der Bewertung der Zytotoxizität 6,11,12,13 . Eine häufige Einschränkung der Organoidkultur ist ihre Abhängigkeit von extrazellulären Matrixkomponenten (ECM) wie Matrigel (im Folgenden als Basalmembranmatrix [BMM]) für die Erhaltung der 3D-Struktur, was die Infiltration von Immunzellen in Kokultur-Assays behindern kann. Um Konsistenz und optimale Zellinteraktion in der Kokultur sicherzustellen, werden typischerweise Organoide innerhalb eines definierten Größenbereichs (z. B. 100–200 μm Durchmesser) ausgewählt.

Dieses Protokoll beschreibt eine Kokulturplattform zur Bewertung der CAR-T-Zellzytotoxizität mittels von Kolorektalkrebs abgeleiteter PDTOs. Patiententumorproben werden enzymatisch dissoziiert und in BMM kultiviert, um 3D-Organoide zu erzeugen. Sobald sie gereift und ausgedehnt sind, werden Organoide gleichmäßiger Größe isoliert und fluoreszierend markiert. Sie werden in Mehrschichtplatten ausgesät und mit CAR-T-Zellen in unterschiedlichen Effektor-Ziel-(E:T)-Verhältnissen kokultiviert. Ein zentrales Merkmal dieses Ansatzes ist die gezielte Entfernung von PDTOs aus BMM vor der Kokultur, wodurch der direkte und ungehinderte Zugang von CAR-T-Zellen zu den Tumororganoiden ermöglicht wird, während deren 3D-Integrität in Suspension erhalten bleibt. Nach 24 Stunden zeigt die Hellfeldmikroskopie eine fortschreitende PDTO-Desintegration, gekennzeichnet durch gestörte 3D-Morphologie, Schrumpfung der Tumorzellen und Verlust der Lebensfähigkeit. Lebendzellbildgebung und Fluoreszenzmikroskopie visualisieren zudem Wechselwirkungen zwischen fluoreszenzmarkierten CAR-T-Zellen und Tumorzielen. Quantitative Zelltodestests werden verwendet, um die Zytotoxizität zu beurteilen. Diese organoidbasierte Immun-Kokultur bietet eine robuste und patientenspezifische Plattform zur Bewertung der antitumoralen Wirksamkeit von CAR-T-Zellen ex vivo, was die therapeutische Optimierung und die Unterstützung der klinischen Translation ermöglicht.

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Protokoll

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Organoide aus Kolorektalkrebspatienten wurden verwendet. Tumorgewebefragmente wurden von behandlungsnaiven Patienten mit histologisch bestätigtem primärem kolorektalem Adenokarzinom (CRC) gewonnen. Alle Gewebe wurden aus endoskopischen Biopsieproben gewonnen, die während der Standarddiagnostik im Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital entnommen wurden. Alle Spendergewebe wurden durch histopathologische Untersuchung durch institutionelle Pathologen als CRC bestätigt. Das Protokoll folgt institutionellen Richtlinien. Von allen Patienten wurden schriftliche informierte Einwilligungen eingeholt. Die Studie wurde vom Ethischen Komitee des Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital (2024KY-009-01K) genehmigt.

1. PDTO-Kultur

  1. Gewebevorbereitung
    1. Lege Tumorgewebefragmente, die durch eine Koloskopiebiopsie von Patienten mit histologisch bestätigtem primärem kolorektalem Adokarzinom (CRC) gewonnen wurden, in ein steriles 50-ml-Rohr.
    2. Fügen Sie 30 ml Kaltgewebe-Waschlösung hinzu, bestehend aus Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 1 % Rinderserumalbumin (BSA), 100 U/mL Penicillin, 0,1 mg/mL Streptomycin, 50 μg/mL Gentamicin, 5 μg/mL Amphotericin B und 10 μM Rho-assoziiertem Kinase-Inhibitor (Y-27632).
    3. Lege den Schlauch auf Eis und wiege vorsichtig 5 Minuten lang, um das Gewebe zu waschen.
    4. Wiederhole Schritt 1.1.3. Zweimal weitere Male mit neuer Spüllösung.
  2. Gewebeverdauung
    1. Entfernen Sie nekrotisches oder fetthaltiges Gewebe und schneiden Sie den Tumor in Gewebefragmente.
    2. Erwärme 8 ml Verdauungsmedium (DMEM-Medium, 500 U/mL Kollagenase IV, 1,5 mg/mL Kollagenase II, 20 μg/mL Hyaluronidase, 0,1 mg/mL Dispase Typ II, 10 μM Y-27632 und 1 % fetales Rinderserum) auf 37 °C.
    3. Fragmente werden in den Verdauungspuffer übertragen und bei 37 °C in einem Wasserbad inkubiert. Bewegen Sie den Schlauch vorsichtig von Hand für ~10 Sekunden alle 5 Minuten, um das Eindringen durch Enzyme zu erleichtern.
      HINWEIS: Stellen Sie das Volumen des Verdauungspuffers entsprechend der Größe des Gewebeblocks an. In der Regel reichen 8–10 ml für endoskopische Biopsiegrößen aus.
    4. Beobachte nach 15 Minuten unter dem Mikroskop, um den Dissoziationsstatus zu überprüfen. Wenn Gewebefragmente zurückbleiben, wird die Verdauung bis maximal 30 Minuten fortgesetzt.
    5. Wenn Cluster sichtbar sind, pipettieren Sie vorsichtig (5-10 Mal) mit einer 10-mL-Pipette zur mechanischen Dissoziation. Zentrifugiere bei 350 × g für 5 Minuten.
    6. Supernatant entsorgen; Pellet in 10 mL Waschlösung wieder suspendieren und 5 Minuten bei 350 × g zentrifugieren. Wiederhole die Wäsche zweimal.
      HINWEIS: PDTOs begannen typischerweise innerhalb von 3–5 Tagen nach der Kultur kompakte kugelförmige Strukturen zu bilden. Organoide zeigten eine robuste Vermehrung und erreichten bis zum Tag 10–14 eine geeignete Größe für Experimente (etwa 100–200 μm Durchmesser). Das Passaging wurde alle 7–10 Tage durchgeführt, um ein gesundes Wachstum zu erhalten und Überkonfluenz oder zentrale Nekrose zu verhindern. In der Regel wird pro Biopsie ein 8–10 mL Verdauungspuffer verwendet (2 mm³ Fragmente), um sicherzustellen, dass TrypLE Express eine Endverarbeitungskonzentration von 1 × erreicht.

2. Bau von PDTOs

  1. Matrix-Einbettung
    1. Geben Sie 200 μL BMM (vorgekühlt bei 4 °C) in ein sauberes Rohr und pipettieren Sie das Zellpellet mindestens 10–15 Mal mit einer vorgekühlten Pipettenspitze, bis die Suspension homogen und ohne sichtbare Klumpen erscheint.
    2. Geben Sie etwa 30-μL-Tröpfchen in jeden Brunnen einer 24-Loch-Platte. Inkubiere bei 37 °C für 10 Minuten, damit sie erstarrt.
    3. Fügen Sie 500 μL Organoid-Kulturmedium hinzu (Advanced DMEM/F12 Medium, enthalten 50 μg/mL R-Spondin 1, 10 μg/mL Noggin, 500 μg/mL EGF, 100x HEPES, 100x Glutamax, 500x Normocin, 500x Gentamicin/Amphotericin B, 50x N2, 100x B27, 500 mM n-Acetylcystein, 1 M Niacinamid, 5 mM Alk 4/5/7 Inhibitor, 30 M p38 Inhibitor, 100 μM Gastrin, und 100 μM Prostaglandin E2) pro Bohrloch.
      HINWEIS: Verwenden Sie etwa 30 μL BMM pro Tröpfchen; Anpassung basierend auf der Zelldichte.
  2. Kulturerhaltung
    1. Organoide wurden bei 37 °C mit 5 %CO2 kultiviert; Wechsle das Medium alle 3 Tage.
    2. Überwachen Sie die Organoidbildung täglich. Erwarten Sie bis Tag 3 kleine Sphäroide.
    3. Bewerten Sie die erfolgreiche Etablierung des organoiden Organoids an den Tagen 6 bis 10. Die Entstehungszeit (zwischen 3 und 14 Tagen) hängt von der Gewebelebensfähigkeit und dem Stamm ab.

3. Weitergabe von PDTOs

  1. Disaggregation
    1. Kühle die Zentrifuge auf 4°C vor. Entferne das Medium und gib 1 ml eiskaltes HBSS hinzu und pipette vorsichtig 3-5 Mal, um die Milchmenge zu stören.
      HINWEIS: Gut gewachsene Organoide können mit bloßem Auge als kleine weiße Punkte beobachtet werden.
    2. Die Suspension wird in ein steriles 15-mL-Rohr übertragen und 5 Minuten bei 350 × g zentrifugiert.
  2. Enzymdissoziation
    1. Verwerfen Sie das Supernatant und fügen Sie 1 ml TrypLE hinzu. Für 2 Minuten in ein 37 °C warmes Wasserbad geben.
    2. Fügen Sie 2 ml HBSS hinzu, um TrypLE zu neutralisieren; Zentrifugiere bei 350 × g für 5 Minuten.
    3. Entferne das Obermaterial und suspendiere es in 2 mL HBSS. Zentrifugiere erneut bei 350 × g für 5 Minuten.
  3. Neueinbettung
    1. Frisches BMM in einem Verhältnis von 1:3-1:6 zum Pellet hinzufügen (Organoid-Pellet: BMM, V/V); Sanft wieder aufhängen. Jeder Tröpfchen enthält etwa 30 μL Endvolumen. Tropfen in eine neue 24-Well-Platte geben; 10 Minuten bei 37 °C inkubieren.
    2. Fügen Sie pro Bohrloch 500 μL Kulturmedium hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 %CO2.
    3. Untersuchen Sie täglich Brunnen; 3D-Wiederaufbau innerhalb von etwa 48 Stunden beobachten.
    4. Nach 3-5 Durchgängen werden gesunde Organoide für nachgelagerte Assays oder Kryokonservierung ausgewählt.

4. Kokultur von CAR-T-Zellen und PDTOs

  1. Vorbereitung von Kokulturmedium
    1. Ergänzen Sie das Basis-Organoidkulturmedium mit 10 ng/L IL-2 und 0,05 mM β-Mercapptoethanol, um die CAR-T-Viabilität zu unterstützen.
      HINWEIS: Das Basismedium unterstützt die 3D-Struktur und die Viabilität von PDTOs.
  2. PDTO-Vorbereitung
    1. Entfernen Sie die BMM-Tröpfchen, die reife PDTOs enthalten (z. B. Tag 4–6), mit einem sterilen Zellschaber oder einer Pipettenspitze von der Kulturplatte.
    2. Übertragen Sie das BMM/PDTO-Gemisch in ein 15-mL konisches Rohr.
    3. Gib 5–10 ml eiskaltes HBBS oder Gewebewaschlösung (wie in Schritt 1.1.2 beschrieben) in das Rohr ein. Weiche vorsichtig 5-10 Mal um, um Organoide aus dem BMM zu lösen.
    4. Lassen Sie die Mischung 5 Minuten auf Eis stehen. Das BMM wird flüssig, während dissoziierte PDTOs in der Suspension bleiben.
    5. Saugen Sie vorsichtig das Supernatant mit BMM ab und lassen Sie das PDTO-Pellet zurück. Vermeiden Sie es, das Pellet zu stören.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.3 bis 4.2.5 zweimal mehrmal, um die vollständige Entfernung des BMM sicherzustellen.
    7. Nach der Endwäsche wird das PDTO-haltige Supernatant gesammelt und bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert.
    8. Aspiratiere das Supernatant und suspendiere das PDTO-Pellet in 1–2 ml Organoid-Kulturmedium oder Kokulturmedium neu.
    9. (Optional zum Zählen) Bereite eine Einzelzell-Suspension vor.
      1. Falls eine präzise Zählung erforderlich ist, werden die neu suspendierten Organoide in ein neues Rohr übertragen und mit vorgeheiztem TrypLE Express bei 37 °C 3–5 Minuten inkubiert, gefolgt von sanftem Pipetteren zur Einzellensuspension. Fahren Sie mit der Zellzählung fort (z. B. mit einem Hämozytometer oder automatischen Zellzähler).
        HINWEIS: Dieser Schritt dissoziiert die Organoide und dient nur dem Zählen vor dem erneuten Platten.
    10. Größenauswahl und Standardisierung: Um eine konstante Organoidgröße für die Kokultur sicherzustellen, führen Sie die resuspendierten PDTOs (ab Schritt 4.2.8) durch ein 70-μm-Zellsieb, das auf einem 50-mL konischen Rohr angebracht ist. Dieser Schritt entfernt große organoide Aggregate und Ablagerungen, was einen standardisierten Größenanteil darstellt, der für eine einheitliche Kokultur geeignet ist.
    11. Zentrifugiere die standardisierte Organoid-Suspension bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
    12. Aspirieren Sie das Supernatant und suspendieren Sie die standardisierten PDTOs in einem geeigneten Volumen vorgewärmten Kokulturmediums.
    13. Zählen Sie die standardisierten PDTOs (z. B. mit einem Hämozytometer unter dem Mikroskop, bei dem die Anzahl der Organoiden pro Feld gezählt wird).
      HINWEIS: Das Zählen basiert auf der Organoidnummer, nicht auf der Zellnummer.
    14. Säen Sie die standardisierten PDTOs in die gewünschte Multi-Well-Platte (z. B. 96-Well-U-Bottom-Plate) bei der Zielzahl pro Well.
    15. Fügen Sie CAR-T-Zellen in die Wells mit den gewünschten Effektor-Ziel-(E:T)-Verhältnissen hinzu.
  3. Kennzeichnung von PDTOs
    1. Die Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen. Das Medium aspirieren; Gib 1 ml HBSS hinzu, um Tröpfchen zu lösen.
    2. Auf ein 15-mL-Zentrifugenrohr übertragen, 4 ml HBSS hinzufügen und vorsichtig pipetten. Zentrifugiere bei 350 × g für 5 Minuten.
    3. Entsorge das Supernatant, gib 5 ml HBSS hinzu und pipette vorsichtig. Zentrifugiere erneut mit 350 × g für 5 Minuten.
    4. Bereite die funktionierende Lösung von Hoechst 33342 vor.
    5. Pellet in 1 mL Hoechst 33342-Lösung resuspendieren (Endkonzentration 5 μg/mL). Sanft 3-5 Mal umkehren, um eine gleichmäßige Farbeindringung zu gewährleisten. Schützen Sie vor Licht, indem Sie das Rohr mit Alufolie umwickeln. Inkubiere bei 37 °C für 10 Minuten. Nach dem Flecken sollte man zweimal mit HBSS waschen, um überschüssige Farbe zu entfernen.
  4. Beschichtung von PDTOs
    1. Schätze die Organoiddichte bei einem Geltropfen-zu-Brunnen-Verhältnis von 1:5; in einem Kokulturmedium bei etwa 1 × 103 Organoiden/ml wieder suspendieren.
    2. Fügen Sie 100 μL pro Bohrloch in eine 96-Well-Platte ein; Fügen Sie pro Bedingung mindestens drei Exemplare hinzu.
      HINWEIS: Führen Sie in dieser Phase keine Zellzählung durch; Organoide bleiben intakt.
  5. CAR-T-Kokultur
    HINWEIS: Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Kokultivierung und Wirksamkeitsbewertung von CAR-T-Zellen mit PDTOs. Die Erzeugung und Charakterisierung der in dieser Studie verwendeten CAR-T-Zellen sind in Abschnitt 8 beschrieben.
    1. Entnehmen Sie CAR-T-Zellen in der logaritmischen Phase. Mit Trypan Blue beizieren, um die Lebensfähigkeit >95% zu bestätigen.
    2. Zentrifugenzellen mit 350 × g für 5 Minuten; im Medium der Kokultur wieder suspendieren.
    3. Stellen Sie die Konzentrationen auf 4 × 106/mL, 2 × 106/mL und 1 × 106/mL an.
    4. Fügen Sie gemäß dem experimentellen Design 100 μL CAR-T-Federung pro Bohrung hinzu. Fügen Sie 100 μL Kokulturmedium hinzu, um die Bohrungen zu kontrollieren.
    5. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, 5 % CO2für 6 –24 Stunden.

5. Tote Zellfärbung

  1. SYTOX Grünfärbung
    1. Für jeweils 1 × 105 Zellen bereiten Sie 100 μL Nuclear Green Färbungslösung vor, indem Sie 1 μL SYTOX Green (1000x) in 1 mL Assaypuffer verdünnen.
    2. Zu den 6- und 24-Stunden-Zeitpunkten der Kokultur werden pro Bohrloch 100 μL SYTOX Green-Färbungslösung hinzugefügt. Inkubiere bei 37 °C 20 Minuten im Dunkeln.

6. Bildaufnahme

  1. Sauge das Supernatant ab und füge 100 μL DMEM/F12 hinzu.
  2. Erfassen Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbilder mit einem Mikroskop (z. B. Konfokal):
    Hoechst 33342 (PDTOs): Anregung (Ex)/Emission (Em) = 350 nm/461 nm
    mCherry (CAR-T): Ex/Em = 587 nm/610 nm
    SYTOX Green (tote Zellen): Ex/Em = 504 nm/528 nm
  3. Mach mindestens dreifache Bilder pro Bohrloch, wobei du dich auf das zentrale Feld konzentriere.

7. Datenanalyse

  1. Launch ImageJ (Version 1.54, NIH, https://imagej.nih.gov/ij/); Importiere SYTOX Green-Kanalbilder. Stellen Sie den Schwellenwert manuell ein, um Fluoreszenzsignale vom Hintergrund zu unterscheiden (Bild > Anpassen > Schwellenwert).
  2. Verwenden Sie die Funktion Analysieren > Messen , um die integrierte Dichte zu berechnen. Exportieren Sie Daten als .csv für eine anschließende statistische Analyse in einer geeigneten Analysesoftware (z. B. GraphPad Prism).
  3. Stellen Sie die Schwelle ein, um Fluoreszenzsignale vom Hintergrund zu trennen.
  4. Wählen Sie das gesamte Feld aus; Ausführen Analysieren > Messen , um die summierte Fluoreszenzsignalintensität zu berechnen.
  5. Exportiere Daten und führe statistische Analysen durch, um behandelte und kontrollierte Daten bei 24 Stunden zu vergleichen.

8. Erzeugung und Charakterisierung von CAR-T-Zellen

  1. CAR-Konstruktionsdesign
    HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten CAR-T-Zellen zielen auf B7-H3 (codiert durch das CD276-Gen), ein Antigen, das häufig bei Darmkrebs14 überexprimiert wird. Der CAR-Konstrukt besteht aus:
    Extrazelluläre Domäne: Ein einzelkettiges variables Fragment (scFv), abgeleitet von einem monoklonalen Antikörper gegen den B7-H3-Klon 376.96.
    Scharnier- und Transmembrandomäne: CD8α-Scharnier- und Transmembrandomäne.
    Kostimulatorische Domäne: menschliches CD28.
    Signalisierungsbereich: menschliches CD3ζ.
  2. Erzeugung von CAR-T-Zellen
    1. Isolierung: Isolieren Sie periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) aus gesunden Spender-Buffycoats mittels Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugation14.
    2. Aktivierung: Aktivierung menschlicher PBMCs mit plattengebundenen Anti-CD3/CD28-Antikörpern für 48 Stunden in T-Zellmedien, ergänzt mit 10 ng/mL IL-7 und 5 ng/mL IL-15. Bereiten Sie das T-Zell-Medium vor, indem Sie gleiche Mengen (jeweils 250 ml) RPMI 1640 und Click's Media mischen und mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS), 1x GlutaMAX und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) ergänzen.
    3. Transduktion: Transduziere die aktivierten T-Zellen mit einem Retroviren-Supernatanten mittels einer mit Retronectin beschichteten Platte, wie zuvorbeschrieben 15.
    4. Expansion: T-Zellen werden 3 Tage nach der Transduktion in einem vollständigen menschlichen T-Zell-Medium mit IL-7 und IL-15 geerntet und kultiviert, weitere 7–9 Tage vor Charakterisierung und funktionellen Analysen.
  3. CAR-T-Zellcharakterisierung
    1. CAR-Expression: Beurteilung der CAR-Expression 5–7 Tage nach der Transduktion mittels Durchflusszytometrie mit einem rekombinanten B7-H3-Fc-Protein, gefolgt von einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper gegen humane Fc14. Die typische Transduktionseffizienz (CAR+-Zellen) liegt zwischen 80 % und 90 %.
    2. Phänotyp: Charakterisiere die T-Zell-Subsets (z. B. CD4+, CD8+ usw.) mittels Durchflusszytometrie mit Antikörpern gegen CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7 usw.14.
    3. Funktionelle Validierung (optionale Vor-Kokultur): Vor Kokultur-Experimenten validieren Sie die CAR-T-Zellen funktionell durch Kokultivierung mit B7-H3-positiven und B7-H3-negativen Zielzelllinien und Messung der Zytokinfreisetzung (z. B. IFN-γ durch ELISA) oder Zytotoxizität (z. B. mit Flowzytometrie15).
  4. Vorbereitung auf Kokultur (PDTO-Assay)
    1. Verwenden Sie CAR-T-Zellen zur Kokultur während ihrer Log-Phase-Expansion (typischerweise zwischen Tag 10 und 14 nach der Aktivierung). Vor der Anwendung werden die Zellen zweimal mit HBSS gewaschen, um IL-7/IL-15 zu entfernen, und sie in dem in Schritt 4.1 beschriebenen Kokulturmedium neu suspendiert.
    2. Bestätigen Sie die Wirksamkeit von >95 % mit Trypan Blue-Färbung.
    3. Visuelle Kontrollpunkte: Prüfen Sie kleine kugelförmige Cluster (50-100 μm) an den Tagen 3-5 und ausgewachsene Sphäroide (100-200 μm) an den Tagen 10-14.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolorektalkrebsorganoide wurden erfolgreich aus endoskopischen Biopsieproben gewonnen (Abbildung 1), wobei die Tumoridentität durch pathologische Diagnose bestätigt wurde (Abbildung 2). Die in BMM kultivierten Tumorfragmente begannen innerhalb von 24 Stunden 3D-Strukturen zu bilden. Organoide der ersten Generation (P0) wurden zwischen Tag 7 und 14 vermittelt. Organoide wiesen unterschiedliche Morphologien auf, darunter kugelförm...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Bewertung des zytotoxischen Effekts von CAR-T-Zellen auf PDTOs vor, indem sie Hellfeldbildgebung und fluoreszierende Färbung kombiniert, um die Lebensfähigkeit organoider zu bewerten. Dieser dualmodale Ansatz ermöglicht eine robuste Visualisierung des Tumorzelltods in einem 3D-Modellsystem und liefert eine halbquantitative Bewertung der CAR-T-Zytotoxizität.

Ein entscheidender Bestandteil dieses Protokolls ist das Kulturme...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom Nationalen Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm Chinas (2022YFC2304400, 2022YFC2304401), dem Science and Technology Project im Nanshan Medical and Health System (NSZD2024046, NS2024105) und dem Shenzhen Medical Research Fund (D2401023) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15-mL-RöhreSAINING3030100
24-Well-PlatteCORNING3524
50-mL-RöhreSAINING3030000
96-Well-PlatteCORNING3599
Fortgeschrittenes DMEM/F12GibcoC11330500BT
ALK 4/5/7-InhibitorMCEHY-10432 
B27Gibco17504044
Biosicherheitsschrank (Klasse II)Thermo FisherN/A
Rinderserum-AlbuminSigma AldrichA9056
ZellkulturschaleBIOFILTCD010060
ZentrifugeEppendorf5810R
Clicks MediumFUJI-FILM9195
CO2-InkubatorYamataIP610
Kollagenase IISolarbioC8150
Kollagenase IVSigma AldrichC9407
Konfokales LasermikroskopZeissLSM900
KryokonservierungsmediumZENOAQCELLBANKERTM2
VerdauungspufferIm Haus hergestellte ReagenzienN/AIm Manuskript enthaltene Komposition
Digitaler ShakerMIULABHS-25
Dispase Typ IISigma-aldrichD4693
DMEMGibcoC11995500BT
Dynabeads Human T-Aktivator CD3/CD28Thermo Fisher11131D
EGFPeproTechAF-100-15-500UG
Fetales RinderserumGibco1631389
GastrinGlpBioGA20228
Gentamicin/amphoteritin BGibcoR0151
GlutamaxGibco35050061
Hanks' ausgewogene SalzlösungGibcoC14175500BT
HEPESGibco15630080
Hoechst 33342 BeyotimeC1027
HyaluronidaseSolarbioh8030
IL-15Peprotech200-15-10UG
IL-2NovoproteinCK24-10
IL-7Peprotech200-07-10UG
ImageJNIH (Open Source)https://imagej.nih.gov/ij/
Invertiert  Fluoreszierendes MikroskopMshotMF52-N
MatrigelCorning356231
N2Gibco17502048
n-AcetylcysteinSigma AldrichA7250-5G
NiacinamidSigma AldrichN0636-100G
NogginPeproTech120-10C-20
NormocinInvivoGenANT-NR-1
Organoid-KulturmediumIm Haus hergestellte ReagenzienN/AIm Manuskript enthaltene Komposition
p38-InhibitorMCEHY-10295 
Penicillin-StreptomieGibco15140122
Prostaglandin E2MCEHY-101952 
Rho-assoziierter Kinaseinhibitor Stammzelle72304
RPMI 1640HyCloneSH30809.01B
R-spondin 1PeproTech120-38-20UG
S1 Pipet-FüllerThermowissenschaftlich9501
Serologische PipetteBIOFILGSP-010-050
Einkanal-PipetteEppendorf3123000063
Einkanal-PipetteEppendorf3123000055
Einkanal-PipetteEppendorf3123000098
Einkanal-PipetteEppendorf3123000022
Sterile EinwegskalpelleTech-SSSD10
SYTOX GreenBeyotimeC1181S
TexMACS MediumMiltenyi Biotec130-097-196
Thermostat-WassertankBluepardBWS-10
Trypan BlauPhygenePH0519
TrypLE ExpressGibco12605028
β-MercapptoethanolGibco21985023

Referenzen

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