Methodenartikel

Ein geschichtetes genomisches Rahmenwerk für die Vorhersage von Salmonellen-Serotypen : Bewertung von MLST, SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S und SISTR im Südwesten Chinas

DOI:

10.3791/69117

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9. Januar 2026

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1West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, 2College of Pharmacy, Youjiang Medical University for Nationalities, 3Chengdu Center for Disease Control and Prevention (Chengdu Institute of Health Supervision), 4Sichuan Provincial Centre for Disease Control and Prevention, 5Department of Laboratory Medicine and Port Epidemic Disease Monitoring Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan International Travel and Healthcare Center (Chengdu Customs District Port Clinic), 6Health Promotion and Food Nutrition & Safety Key Laboratory of Sichuan Province, 7Innovation Center of Nursing Research and Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll etabliert einen stratifizierten genomischen Workflow für die Salmonella-Serotyp-Vorhersage, bei dem MLST oder SeqSero2S für routinemäßige Überwachung, SISTR mit Kerngenom-MLST für die Ausbruchserkennung und SeqSero2S für das schnelle Screening verwendet werden. Das Protokoll wurde durch eine multizentrische Analyse validiert, um die Überwachung in China zu verbessern.

Zusammenfassung

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Eine genaue Serotypisierung von Salmonellen ist für eine effektive Überwachung und Ausbruchsuntersuchung unerlässlich, da die Serotypienvielfalt direkt die Pathogenität und die Bewertung des öffentlichen Gesundheitsrisikos beeinflusst. Konventionelle Verfahren zur Agglutination von Slides sind jedoch durch schlechte Reproduzierbarkeit, Arbeitsintensität und hohe Kosten eingeschränkt, was ihre Anwendung in Hochdurchsatzüberwachungsprogrammen erschwert. Um diese Einschränkungen zu beheben, entwickelten und validierten wir einen genomischen Workflow, der Multilocus Sequence Typing (MLST), die Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR), SeqSero, SeqSero2 und SeqSero2S für die Serotyp-Vorhersage mit Ganzgenomsequenzierungsdaten integriert. Dieses Protokoll wurde durch eine multizentrische Analyse von 315 Salmonellen-Isolaten aus Lebensmitteln und menschlichen Quellen im Südwesten Chinas bewertet. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten eine signifikant höhere Übereinstimmung zwischen genomischen Ansätzen (bis zu 100 %/99,1 %/90,1 % im Trainingsset und 100 %/97,1 %/93,1 % im Validierungssatz für SISTR/MLST/SeqSero2S) im Vergleich zur traditionellen Serotypisierung. Der Arbeitsablauf enthält Empfehlungen zur Auswahl geeigneter Vorhersagemethoden basierend auf dem Überwachungskontext, mit Schwerpunkt auf MLST und SeqSero2S für routinemäßige Überwachung, SeqSero2S für das schnelle Screening und SISTR mit Kerngenom-MLST für Ausbruchsuntersuchungen. Dieser Ansatz erleichtert die Integration von genomischer Serotypisierung in die öffentliche Gesundheitspraxis, verringert die Abhängigkeit von traditioneller Serologie und verbessert die Reproduzierbarkeit sowie Skalierbarkeit in Salmonellen-Monitoringprogrammen .

Einleitung

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Salmonellen gehören zu den weltweit bedeutendsten lebensmittelbedingten Krankheitserregern und verursachen erhebliche Morbidität und Sterblichkeit 1,2. In China bleibt er eine der Hauptursachen lebensmittelbedingter Krankheiten, wobei nur eine begrenzte Anzahl von Serotypen die Mehrheit der Infektionen ausmacht. Eine genaue Serotyp-Identifizierung ist entscheidend für Überwachung und Ausbruchsuntersuchungen, da die Serotypvielfalt eng mit der Pathogenität und dem Risiko der öffentlichen Gesundheit korreliert. Dies ist bei gängigen Serotypen wie Salmonella enteritidis und Salmonella typhimurium gut bekannt, aber einige weniger untersuchte Serotypen wie Salmonella Panama sind ebenfalls eine bedeutende Ursache für weltweite Ausbreitung und invasiveKrankheiten, was den allgemeinen Bedarf an robusten Serotypisierungsfähigkeiten unterstreicht. Traditionelle Serotypisierungsmethoden, die lange als Goldstandard gelten, sind ein zeitaufwändiger und kostenintensiver Prozess, der über 150 Antisera5 erfordert. Sie sind zudem durch schlechte Reproduzierbarkeit6, arbeitsintensive Arbeitsabläufe7 und inhärente Variabilität aufgrund subjektiver Interpretation der Agglutinationsreaktionen8 eingeschränkt, was sie für Hochdurchsatzüberwachungsprogramme9 unzureichend macht.

Die Einführung der Whole-Genome Sequencing (WGS) hat die Pathogencharakterisierung grundlegend verändert, indem sie eine schnelle, hochauflösende Serotyp-Vorhersageermöglicht 10,11,12. Mehrere In-silico-Werkzeuge wurden entwickelt, darunter Multilocus Sequence Typing (MLST), SeqSero13, SeqSero214, SeqSero2S15 und die Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR)7,15. Während MLST standardisierte, langfristige epidemiologische Nachverfolgung16 bietet, ermöglichen SeqSero2 und SeqSero2S eine direkte Analyse von Rohlesungen und ermöglichen ein Hochdurchsatz-Screening gängiger Serotypen 14,15. Umgekehrt benötigt SISTR zusammengesetzte Genome, integriert aber die Antigengendetektion mit der Kerngenom-Multilocus-Sequenztypisierung (cgMLST), was eine umfassende Auflösung für Ausbruchsuntersuchungen bietet17. Während die auf WGS basierende Salmonellen-Charakterisierung zunehmend als primäres Ebevis in der Forschung 16,18,19 verwendet wird, bleibt ihre Anwendung in der großflächigen Überwachung begrenzt, eine Lücke, die teilweise auf unbehandelte praktische Überlegungen zurückzuführen ist, die die Methodeneignung beeinflussen. Eine weltweite Umfrage ergab, dass nur 8 % der teilnehmenden Labore WGS für routinemäßige Überwachung nutzen, wobei die analytische Komplexität ein großes Hindernisdarstellt. Beispielsweise hängt eine zuverlässige Serotyp-Vorhersage von einer ausreichenden Sequenzierungstiefe ab (typischerweise >75× für Kosteneffizienz, idealerweise ~200× für hochwertige Analysen) und hochwertigen Genomassemblierungen (N50 der Contigs > 30 kbp als kosteneffizientes Minimum, vorzugsweise >100 kbp), insbesondere für assemblierungsabhängige Werkzeuge wie SISTR21, 22, 23. Außerdem muss die Werkzeugauswahl mit den Rechenressourcen und der Expertise eines Labors übereinstimmen: Open-Source-Tools wie SeqSero2S bieten schnellere Alternativen für schnelle Screening, indem sie Rohlesungen analysieren und die rechnerintensive Assembly15 umgehen, während Labore mit begrenzter bioinformatischer Kapazität Schwierigkeiten mit Datenanalyse und -speicherung haben können. Folglich liegen nicht genügend Daten vor, um festzustellen, ob serologische Tests bei großflächiger Überwachungreduziert werden können, was die Notwendigkeit ressourcenadaptiver Ansätze hervorhebt. Bemerkenswert ist, dass es nach der COVID-19-Pandemie eine beträchtliche Menge an ungenutzten Sequenzierungsinstrumenten und qPCR auf verschiedenen Ebenen von Gesundheitseinrichtungen gibt, was die Möglichkeit bietet, diese Kapazität für genomische Überwachung neu zu nutzen.

Um diese Lücke zu schließen, führten wir eine multizentrische Bewertung der oben genannten genomischen Serotypisierungswerkzeuge mit 315 Salmonellen-Isolaten durch, die aus Lebensmitteln und menschlichen Quellen im Südwesten Chinasgesammelt wurden (25,26). Auf Grundlage dieser Ergebnisse entwickelten wir einen geschichteten Arbeitsablauf, der unterschiedliche Laborressourcen und Überwachungsbedürfnisse berücksichtigt und klare Kriterien für die Werkzeugauswahl in unterschiedlichen Kontexten liefert. Dieses Rahmenwerk priorisiert SeqSero2S für das schnelle Screening und SISTR in Kombination mit cgMLST für Ausbruchsuntersuchungen, wodurch die Einführung genomischer Ansätze erleichtert und die Abhängigkeit von traditionellen Serotypisierungsmethoden reduziert wird. Hier beschreiben wir jeden Schritt des Arbeitsablaufs im Detail, einschließlich Isolaterkennung, Sequenzierung, Datenanalyse und Kriterien zur Auswahl von Vorhersagetools in verschiedenen Überwachungskontexten.

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Protokoll

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Die Entnahme und Handhabung menschlicher Stuhlproben erfolgte unter Genehmigung des Ethikausschusses des West China Fourth Hospital, Sichuan University (Protokollnummer: HXSY-EC-2022093), gemäß der Helsinkier Erklärung und der guten klinischen Praxis. Die informierte Einwilligung wurde gemäß den nationalen Gesundheitsvorschriften aufgehoben.

HINWEIS: Alle Verfahren mit lebenden Salmonellenkulturen und menschlichen Stuhlproben müssen in einem Biosicherheits-Level-2-(BSL-2)-Labor von Fachpersonal durchgeführt werden, das in den standardisierten mikrobiologischen Praktiken und Biosicherheitsverfahren geschult ist. Tragen Sie jederzeit geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrillen. Desinfizieren und wechseln Sie regelmäßig kontaminierte Handschuhe. Dekontaminieren Sie alle Arbeitsflächen vor und nach den Experimenten mit einem geeigneten Desinfektionsmittel (z. B. 70 % Ethanol, 1 % Natriumhypochlorit). Dekontaminieren Sie alle flüssigen und festen Abfälle, die biologische Materialien enthalten, durch Autoklavierung (z. B. bei 121 °C für mindestens 30 Minuten) vor der Entsorgung. Vermeiden Sie die Bildung von Aerosolen und Spritzern. Führen Sie alle Verfahren durch, die Aerosole erzeugen können (z. B. Zentrifugation, kräftiges Schütteln), in einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank.

1. Lebensmittelprobenentnahme und Sortenerkennung

  1. Sammeln Sie Lebensmittelproben aus Einzelhandelsmärkten oder Verarbeitungsbetrieben. Isolieren Sie Salmonellen aus Lebensmittelproben gemäß dem nationalen Lebensmittelsicherheitsstandard GB 4789.4 und den Vertraulichkeitsprotokollen des Foodborne Disease Surveillance Program.
  2. Voranreicherung:
    1. Wiege genau 25 g pro Lebensmittelprobe. Fügen Sie der Probe 225 ml gepuffertes Peptonwasser (BPW) hinzu (Verdünnungsverhältnis 1:10) und wirbeln 30 Sekunden lang, um vollständige Homogenisierung und Untertauchung sicherzustellen.
    2. Inkubieren Sie die Probe in BPW bei 36 °C ± 1 °C für 8–18 Stunden in einem Schüttelinkubator mit 150 U/min.
      HINWEIS: Die Voranreicherung in nichtselektiver Brühe erhöht die Pathogenbelastung signifikant. Behandle alle nachfolgenden Materialien (Behälter, Pipetten usw.) als hochinfektiös.
  3. Selektive Anreicherung: Nach der Voranreicherung wird 1 ml der Probe in Tetrathionatbrühe (TTB) übertragen. Inkubiere das TTB bei 42 °C 18–24 Stunden ohne Schütteln.
  4. Isolierung: Nach der Brütung wird die angereicherte Kultur auf folgende selektive Agarplatten gestrichen: Hektoen enterischer (HE) Agar, Xyloselysin-Desoxycholat (XLD) Agar und CHROMagar Salmonella. Inkubieren Sie die Platten bei 36 °C für 18–24 Stunden.
    HINWEIS: Beim Streifen von Platten sollten Sie vorsichtig sein, um Aerosole und Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Auf HE-Agar erscheinen vermutete Salmonellenkolonien typischerweise als blau-grün bis blau gefärbt, mit oder ohne schwarze Mitten. Der umgebende Agar kann einen ähnlichen grünlichen Farbton annehmen. Bei XLD-Agar sind vermutete Salmonellenkolonien typischerweise rot mit schwarzen Zentren. Bei CHROMagar sind vermutete Salmonellenkolonien durch ihre magenta- bis mauve Farbe charakterisiert, wie vom Hersteller angegeben. Auf jeder selektiven Platte ist nach 18–24 Stunden Brutzeit mit gut isolierten Kolonien zu rechnen. Überwucherte Platten (>300 Kolonien) müssen möglicherweise verdünnt und neu gestreift werden.
  5. Identifikation: Untersuchen Sie die Platten auf vermutete Salmonellenkolonien . Identifizieren Sie verdächtige Stämme mithilfe eines automatisierten Identifikationssystems mit einer Gramnegativen (GN) Identifikationskarte und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers zur Analyse.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Chargennummern der GN-Karten gültig und innerhalb des Ablaufdatums sind.
    1. Bereiten Sie eine bakterielle Suspension aus einer reinen Kolonie mit der angegebenen Trübung (0,50–0,63 McFarland-Standard) mit 0,45% Kochsalzlösung vor.
    2. Lege die Federung in die GN-Karte und führe den Test durch. Stellen Sie sicher, dass das System so eingestellt ist, dass die Karte automatisch bei 35,0 °C ± 2,0 °C inkubiert wird, und überwachen Sie biochemische Reaktionen bis zu 8 Stunden.
    3. Akzeptieren Sie ein Ergebnis von Salmonella enterica ssp. enterica mit einer ≥ Wahrscheinlichkeit von 95 % und einer ausgezeichneten Vertrauensbewertung.
  6. Serotypisierung: Einzelne Kolonien von der Schwarmagarplatte nach Übernachtung bei 37 °C auswählen. Führen Sie Dia-Agglutinationstests durch, um O-Antigene und H-Antigene nachzuweisen. Verwenden Sie kommerziell erhältliche Salmonella-Antiserum-Kits (siehe Materialtabelle) für Tests.

2. Menschliche Probenentnahme und Stammbestimmung

HINWEIS: Für die Isolierung von Salmonellen aus menschlichen Kotproben befolgen Sie die Vertraulichkeitsprotokolle des Foodborne Disease Surveillance Program.

  1. Entnahme: Sammeln Sie etwa 2 g frisch entleerte menschliche Stuhlproben. Legen Sie die Kotproben in saubere, trockene, weite Behälter. Innerhalb von 1 Stunde werden die Fäkalproben mit isolierten Transportboxen ins Labor transportiert, um die Probenintegrität zu gewährleisten.
    VORSICHT: Menschliche Stuhlproben können mehrere Krankheitserreger enthalten, die über Salmonellen hinausgehen. Behandeln Sie alle Proben als potenziell ansteckend und halten Sie die Standardvorsichtsmaßnahmen für den Umgang mit Biohazard-Materialien ein.
  2. Impfung: Inokulieren Sie die gesammelten Kotproben direkt auf die folgenden selektiven Agarplatten: CHROMagar Salmonella, Salmonella-XLD Agar und Shigella (SS) Agar.
    HINWEIS: Siehe Schritt 1.4 für die charakteristische Koloniemorphologie bei CHROMagar Salmonella und XLD Agar. Auf SS agar erscheinen vermutete Salmonellenkolonien typischerweise farblos, undurchsichtig oder beige mit schwarzen Zentren. Der Agar selbst ist weitgehend unverändert geblieben.
  3. Identifikation: Identifizieren Sie vermutete Salmonellenkolonien wie in Schritt 1.5 beschrieben.
  4. Serotypisierung: Serotypisierung durch Slide-Agglutination wie in Schritt 1.6 beschrieben durchgeführt.

3. Bibliotheksvorbereitung und Ganzgenomsequenzierung

  1. Bakterienkultur: Streak Salmonella auf LB-Agar, 12 Stunden bei 37 °C inkubieren. Wähle eine Kolonie, impfe sie in 200 mL LB-Brühe und schüttle sie bei 150 U/min (37 °C, 12 H). Zentrifugiere mit 12.000 × g für 10 Minuten, um Zellen zu entnehmen.
    HINWEIS: Führen Sie alle Zentrifugationsschritte mit versiegelten Rotoren oder Sicherheitsbechern durch, um eine Aerosolbildung zu verhindern.
  2. DNA-Extraktion: Genomische DNA mit einem kommerziellen DNA-Extraktionsset extrahieren (siehe Materialtabelle) nach dem Protokoll des Herstellers.
    VORSICHT: Die Reagenzien in kommerziellen DNA-Extraktionskits (z. B. Lysepuffer, Proteinase K) können schädlich sein, wenn sie eingeatmet werden oder bei Kontakt mit Haut und Augen. Führen Sie die Extraktion in einer Dampfhaube oder einem biologischen Sicherheitsschrank durch, falls flüchtige Reagenzien verwendet werden, und tragen Sie geeignete PSA.
  3. DNA-Qualitätsbewertung: Reinigen Sie genomische DNA und quantifizieren Sie mit einem Fluorometer mit dem dsDNA High-Sensitivity Assay Kit. Die DNA-Integrität durch Elektrophorese an einem 1%igen Agarosegel bei 100 V für 45 Minuten überprüfen; hochwertige DNA erscheint als einziges kompaktes Band >20 kbp mit minimalerVerschmierung von 27.
    HINWEIS: (Kritischer Schritt) Hochwertige, hochmolekulare genomische DNA (mit einem A260/A280-Verhältnis von ~1,8-2,0) ist entscheidend für eine erfolgreiche Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung.
    VORSICHT: Die in der Agarose-Gelelektrophorese verwendeten Nukleinsäurefärbungsfarbstoffe (z. B. GelRed, Ethidiumbromid) sind mutagen. Tragen Sie beim Umgang mit Gelen und Fleckenlösungen stets Handschuhe und entsorgen Sie diese gemäß den institutionellen Vorschriften für gefährliche Abfälle.
  4. DNA-Fragmentierung: Fragmentieren Sie etwa 150 ng qualifizierter genomischer DNA auf eine durchschnittliche Größe von ~350 bp mit einem fokussierten Ultraschallsystem gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  5. Stellen Sie die Sequenzierungsbibliothek aus den abgeschnittenen DNA-Fragmenten mit einem kommerziellen Bibliotheksvorbereitungskits zusammen (siehe Materialübersicht). Führen Sie Endreparaturen und 5'-Phosphorylierung der abgescherten DNA-Fragmente durch. Dann fügt man eine einzelne 'A'-Basis an die 3'-Enden hinzu und ligaiert die indexierten Sequenzadapter.
  6. Amplifizieren und bereichern Sie die adapter-ligierten DNA-Fragmente über ein im Kit festgelegtes PCR-Programm mit begrenztem Zyklus.
  7. Qualifizieren und quantifizieren Sie die endgültige Bibliothek mit Methoden wie Fluorometrie und Kapillarelektrophorese.
  8. Führen Sie gepaarte Endsequenzierung (2 × 150 bp) auf einer Sequenzierungsplattform gemäß den Standardbetriebsverfahren durch.

4. Datenanalyse

  1. Qualitätskontrolle der Rohsequenzierungsdaten: Führen Sie die initiale Qualitätskontrolle an den rohen FASTQ-Dateien mit FASTP (Version 0.23.0) mit Standardparametern durch. Das Ziel ist es, Adaptersequenzen und minderwertige Lesungen zu entfernen und so saubere FASTQ-Daten für die nachgelagerte Analyse zu erzeugen.
  2. Stellen Sie die hochwertigen, gefilterten Lesungen in Entwurfsgenome mit SPAdes (Version 3.15.0) zusammen, mit der sorgfältigen Option zur Reduzierung von Fehlanpassungen und kurzen Indels26.
  3. Nutzen Sie die Genomsequenzen (FASTQ / FASTA-Dateien) als Eingabe für die Vorhersage verschiedener Serotypen.
    1. Für MLST importieren Sie die FASTQ-Datei in die BioNumerics-Software (Version 7.6).
      1. Im Fenster Vorlage importieren klicken Sie unter erweiterten Optionen auf Parsing bearbeiten . Setze die Datenparsing-Zeichenkette und die Datendekoration auf [DATA]. Wenden Sie die regulären Ausdrücke DATA]_* und [DATA] für das Parsing von Dateinamen an. Speichere die Vorlage, wähle sie aus und klicke auf Nächst und dann auf Fertigstellen. Bestätigen Sie die Einreichung im Fenster "Aufgabe absenden ", um Daten hochzuladen. Das CEStoreUploader-Tool öffnet sich automatisch, um WGS-Rohdaten an die Berechnungs-Engine zu übertragen.
      2. Wählen Sie den Genomeintrag nach dem Hochladen aus. Navigieren Sie zu WGS Tools und wählen Sie "TraNetGenotype" für die automatische ST-Vorhersage. Im Dialogfeld TraNetGenotype wählen Sie Salmonella als Stammtyp aus, wählen Sie Serotypanalyse, Virulenzanalyse und Antimikrobielle Susceptibilitätsanalyse und klicken Sie auf Ja.
    2. Für SISTR (Version 1.1.3; https://github.com/phac-nml/sistr_cmd; Parameter: Alle Parameter sind Standard), öffne ein Terminal und navigiere zum Verzeichnis, das die zusammengesetzte Genomdatei assembly.fasta enthält.
      1. Führen Sie folgenden Befehl aus, um eine Serovar-Vorhersage durchzuführen und einen umfassenden Bericht im CSV-Format zu erstellen: sistr --qc --alleles-output allele-results.json --cgmlst-profiles cgmlst-profiles.csv -f tab -o sistr-output.tab -i assembly.fasta. Dieser Befehl generiert einen Bericht mit dem vorhergesagten Serovar.
        HINWEIS: -qc: Führt Qualitätskontrollprüfungen an der Baugruppe durch. -i assembly.fasta: Spezifiziert die Eingabedatei FASTA. -f csv: Definiert das Ausgabeformat als CSV. -o sistr_results: Legt den Grundnamen für die Ausgabedatei fest (z. B. sistr_results.csv). -p 4: Verwendet 4 CPU-Threads für die Analyse, um die Berechnung zu beschleunigen. --alleles-output: Speichert Allelsequenzen und Informationen in einer JSON-Datei. --cgmlst-profiles: exportiert cgMLST-Allelprofile in eine CSV-Datei.
    3. Für SeqSero (Version 1.0; https://github.com/denglab/SeqSero; Parameter: Alle Parameter sind Standard), navigiere zum Verzeichnis mit der Eingabedatei. Führen Sie folgenden Befehl mit Standardparametern für die Analyse aus: python SeqSero.py -m 4 -i assembly.fasta. Das Tool erstellt ein Ausgabeverzeichnis, das die Datei Seqsero_result.txt mit dem vorhergesagten Serotyp enthält.
      HINWEIS: -m 4 gibt den Eingabetyp als Genomassemblierung an. -i definiert die Eingabe-FASTA-Datei.
    4. Für SeqSero2 (Version 1.3.1; https://github.com/denglab/SeqSero2; Parameter: Alle Parameter sind Standard). Führe folgenden Befehl aus: python3 SeqSero2_package.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. Das Tool gibt den vorhergesagten Serotyp direkt nach Abschluss auf den Terminalbildschirm aus. Das Ergebnis liefert den vorhergesagten Serotyp.
      HINWEIS: -m k: spezifiziert einen k-mer-basierten Workflow für schnelle Serotyp-Vorhersage unter Verwendung einzigartiger k-mers von Serotyp-Determinanten. -t 4: Gibt den Eingabetyp als zusammengesetzte Sequenzen an.
    5. Für SeqSero2S (Version 1.1.1; https://github.com/denglab/SeqSero2S; Parameter: alle Parameter sind Standard): Führe es mit dem bereitgestellten Skript python SeqSero2S.py -m k -t 4 -i assembly.fasta aus. Das Ergebnis liefert den vorhergesagten Serotyp.
      HINWEIS: -m k ermöglicht eine k-mer-basierte Analyse von Rohlesungen oder Genomassemblierungen. -t 4 gibt die Eingabe der zusammengesetzten Sequenz an.

5. Kritische Parameter und praktische Überlegungen

HINWEIS: Die folgenden Überlegungen sind entscheidend für die erfolgreiche Umsetzung dieses genomischen Workflows, insbesondere in ressourcenbegrenzten Umgebungen.

  1. Überprüfen Sie, dass die Rohsequenzierungsdaten eine ausreichende Abdeckungstiefe erreichen. Eine Sequenzierungstiefe von etwa 100x reicht typischerweise für eine hochwertige Analyse aus.
    HINWEIS: Für Labore, die Kosteneffizienz priorisieren, wird eine minimale Sequenzierungstiefe von 75x als praktisch niedrigere Schwelle für eine zuverlässige Serotyp-Vorhersage mit MLST oder SeqSero221 empfohlen.
  2. Bestätigen Sie, dass die Qualität der Rohlesungen hoch ist, mit einem Q30-Wert (Basisanrufgenauigkeit von 99,9 %) typischerweise über 90 %.
  3. Bewerten Sie die Qualität der de-novo-Genomassemblierung, bevor Sie mit Serotyp-Vorhersagewerkzeugen fortfahren, die assemblierte Kontigs benötigen. Verwenden Sie die N50-Statistik als Schlüsselkennzahl.
    HINWEIS: Ein N50 von mindestens 100 kbp wird mit22 empfohlen, während ein N50 über 30 kbp als Mindestanforderung für eine zuverlässige Analyse23 gilt.
  4. Überprüfen Sie die Vollständigkeit der Assemblierung, indem Sie sicherstellen, dass eine Lesekartierungsrate von mindestens ≥98 % liegt, wenn die gefilterten Reads auf das assemblierte Genom zurückgemappt werden.

6. Empfohlenes Serotyp-Vorhersageprotokoll für die Überwachung von Hochdurchsatz-Salmonellen

HINWEIS: Wählen Sie Serotyp-Vorhersagemethoden basierend auf dem Überwachungskontext, der erforderlichen Genauigkeit und den verfügbaren Laborressourcen. Für die Hochdurchsatz-Salmonella-Überwachung folgen Sie dem untenstehenden Protokoll:

  1. Vorläufige Identifizierung: Erstuntersuchungen gemäß GB 4789.4 durchführen, um die Isolate als Salmonellen-Arten zu bestätigen.
    HINWEIS: In diesem Stadium ist es nicht notwendig, den spezifischen Serotyp der Isolate zu bestimmen.
  2. Routinemäßige Überwachung (High-Throughput-Modus): Für routinemäßige Überwachung, da BioNumerics nicht mehr aktualisiert wird, verwenden Sie Open-Source-Plattformen MLST28, SeqSero2S oder andere validierte, benutzerfreundliche Genomanalyseplattformen, die fortlaufenden technischen Support und Aktualisierungen erhalten.
    HINWEIS: Für MLST: Das 7-Gen-Schema bietet ein standardisiertes, portables und phylogenetisch informatives Profil (Sequence Type, ST), das ideal für langfristige Epidemiologie und globalen Stammvergleich ist. Seine Einfachheit gewährleistet eine schnelle Analyse und minimale Rechenbelastung. Für SeqSero2S: Es bietet den doppelten Vorteil einer schnellen Serotyp-Vorhersage und integrierten MLST-Ergebnissen in einem einzigen Durchlauf. Es kann rohe Sequenzierungslesungen direkt analysieren und so die Genomassemblierung umgehen, um Zeit und Ressourcen zu sparen. Selbst mit zusammengestellten FASTA-Daten ist es schneller als Werkzeuge wie SISTR, da es die Serotyp-Vorhersage unabhängig vornimmt, ohne auf rechnergestützte Analysen zu setzen.
  3. Schnellscreening (zeitkritische Einstellungen): Für schnelle Ergebnisse oder in Laboren mit begrenzter Rechenkapazität verwenden Sie SeqSero2S zur vorläufigen Serotyp-Vorhersage.
    HINWEIS: Bei der Durchführung von SeqSero2S-Vorhersagen wird grundsätzlich empfohlen, "I_4,[5],12:i:-" als Salmonella Typhimurium zu interpretieren.
  4. Ausbruchsuntersuchung (Hochpräzisionsmodus): Für Ausbruchsverfolgung, die eine hohe Auflösung erfordert, verwenden Sie SISTR, das cgMLST nutzt, um die Serotypvorhersage zu ergänzen und hochauflösende Clusteranalysen für die Quellenverfolgung bereitzustellen.
  5. Qualitätskontrolle und inkonsistente Ergebnisbestätigung:
    1. Für gängige Sequenztyp-Stämme führen Sie eine zufällige Verifikation durch. Für nicht-häufige verwenden Sie ein Verifikationsverhältnis von 20 %. Bei inkonsistenten Serotypisierungsergebnissen werden Isolate für ein endgültiges Ergebnis an ein höheres oder Referenzlabor verwiesen.
    2. Für die bestätigende Analyse verwenden Sie mehrere validierte Methoden, darunter: wiederholte genomische Analyse mit mindestens zwei verschiedenen in-silico-Vorhersagewerkzeugen; wiederholt in Silico-Vorhersage mit mindestens zwei verschiedenen Werkzeugen; phylogenetische Kontextualisierung mit hochauflösenden, WGS-basierten Methoden (z. B. cgMLST oder Whole-Genome SNP-Analyse)29.
    3. Weisen Sie den endgültigen Serotyp auf Grundlage des Konsenses aus diesen umfassenden Evidenzen zu.
      HINWEIS: Das empfohlene Verifizierungsverhältnis von 20 % für nicht-häufige Serotypen basiert auf der Beobachtung, dass genomische Werkzeuge eine hohe Konkordanz (93,3 % für SISTR vs. MLST, 95,0% für SISTR vs. SeqSero2S) auch bei nicht-häufigen Serotypen aufrechterhalten (Tabelle 1). Diese Schwelle ist kosteneffektiv und bietet eine ausreichende Sicherheitsmarge, um die geringe Häufigkeit von Abweichungen zwischen genomischen Werkzeugen bei routinemäßiger Überwachung zu erkennen.

7. Statistische Analyse

  1. Führen Sie Datenanalysen mit R-Software (Version 4.1.2) durch.
  2. Stellen Sie kategoriale Variablen als Häufigkeiten mit Prozentsätzen dar.
  3. Vergleichen Sie Gruppen mitχ-2-Tests für kategoriale Daten30, betrachten Sie einen P-Wert <0,05 als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

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Das Protokoll wurde mit 315 Salmonellen-Isolaten aus Südwestchina validiert, wobei 213 Isolate (2/3) als Trainingsset dienten, um fünf WGS-basierte Serotyp-Vorhersagemethoden (MLST, SISTR, SeqSero, SeqSero2 und SeqSero2S) mit konventionellen Serotypisierungsergebnissen zu vergleichen, während die übrigen 102 Isolate (1/3) als Validierungsset zur Bewertung der Leistung von MLST, SISTR und SeqSero2S verwendet wurden.

Trainingssatzanalyse (n = 21...

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Diskussion

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Diese groß angelegte Analyse, die 315 Salmonellen-Isolate aus Südwestchina umfasst, zeigt die überlegene Reproduzierbarkeit von WGS-basierten Serotypisierungsmethoden im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen (84,1 % gegenüber 62,9 % Abdeckung, P<0,001). Unsere Ergebnisse bestätigen einen umfassenden genomischen Workflow, bei dem kritische erste Schritte der Probenvorbereitung und DNA-Qualitätskontrolle (Abschnitte 1–3) direkt die Zuverlässigkeit der Downstream beeinflussen. Das Pr...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Fördermittel des Tibet and Sichuan Science and Technology Bureau (XZ202301ZY0049G, 2024NSFSC0563 an H.Z. und 2024NSFSC0033 an X.P.), das Sichuan Science and Technology Program (2024JDRC0032 an Y.X.), das Projekt des Institute of Health New Productivity (HN240302C an H.Z.), das Disziplin Revitalisierungsprojekt der Public Health Laboratory Sciences (2023SY-04 bis H.Z.) unterstützt, West China School of Public Health/West China Fourth Hospital, Universität Sichuan.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BioNumerics (Version 7.6)Angewandte Mathematikhttps://bionumerics.software.informer.com/7.6/MLST/Serotyp-Vorhersage/phylogene Analyse
CHROMagar SalmonellaBecton, Dickinson und Co.214983Selektives Salmonella-chromogenes Medium
Fastp (Version 0.23.0)Open Sourcehttps://github.com/OpenGene/fastpLese-Qualitätskontrolle
Illumina NovaSeq 6000 SequenzierungssystemIllumina20012850Plattform zur Ganzgenomsequenzierung
M220 Fokussiert-UltraschallgeräterCovaris500295DNA-Scherung
Magbeads Fast DNA Kit für ErdeMP BiomedizinMP116560200Genomisches DNA-Extraktionskit
Microsoft Excel 2016MicrosoftKB5002794Datenmanagement
NEXTFLEX Schnelles DNA-Seq-KitRevvity50-255-1124Sequencing-Bibliotheksvorbereitung
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866DNA-Quantifizierung
Qubit dsDNA Hochsensitivitäts-Assay-KitThermo Fisher ScientificQ32851DNA-Quantifizierung
R (Version 4.1.2)R-Stiftunghttps://www.r-project.org/Statistische Berechnung
Salmonellen-Antiserum-SetStatens Serum Institut60898O/H-Antigendetektion
SeqSeroOpen Sourcehttps://github.com/denglab/SeqSeroSerotyp-Vorhersage
SeqSero2Open Sourcehttps://github.com/denglab/SeqSero2Serotyp-Vorhersage
SeqSero2SOpen Sourcehttps://github.com/denglab/SeqSero2sSerotyp-Vorhersage
SISTROpen Sourcehttps://github.com/phac-nml/sistr_cmdSerotyp-Vorhersage
SPAdes (Version 3.15.0)Open Sourcehttps://github.com/ablab/spadesGenomassemblierung
Schwarm AgarBD Biosciences211519Verwendet zur Serotypisierungsinkubation
TBS-380 FluorometerTurner BioSystemsP/N 3800-003DNA-Quantifizierung
VITEK 2 KompaktsystemBioM&eakut; Rieux95061-768Automatisiertes mikrobielles Identifikationssystem

Referenzen

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