Effiziente Produktion von chimerischen Antigenrezeptoren (CAR) T-Zellen mit Transgenen über 10 kb mittels lentiviraler Vektoren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir einen optimierten Arbeitsablauf zur Produktion von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen mit großen Transgenen von über 10 kb mittels lentiviralen Vektoren.

Zusammenfassung

Die Entwicklung mehrerer Rezeptoren in chimerische Antigenrezeptoren (CAR) T-Zellen hat sich als wirksame Strategie erwiesen, um antigennegative Rückfälle zu verhindern und On-Target/Off-Tumor-Toxizitäten zu reduzieren. Die Herstellung von Multi-Rezeptor-CAR-T-Zellen bleibt jedoch eine Herausforderung, da die Vergrößerung der lentiviralen Transgengrößen die viralen Titer und die Transduktionsraten von T-Zellen signifikant reduziert. Aktuelle Produktionsabläufe basieren oft auf Zellsortierung, um transduzierte T-Zellen aus niedrigerträglichen Produktionen anzureichern. Zellsortiertechniken erhöhen jedoch nicht die absolute Anzahl der CAR-T-Zellen und fügen dem ohnehin schon aufwendigen Herstellungsprozess keine zusätzliche Komplexität hinzu. Folglich behindern diese Einschränkungen die klinische Translation von Multirezeptor-CAR-T-Zellen und schränken die Entwicklung von Immuntherapien der nächsten Generation ein.

Hier präsentieren wir einen detaillierten, schrittweisen Produktionsablauf, der für die Erzeugung von CAR-T-Zellen mit großen lentiviralen Transgenen optimiert ist. Mit diesem Workflow zeigen wir größenabhängige Steigerungen der Transduktionseffizienz über eine Reihe von Transgengrößen hinweg, wobei die ausgeprägteste Verbesserung von bis zu 14,8-fach für einen 10,1 kb lentiviralen Vektor beobachtet wurde. Wichtig ist, dass der Workflow eine robuste T-Zell-Expansion unterstützt und die Notwendigkeit einer Zellsortierung eliminiert. Durch das Überwinden aktueller Größenbeschränkungen beim lentiviralen Gentransfer ermöglicht dieser Arbeitsablauf die effiziente Erzeugung von Multirezeptor-CAR-T-Zellen und ermöglicht so die Entwicklung fortschrittlicher Immuntherapien.

Einleitung

Chimerische Antigenrezeptorzellen (CAR) T-Zellen haben das Feld der Immuntherapie revolutioniert. Trotz ihres bemerkenswerten Erfolgs bleiben jedoch kritische Herausforderungen, darunter Immunsuppression, vermittelt durch die Tumormikroumgebung (TME), antigennegative Tumorrückfälle sowie On-Target/Off-Tumor-Toxizitäten ^1,2. Die Entwicklung von CAR-T-Zellen mit mehreren synthetischen Rezeptoren, wie dualen CARs, kombinierten CAR- und TCR-Konstrukten oder Zytokin-Schalterrezeptoren, hat das Potenzial, diese Hindernisse zu überwinden ^3,4. Bei Blutkrebs ermöglicht die Ausstattung der Effektor-T-Zellen mit doppelten CARs die gleichzeitige Zielsetzung von zwei verschiedenen Antigenen wie CD19 und CD20⁵, wodurch das Risiko eines Tumorantigenentweichens verringert wird. Bei soliden Tumoren können On-Target/Off-Tumor-Toxizitäten gemildert werden, indem z. B. synthetische Notch-(synNotch)-Rezeptorschaltkreise integriert werden, die eine logisch gesteuerte CAR-Expression ermöglichen und die Zielgenauigkeit erhöhen 6,7,8,9,10,11,12,13 . Die Produktion von CAR-T-Zellen, die mehrere Rezeptoren tragen, bleibt jedoch aufgrund der zugrundeliegenden Zunahme der Transgengröße schwierig. Selbstinaktivierende lentivirale Vektoren der dritten Generation, abgeleitet vom humanen Immundefizienzvirus (HIV) Typ 1, sind derzeit der Goldstandard für die CAR-T-Zellproduktion auf Forschungs- und klinischer^{Ebene 14}. Um CAR-T-Zellen zu erzeugen, werden lentivirale Vektoren mit individuell angepassten CAR-Expressionskassetten konstruiert, flankiert von Long Terminal Repeat (LTR)-Sequenzen, die die Integration in das T-Zell-Genom vermitteln. Die maximale effektive Verpackungskapazität (EPC) der aktuellen lentiviralen Vektoren beträgt etwa 9,2 Kilobasen (kb) LTR-zu-LTR, was der natürlichen Genomgröße von HIV-1 entspricht. Da lentivirale Titer semilogarithmisch mit zunehmender Vektorlänge¹⁵ abnehmen, reduziert die Entwicklung großer Transgene mit mehreren Rezeptoren drastisch die lentivirale Produktion und behindert letztlich die Herstellung von CAR-T-Zellen¹⁶. Während Zellsortiertechniken, wie magnetisch- oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (MACS bzw. FACS), zur Anreicherung von CAR-T-Zellen aus niedrigerträglichen Produktionen verwendet werden können, erhöhen diese Methoden nicht die absolute Anzahl der CAR-T-Zellen und fügen einem ohnehin schon aufwendigen Herstellungsprozess keine zusätzliche Komplexität hinzu. Daher bleiben die Herstellungsprobleme von CAR-T-Zellen mit großen lentiviralen Transgenen ein großes Hindernis sowohl für die präklinische Forschung als auch für die klinische Anwendung.

Wir haben kürzlich einen CAR-T-Zell-Produktionsworkflow eingerichtet, der für Effektor-T-Zellen optimiert ist, die große lentivirale Transgene tragen, wie zum Beispiel das Single-Vector-SynNotch-System¹⁷. Hier erläutern wir die Methodik in einem Schritt-für-Schritt-Protokoll, um ihre breite Einführung zu erleichtern. Als Proof of Concept zeigen wir größenabhängige Verbesserungen der Transduktionseffizienz über lentivirale Transgengrößen von 5,7 kb bis 9,2 kb und 10,1 kb. Insgesamt erhöht dieser optimierte Arbeitsablauf die Transduktionsraten um bis zu 14,8-fach, wodurch die Notwendigkeit einer Zellsortierung entfällt und die effiziente Erzeugung von Effektor-T-Zellen mit Transgengrößen über 10 kb ermöglicht wird.

Protokoll

Humane T-Zellen wurden über den Human Immunology Core der University of Pennsylvania beschafft, der nach den Prinzipien der guten Laborpraxis arbeitet und mit festgelegten Standardverfahren und/oder Protokollen für Probenentnahme, Verarbeitung, Einfrieren und Analyse arbeitet, die den Ethikrichtlinien von MIATA und der University of Pennsylvania entsprechen.

HINWEIS: Ein schematischer Überblick über den optimierten Arbeitsablauf für die Lentivirus- und CAR-T-Zellproduktion ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein Vergleich der wichtigsten Optimierungsschritte mit dem aktuellen Standardworkflow ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Alle Zellkulturen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %_CO2 unter Verwendung von T-Zell-Medium (TCM) gehalten, bestehend aus RPMI-1640, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), 10 mM HEPES-Puffer, 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin (siehe Materialtabelle), 100 U/mL Penicillin und 100 U/mL Streptomycin.

Abbildung 1: Optimierter Arbeitsablauf für die Lentivirus- und CAR-T-Zellproduktion mit großen Transgene. Schematische Darstellung der Lentivirusproduktion (oben) und der CAR-T-Zellgenerierung (unten), wobei wichtige Schritte und Optimierungen hervorgehoben werden, die virale Titer und Transduktionseffizienz verbessern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

		Standard-Arbeitsablauf	Optimierter Arbeitsablauf
Virus	Virale Hülle	VSV-G	Cocal-G
	Transfektion	L2000	L30001
	LV-Ernte	24 Stunden2 + 48 Stunden2	30-36 H3
T-Zelle	Schiff	T25-Flasche	96-Bohrloch-flache Bodenplatte
	Oberflächen-Volumen-Verhältnis	Variable	5,12 cm2/mL4
	Adjuvans	Nichts	SF1085
13 μL L3000 pro 1 μg DNA, kein Medienwechsel
2Zentrifugationen bei 106.800 x g für 2,5 Stunden, rundes Rohr am Boden
3-Zentrifugationbei 12.300 x g über Nacht, konisches Rohr am Boden
4zusätzliche Medienergänzungen nach der Transduktion
555 μg/mL

Tabelle 1: Vergleich von Standard- und optimierten Arbeitsabläufen. Wichtige Optimierungen des verbesserten Arbeitsablaufs im Vergleich zum aktuellen Standard-Arbeitsablauf. Diese Tabelle wurde mit Genehmigung von Rommel et ^al.17 angepasst.

1. Lentivirus-Produktion

1. Pflege der HEK293T Zellen
   1. Stellen Sie sicher, dass HEK293T Zellen gleichmäßig verteilt, frei von Klumpen und bei 50–70 % Konfluenz liegen (typische Ausbeute: 1,0–1,5 × 10^{7 Zellen pro} T150-Kolben).
   2. Aspirieren Sie das Supernatant, geben Sie 20 ml Raumtemperatur-PBS (RT) an die Oberseite des Kolbens, um das Lösen der Zellen zu vermeiden, schwenken Sie PBS sanft über die Zellen und aspirieren Sie die Wasch.
   3. Füge 3 ml 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubiere 15-30 Sekunden bei RT, während du die Flasche von Seite zu Seite kippst. Überwachen Sie die Zellabtrennung.
   4. Fügen Sie 7 ml kaltes TCM hinzu, suspendieren Sie die Zellen am Boden des Kolbens, um eine Einzelzellensuspension zu erzeugen, und übertragen Sie sie in ein 50-mL-Rohr. Wasche den Kolben mit 10-20 ml kaltem TCM und gib den Waschfluss in denselben Tube.
   5. Zentrifugieren Sie die Zellen (300 × g, 5 min, 4 °C), aspirieren Sie das Supernatant, suspendieren Sie sie in 10 mL TCM und zählen Sie die Zellen.
   6. Plattieren Sie HEK293T Zellen in T150-Kolben mit 3 × 10^{6 Zellen pro} Flasche zum Passaging alle 2 Tage (z. B. Montag und Mittwoch) oder bei 1 × 10^{6 Zellen pro} Kolben zum Passieren alle 3 Tage (z. B. Anrichten am Freitag zum Passieren am Wochenende) mit 30 ml TCM, vorgewärmt auf 37 °C.
2. Transfektion von HEK293T Zellen zur Lentivirusproduktion
   HINWEIS: Führen Sie ein kleines Pilotexperiment durch, um die Aussaatdichte zu bestimmen, die nach 2 Tagen konstant 70–80 % Konfluenz ergibt. Stellen Sie sicher, dass HEK293T Zellkonfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion 80 % nicht überschreitet (siehe Diskussion). Die Transfektion wurde mit reduzierten serumreduzierten minimal essentiellen Mediums und kommerziellen Lipofektionsreagenzien optimiert (L3000 und P3000, siehe Materialtabelle).
   1. Entnehmen Sie HEK293T Zellen mittels Trypsinisierung wie oben beschrieben und Platte 4 × 10^{6 Zellen pro} T150-Kolben mit 30 ml TCM, vorgeheizt auf 37 °C.
   2. Nach 2 Tagen sollte man bestätigen, dass die Kulturen gleichmäßig verteilt sind und 70–80 % zusammenfließen.
   3. Erwärme 50 ml reduziertes Serum, minimal essentielles Medium bis RT. Taue lentivirale Plasmide, mische sanft und drehe es schnell durch. Pulswirbel-Lipofektionsreagenzien verwenden, kurz schleudern und sie bei RT lassen.
   4. Bereite DNA-Master-Mixe vor. Für jeden Kolben wird in folgender Reihenfolge kombiniert: 2 ml reduziertes Serum-Minimal-essentielles Medium, 39 μg lentivirale Verpackungsplasmide (18 μg pTRP Gag-Pol, 18 μg pTRP RSV-Rev, 3 μg pTRP Cocal-G), 15 μg Transferplasmid und 108 μL P3000-Reagenz (2 μL P3000/μg DNA). Skalieren Sie bei Bedarf auf und erhöhen Sie die Endbeträge um mindestens 10 %, um den Pipettverlust zu berücksichtigen. Pulswirbel, schneller Dreh und Lagerung bei RT.
   5. Bereite L3000-Mastermixe vor. Für jeden Kolben wird in folgender Reihenfolge kombiniert: 1,84 ml minimal-essentielles Medium mit reduziertem Serum und 162 μL L3000 (3 μL L3000/μg DNA). Skalieren Sie bei Bedarf auf und erhöhen Sie die Endbeträge um mindestens 10 %, um den Pipettverlust zu berücksichtigen. Pulsvortex, schneller Spin und 5 Minuten im RT inkubieren.
   6. Nach 5 Minuten gibt man pro Flasche 2 ml L3000-Mastermischung zur entsprechenden DNA-Mastermischung, um eine ungefähre Verdünnung von 1:2 zu erreichen. Fügen Sie das L3000-Gemisch langsam vom Boden des Röhrchens hinzu, ohne die Seiten zu berühren. Gründlich durch Pipetteren mischen und 15 Minuten bei RT inkubieren.
   7. Entfernen Sie währenddessen vorsichtig 6 ml Supernatant aus jeder HEK293T Kultur und beschriften Sie jede Flasche.
   8. Nach 15 Minuten transfectieren Sie jede Kultur, indem Sie den Kolben nach oben kippen und langsam 4 ml Transfektionsmischung in das Überlagerungsmittel auf der Oberseite des Kolbens freisetzen, um ein Lösen der Zellen zu vermeiden. Langsam zweimal hoch- und runterpipetten, den Kolben wieder an seine ursprüngliche Position bringen, vorsichtig kreisen, ihn zurück in den Inkubator legen und die Zeit notieren.
      HINWEIS: Kulturen sollten bis zur Lentivirus-Ernte ungestört bleiben. Im Gegensatz zur Empfehlung des Herstellers, das HEK293T Überstandsmittel mit dem L3000-Transfektionsgemisch nach Transfektion¹⁸ durch frisches Kulturmedium zu ersetzen, bewahren die höheren lentiviralen Titer¹⁷.
3. Ernte, Konzentration und Einfrieren lentiviraler Supernatanten
   HINWEIS: Lagern Sie lentivirale Supernatanten während aller Verarbeitungsschritte auf Eis oder bei 4 °C, um den Abbau zu verhindern.
   VORSICHT: Lentivirale Vektoren werden als infektiöse Materialien klassifiziert. Beachten Sie die entsprechenden Biosicherheitsvorkehrungen, einschließlich der Verwendung persönlicher Schutzausrüstung (z. B. Doppelhandschuhe, Einweg-Laborkittel). Dekontaminieren Sie alle Arbeitsflächen mit 10 % Bleichmittel, gefolgt von 70 % Ethanol. Desinfizieren Sie kontaminierte Verbrauchsgüter und flüssige Abfälle mit 10 % Bleichmittel vor der Entsorgung als biologisch gefährlicher Abfall gemäß den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien.
   1. Reinigen Sie Ultrazentrifugengeräte (Eimer, konische Röhrchen und konische Adapter) mit 10%-Bleichmittel und spülen Sie sie dann mit Wasser ab. Kurz an der Luft trocknen, anschließend mit 70 % Ethanol sprühen und unter einer Gewebekulturhaube an der Luft trocknen.
   2. Vorkühlen Sie die Ultrazentrifuge mit dem eingesetzten Rotor auf 4 °C.
   3. Entnehmen Sie lentivirale Supernatanten 30–36 Stunden nach der Transfektion, indem Sie sie in 50-ml-Röhrchen übertragen. Klären Sie Supernatanten durch Zentrifugation (500 × g, 5 min, 4 °C), filtern Sie durch einen 0,45 μm Porenfilter und lagern Sie sie auf Eis.
   4. Stecken Sie konische Adapter in die Eimer, übertragen Sie die gefilterten Supernatanten in konische Ultrazentrifugenröhren und laden Sie sie in die Eimer. Balancieren Sie gegenüberliegende Eimer mit kalter TCM, wobei die Gewichtsunterschiede unter 0,1 g liegen.
   5. Konzentration von Supernatanten durch Ultrazentrifugation bei 12.300 × g über Nacht bei 4 °C.
   6. Am nächsten Morgen nehmen Sie die Eimer vorsichtig heraus und legen Sie sie auf Eis.
   7. Bereite eine Box mit Trockeneis zum Einfrieren und beschrifteten Kryovials zum Aliquotieren vor.
   8. Unter einer Gewebekulturhaube öffnen Sie jeden Eimer und entfernen Sie das Ultrazentrifugenrohr darin mit einer Pinzette. Für jede Röhre gehen Sie wie folgt vor:
   9. Saugen Sie das Supernatant vorsichtig bis 0,5 Zoll vom Rohrboden ab und übergeben Sie die restliche Flüssigkeit in eine 6-Well-Platte. Klopfen Sie vorsichtig auf den Schlauch, um etwas von der Restflüssigkeit zu entfernen.
   10. Fügen Sie 300 μL kaltes TCM hinzu, suspendieren Sie vorsichtig 30 Sekunden und übertragen Sie die Suspension in eine Kryoviale.
   11. Wasche den Schlauch mit 200 μL kaltem TCM und gib die Spülung in dasselbe Kryovial.
   12. Sanft mischen und aliquotieren Sie 60 μL zur Lentivirus-Titerung (siehe Schritt 1.4), mehrere 100-μL-Aliquoten für die CAR-T-Zellproduktion und ein zusätzliches Rohr, wobei das restliche Volumen übrig bleibt. Sofort die Aliquots auf Trockeneis einfrieren. Transferiere Aliquots auf -80 °C für die Langzeitlagerung.
4. Titerung des konzentrierten Lentivirus mit primären T-Zellen.
   HINWEIS: Ungefähr 1 × 10⁵ T-Zellen werden per Verdünnung per Lentivirus benötigt. Zum Beispiel benötigen sechs Lentiviren mit jeweils acht Verdünnungen: 6 × 8 × 1 × 10⁵ = 4,8 × 10⁶ T-Zellen. Zusätzliche Zellen sollten vorbereitet werden, um den Pipetterverlust zu berücksichtigen. T-Zellen werden mit magnetischen Aktivierungsperlen stimuliert, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind (siehe Materialtabelle).
   1. T-Zell-Aktivierung (Tag 0)
      1. Voraussetzung: Halten Sie gereinigte menschliche CD4⁺ - und CD8⁺ T-Zellen in der TCM bereit.
      2. Zähle CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen und kombiniere sie im Verhältnis 1:1.
      3. Waschen Sie die Aktivierungsperlen wie folgt: Geben Sie 1 ml TCM in ein Rohr, suspendieren Sie die Perlen durch Vortexen wieder und übertragen Sie die erforderliche Menge, um ein Verhältnis von 3:1 von Perlen zu T-Zellen zu erreichen. Stellen Sie das Rohr in einen magnetischen Stand und lassen Sie die Perlen entlang der Röhrenwand zu einem Pellet formen. Nach 30 Sekunden wird das Überlagerungsmittel vorsichtig aspiriert, das Rohr vom magnetischen Stand entfernt und die Perlen in 1 ml TCM wieder aufgehängt. Wiederhole das Spülen noch zweimal.
      4. Aktivierende Perlen zu den T-Zellen hinzufügen und die Endkonzentration auf 1 × 10⁶ Zellen/mL anpassen, wobei das TCM vorgewärmt auf 37 °C vorgewärmt ist.
      5. Gut mischen und die Suspension in ein Reagenzreservoir übergeben. Plattenzellen in 96-Bohrlochplatten mit flachem Boden und 100 μL TCM pro Bohrloch unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. Alle 1-2 Minuten gründlich mischen, um ein Setzen der Perlen zu verhindern.
   2. T-Zell-Transduktion (Tag 1)
      HINWEIS: Für Lentiviren mit großen Transgenen (z. B. 9 kb LTR-zu-LTR) bereiten Sie 6 Bedingungen mit 1:2 seriellen Verdünnungen vor (unverdünnt, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Für Lentiviren mit kleineren Transgenen (z. B. 7 kb LTR-zu-LTR) sind 8 Bedingungen mit 1:4 seriellen Verdünnungen erforderlich. Verwenden Sie verbleibende Brunnen als untransduzierte (UTD) Kontrollen.
      1. Taue 60 μL jedes konzentrierten Lentivirus bei RT auf und lagere es auf Eis.
      2. Bereite eine Verdünnungsserie in einer 96-Wellen-Platte mit rundem Boden vor: Gib 60 μL Lentivirus in die oberste Reihe, 30 μL kaltes TCM in jede darunterliegende Reihe, übertrage 30 μL von der oberen in die zweite Reihe und mische (1:2 Verdünnung), transferiere 30 μL von der zweiten in die dritte Reihe und mische (1:4 Verdünnung). Fahren Sie fort, bis insgesamt sechs Bedingungen vorbereitet sind (unverdünnt, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Verwenden Sie sofort für die Transduktion.
      3. Zwischen 23 und 26 Stunden nach der Perlenstimulation werden T-Zellen mit 25 μL pro Lentivirus-Brunnen von der Verdünnungsplatte mit einer Mehrkanalpipette transduziert. Fügen Sie 25 μL TCM zu UTD-Kontrollbrunnen hinzu.
   3. T-Zell-Ernährung (Tag 3)
      1. Geben Sie vorsichtig 125 μL TCM, das auf 37 °C vorgewärmt ist, mit einer Mehrkanalpipette zu jedem Bohrloch.
   4. T-Zell-Debeadierung und Durchflusszytometrie-Analyse (Tag 5)
      1. Bereiten Sie für jede Bedingung drei Sätze von 1,5-ml-Schraubverschlussrohren vor und entfernen Sie die Deckel. Stellen Sie zwei der drei Sets in einen magnetischen Ständer.
      2. Jedes Bohrloch wird wieder aufgehoben und die Zellen in die erste Röhrengruppe übertragen, damit die Perlen sich entlang der Rohrwand zu einem Pellet bilden können. Nach 30 Sekunden werden die Supernatanten vorsichtig in die zweite Röhrengruppe übertragen. Warte 30 Sekunden (die Perlen sollten nicht mehr sichtbar sein), dann übertrage die Supernatanten in den dritten Satz Röhrchen und lagere sie auf Eis.
      3. Färbe T-Zellen für den passenden Transduktionsmarker (z. B. Anti-CD19 CAR oder Anti-HER2 SynNotch) mit Antikörpern (siehe Materialtabelle) und analysiere die Markerexpression mittels Durchflusszytometrie.
      4. Identifizieren Sie Bedingungen mit Transduktionsraten unter 30 %, die ungefähr dem linearen Bereich zwischen Virusvolumen und Transduktionsrate entsprechen.
      5. Berechnen Sie lentivirale Titer mit folgender Formel:
         Titer (TU/mL) = (Anfangszahl der T-Zellen x Prozentsatz der transduzierten Zellen x Verdünnungsfaktor)/Virusvolumen (mL)
         z. B. 20%-CAR-Expression mit einer 1:32-Verdünnung des lentiviralen Stocks:
         (100.000 Zellen x 0,2 x 32) / (0,025 mL) = 2,56 × 10⁷ TU/mL

2. CAR-T-Zellenproduktion

HINWEIS: Typische Anfangsmengen für die CAR-T-Zellproduktion liegen bei 1–5 × 10 6-T-Zellen pro Gruppe. Erhöhen Sie die Anzahl der Zellen in der UTD-Kontrollgruppe um 50 %, da diese Gruppe auch zur Normalisierung von Transduktionsniveaus in nachgelagerten Experimenten verwendet wird. Erwarten Sie während der Expansion eine Bevölkerungsverdoppelung von 5 bis 6 Jahren. Die T-Zell-Transduktion wurde mit einem Blockcopolymer als Verstärker optimiert (siehe Materialtabelle) und mit spezifischen Oberflächen-zu-Volumen-Kulturverhältnissen in 96-Well-Flachbodenplatten¹⁷.

1. Herstellung einer 100 mg/mL Enhancer-Stocklösung
   1. Gib 5 g Copolymer-Enhancer in eine Plastikflasche und dann 45 ml ultrareines Wasser. Über Nacht bei RT umrühren.
   2. Übertragen Sie die Lösung in einen abgestuften Zylinder und stellen Sie das Volumen mit ultrareinem Wasser auf 50 ml ein.
   3. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 μm Porenfilter und lagern Sie sie bei 4 °C.
2. T-Zell-Aktivierung (Tag 0)
   1. Voraussetzung: Halten Sie gereinigte menschliche CD4⁺ - und CD8⁺ T-Zellen in der TCM bereit.
   2. Zähle CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen und kombiniere sie im Verhältnis 1:1.
   3. Wasch-Aktivierungsperlen wie folgt.
      1. Gib 1 ml TCM in ein Rohr, suspendiere die Perlen durch Vortex wieder und übertrage die benötigte Menge, um ein Verhältnis von 3 zu 1 von Perlen-zu-T-Zellen zu erreichen. Stellen Sie das Rohr in einen magnetischen Stand und lassen Sie die Perlen entlang der Röhrenwand zu einem Pellet formen.
      2. Nach 30 Sekunden wird das Überlagerungsmittel vorsichtig aspiriert, das Rohr vom magnetischen Stand entfernt und die Perlen in 1 ml TCM wieder aufgehängt. Wiederhole das Spülen noch zweimal.
   4. Aktivierende Perlen zu den T-Zellen hinzufügen und die Endkonzentration auf 1 × 10⁶ Zellen/ml anpassen, wobei das TCM auf 37 °C vorgewärmt ist.
   5. Gut mischen und die Suspension in ein Reagenzreservoir übergeben. Plattenzellen in 96-Bohrlochplatten mit flachem Boden und 50 μL TCM pro Bohrloch unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. Alle 1-2 Minuten gründlich mischen, um ein Setzen der Perlen zu verhindern.
3. T-Zell-Transduktion (Tag 1)
   HINWEIS: Wählen Sie die Lentivirusmengen basierend auf den Ergebnissen der vorherigen Titration aus, um sicherzustellen, dass die Endtransduktionswerte zwischen den Gruppen vergleichbar sind (typischerweise zwischen 20 % und 30 %). Um mehrere lentivirale Integrationen zu vermeiden, sollten die maximalen Transduktionsniveaus ≤ 30 % bleiben. Lentiviren mit großen Transgenen benötigen in der Regel entweder ein unverdünntes Virus oder eine Verdünnung von 1:4 bis 1:8. Passen Sie die Gruppengrößen an, um Lentivirus-Reste zu vermeiden, da jeder Gefrier-Tau-Zyklus die lentiviralen Titer reduziert. Verwenden Sie sofort nach der Zubereitung lentivirale Mastermischungen.
   1. Tauen Sie die erforderlichen Mengen konzentrierten Lentivirus bei RT auf und lagern Sie sie auf Eis.
   2. Bereiten Sie einen 2 mg/mL Enhancer in kaltem TCM vor, indem Sie z. B. 100 μL Enhancer (100 mg/mL Lager) mit 4,9 mL TCM mischen.
   3. Bereite Lentivirus-Mastermischungen basierend auf den Titrationsergebnissen vor und gib Enhancer auf eine Endkonzentration von 275 μg/mL hinzu. Erhöhen Sie die Endvolumen um mindestens 10 %, um den Pipettverlust zu berücksichtigen. Zum Beispiel um eine 1:16-Verdünnung mit 100 Bohrlöchern zu erreichen:
      Gesamtvolumen: 100 Bohrlöcher × 12,5 μL Lentivirus × 110 % = 1.375 μL
      1:16 Verdünnung: 1.375 μL/ 16 = 85,9 μL Lentivirus
      Verstärker: 189 μL (275 μg/mL final)
      Endgültige Mastermischung: 1.100 μL TCM + 85,9 μL Lentivirus + 189 μL Enhancer = 1.375 μL
   4. Zwischen 23 und 26 Stunden nach der Perlenstimulation werden T-Zellen mit 12,5 μL pro Bohrloch des Lentivirus-Master-Mix mit einer Mehrkanalpipette transduziert, was zu einer Endkonzentration des Enhancers von 55 μg/mL führt. Fügen Sie 12,5 μL TCM zu UTD-Kontrollbrunnen hinzu.
4. T-Zell-Ernährung (Tag 3)
   1. Geben Sie vorsichtig 125 μL TCM, das auf 37 °C vorgewärmt ist, mit einer Mehrkanalpipette zu jedem Bohrloch.
5. T-Zell-Abplatzung (Tag 5)
   HINWEIS: Bereiten Sie für jede Kultur ein steriles Reservoir und drei Sätze von 50-mL-Röhrchen vor. Begrenzen Sie das gesamte Waschvolumen auf ≤ 20 % des T-Zellkulturvolumens, um zu vermeiden, dass Zellen unter 8 × 105^Zellen /ml verdünnt werden.
   1. Jede Kultur wird mit einer Mehrkanal-Pipette in ein steriles Reservoir gelegt, die Originalplatten mit TCM gewaschen und die Spülung dem Reservoir hinzugefügt. Übertragen Sie jede Zellsuspension auf den ersten Satz von 50-mL-Röhren.
   2. Setzen Sie die Röhren in einen magnetischen Halter, damit die Perlen eine Kugel entlang der Rohrwand bilden können. Nach 30 Sekunden überträgt man die Überstandsmittel vorsichtig auf den zweiten Röhrensatz und legt sie in den magnetischen Halter. Warte 30 Sekunden (Perlen sollten nicht mehr sichtbar sein), dann übertrage die Überlagerungsmittel in die dritte Röhrengruppe und lagere sie im Inkubator.
   3. Zählen Sie jede Kultur und normalisieren Sie auf 8 × 10⁵ Zellen/ml mit TCM vorgewärmt auf 37 °C. Je nach Endvolumen im entsprechenden Kulturgefäß (Tabelle 2) verplatte (Tabelle 2).
   4. Lassen Sie die T-Zellen einen Tag ruhen und beginnen Sie ab Tag 7 mit täglichen Fütterungen (siehe nächsten Schritt).
6. T-Zell-Ernährung (Tag 7 und täglich danach)
   HINWEIS: T-Zellen verdoppeln sich etwa alle 24–36 Stunden und durchlaufen 5–7 Populationsverdoppelungen, bevor sie rasten. Überwachen Sie T-Zellvolumina mit einem elektrisch impedanzbasierten Zellzähler (siehe Materialtabelle), um den optimalen Zeitpunkt für die Kryokonservierung zu bestimmen.
   1. Sammelt jede Kultur, mischt gut und zählt die Zellen.
   2. Normalisieren Sie jede Kultur auf 8 × 10⁵ Zellen/mL mit TCM vorgewärmt auf 37 °C und verplatten Sie sie erneut im entsprechenden Kulturgefäß (Tabelle 2).
   3. Weiter expandieren, bis das mittlere Zellvolumen unter 320 μm³ fällt, dann zum Kryoreservierungsschritt übergehen.
7. Validierung der T-Zell-Transduktion mittels Durchflusszytometrie
   HINWEIS: Die T-Zell-Transduktion kann jederzeit zwischen Tag 5 und dem Tag der Kryokonservierung beurteilt werden. Die Expressionswerte sinken im Verlauf der Expansion, sodass eine frühe Messung eine klare Trennung von negativen und positiven Fraktionen während der Flowzytometrieanalyse sicherstellt.
   1. Entnehmen Sie 2 × 10 5-T-Zellen aus jeder Kultur.
   2. Färbe T-Zellen für den passenden Transduktionsmarker (z. B. Anti-CD19 CAR oder Anti-HER2-SynNotch) mit Antikörpern (siehe Materialtabelle) und analysiere die Markerexpression mittels Durchflusszytometrie
8. T-Zell-Kryokonservierung (typischerweise zwischen Tag 10 und 12)
   HINWEIS: Cryopreserveerte erweiterte T-Zellen direkt vor oder nach ihrem Ruhezustand, um die Lebensfähigkeit während des Auftauens zu verbessern. Ein mittleres Volumen von 320 μm³ kann als Grenze für die Kryokonservierung dienen. Sobald das Zellvolumen unter 300 μm³ sinkt, hören die T-Zellen auf sich zu teilen, und ihre Gesamtzahl beginnt zu sinken. Stellen Sie sicher, dass alle Gruppen zum Zeitpunkt der Kryokonservierung vergleichbare Mengen besitzen, was für einige Gruppen einen zusätzlichen Kulturtag erfordern kann. Kühlen Sie Zellen mit einer konstanten Geschwindigkeit von -1 °C pro Minute mit geeigneten Gefrierbehältern (z. B. alkoholfreie Zellgefrierbehälter, siehe Materialtabelle).
   1. Jede Kultur wird in einem geeigneten Rohr (z. B. 500 ml) zusammengefasst, die Zellen gezählt und im Inkubator gelagert.
   2. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und die gewünschten Aliquot-Mengen.
   3. Zentrifugenzellen (300 × g, 10 min, 4 °C) aspirieren die Supernatanten und suspendieren jede Kultur in einem Gefriermedium mit 50 % serumfreiem Medien, 40 % wärmeinaktiviertem FBS und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 2 × 10^{7 Zellen} /mL (siehe Materialtabelle).
   4. Aliquot-Zellen in Kryoviale (250 μL bis 1 mL, entsprechend 5–20 × 10^{6 Zellen pro} Fläschchen). Stellen Sie die Kryoviale in einen Zellgefrierbehälter und lagern Sie sie über Nacht bei -80 °C.
   5. Übertragen Sie die Kryoviale in flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung.
9. T-Zell-Auftauen
   HINWEIS: Für jede T-Zellgruppe bereiten Sie ein Rohr mit 50 ml TCM vor, das auf 37 °C vorgewärmt ist, um das DMSO im Gefriermedium nach dem Auftauen zu verdünnen. Erwärme zusätzliches TCM zum Anrichten.
   1. Tauen Sie Kryoviale schnell bei 37 °C in einem Wasserbad oder unter fließendem warmem Wasser auf.
   2. Sobald die Flüssigkeit sichtbar ist, gehen Sie zu einer Gewebekulturhaube, fügen Sie 500 μL vorgewärmtes TCM hinzu, mischen Sie vorsichtig und übertragen Sie die Zellen in die vorbereiteten Röhren mit 50 mL TCM.
   3. Waschen Sie das Cryovial mit 500 μL TCM und geben Sie das Wash in dasselbe Rohr.
   4. Inkubiere die Zellen 10 Minuten bei RT.
   5. Zentrifugenzellen (300 × g, 10 min, Raumtemperatur) aspirieren die Supernatanten und suspendieren die Zellen bei 4 × 10⁶ Zellen/ml neu.
   6. Plattieren Sie die Zellen im entsprechenden Kulturgefäß (Tabelle 2).
   7. Lassen Sie die Zellen über Nacht im Inkubator ruhen, bevor Sie mit den nachgelagerten Experimenten fortfahren.

Schiff	Minimales Volumen	Maximales Volumen
96-Brunnen	0,1 mL/Bohrloch*	0,25 mL/Bohrung
48-Brunnen	0,2 mL/Bohrloch	1 mL/Brunnen
24-Brunnen	0,5 mL/Bohrloch	2 mL/Brunnen
12-Brunnen	1 mL/Brunnen	4 mL/Brunnen
6-Well	2 mL/Brunnen	6 mL/Brunnen
T25 (horizontal)	3 mL	8 mL
T75 (horizontal)	8 mL	20 mL
T150 (horizontal)	20 mL	60 mL
* Das Kulturvolumen wird vorübergehend auf 50 μL/Bohrloch reduziert, um die Transduktion der T-Zelle zu verbessern

Tabelle 2: Empfohlene Kulturmedienmengen für CAR-T-Zellerweiterungen. Minimale und maximale Kulturmedienvolumen über häufig verwendete Gefäßformate während der T-Zell-Expansion.

Ergebnisse

Um die mit dem optimierten Arbeitsablauf erzielten Verbesserungen (Abbildung 1) über eine breite Palette von Transgengrößen hinweg zu demonstrieren, wählten wir drei lentivirale Vektorgrößen aus: 5,7 kb (CD19 CAR), 9,2 kb (HER2-MSLN svsNotch) und 10,1 kb (HER2-MSLN-CBG svsNotch) (Abbildung 2A). Lentiviren wurden entweder unter Standard- oder optimierten Bedingungen produziert (Abbildung 2B: std vs. opt und Tabelle 1).

Für den kleinsten Vektor mit 5,7 kb wurde in einer Produktionscharge nur eine moderate Verbesserung der T-Zell-Transduktion beobachtet (Abbildung 2B: oben, 73 % gegenüber 88 % bei unverdünntem Virus). Konsequent stiegen die lentiviralen Titer nur moderat um etwa 1,5-fach an (Abbildung 2C: oben, 2,86 × 10⁸ TU/mL vs. 4,35 × 10⁸ TU/mL). Im Gegensatz dazu zeigte der 9,2-kb-Vektor eine deutlich verbesserte Leistung, wobei die maximalen T-Zell-Transduktionsraten je nach Charge um etwa 5,4- oder 3,8-fach anstiegen (Abbildung 2B: mittler, 8,3%/16,6% vs. 45,1%/63,1% bei unverdünntem Virus) und die funktionellen Titer sich etwa um das 3,3-fache verbesserten (Abbildung 2C: mittler; 3,1 × 10⁶ TU/mL vs. 10,1 × 10⁶ TU/mL). Der stärkste Effekt wurde beim 10,1-kb-Vektor beobachtet, bei dem die Transduktionsraten um etwa das 12,4- oder 9,8-fache anstiegen (Abbildung 2B: unten, 1,4%/1,5% gegenüber 17,3%/14,7% bei unverdünntem Virus) und die funktionellen Titer sich etwa um das Zehnfache verbesserten (Abbildung 2C: unten, 0,24 × 10⁶ TU/mL vs. 2,41 × 10⁶ TU/mL).

Anschließend wurden T-Zellen gesunder Spender mit lentiviralen Vektoren transduziert, die unter standardisierten oder optimierten Bedingungen produziert wurden, unter den entsprechenden Arbeitsabläufen (Abbildung 3 und Tabelle 1). Um die Transduktionseffizienzen zu vergleichen, wurden in jedem Workflow gleiche Mengen Lentivirus verwendet, und die Virusdosis wurde so angepasst, dass die Transduktionsraten bei oder unter 30 % gehalten wurden, um mehrere Integrationsereignisse zu verhindern. Im Vergleich zu T-Zellen, die unter Standardbedingungen und mit Standardlentivirusproduktion transduziert wurden, erhöhte sich die Transduktion im Durchschnitt um 5,1-fach für den 5,7-kb-Vektor, 13,3-fach für den 9,2-kb-Vektor und um 14,8-fach für den 10,1-kb-Vektor (Abbildung 3A und ergänzende Tabelle 1). Ausgewählte T-Zellkulturen, die mit dem optimierten Workflow erzeugt wurden, wurden weiter erweitert, bis sie einen Ruhezustand erreichten (Abbildung 3B,C). Die Bevölkerungsverdoppelung lag zwischen 5,3 und 6,7, abhängig vom T-Zellspender (Abbildung 3B). Tägliche Messungen des T-Zellvolumens zeigten nur minimale Zellreste, was auf keine Anzeichen von Toxizität während der Expansion hindeutet. Vor der Kryokonservierung wurden Transduktionsraten durch Färben auf die Expression des CAR/synNotch-Rezeptors oder durch Messung der mTag-BFP2-19-Fluoreszenz bewertet (Abbildung 3C und ergänzende Abbildung 1). Die Transduktionsraten betrugen 31,2 % für den 5,7 kb Vektor (schwarz; 1:512 Lentivirus-Verdünnung), 29,8 % für den 9,2 kb Vektor (rot; 1:16 Lentivirus-Verdünnung) und 20,2 % für den 10,1 kb Vektor (blau; 1:4 Lentivirus-Verdünnung). Weitere funktionale Daten, die die Leistung der generierten svsNotch T-Zellen und CAR-T-Zellen validieren, werden in unserer Begleitstudie¹⁷ präsentiert. Wichtig ist, dass Effektor-T-Zellen, die mit dem optimierten Protokoll erzeugt wurden, keine Unterschiede bei Populationsverdopplungen oder T-Zell-Phänotyp im Vergleich zu denen mit dem^{Standard-Workflow 17} erzeugten Zellen aufwiesen.

Abbildung 2: Lentivirusproduktion folgt standardisierten und optimierten Arbeitsabläufen. (A) Schematische Übersicht der lentiviralen Vektoren mit entsprechenden Transgengrößen¹⁷. Oben: Ein CAR gegen CD19 (CD19 CAR) wird durch den humanen Elongation Factor 1 Alpha (EF1α)-Promotor exprimiert, mit einer Gesamtgröße des Transgens von etwa 5,7 kb. Mitte und unten: Ein HER2-SynNotch-Rezeptor wird entweder mit einem blau-fluoreszierenden Reporterprotein (BFP2) (in der Mitte) oder einem Klickkäfer-grünen Luciferase (CBG) (unten) über ein 2A-selbstspaltendes Peptid (P2A) vom EF1α-Promotor mitexprimiert. Die Expression eines mesothelin (MSLN)-zielenden CAR (MSLN CAR) wird von einem GAL4-spezifischen minimalen Cytomegalovirus-(CMV)-Promotor (GAL4-CMV) gesteuert. Die Gesamtgröße des Transgens beträgt etwa 9,2 kb für das HER2-MSLN svsNotch (mittler) und 10,1 kb für das HER2-MSLN-CBG svsNotch (unten). SIN = selbstinaktivierender Vektor; LTR = lange terminale Wiederholungssequenz. (B) Transduktion von T-Zellen mit seriellen Verdünnungen von Lentiviren, die unter Standardbedingungen (STD) und optimierten (opt) Bedingungen unter Verwendung der in (A) beschriebenen Vektoren erzeugt werden. Zwei unabhängige Produktionen (Kreise und Dreiecke) pro Vektor mit jeweils zwei Chargen und zwei verschiedene T-Zell-Spender pro Charge. Transduktionsraten wurden über T-Zellspender hinweg gemittelt. (C) Funktionale Titer der Standard- (STD, offene Kreise) und optimierten (opt, geschlossene Kreise) Virusproduktionen, wie in (B) gezeigt. Die Daten wurden aus zwei unabhängigen Lentivirus-Produktionen generiert, jeweils mit zwei Chargen und jeweils zwei verschiedenen T-Zell-Spendern pro Charge. Alle Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD an. Die statistische Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen gepaarten T-Test berechnet. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Rommel et ^al.17 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: CAR-T-Zellenproduktion mit standardisierten und optimierten Arbeitsabläufen. (A) Faltungserhöhung der T-Zellen-Transduktionsraten mit dem optimierten (opt) Workflow im Vergleich zum Standard-(standard-)Workflow (siehe auch Tabelle S1). Daten wurden aus zwei oder drei unabhängigen T-Zell-Erweiterungen gewonnen, wobei unterschiedliche Spender und zwei unabhängige Lentivirus-Produktionen verwendet wurden. (B) Populationsverdopplungen von T-Zell-Erweiterungen, die mit dem optimierten Workflow erzeugt werden. Für jeden Vektor werden zwei unabhängige T-Zell-Erweiterungen von unterschiedlichen normalen Spendern (ND) gezeigt, die jeweils eine separate Lentivirusproduktion verwenden. (C) Durchflusszytometriediagramme, die die Expression von CAR, BFP2 und synNotch-Rezeptoren in expandierten Effektor-T-Zellen am Tag 7 (10,1 kb) oder Tag 10 (5,7 kb und 9,2 kb) zeigen (siehe auch ergänzende Abbildung 1). Alle Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD an. Die statistische Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen gepaarten T-Test berechnet. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Rommel et ^al.17 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Gating-Strategie zur Bewertung der Expression von CAR, SynNotch-Rezeptor und BFP2, bezogen auf Abbildung 3C. Repräsentative Flowzytometriediagramme, die die Gating-Strategie zeigen, die zur Bestimmung von CAR, SynNotch und BFP2-Expression in expandierten T-Zellkulturen verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Transduktionsraten über einzelne T-Zell-Expansionen, bezogen auf Abbildung 3A. Transduktionsraten der T-Zell-Erweiterungen, die mit den standardisierten und optimierten Arbeitsabläufen erzeugt wurden. Diese Tabelle wurde mit Genehmigung von Rommel et ^al.17 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, das einen optimierten Produktionsablauf für CAR-T-Zellen mit großen lentiviralen Transgene, wie svsNotch T-Zellen, beschreibt. Dieser Arbeitsablauf eliminiert die Notwendigkeit einer Zellsortierung und ermöglicht die effiziente Erzeugung von Effektor-T-Zellen, die große lentivirale Transgene tragen. Mit diesem Workflow produzieren wir routinemäßig Effektor-T-Zellen mit lentiviralen Transgenen von 9–10 kb und maximalen Transduktionsraten von 60–70 % (9 kb) oder 15–20 % (10 kb).

Bei der Fehlersuche bei niedrigen viralen Titern oder Transduktionsraten sollten mehrere Schlüsselfaktoren berücksichtigt werden. Erstens die Qualität HEK293T Zellen. Es ist wichtig, dass HEK293T Zellen mit einem einheitlichen Zeitplan durchgeführt werden und niemals über 50–70 % Konfluenz hinausgehen dürfen. Nach unserer Erfahrung zeigen lentivirale Vektoren, die aus HEK293T zuvor überwucherten Zellen entstehen, reduzierte Titer, selbst wenn die Zellen morphologisch genesen erscheinen. Wir erzeugen routinemäßig hoch-titer Virusvektoren mit HEK293T Zellen jenseits von Passage 30, was darauf hindeutet, dass höhere Passage-Zahlen toleriert werden, wenn die Zellen richtig erhalten werden. Neben der Zellqualität ist die Zusammenflussstelle HEK293T Zellen zum Zeitpunkt der Transfektion ein entscheidender Faktor. Wir haben eine verminderte lentivirale Titer beim Transfektieren HEK293T Zellen bei hoher Konfluenz (90–100 %) beobachtet.

Zweitens ist die strikte Einhaltung der in diesem Protokoll festgelegten Zeitpunkte, Konzentrationen und Volumina unerlässlich, da viele Schritte in einer früheren Studie¹⁷ gründlich optimiert wurden. Zum Beispiel wurde der Copolymer-Enhancer (siehe Materialtabelle) getitriert, um die Transduktionsraten ohne nachweisbare Toxizität zu maximieren. Obwohl höhere Konzentrationen die Transduktion weiter erhöhen können, verursachen sie auch Toxizitäten und verringern die T-Zellexpansion. Ähnlich ergab das Ernten von lentiviralen Supernatanten außerhalb des empfohlenen 30-36-Stunden-Fensters (z. B. bei 24 oder 48 Stunden) in einem entsprechenden Zeitverlaufsexperiment¹⁷ niedrigere Titer. Im Gegensatz dazu ist eine strikte Einhaltung eines CD4-zu-CD8-T-Zellverhältnisses von 1:1 nicht erforderlich, da wir bei Verwendung von Bulk-T-Zellen mit variablen CD4/CD8-Verteilungen keine signifikanten Unterschiede in der Transduktionseffizienz beobachtet haben. Abweichungen von diesem Verhältnis können jedoch die Dauer der Expansion und die Anzahl der Bevölkerungsverdoppelungen beeinflussen. Daher halten wir typischerweise das 1:1-CD4-zu-CD8-Verhältnis für Konsistenz zwischen den Experimenten bei.

Zukünftige Optimierungsmaßnahmen könnten sich auf zusätzliche Strategien zur Verbesserung der T-Zell-Transduktion mit noch größeren lentiviralen Transgenen konzentrieren, wie spezielle Medienformulierungen oder maßgeschneiderte Zytokin-Regime. Die Ausweitung dieses Arbeitsablaufs auf andere Immunzelltypen, einschließlich natürlicher Killerzellen und Makrophagen, könnte seine therapeutischen Anwendungen erweitern. Wichtig ist, dass die klinische Übersetzung dieses Arbeitsablaufs auch dazu beitragen kann, die Herstellungskosten von lentivirus-modifizierten Zelltherapieprodukten zu senken.

Das hier vorgestellte umfassende Schritt-für-Schritt-Protokoll bietet eine praktische Referenz zur Produktion von CAR-T-Zellen mit großen lentiviralen Transgenen und legt die Grundlage für die Entwicklung neuartiger CAR-T-Zellen gegen solide und Blutkrebse.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antikörper – Anti-CD19 CAR	Cytoart	200101	Anti-CD19 CAR (Idiotyp), AF647-konjugiert, 1:100
Antikörper – Anti-HER2 SynNotch	R& D-Systeme	FAB95471G	Anti-Trastuzumab (Idiotyp), AF488-konjugiert, 1:80
Bleichmittel	Clorox	Keimtötendes Bleichmittel
Zellgefrierbehälter	Biocision	FTS30	Alkoholfrei
Zentrifuge (groß)	Thermowissenschaftlich	Legend XTR
Zentrifuge (Mini)	Fisher Scientific	Sprout Plus
Zentrifuge (klein)	Eppendorf	5425
Coulter-Zähler	Beckman Coulter	Multisizer 4	Elektrischer impedanzbasierter Zellzähler, der Zellzahlen und Zellvolumen bestimmt
Kryoröhren	Thermowissenschaftlich	375418
Dimethylsulfoxidid (DMSO)	Zell-Signaltechnik	12611P
DPBS (kein Kalzium, kein Magnesium)	Gibco	14190-136
Dynabeads (CD3/CD28)	Gibco	40203D	Aktivierungsperlen, die zur T-Zell-Stimulation verwendet werden
Ethanol	Dekontaminationslabore	200 Proof
FBS (hitzeinaktiviert)	Avantor (VWR)	97068-091
Durchflusszytometer	BD	LSRFortessa (647177)
Gefrierschrank (-80 °F; C)	Panasonic	MDFU76VA-PA
Gefrierschrank (flüssiger Stickstoff)	MVE HEco	1500-190
Kühlschrank (4 & Grad; C)	Fisher Scientific	Isotemp
Handschuhe (Nitril)	Halyard	55082
GlutaMAX-Ergänzungsmittel	Gibco	35050-061	L-Alanyl-L-Glutamin
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Eis (trocken)	n.a.	n.a.
Eis (nass)	n.a.	n.a.
Eiskübel	Fisher Scientific	07-210-108
Laborkittel (Einweg)	Kappler	PVS112WH-MD
Lentivirale Verpackungsplasmide	Proprietär	n.a.	pTRP Gag-Pol, pTRP RSV-Rev, pTRP Cocal-G
Lentivirale Transferplasmide	Proprietär	n.a.	z. B. pTRPE svsNotch
Lipofectamin 3000 Transfektionsreagenz	Invitrogen	L3000015	Kommerzielles Lipofektionsreagenz; enthält Lipofectamin 3000 (L3000) und dessen Verstärkerreagenz (P3000)
Magnetischer Ständer (groß)	Stemcell	EasySep 18103	Für 5 mL/15 mL
Magnetischer Ständer (klein)	Invitrogen	DynaMag-2 12321D	Für 1,5-mL-Röhren
Magnetischer Rührstab	Fisher Scientific	14-513-82	Rührstangen-Kit
Magnetische Rührplattform	Thermowissenschaftlich	S88857100
Messzylinder (100 mL)	VWR	76019-316
MQ-Wasser	Merck	Q-POD	Ultrapue-Wasser; verwendet Millipak 40 Express Endfilter, 0,22 Mikron (MPGP04001)
Mehrkanal-Pipette	Fisher Scientific	Siehe Kommentare	30-300 & Mikro; L:  FBE1200300; 5-50 & Mikro; L:  FBE1200050
Opti-MEM (mit L-Glutamin, Phenol Red)	Gibco	31985-070	Minimal-essentielles Medium mit reduziertem Serum, das für die DNA-Transfektion verwendet wird
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL, 10.000 & Mikro; g/mL)	Gibco	15140-122
Pipets	Fisherbrand	Siehe Kommentare	50 mL: 13-678-11°F; 25 mL: 13-678-11; 10 mL: 13-678-11E; 5 mL: 13-678-11D
Pipeten (Aspiration)	Falcon	357558	2 mL
Pipette	Gilson	PIPETMAN P10/P20/P200/P1000
Pipettenregler	Hirschmann	Pipetus Z314951
Pipettenspitzen	Thomas Scientific	Siehe Kommentare	1000 & Mikro; L: 1159M42; 200 & Mikro; L: 1159M40; 20 & Mikro; L: 1159M43; 10 & Mikro; L: 1159M41
Kunststoffaufbewahrungsflasche (500 mL)	Corning	430282
Reagenzreservoir	Celltreat	3054-2007
RPMI-1640 (mit L-Glutamin, Phenol Red)	Gibco	11875-085
Maßstab	Ohaus	Pionier	Minimale Genauigkeit von 0,1 g erforderlich
Steriflip-Filter (0,45 & Mikro; m)	Millipore	SE1M003M00
Synperonic F 108 (SF108)	Sigma-Aldrich	07579-250G-F	Blockcopolymer zur Verbesserung der T-Zell-Transduktion verwendet
Gewebekulturkolbe – T150	Corning	430825
Gewebekulturkolbe – T25	Corning	430639
Gewebekulturkolbe – T75	Corning	430641U
Gewebekulturhaube	Thermowissenschaftlich	1300er Serie A2
Gewebekultur-Inkubator	Thermowissenschaftlich	Heracell 150i
Gewebekulturplatte – 6-Brunnen	Corning	3516
Gewebekulturplatte – 96-Well-flacher Boden	Falcon	353072
Gewebekulturplatte – 96-Well-Rundboden	Falcon	353077
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Gibco	25300-054
Röhrchen – 1,5-ml-Schraubkappen	Sarstedt	72692005
Röhren – 15 mL	Falcon	352099
Röhren – 5 mL	MSP	62-1028-2
Röhren – 500 mL	Corning	431123
Tuben – 50 ml	Falcon	352098
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima XPN-100
Ultrazentrifugenrotor mit Schaufeln	Beckman Coulter	SW 32 Ti
Ultrazentrifugenröhrenadapter (für konische Röhren)	Seton Wissenschaftlich	4230
Ultrazentrifugenröhren (konisch)	Seton Wissenschaftlich	5067
Vortex	Fisher Scientific	02215414
Wasserbad (37 & Grad; C)	Fisher Scientific	Isotemp 210	Verwendet mit Lab Amor Beads (Gibco) statt Wasser
X-VIVO-15	Lonza	04-418Q	Serumfreie Medien zum Einfrieren von T-Zellen verwendet