Eine verfeinerte, aerosolbasierte intratracheale Bleomycin-Verabreichungsmethode für reproduzierbare und minimalinvasive Mausmodelle der Lungenfibrose

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Modellierung der Lungenfibrose bei Mäusen mittels aerosolisiertem Bleomycin, das über die Luftröhre verabreicht wird. Diese optimierte Methode ermöglicht eine einheitliche, quantitative und präzise Verabreichung ohne chirurgischen Schnitt und erhöht so die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der durch Bleomycin induzierten Fibrose.

Zusammenfassung

Lungenfibrose ist gekennzeichnet durch eine fortschreitende Ablagerung von fibrotischem Narbengewebe im Lungenparenchym, was zu einem stark beeinträchtigten Gasaustausch führt. Sie liegt einem Spektrum chronischer interstitieller Lungenerkrankungen zugrunde, insbesondere der idiopathischen Lungenfibrose, einer Erkrankung, die mit einer äußerst schlechten Prognose einhergeht. Angesichts des Mangels wirksamer Therapien sind robuste Mausmodelle entscheidend, um zugrunde liegende pathologische Mechanismen aufzuklären und neuartige antifibrotische Interventionen zu evaluieren. Die durch Bleomycin induzierte Lungenfibrose bleibt das am weitesten genutzte experimentelle Modell. Gängige Verabreichungswege bei Mäusen sind intravenöse und peritoneale Injektionen, invasive offene Tracheal-Instillation und nicht-invasives Trachealtropfen. Invasive chirurgische Verfahren verursachen jedoch häufig sekundäre Gewebeschäden, was die Reproduzierbarkeit und Stabilität des Modells beeinträchtigen kann. Im Gegensatz dazu führt nicht-invasives Trachealtropfen meist zu einer ungleichmäßigen Verteilung des Bleomycins über die Lungenlappen und birgt ein Erstickungsrisiko, was die Reproduzierbarkeit verringert und die technischen Herausforderungen erhöht. Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde eine verfeinerte, aerosolbasierte intratracheale Verabreichungsmethode entwickelt, die operationell einfacher, minimalinvasiv, hochreproduzierbar und ethisch überlegen ist, indem sie Tierbelastungen deutlich reduziert. Mit einem Laryngoskop für Kleintiere, um die Rima Glottide direkt zu visualisieren, wird eine spezialisierte Aerosolnadel in die Luftröhre eingeführt, die deutlich schmaler ist als der Durchmesser der Luftröhre der Maus. Die Bleomycin-Lösung wird unter präzise kontrolliertem Druck abgegeben, wodurch ein feines Aerosol entsteht. Dies gewährleistet eine gleichmäßige und effiziente Verteilung des Erregers im gesamten Lungenparenchym. Außerdem kann man selektiv die linke oder rechte Lunge anvisieren, indem man die Nadel in den entsprechenden Bronchus richtet. Die Dosis-Wirkungs-Beziehung dieses optimierten Modells ist umfassend durch die systematische Überwachung von Veränderungen der Lungenfunktion, histopathologischer Manifestationen und des Lungenhydroxyprolingehalts charakterisiert. Dieses verfeinerte experimentelle Protokoll soll die Laborstandardisierung erleichtern und letztlich die Entwicklung und präklinische Validierung neuartiger antifibrotischer Therapeutika beschleunigen.

Einleitung

Lungenfibrose (PF) ist eine Gruppe von tödlichen Erkrankungen, die durch fortschreitende Lungenparenchymschäden und abnormale Reparatur gekennzeichnet sind, wovon die idiopathische Lungenfibrose (IPF) 30 % bis 40 % ausmacht, wobei das Medianalter der Patienten bei der Diagnose 65 Jahre beträgt und mehr als 80 % davon 60 Jahre älter als 60 Jahre^sind. ². Mit zunehmender globaler Alterung steigt die IPF-Inzidenz von Jahr zu Jahr, mit einer weltweiten IPF-Inzidenz von 3-9/100.000 pro Jahr, und laut einer Studie in den Vereinigten Staaten von Amerika bei Menschen über 65 Jahren stieg die Inzidenz in dieser Population auf 93,7/100.000/Jahr ^3,4.

Das erste historisch entwickelte Modell der Lungenfibrose war das bleomycininduzierte Modell, das häufig in der Wissenschaft verwendet wird, mit der besten Charakterisierung und dem derzeit am weitesten verbreiteten Tiermodell⁵, das viele Merkmale von IPF und anderen fibrotischen ILDs wiederholt, darunter Lungenentzündung, Epithelverletzung, Fibroblastproliferation und übermäßige extrazelluläre Matrix (ECM) Ablagerung⁶. Darüber hinaus können sowohl akute als auch chronische Lungenfibrose je nach Dosis und Häufigkeit der Bleomycin-Verabreichung modelliert werden. Es wurde berichtet, dass die Lunge innerhalb von 5–7 Tagen nach Bleomycin-Exposition in eine akute Entzündungsphase eintritt, gefolgt von einer fibrotischen Phase, die etwa Tag 7 beginnt. Bis zum 21. Tag wird typischerweise eine ausgeprägte fibrotische Remodellierung beobachtet, die es dem Modell ermöglicht, sowohl die frühe Entzündungsreaktion als auch die späte fibrotische Pathologie zeitlich definiert wiederzubilden⁷ (Abbildung 1A). Dies ermöglicht die Untersuchung des gesamten Krankheitsprozesses von der anfänglichen Verletzung bis zum fibrotischen Stadium, was für die Entwicklung von Medikamenten und Mechanismusstudien in^{allen Stadien} sehr wichtig ist^.

Bleomycin-Modellierungswege sind vielfältig und können lokal oder systemisch verabreicht werden, einschließlich endotrachealer, nasaler, intravenöser und peritonealer Routen. Am häufigsten wird eine endotracheale Injektion verwendet. Der Nachteil ist, dass es Schnitte in den Mäusen erzeugt, was die Überlebensrate der modellierten Mäuse¹⁰ beeinträchtigt. Später wurden Verbesserungen vorgenommen, um den Einsatz einer einwohnenden Nadel für die Trachealintubation und Tropfinjektion bei Mäusen¹¹ zu ermöglichen. Das von der Spritze gedrückte Medikament kann jedoch nur als Block in der Lunge verteilt werden, was zu einer ungleichmäßigen Verteilung von Bleomycin in jedem Lungenlappen führen kann, was zu einer lokalen Überdichte führt und die Stabilität des Mausmodells beeinträchtigt. Zusätzlich wurden Kammervernebler-Kartuschen zur Bleomycin-Verabreichung verwendet, aber die Menge des eingeatmeten Bleomycin-Aerosols in jeder Maus lässt sich nicht genau quantifizieren, und die einzelne Induktionszeit beträgt¹² Jahre lang. Daher wurde eine verfeinerte, aerosolbasierte intratracheale Bleomycin-Verabreichungsmethode für reproduzierbare und minimalinvasive Mausmodelle der Lungenfibrose entwickelt. Bleomycin ist aerosolisiert, was eine gleichmäßige Dispersion und Ablagerung in der Lunge ermöglicht und so die Lungenerkrankungen besser rekonzipiert. Es wird gehofft, dass das Aufkommen dieser Methode die Forschung an Medikamenten beschleunigen wird, die Lungenfibrose vollständig heilen können.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden nach institutionellen Richtlinien durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden. Während des gesamten Experiments wurden angemessene Maßnahmen zum Tierschutz umgesetzt. Männliche C57BL/6 Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen und einem Gewicht von etwa 25 g wurden für das Experiment ausgewählt. Die Materialtabelle listet alle Tiere, Reagenzien und Geräte auf, die in dieser Studie verwendet wurden, sowie deren kommerzielle Quellen.

1. Tierselektion und Eingewöhnung

1. Halten Sie alle Mäuse unter spezifischen, krankheitserregerfreien Bedingungen mit einem 12-Stunden-Licht-/Dunkelzyklus und ad libitum-Zugang zu Nahrung und Wasser.
2. Gewöhnen Sie die Mäuse für 5–7 Tage an die Anlage, bevor das aerosolbasierte Modell gestartet wird.

2. Herstellung der Bleomycin-Lösung

VORSICHT: Bleomycin ist ein zytotoxisches Antitumormittel. Führen Sie alle Schritte in einem zertifizierten Biosicherheitsschrank mit geeigneter PSA durch.

1. Mit einer sterilen 1-mL-Spritze entnehmen Sie 3 ml steriles 0,9 % Natriumchlorid und injizieren Sie es in ein Fläschchen mit 15 U Bleomycin-Hydrochlorid.
2. Schwenken Sie das Fläschchen vorsichtig, bis das Pulver vollständig gelöst ist, um eine 5 U/mL Lagerlösung zu erhalten.
3. Aliquot die Standardlösung in sterile 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhren. Bereite Arbeitslösungen von 3,75 U/mL und 2,5 U/mL durch Verdünnen mit steriler Kochsalzlösung vor.
   HINWEIS: Für eine 25-g-Maus entsprechen diese Konzentrationen Dosen von 7,5 U/kg bzw. 5 U/kg. Passen Sie die Konzentrationen an, wenn das Gewicht der Maus variiert.
4. Speichern Sie funktionierende Lösungen bei 4 °C bis zu einer Woche oder bis zu einem Monat bei -80 °C. Auftauen und vor der Anwendung auf Zimmertemperatur bringen.

3. Aerosolbasierte intratracheale Bleomycin-Verabreichung

1. Anästhesievorbereitung und -verabreichung
   1. Bereite die anästhetische Arbeitslösung vor, indem 0,1 g Natriumpentobarbitalpulver in 10 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung gelöst wird. Filter mit einem 0,22 μm PES-Membranfilter. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C in einer lichtgeschützten Umgebung und verwenden Sie sie innerhalb von 3 Tagen nach der Zubereitung.
   2. Verabreichen Sie Natrium-Pentobarbitallösung per intraperitonealer Injektion mit einer 1-ml-Spritze und einer 26-Gauge-Nadel bei einer Dosis von 60 mg/kg Körpergewicht. Wenn die Tiefe oder Dauer der Anästhesie unzureichend ist, passen Sie die Dosis basierend auf der Reaktion des Tieres unter Anleitung des behandelnden Tierarztes an.
   3. Beurteilen Sie die Anästhesietiefe mehrere Minuten nach der Injektion, indem Sie den Zeh fest zusammenkneifen und das Fehlen eines Entzugsreflexes bestätigen, bevor Sie mit den weiteren Eingriffen fortfahren.
2. Vorbereitung des Aerosolabgabeapparats
   1. Bereiten Sie das Aerosolabgabeapparat vor, wobei sichergestellt wird, dass die Verneblungsnadel, die Verneblungsspritze und die Dosiersäule alle vorhanden und steril sind (Abbildung 1B).
   2. Tauchen Sie die Aerosolspritze in sterile Kochsalzlösung ein. Langsam die Flüssigkeit aspirieren und 8 Sekunden pausieren. Geben Sie die Flüssigkeit schnell aus. Wiederhole das dreimal, um das System zu füllen und zu spülen.
   3. Füllen Sie die Spritze nach dem endgültigen Ausstoß mit Kochsalzlösung nach. Befestigen Sie die Aerosolnadel und stellen Sie sicher, dass die Verbindung mit Kochsalzlösung gefüllt ist.
   4. Tauchen Sie die zusammengesetzte Nadel in Kochsalzlösung und wiederholen Sie den Aspirations-Pause-Ausstoß-Zyklus noch dreimal, um Luftblasen zu vermeiden.
      HINWEIS: Um die Bereitschaft zu bestätigen, stoßen Sie Kochsalzlösung vor dunklem Hintergrund aus. Stellen Sie sicher, dass die schnell ausgestoßene Kochsalzlösung vor dunklem Hintergrund einen fächerförmigen Nebel bildet.
3. Intratracheales Aerosolabgabeverfahren
   1. Grundieren Sie die Aerosolnadel mit Bleomycin-Arbeitslösung, indem Sie sie dreimal mit 8 Sekunden Pause aspirieren und ausstoßen.
   2. Setzen Sie eine 25 μL Dosiersäule auf die 50 μL Säule, um das Volumen zu kalibrieren. Aspiratiere das erforderliche Volumen (50 μL). Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit.
      HINWEIS: Diese Dosierungskonfiguration gewährleistet eine gleichmäßige Zuteilung, indem menschliche Fehler minimiert werden.
   3. Setzen Sie die betäubte Maus auf die Intubationsplattform, haken Sie die oberen Schneidezähne ein und kleben Sie die Gliedmaßen ab, um zu stabilisieren (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Bestätigen Sie rhythmische Brustbewegungen. Wenn das Tier aktiv erscheint, verabreichen Sie eine zusätzliche Betäubungsdosis.
   4. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um die Zunge vorsichtig herauszuziehen. Setzen Sie ein Kleintierlaryngoskop ein, um die Glottis freizulegen (Abbildung 1D).
   5. Führe die Aerosolnadel vertikal durch die Glottis ein. Geben Sie das Bleomycin-Aerosol schnell ab (Abbildung 1E).
      HINWEIS: Richten Sie die Nadelspitze auf die gewünschte Lunge für die gezielte Verabreichung. Vermeiden Sie es, zu tief einzuführen, um Traumata zu verhindern. Die Spitze der Verneblernadel sollte nahe, aber nicht am Bifurkationspunkt (erste Bifurkation) der Luftröhre der Maus positioniert werden, um den besten Modellierungseffekt zu erzielen. Wenn die Spitze nur in die Mitte der Luftröhre eingeführt wird, kann das Aerosol nur auf die Luftröhrenwand stoßen und große Tropfen bilden, die ausgehustet oder geschluckt werden. Befindet sich die Spitze zu nah an der Trachealbifurkation, besteht ein Risiko einer Trachealschädigung.

4. Genesung nach dem Eingriff

1. Setzen Sie die Maus auf ein Wärmepad, um die Körpertemperatur zu halten. Beobachten Sie die Maus kontinuierlich, bis sie sich von der Narkose erholt hat (typischerweise 1–2 Stunden).
2. Führe einen Zehenkneif durch, um die Reflexe zu überprüfen und zu bestätigen, dass die Maus am Leben ist.
3. Führen Sie tägliche klinische Überwachung für 21 Tage durch, einschließlich Körpergewichts-, Aktivitäts-, Pflege- und Atemwegssymptome.
4. Tiere werden eingeschläfert, wenn eines der folgenden Kriterien erfüllt ist: (i) >20 % Körpergewichtsverlust im Vergleich zum Ausgangsstand vor der Behandlung oder ≥15 % Verlust, begleitet von weiteren klinischen Anzeichen von Belastung; (ii) anhaltende schwere Atemnot in Ruhe (angestrengte oder Bauchatmung, ausgeprägte Tachypne oder Bradipnee, Nasenaufflammen oder Atmung mit offenem Mund), mit oder ohne Zyanose der Extremitäten; (iii) Unfähigkeit, Nahrung oder Wasser zu bekommen, ausgeprägte Lethargie oder ein sterbendes Erscheinungsbild (keine Reaktion auf Handhabung und/oder Verlust des Aufrichtreflexes); oder (iv) schwere Dehydrierung, Unterkühlung oder andere Anzeichen irreversibler Verschlechterung, wie vom behandelnden Tierarzt beurteilt. Wenn diese humanen Endpunkte erreicht sind, wird die Tiere mit einer Überdosis Natriumpentobarbital (≥150 mg/kg, I.P.) eingeschläfert, gefolgt von einer sekundären physikalischen Methode (z. B. zervikaler Verrenkung), um den Tod sicherzustellen und Schmerzen sowie Belastung zu minimieren.

5. Messung der terminalen Lungenfunktion und Gewebeentnahme

1. Am Tag 21 wird die Maus mit 90 mg/kg I.P. derselben Anästhesielösung betäubt, um eine tiefe Anästhesie zu induzieren und die Atmung zu unterdrücken.
2. Vollständige Narkose durch Zehenkneifen bestätigen. Legen Sie die Luftröhre frei, indem Sie die Haut durchschneiden und die Muskeln trennen.
3. Machen Sie einen kleinen abgeschrägten Schnitt in der Luftröhre und führen Sie die Intubationsnadel ein. Mit einer chirurgischen Ligatur gesichert.
4. Übertragen Sie die Maus an das computergesteuerte Lungenmechaniker-Beatmungsgerät für kleine Tiere. Beginnen Sie mit der mechanischen Beatmung und sorgen Sie dafür, dass keine spontane Atmung erfolgt. Verwenden Sie das Beatmungssystem, um die Parameter der Lungenfunktion zu messen.
5. Führen Sie eine rechtsventrikuläre Perfusion mit 5–10 ml steriler Kochsalzlösung durch, bis die Lunge blass erscheint.
6. Seziere die gesamte Lunge heraus. Fixiere die linke Lunge für 24 Stunden in neutralem gepuffertem Formalin.
7. Das fixierte Lungengewebe in Paraffin einbetten, es durchschneiden und H&E-Färbung, Masson-Trichrom-Färbung sowie immunhistochemische Färbungen für COL1A1 und α-SMA durchführen.
8. Setzen Sie die rechte Lunge in ein 2-mL Homogenisierungsrohr mit Perlen. Füge Wasser gemäß dem Protokoll des Hydroxyprolin-Kits hinzu. Homogenisieren und mit dem Assay fortfahren.

Ergebnisse

In dieser Studie schlugen wir eine aerosolbasierte intrabronchiale Abgabemethode vor, um Lungenfibrose bei Mäusen mit Bleomycin zu induzieren. In ersten Experimenten wurde ein grüner Farbstoff aerosolisiert und in die Lunge verschiedener Mäuse verabreicht. Der Farbstoff zeigte ein gesprenkeltes Verteilungsmuster in der gesamten Lunge, was darauf hindeutet, dass die aerosolbasierte intrabronchiale Verabreichung eine gleichmäßige Verteilung des Erregers über alle Lungenlappen ermöglichte (...

Diskussion

Diese Studie schlug ein optimiertes nicht-invasives Trachealnebulisationsmodell der durch Bleomycin induzierten Lungenfibrose bei Mäusen vor. Ein kleiner Tierlaryngoskop wurde verwendet, um die Glottis zu lokalisieren, und eine winzige Verneblungsnadel wurde in die Atemwege der Maus eingeführt. Der Druck wurde manuell ausgeübt, um das Medikament in die Lunge zu vernebeln, wodurch das Unbehagen und die Erstickung, die mit der Retentionsnadel bei der nicht-invasiven Injektion verbunden

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 μ M Polyethersulfon-Spritzenfilter	Zytowissenschaft	CSTPE3320
1 mL Einwegspritze	BD	300481
1,5 mL Mikrozentrifugenröhre	Servicebio	EP-150-M
2,0 mL verstärktes Lyserohr	Servicebio	HT-200-M
4 & Grad; C-Laborkühlschrank	Meiling	BCD-402WPCX
50 mL konische Zentrifugenröhre	Servicebio	EP-5001-J
-80 & Grad; C-Gefrierfach mit ultraniedriger Temperatur	Haier Biomedical	DW-86L828J
Absolutes Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092683
Saure Differenzierungslösung	Servicebio	G1039
Aerosol-Mikrosprüher für die Intubation von Kleintieren	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	Yan-30012
Grundlegendes chirurgisches Instrumentenset	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	YAN-21A3
Bleomycin-Hydrochloridlösung	Hanhui Pharmaceutical Co., Ltd	H20055883
Bläu-Reagenz	Servicebio	G1040
Computergesteuertes Lungenmechanik-Beatmungsgerät für kleine Tiere	EMKA Biotech Beijing Co., Ltd.	FX-2
Isolierband	3M	1500
Eosin-Y-Färbungslösung	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4022
Grüne Markierungstinte	Pilotfolge	Chiku-rin
Hämatoxylin-Färbungslösung	Servicebio	G1004
Hydroxyprolin-Quantifizierungs-Assay-Kit	Abcam	ab222941
Laminarer Flusshaube	HDL	DL-CJ-1N
Laryngoskop für Kleintierverfahren	Shenzhen Bilead Biology Technology CO., LTD	DXSHJ0
Lichtmikroskop	Nikon	E100
Entwachslösung mit niedriger Toxigkeit	Servicebio	G1128
Massons trichromes Flecken-Set	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4079B
Mikroplattenleser mit Absorptionserkennung	Agilent	Synergie H1
Neutral gepuffertes Formalin	Servicebio	G1101-3ML
Neutrales Montagemedium	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Rekombinanter Kaninchen-monoklonaler Anti-COL1A1-Antikörper	Huabio	HA722517
Gekühlte Zentrifuge	Eppendorf	5424R
RNase-freies Wasser	Generalbiol	TYJC002
Kleintier-Trachealintubationsplattform	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	CG-02M
Sterile 0,9 % natriumchloridhaltige Lösung	China Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	H12020024
Gewebehomogenisator	Servicebio	KZ-III
Xylen	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10023418
Zirkonia-Mahlkugeln	Servicebio	G0203