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Methodenartikel

Echtzeit-Überwachung der akupunkturinduzierten Dynamik im subkutanen Bindegewebe mittels konfokaler In-vivo-Laserbildgebung

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DOI:

10.3791/69173

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10. Oktober 2025

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1Institute of Acupuncture and Moxibustion, Jianghan University, 2School of Medicine, Jianghan University, 3Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie etabliert in vivo die konfokale Laserbildgebung als Echtzeitmethode zur Verfolgung akupunkturinduzierter morphologischer Dynamiken, wie z.B. Vasodilatation und Kollagenumbau, bei lebenden Ratten. Unter Verwendung der Fluoreszein-Natrium-Markierung erfasst der Ansatz sowohl unmittelbare als auch verzögerte Gewebereaktionen und bietet ein neues Instrument für die quantitative Bewertung physikalischer Therapien, einschließlich Akupunktur und Moxibustion.

Zusammenfassung

Die dynamische Echtzeitüberwachung der Akupunktureffekte ist entscheidend für die Aufklärung ihrer biologischen Mechanismen, doch traditionelle histologische Methoden sind nicht in der Lage, transiente Reaktionen in der Live-Mikroumgebung zu erfassen. Hier haben wir einen methodischen Rahmen auf Basis der konfokalen Laserbildgebung in vivo etabliert, der eine hochauflösende Echtzeitbeobachtung morphologischer Veränderungen in lokalem Gewebe nach Akupunktureingriffen ermöglicht. Nach intravenöser Injektion von Natriumfluorescein bei Ratten wurden während der Akupunktur dynamische Veränderungen der Mikrozirkulation und der extrazellulären Matrix (z. B. Kollagenfaseranordnung) verfolgt. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Methode mit einer räumlichen Auflösung von 0,5 μm und einer zeitlichen Auflösung von 3,5 fps sofortige (z.B. Vasodilatation) und verzögerte (z.B. Entzündungsreaktion) Gewebereaktionen, die durch Akupunktur induziert wurden, klar unterschied. Die anschließende quantitative Analyse ermöglichte eine objektive Messung morphologischer Parameter. Dieses Protokoll, das in dieser Studie beschrieben wird, bietet ein Visualisierungswerkzeug für in vivo Studien von Akupunkturmechanismen und dient als technische Referenz für die Bewertung der Auswirkungen anderer physikalischer Reize (z. B. Moxibustion).

Einleitung

Die Akupunktur als Eckpfeiler der traditionellen Medizin übt therapeutische Wirkungen durch komplexe Reaktionen auf Gewebeebene aus 1,2,3,4. Die mechanistischen Erkenntnisse sind jedoch nach wie vor durch die konventionelle Histologie begrenzt, die statische Schnappschüsse erfasst, aber die Echtzeitdynamik morphologischer Anpassungen (z. B. Vasomodulation, Umbau der extrazellulären Matrix) in lebendem Gewebe nicht aufklärenkann 5. Während die Intravitalmikroskopie dynamisches Bildgebungspotenzial bietet, ist ihre Anwendung in der Akupunkturforschung gering, insbesondere zur Quantifizierung raumzeitlicher Reaktionen auf physikalische Reize 6,7. Im Gegensatz dazu ermöglicht dieser konfokale Bildgebungsansatz die quantitative Extraktion von strukturellen und dynamischen Parametern - wie der Änderungsrate der Bewegungsgeschwindigkeit der roten Blutkörperchen und der Kollagenanordnung - in tiefen Geweben (z. B. Muskelschichten und Akupunkturpunkte ST 36/GB 34) und überwindet damit die Einschränkungen der herkömmlichen Intravitalmikroskopie in Bezug auf räumliche Auflösung, volumetrische Bildgebung und Langzeitverfolgung8.

Die konfokale Laserbildgebung hat sich als leistungsstarkes Werkzeug für die In-vivo-Visualisierung mit zellulärer Auflösungerwiesen 9,10,11,12,13. Bestehende Studien konzentrieren sich jedoch in erster Linie auf oberflächliche Gewebe (z. B. Haut oder Hornhaut), während sich nur wenige mit tiefen Akupunkturzielen befassen oder quantitative morphologische Analysen integrieren. Entscheidend ist, dass es unseres Wissens nach keine standardisierte Methodik gibt, um die Akupunkturmanipulation mit kinetischen Veränderungen des lebenden Gewebes zu korrelieren.

Hier schließen wir diese Lücke, indem wir eine auf konfokaler Bildgebung basierende methodische Plattform für die Echtzeit-Verfolgung von akupunkturinduzierten morphologischen Ereignissen etablieren. Unter Verwendung von Natriumfluorescein (intravenös verabreicht in einer Konzentration von 1 %, 0,1 ml/100 g Körpergewicht) als Kontrastmittel erreichen wir ein hochauflösendes Monitoring (0,5 μm räumliche/3,5 fps zeitliche Auflösung) von Mikrozirkulations- und Matrixveränderungen über ein Sichtfeld von 450 μm × 450 μm in bis zu 400 μm Tiefe - von sofortiger Vasodilatation bis hin zu verzögerten Entzündungskaskaden - während der Akupunkturstimulation. Dieser Ansatz ermöglicht außerdem die 3D-Rekonstruktion und Parameterquantifizierung der Neuausrichtung von Kollagenfasern und überwindet die Grenzen der Endpunkthistologie.

Die praktischen Überlegungen für die Implementierung dieses Protokolls sind: (i) die empfohlene Hardware umfasst ein konfokales System mit einer Auflösung von ≥0,5 μm und einer Erfassungsrate von ≥3 fps, (ii) typische Einschränkungen umfassen Photobleaching über 90 s kontinuierliche Bildgebung hinaus und Empfindlichkeit gegenüber Atem- oder Gewebebewegungen, und (iii) die Tiefenpenetration kann in hochdichtem oder streuendem Gewebe reduziert werden. Unseres Wissens liefert diese Arbeit nicht nur den ersten dynamischen Atlas der akupunkturevozierten Gewebereorganisation, sondern stellt auch einen Präzedenzfall für die Bewertung physikalischer Therapien (z.B. Moxibustion) in lebenden Systemen dar. Durch die Umwandlung transienter physiologischer Reaktionen in quantifizierbare Metriken bieten wir ein neues Paradigma für mechanistische Studien neuromodulatorischer Therapien.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Tierethikkommission des Instituts für Akupunktur und Moxibustion der Chinesischen Akademie der Chinesischen Medizinischen Wissenschaften (Nr. D2023-01-29-01) genehmigt. Acht männliche Sprague Dawley (SD) Ratten (8 Wochen alt, 200-220 g) wurden von Biotechnology Co., Ltd. (Lizenz-Nr. SCXK (Jing) 2020-0001). Die Tiere wurden in sterilisierten Isolationsgehegen unter kontrollierten Bedingungen untergebracht: 12 Stunden Hell-Dunkel-Zyklus, 21 ±± 2 °C Temperatur, mit ad libitum Zugang zu Standard-Chow-Pellets und Wasser. Alle Versuche entsprachen den institutionellen Richtlinien und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren.

HINWEIS: In Abbildung 1 ist ein Flussdiagramm dargestellt, in dem die wichtigsten Verfahren aufgeführt sind.

1. Aufbereitung von Tier und Tracer: Fluorescein-Natrium (FS)

  1. Zur Herstellung einer 1%igen Färbelösung für Fluorescein-Natrium (FS) lösen Sie 0,1 g FS in 10 ml steriler Kochsalzlösung (0,9 % NaCl). Lagern Sie die Lösung für die spätere Verwendung bei Raumtemperatur (RT).
  2. Anästhesieren Sie SD-Ratten durch Isofluran-Induktion (Induktion: 5 % Isofluran, Erhaltung: 2,5 % Isofluran). Entfernen Sie die Haare aus dem Schädelbereich (mit Ausnahme des Kopfes) mit einer elektrischen Haarschneidemaschine und tragen Sie dann 5 Minuten lang Enthaarungscreme auf. Entfernen Sie Creme- und Haarreste, indem Sie sie mit warmem Wasser ausspülen.
    HINWEIS: Halten Sie die Scherklinge während des Betriebs parallel zur Hautoberfläche, um Hautverletzungen zu vermeiden, die die quantitative Bildgebung beeinträchtigen könnten. Zum Spülen muss ausschließlich warmes Wasser verwendet werden, um eine Unterkühlung der Tiere zu vermeiden, die die Versuchsergebnisse beeinträchtigt.

2. Injektion von FS

  1. Sichern Sie die Ratte.
    1. Narkose von enthaarten Ratten durch intraperitoneale Injektion von 10% Urethan (1 g/10 ml, in Kochsalzlösung) in einer Dosierung von 1,0 g/kg.
    2. Nach Erreichen der Vollnarkose die Tiere in Rückenlage auf der Operationsplattform sichern. Kneifen Sie die Hinterpfote mit einer Zange sanft in die Zehen und beobachten Sie, dass kein Rückzugsreflex vorhanden ist. Überprüfen Sie den Verlust des Hornhautreflexes, indem Sie die Hornhaut leicht mit einer feuchten Wattespitze berühren.
    3. Bestätigen Sie die anhaltende Reaktionslosigkeit und eine stabile Atemfrequenz, bevor Sie mit dem Eingriff fortfahren. Halten Sie während der Anästhesie die Körpertemperatur des Tieres mit einem 37 °C warmen Heizkissen aufrecht.
      HINWEIS: Die Vollnarkose muss bestätigt werden, um unwillkürliche Bewegungen zu vermeiden, die die Verlagerung des Bildgebungsfensters beeinträchtigen würden.
  2. Verabreichen Sie intravenös 1% FS-Lösung über die Schwanzvene in einer Dosierung von 0,1 ml pro 100 g Körpergewicht.
    1. Führen Sie die Schwanzveneninjektion mit einer 1-ml-Spritze durch, die mit einer 27-G-Nadel versehen ist. Wischen Sie den Schwanz vorsichtig mit warmem Wasser ab, um die Vasodilatation zu fördern, gefolgt von einer Desinfektion mit 70% Ethanol.
    2. Führen Sie die Nadelabschrägung in einem flachen Winkel (≤15°) entlang der Längsachse der Vene ein. Injizieren Sie die Lösung langsam mit einer Geschwindigkeit von 0,1-0,2 ml/min.
    3. Gewährleisten Sie einen technischen widerstandsfreien Fluss, das Fehlen von perivaskulären Ödemen und bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion durch gelbe Verfärbung der Pupillen, Ohrmuscheln und Pfoten.
      HINWEIS: Eine versehentliche intraarterielle Injektion muss strengstens vermieden werden.

3. Einrichtung der konfokalen Laserendomikroskopie (pCLE) in vivo-Sonde

  1. Aktivieren Sie das pCLE-System und überprüfen Sie die Sauberkeit sowohl des Scanning-Sondensteckers als auch der distalen Spitze.
  2. Reinigen Sie die distale Spitze der Sonde (auch als Scanspitze bezeichnet) mit einem Wattestäbchen, das mit physiologischer Kochsalzlösung angefeuchtet ist, und trocknen Sie sie dann vorsichtig mit Linsentuch ab.
  3. Positionieren Sie die Lasersonde an der Zielbeobachtungsstelle (z. B. im Bereich des medialen Oberschenkels). Befestigen Sie die konfokale Bildgebungssonde mit einer verstellbaren Klemme, die einen stabilen Kontakt mit der Gewebeoberfläche ohne Kompressionsartefakte gewährleistet, und fixieren Sie sie, indem Sie den Einstellknopf festziehen.
  4. Schließen Sie die Sonde an das pCLE-System an und konfigurieren Sie die Erfassungsparameter (z. B. Sichtfeld [FOV], Speicherverzeichnis). Die spezifischen Parameter, die in diesem Experiment verwendet werden, sind wie folgt:Tiefe: 18 μm; Laserleistung: 219 mW; Helligkeit: 76%; Geschwindigkeit: 1920 × 540; Gewinn: 2400; Zoom: 1× (464 μm); Filter: LP 515; Nachschlagtabelle: Grauer Scan.
    HINWEIS: Die Bildgebungsparameter (Scantiefe/Laserleistung) wurden iterativ optimiert, bis eine eindeutige Visualisierung der Gewebearchitektur erreicht wurde. Eine gleichbleibende Intensität ist entscheidend für die Vergleichbarkeit von Längsbildern. Die Zugabe von 37 °C heißen Salztröpfchen an der Grenzfläche zwischen Sonde und Gewebe eliminierte den Signalverlust, der in den ersten Iterationen beobachtet wurde. Die in dieser Studie verwendete Laserleistung liegt unter dem allgemein akzeptierten Schwellenwert für Phototoxizität in der konfokalen In-vivo-Bildgebung .

4. Abbildung der Organisationsstruktur mit pCLE und Erfassung

  1. Positionieren Sie die Sonde auf der Hautoberfläche und starten Sie die Datenerfassung, um die Gewebearchitektur zu visualisieren.
    1. Halten Sie die Sonde mit einem Bleistiftgriff; Manövrieren Sie es in Zielregionen (z. B. Bereiche mit Gefäßen oder fibrösem Bindegewebe innerhalb des Sichtfelds), platzieren Sie die distale Spitze direkt auf der Bildgebungszone und stabilisieren Sie sie dann über den Sondenarm.
  2. Erfassen Sie zunächst die Ausgangsgewebearchitektur für 1 Minute unter physiologischen Bedingungen, gefolgt von einer 5-minütigen Aufzeichnung während der Akupunkturintervention. Beenden Sie die Akquisition nach der Intervention. Die Datendateien werden automatisch in dem in den Schritten 3.3-3.4 angegebenen Verzeichnis gespeichert.
    HINWEIS: Dateien werden als Ebenenstapel (.tiff) und einzelne Rahmen (.tiff) gespeichert.

5. Akupunktur-Eingriff

HINWEIS: Die Erfassung im Bildgebungsschritt wird während des Eingriffs durchgeführt.

  1. Führen Sie eine 1-Kubik-Einwegnadel aus Edelstahl (die chinesische Maßeinheit für die Länge beträgt ca. 13 mm) in den Akupunkturpunkt ein, der an das von der Sonde beobachtete Gewebe angrenzt. Verbinden Sie eine Elektrode mit der Edelstahlnadel und befestigen Sie die andere Referenzelektrode am Schwanz der Ratte.
  2. Wenden Sie die Elektroakupunktur (EA) Stimulation mit den folgenden Parametern an: 1 mA Intensität, dicht disperse Welle (2/15 Hz), für 5 Minuten.
    HINWEIS: Halten Sie einen ausreichenden Abstand (>3 mm) zwischen der Einstichstelle der Nadel und der Sonde ein, um EA-induziertes dermales Zittern zu vermeiden, das die Bildstabilität beeinträchtigt.

6. Bildanalyse

  1. Öffnen Sie die erfassten Bildstapel in ImageJ. Konvertieren Sie die räumliche Kalibrierung in Mikrometer und wandeln Sie das Bildformat in 8-Bit um, um die Plugin-Kompatibilität zu gewährleisten (Bild > Typ > 8-Bit).
    HINWEIS: Die Standard-Bildabmessungen werden in Zoll angegeben (systemspezifische Einstellung).
  2. Definieren Sie die Region of Interest (ROIs) für: Mikrozirkulation: einzelnes Kapillarsegment, Matrixstruktur: Kollagenfaserregion. Behalten Sie identische ROIs über sequenzielle Bilder hinweg bei, um die Konsistenz im Längsverlauf zu gewährleisten.
  3. Mikrozirkulationsanalyse
    1. Wählen Sie den Bereich mit den roten Blutkörperchen aus, der beobachtet werden soll, und schneiden Sie das Bild zu, um andere störende Bereiche zu entfernen (Rechteck > Bild > Zuschneiden). Verwenden Sie das Schwellenwert-Werkzeug , um ausschließlich die roten Blutkörperchen (RBC) zu segmentieren (Bild > Anpassen > Schwellenwert-Werkzeug).
    2. Laden Sie das MTrack2-Plugin . Legen Sie geeignete Tracking-Parameter basierend auf der RBC-Größe fest (in diesem Experiment 10-42 Pixel), um Interferenzen auszuschließen und eine genaue RBC-Verfolgung zu gewährleisten (Plugin > Tracking > MTrack2).
  4. Matrix-Strukturanalyse
    1. Laden Sie das Plug-in "Richtung", wählen Sie den Modus "Fourier-Komponenten" und führen Sie eine statistische Analyse des Verteilungsanteils von Kollagenfasern über Ausrichtungen von 0° bis 180° durch (Analyse > Richtung).

7. Finalisierung der Daten

  1. Exportieren Sie die analysierten Daten in den TIFF/XSL-Formaten unter Verwendung der Namenskonvention: [Gruppe]_[Datum].Erweiterung. Sichern Sie alle Rohdateien und verarbeiteten Dateien auf einem bestimmten sicheren Server. Erfassen Sie quantitative Ergebnisse in einer zusammenfassenden Tabelle für die statistische Analyse.

8. Sicherheit und Abfallwirtschaft

  1. Persönliche Schutzausrüstung (PSA): Tragen Sie Nitrilhandschuhe, einen Laborkittel und eine Schutzbrille, wenn Sie mit Urethan, Isofluran oder Fluorescein-Natrium umgehen.
  2. Handhabung von Anästhetika: Führen Sie Verfahren mit Urethan oder Isofluran in einem Abzug durch, um die Exposition bei Inhalationen zu minimieren.
  3. Vorsichtsmaßnahmen für scharfe/spitze Gegenstände: Entsorgen Sie alle Nadeln und scharfen Gegenstände sofort in dafür vorgesehenen durchstichsicheren Behältern für scharfe Gegenstände.
  4. Sicherheit der Elektroakupunktur (EA): Überprüfen Sie die elektrische Isolierung von EA-Geräten und sichern Sie die Leitungsverbindungen, um Leckströme oder Kurzschlüsse zu vermeiden.
  5. Abfallentsorgung: Entsorgen Sie Isofluranflaschen als medizinischen Abfall gemäß den institutionellen Richtlinien. Entsorgen Sie mit Farbstoffen kontaminierte Materialien (z. B. Tupfer, Taschentücher) Abfälle in verschlossenen Behältern für gefährliche Abfälle. Sammeln Sie scharfe Gegenstände in zertifizierten Entsorgungsboxen für scharfe Gegenstände.
    HINWEIS: Alle Verfahren müssen den Vorschriften für institutionelle Sicherheit und Umweltgesundheit entsprechen.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll demonstriert die Nützlichkeit von pCLE für die dynamische Echtzeitbewertung der Auswirkungen der Akupunktur auf die Mikrozirkulation und die extrazelluläre Matrixarchitektur. Nach intravenöser Verabreichung von Natriumfluorescein über die Schwanzvene wurden die Veränderungen bewertet, indem Veränderungen der Erythrozytengeschwindigkeit innerhalb der lokalen Kapillaren und eine Reorganisation der Kollagenfaseranordnung beobachtet wurden.

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Diskussion

Wie in den Ergebnissen gezeigt, ermöglicht das in dieser Studie etablierte konfokale In-vivo-Bildgebungsprotokoll die gleichzeitige quantitative Analyse der mikrozirkulatorischen und extrazellulären Matrixdynamik während der Akupunkturintervention unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Standardgeräten und routinemäßiger Fluoreszenzmarkierung. Der Erfolg dieses Protokolls hängt von zwei entscheidenden Schritten ab: dem präzisen Timing der Natriumfluorescein-Injektion, die ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde finanziert durch das National Key Research and Development Program of China (2024YFA1209900, 2024YFA1209903, 2024YFA1209904); Sonderfonds der National Natural Science Foundation of China (82050006); TCM-Forschungsprojekt der TCM Medicine Administration der Provinz Hubei (ZY2025Z015); Der Forschungsfonds der Universität Jianghan (2024JCYJ13).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 cun AkupunkturnadelHwato, Suzhou, ChinaN/A13 mm/0,25 mm
10% Fluorescein-NatriumGuangxi Wuzhou Pharmaceutical Co Ltd, ChinaH45021477
Anästhesiegerät für TiereRWD, Shenzhen, ChinaR620IE
Überwachung der KörpertemperaturRWD, Shenzhen, China69026
Elektrisches AkupunkturgerätHwato, Suzhou, ChinaSDZ-III
Creme zur HaarentfernungVeet, Frankreich
BildJNationale Institute für Gesundheit, USAhttps://imagej.nih.gov/ij/
Konfokale Laser-Endomikroskopie mit In-vivo-SondeOptiscan, AustralienViewnVivoB30Durchmesser: 4 mm starre Handsonde, biegefest und behält die strukturelle Integrität im Laufe der Zeit bei. Länge: ≥ 46 mm. Scan-Modus: Zoom-Scanfunktion.
IsofluranRWD, Shenzhen, China
R510-22-16
UrethanSigma-Aldrich, Vereinigte Staaten von Amerika94300

Referenzen

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