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Dissektion von Drosophila melanogaster Indirekte Flugmuskulatur für Mikroskopie-Ansätze

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DOI:

10.3791/69185

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7. November 2025

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1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Drosophila ist ein leistungsfähiges Modell, um die grundlegenden Mechanismen der Myogenese zu verstehen. Dieses Protokoll für die Dissektion und Präparation von Thorax-Hemisektionen ermöglicht die mikroskopische Analyse des indirekten Flugmuskels sowohl im Puppen- als auch im Erwachsenenstadium. Dieses Protokoll ermöglicht die konfokale Bildgebung der zellulären Morphologie, der Proteinlokalisierung, der Muskelstruktur und mehrerer anderer Aspekte der Myogenese.

Zusammenfassung

Die indirekten Flugmuskeln (IFMs) von Drosophila melanogaster sind ein leistungsfähiges genetisches Modell, um die grundlegenden Prinzipien der Myogenese zu erforschen. Der kontraktile Mechanismus und viele Sarkomerkomponenten sind von der Fliege bis zum Wirbeltier erhalten geblieben und ermöglichen die Untersuchung zellulärer Prozesse von der Transkriptionsregulation und RNA-Verarbeitung bis hin zum Stoffwechsel und der Mechanobiologie, die die Muskelentwicklung steuern und fein abstimmen. Viele dieser zellulären Signalwege sind bei menschlichen Myopathien verändert, und IFM-Studien liefern relevante Einblicke in die molekulare Ätiologie von Muskelerkrankungen. Insbesondere eignen sich Fliegen gut für die Mikroskopie, um die Morphologie und Funktion von Myofasern und Sarkomeren über den gesamten Prozess der IFM-Myogenese hinweg zu analysieren, von der Myoblastenspezifikation über die Myofibrillenbildung, Reifung bis hin zur Erhaltung. In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Dissektion von D. melanogaster IFMs zu Puppen- und adulten Zeitpunkten für Mikroskopie-Ansätze vorgestellt. Illustrierte Protokolle werden für die Hemithorax-Dissektion von späten Puppen- und adulten IFMs sowie für die Open-Book-Dissektion von frühen Puppen-IFMs zur Verfügung gestellt. Fixierungs-, Färbe- und Probeneinbettungsverfahren sowie häufige Dissektionsartefakte werden beschrieben, wobei repräsentative Daten die Kompatibilität der IFM-Dissektion mit verschiedenen Fixationsreagenzien belegen. Diese Protokolle werden angewendet, um das hypomorphe SmnE33-Allel des RNA-bindenden Proteinüberlebens-Motoneurons (Smn) 26 h nach der Pupariumbildung (APF), 72 h APF und in adulten IFMs zu untersuchen, was neue Einblicke in ein Modell der Spinalen Motorischen Atrophie (SMA) liefert und den allgemeinen Nutzen dieses Protokolls veranschaulicht. Dieses detaillierte Protokoll erleichtert den Zugriff auf das IFM-Modellsystem und die Erfassung hochwertiger Mikroskopiedaten, um die Prinzipien der Myogenese zu untersuchen.

Einleitung

Tiere haben Hunderte von Muskeln, die verschiedene Bewegungen steuern, von der Ermöglichung des Gehens über die Erleichterung des Sprechens bis hin zum Greifen eines Werkzeugs. Um ein so breites Spektrum an Funktionen zu unterstützen, unterscheiden sich Muskeln in Größe, Anhaftung, Kontraktionsfähigkeit, Stoffwechsel und Genexpression1. Ein Hauptaugenmerk auf dem Gebiet der Muskelbiologie liegt auf dem Verständnis, wie diese strukturellen und funktionellen Unterschiede während der Entwicklung entstehen und sich bei Muskelerkrankungenverändern 2. Die Muskelkontraktion wird durch Sarkomere angetrieben, die aus aktinhaltigen dünnen Filamenten bestehen, die an der Z-Scheibe verankert sind und sich mit bipolaren Myosin-haltigen dicken Filamenten verzahnen, die an der M-Linieverankert sind 3. Sarkomere sind von Ende zu Ende in Myofibrillen organisiert, und diese regelmäßige Anordnung im quergestreiften Muskel erscheint als abwechselnd helle und dunkle Bänder unter einem Mikroskop4, was eine praktische visuelle Methode zur Überwachung von Veränderungen in der Sarkomer-Anordnung und -Organisation bietet. In Kombination mit genetischen und biochemischen Ansätzen hat die Mikroskopie wichtige Einblicke in zelluläre Prozesse wie Transkriptionsregulation, RNA-Prozessierung, Metabolismus und Mechanotransduktiongeliefert 5,6,7, die die Muskelentwicklung und -funktion anleiten und verfeinern. Viele dieser zellulären Prozesse sind bei menschlichen Myopathien und neuromuskulären Erkrankungen gestört 8,9, was unterstreicht, wie wichtig es ist, die Muskelentwicklung zu verstehen, um Einblicke in die Ätiologie von Muskelerkrankungen zu erhalten. Fortschritte in der Gentechnik, die die Manipulation einzelner Zellen und die endogene Markierung von Proteinenermöglichen 10,11 in Verbindung mit technologischen Fortschritten bei der Bildaufnahme und -auflösung12,13 sorgen dafür, dass die Mikroskopie für die Muskelforschung weiterhin wichtig ist. Modellsysteme mit klaren und einfach zu implementierenden Protokollen für die Muskeldissektion und Probenvorbereitung sind daher im Muskelbereich wertvoll.

Die indirekten Flugmuskeln (IFMs) von D. melanogaster sind ein leistungsfähiges und gut charakterisiertes Modell zur Untersuchung der Grundprinzipien der Myogenese8. IFMs bestehen aus sechs dorsal-longitudinalen Muskeln (DLMs) pro Hemithorax, die sich auf Larvenmuskelschablonen bilden, und sieben dorsal-ventralen Muskelfasern (DVMs), die während der Puppenentwicklung de novo aufgebaut werden14. Aufgrund ihrer Zugänglichkeit in der Nähe der Mittellinie konzentrieren sich viele IFM-Studien auf die DLMs, den größten Muskel bei erwachsenen Fliegen, der sich über die gesamte Länge von 1 mm des Thoraxerstreckt 15. Zu Beginn der Verpuppung wandern IFM-Myoblasten aus ihrer Nische am Flügelscheibengelenk zum Thorax, wo sie zu synzytialen Myotuben verschmelzen16. Nach dem Sehnenansatz um 24 h APF bei 27 °C organisieren die IFM-Myofasern nach und nach ihr Zytoplasma und Zytoskelett, verdichten sich und initiieren die Myofibrillogenese von 30-32 h APF17. Neue Sarkomere werden den Myofibrillen zugesetzt und Myofasern wachsen, um den Thorax bis etwa 48 h APF zu füllen. IFMs durchlaufen dann einen Reifungsprozess, der mit Veränderungen sowohl der Transkription als auch des Spleißens einhergeht und den Erwerb von metabolischen und kontraktilen Eigenschaften bei Erwachsenen und die Dehnungsaktivierung fördert18. Adulte Fliegen schließen sich zwischen 90 h und 100 h APF bei 27 °C und bei ca. 100 h APF (Weibchen bei ca. 98 h APF und Männchen bei ca. 102 h APF) bei 25 °C19 aus der Puppenhülle ab. IFMs sind ein vielseitiges und relevantes Modellsystem. Sie können in allen Stadien der Myogenese überwacht werden, unterscheiden sich morphologisch und funktionell von anderen Myofasertypen in der Fliege und profitieren von einer breiten Palette zugänglicher genetischer Werkzeuge und Manipulationsansätze 8,20. Der kontraktile Mechanismus, die grundlegende Sarkomer-Morphologie und viele strukturelle Komponenten sind von der Fliege bis zu den Wirbeltieren erhaltengeblieben 5, was die Übertragung myogener Prinzipien von der Fliege auf den Menschen ermöglicht. In der Tat haben Fliegenmodelle von neuromuskulären Erkrankungen wie myotoner Dystrophie, spinaler motorischer Atrophie (SMA), myofibrillären Myopathien und Aktinopathien ätiologische und therapeutische Erkenntnisse geliefert21,22. Insbesondere eignen sich Fliegen gut für die Mikroskopie, um die Morphologie von Myofasern und Sarkomeren über die gesamte Myogenese hinweg zu analysieren, von der Myoblastenspezifikation über die Myofibrillogenese bis hin zur Sarkomerreifung und -erhaltung.

Die Drosophila IFMs werden seit mehr als vier Jahrzehnten für Mikroskopieanwendungen eingesetzt und tragen wesentlich zum Verständnis des Muskelwachstums und der Muskelentwicklung bei8. In dieser Zeit wurden die IFM-Dissektionsprotokolle kontinuierlich an den technologischen Fortschritt angepasst, was zu einer breiten Palette von Protokollen führte, die in unterschiedlichen Detaillierungsgraden präsentiert wurden, die für einige optimal und für andere bildgebende Verfahren suboptimal sind. Zum Beispiel beinhalten Protokolle, die für die Elektronenmikroskopie entwickelt wurden, starke Fixierungsbedingungen, ultradünne Schnitte und Kontrastfärbungen mit den Schwermetallen 3,23,24,25, sind aber nicht optimal für die Lichtmikroskopie. Protokolle, die entwickelt wurden, um IFMs schnell aus dem Thorax heraus zu präparieren, um sie in biochemischen Assays oder molekularen Analysen zu verwenden26,27, verlieren den Gewebekontext und können die Myofibrillenstruktur stören und sind daher für mikroskopische Ansätze suboptimal. Für die Analyse der Larvenmuskulatur oder des adulten Bauchmuskels wurden Dissektionsansätze entwickelt20,28, die jedoch für die Isolierung intakter IFMs nicht optimal sind. Live-Imaging-Ansätze erfordern entweder minimalinvasive Dissektionen oder spezielle Medien, um das IFM-Gewebe während des Bildgebungsprozesses am Leben zu erhalten29,30 und beinhalten nicht die Fixierungsschritte, die zur Erhaltung der Muskeln für die Immunhistochemie erforderlich sind. Es existieren mehrere Protokolle für die Paraffineinbettung oder Kryoschnitte von IFM-Geweben, die mit der Histochemie oder Antikörperfärbung kompatibel sind 27,31,32, aber diese Ansätze beinhalten typischerweise das Einfrieren und die Dehydrierung des Gewebes, was die Muskelultrastruktur verändern und die Erkennung bestimmter Antigene durch Primärantikörper einschränken kann. Protokolle, die die IFMs direkt fixieren, bewahren die Muskelmorphologie und begrenzen Veränderungen in der Antigenkonformation und sind für viele immunhistochemische Experimente wünschenswert24. Diese Protokolle sind jedoch auch auf spezifische Anwendungen ausgerichtet, z. B. Protokolle zur Disssoziation von IFMs, die die Analyse einzelner Myofibrillen durch Fluoreszenz, KryoEM oder hochauflösende Mikroskopie ermöglichen 20,33,34. Andere Beispiele umfassen Protokolle zum Präparieren intakter IFM-Fasern aus dem Thorax32,35 oder zur Erzeugung von Ganzeinband- oder Hemithoraxpräparaten 20,32,36, die die Analyse sowohl von Myofasern als auch von Sarkomeren in einem intakten Kontext ermöglichen. Für einen neuen Benutzer kann es eine Herausforderung sein, die große Anzahl vorhandener Protokolle zu durchsuchen, von denen die meisten textbasiert sind. Praktikanten und Forscher im Grundstudium würden von einem detaillierten IFM-Dissektionsprotokoll profitieren, wie es bei Standardanwendungen der Immunhistochemie angewendet wird.

Dieser Artikel enthält eine Reihe von Protokollen für die Dissektion und Präparation von D. melanogaster IFMs im Puppen- und Erwachsenenstadium für immunhistochemische Mikroskopieansätze. Dieser Ansatz wurde in neueren Publikationen verwendet, die die Entwicklungsfunktionen der RNA-bindenden Proteine Bruno137 und Rbfox138 während der IFM-Myogenese verfolgen. Das Protokoll enthält detaillierte Illustrationen und Schritt-für-Schritt-Bilder, um potenzielle Anwender durch die IFM-Hemithorax-Dissektion von adulten und späten Puppen (48 h bis 96 h APF) IFMs zu führen, bei denen der Thorax entlang der Mittellinie halbiert wird, wobei die Myofaserstruktur intakt bleibt. Darüber hinaus deckt dieses Protokoll die Dissektion in offenen Büchern der frühen Puppenstadien (8 h bis 48 h APF) ab, bei denen der ventrale Teil des Thorax aufgeschlitzt und angehoben wird, wie beim Öffnen eines Buches, um die intakten IFMs freizulegen, die an der dorsalen Epidermis befestigt sind. Zu den weiteren Schritten des Protokolls gehören die Fixierung, Färbung und Probenmontage, und repräsentative Daten zeigen, dass dieser Ansatz mit verschiedenen Fixierungsmethoden zur Vorbereitung von Geweben für die Immunhistochemie und Fluoreszenzmikroskopie kompatibel ist. Repräsentative Beispiele werden bereitgestellt, um neuen Benutzern bei der Identifizierung häufiger Präparierungsartefakte zu helfen. Das Protokoll wird angewendet, um den entwicklungsbedingten IFM-Phänotyp von SmnE33 zu analysieren, einem hypomorphen Allel des Überlebensmotoneurons (Smn), das als Fliegenmodell der Spinalen Motorischen Atrophie (SMA)21,39 verwendet wird, bei 26 h APF, 72 h APF und bei adulten IFMs. Die hier vorgestellten Daten geben einen Einblick in die muskelspezifische Funktion von Smn und unterstreichen die Anwendbarkeit dieses Dissektionsprotokolls zur Untersuchung der Muskelentwicklung und der Ätiologie von Muskelerkrankungen.

Protokoll

Ethische Erklärung:
Alle Experimente in diesem Protokoll verwenden Drosophila melanogaster, ein holometaboles Insekt. Wirbellose Tiere unterliegen in den Vereinigten Staaten von Amerika nicht den Tierschutzbestimmungen und ihre Verwendung erfordert keine ethische Genehmigung. Alle Arbeiten wurden gemäß den Standardrichtlinien für institutionelle Biosicherheit und Laborsicherheit durchgeführt und vom Institutional Biosafety Committee der University of Missouri Kansas City unter der Protokollnummer 21940 (22-11) genehmigt.

1.Hemithorax-Dissektion eines adulten IFM (Abbildung 1)

  1. Stellen Sie die notwendigen Vorräte zusammen, darunter zwei Dumont #5 Pinzetten mit Biologiespitzen, eine Dumont #3 Pinzette, eine Vannas Federschere, eine Kunststoffpipette, einen Pinsel, eine 24-Well-Platte, fusselfreie Tücher, einen Objektträger und Kryostatklingen (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie 1x PBS, 0,05% PBS-T und Fixierlösungen vor (siehe Zusatzdatei 1). Eine Übersicht über das Flussdiagramm der folgenden Hemithorax-Dissektion bei Erwachsenen ist verfügbar (Ergänzende Abbildung 1).
  2. Sammeln Sie erwachsene Tiere mit dem gewünschten Genotyp und Alter (z. B. neu geschlossen, 1 Tag Erwachsener oder 5 Tage Erwachsener). Betäubung von Probenfliegen auf CO2 oder Eis.
    HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Fliegen wurden an einem 12-Stunden-Tag: 12-Stunden-Nachtzyklus in einem temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Inkubator gezüchtet. Drosophila wird standardmäßig bei 25 °C oder 27 °C gezüchtet und kann bei 18 °C gezüchtet werden, was den Wachstumszyklus von 10 Tagen auf etwa 20 Tage verlängert.
  3. Übertragen Sie mit einer Kunststoffpipette einen Tropfen 1x PBS40 auf einen Objektträger unter einem Stereo-Präpariermikroskop.
  4. Übertragen Sie die Probenfliegen in kleinen Gruppen mit einem Pinsel oder einer Pinzette in den PBS-Tropfen (Abbildung 1A). Entfernen Sie den Kopf (Abbildung 1B), die Flügel (Abbildung 1C - D) und den Bauch (Abbildung 1E) mit einer Federschere von Vannas. Lassen Sie die Beine befestigt (Abbildung 1F).
  5. Übertragen Sie die Thrakasen vorsichtig mit einem Pinsel oder einer Pinzette auf 500 μl Fixierlösung in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte. Für die gewünschte Zeit (typischerweise 15-60 min) auf einem Nutator/Schaukelschüttler fixieren.
    HINWEIS: Dieses Protokoll ist mit mehreren Fixierungspuffern kompatibel, einschließlich Paraformaldehyd, Glutaraldehyd, Methanol, Glyoxallösung und anderen. Siehe Repräsentative Ergebnisse und Ergänzende Datei 1 für Details zur Optimierung der Fixationsbedingungen. Fixiermittel sollten mit Handschuhen und geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) gemäß den Richtlinien Ihrer Einrichtung für gefährliche Chemikalien gehandhabt werden.
  6. Entfernen Sie das Fixiermittel mit einer 200-μl-Pipette und waschen Sie 1 ml 0,05 % PBS-T auf einem Nähr-/Schaukelschüttler für 5 Minuten bei Raumtemperatur ein.
    HINWEIS: Entsorgen Sie das Fixiermittel gemäß den Richtlinien der Institution für gefährliche Chemikalien. Für die meisten Antigene können fixierte Thoracen in 1 ml 0,05 % PBS-T bis zu 2 Wochen lang bei 4 °C gelagert werden, bevor sie geschnitten und gefärbt werden. Höhere Konzentrationen von Triton X-100 sollten vor der Verwendung getestet werden, da lange Inkubationen in Detergenzien die Sarkomerstruktur beeinträchtigen können.
  7. Entfernen Sie den Puffer mit einer 200-μl-Pipette und übertragen Sie die Gefäße mit einer Bürste oder Pinzette auf einen Tropfen von 0,05 % PBS-T auf einem Objektträger unter einem Stereo-Präpariermikroskop.
  8. Richten Sie den Thorax so aus, dass das Scutellum nach oben zeigt und zwischen einer Dumont #3 Pinzette stabilisiert ist (Abbildung 1G-H).
  9. Schieben Sie eine Kryostatenklinge über den Thorax, um das Scutellum einzukerben (Abbildung 1H, J, L), und schneiden Sie dann in einem gleichmäßigen Abwärtsstrich entlang der Mittellinie (Abbildung 1I, J, L - N), um den Thorax-Halbschnitt zu erzeugen, der die IFMs freilegt (Abbildung 1K).
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Nagelhaut vor dem Schneiden durch die IFMs "eingekerbt" oder gerissen wird, um Dehnungsartefakte zu vermeiden, die die Sarkomerstruktur beschädigen. "Sägen" Sie die Klinge nicht hin und her, da diese Bewegung die IFMs mechanisch beschädigt, was zu ausgefransten Myofibrillen führt. Zu viel Puffer destabilisiert den Thorax zwischen den Pinzetten und erschwert den Schnitt. Zu den alternativen Ansätzen gehören die Stabilisierung der Brustkrebse nacheinander mit Doppelklebeband, um Schnitte zu erleichtern, sowie das Schneiden von der ventralen Seite des Brustkorbs.
  10. Bewegen Sie die beiden Hälften des Brustkorbs in eine Position auf dem Objektträger, an der sie mit Puffer bedeckt bleiben, um ein Austrocknen zu vermeiden, aber zukünftigen Schnitten nicht im Weg stehen. Wiederholen Sie die Schritte 1.8-1.10, bis alle Durchhänge durchtrennt sind.
  11. Verwenden Sie eine Pinzette, um Thorax-Halbschnitte vom Objektträger auf 500 μl 0,05 % PBS-T in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte zu übertragen, und fahren Sie mit der Blockierung und Immunfärbung fort (siehe Abschnitt 4 unten).

2. Hemithorax-Dissektion der späten Puppen-IFM (~48 h bis 96 h APF) (Abbildung 2, Abbildung 3)

  1. Stadien der Puppen des gewünschten Genotyps und Alters bis zum ausgewählten Zeitpunkt in der Puppenentwicklung (Abbildung 2). Männliche oder weibliche weiße Vorpuppen (Abbildung 2A, B) mit einem feuchten Pinsel sammeln und auf benetztem Filterpapier in einer 60-mm-Zellkulturschale inkubieren. Das Puppenstadium und die Entfernung aus dem Puppenfall wurde bereits beschrieben20,26.
    HINWEIS: Puppen durchlaufen mit zunehmendem Alter mehrere morphologische Veränderungen, wie z. B. Kopfeversion und Pigmentierung des Puppengehäuses, der Augen und der Borsten19,41 (Abbildung 2C). Diese morphologischen Merkmale können als grober Anhaltspunkt verwendet werden, um das Alter einer Puppe zu bestimmen (Abbildung 2D-E) und um Puppen zu identifizieren, die sich nicht normal entwickeln (Abbildung 2F). Um jedoch einen genauen Zeitplan für die Inszenierung zu gewährleisten, wird empfohlen, weiße Vorpuppen in engen Zeitfenstern zu sammeln, z. B. alle 30 Minuten oder alle 2 Stunden. Eng abgestufte Zeitpunkte sind notwendig, um größere Veränderungen der Zytoskelettstruktur und der Myofaserlänge zu unterscheiden, die von 24 h bis 35 h APF auftreten, sowie um Unterschiede in der Sarkomerstruktur bei 35h, 48 h, 60 h, 72 h, 80 h und 90 h APF zu unterscheiden18,42.
  2. Stellen Sie die notwendigen Utensilien zusammen, darunter einen Pinsel, zwei Dumont #5-Pinzetten mit Biologietipps, eine Vannas-Federschere, ein Doppelklebeband, einen Objektträger, eine Kunststoffpipette, eine 24-Well-Platte, Kimwipes und Kryostatklingen (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie 1x PBS, 0,05% PBS-T und Fixierlösungen vor (siehe Zusatzdatei 1). Eine Übersicht über das Flussdiagramm der folgenden Puppen-Hemithorax-Dissektion ist verfügbar (Ergänzende Abbildung 2).
  3. Übertragen Sie zum gewünschten Zeitpunkt mit einem Pinsel die Puppen vom Filterpapier auf einen Streifen Doppelklebeband, der unter einem Stereo-Präpariermikroskop bei 10- bis 20-facher Vergrößerung auf einen Objektträger geklebt wird (Abbildung 3A,B). Richten Sie die Puppen mit der Bauchseite nach unten in die gleiche Richtung auf dem Band aus.
  4. Verwenden Sie eine Pinzette #5, um die Vorderseite der Puppenhülle der ersten Puppe zu öffnen, und entfernen Sie vorsichtig das Operculum (den Bereich über dem Kopf) (Abbildung 3C, D, I).
  5. Verwende vorsichtig eine Pinzette #5, um entlang der Puppenhülle direkt dorsal zum Flügel zu schlitzen, und schäle die Puppenhülle in Schritten von 1-2 mm von der Puppe ab. Kleben Sie die Puppenhülle auf das Doppelklebeband, während Sie von vorne nach hinten arbeiten (Abbildung 3E - G, I). Vermeiden Sie es, in die Puppe selbst zu stechen, sondern führen Sie die Pinzettenspitze zwischen die Puppenhülle und die Basalmembran/den Puppensack ein, der die Puppe umgibt.
  6. Nachdem das Gehäuse entfernt wurde, heben Sie es mit der Pinzette mit einer Schöpfbewegung unter (Abbildung 3H, I) und übertragen Sie die Puppe vorsichtig aus dem Gehäuse in einen Tropfen 1x PBS auf einem zweiten Objektträger (Abbildung 3J, K), um eine Dehydrierung zu vermeiden. Wiederholen Sie die Schritte 2.4 bis 2.6 (Abbildung 3I), bis alle Puppen aus der Puppenhülle entfernt wurden.
  7. Entfernen Sie den Bauch von den präparierten Puppen mit einer Federschere von Vannas (Abbildung 3L).
    HINWEIS: Im folgenden Schritt wird der Bauch entfernt, um eine bessere Penetration durch das Fixiermittel zu ermöglichen. Um eine Beschädigung des Brustkorbs zu vermeiden, schneiden Sie direkt in den Bauch und lassen Sie bis zu 30 % des Bauches am Brustkorb haften.
  8. Übertragen Sie den Puppenkopf vorsichtig mit dem Thorax (Abbildung 3M) mit einer Bürste oder Pinzette auf 500 μl Fixierlösung in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte. Fixieren Sie für die gewünschte Zeit (typischerweise 15-60 Minuten) und waschen Sie 1 ml 0,05 % PBS-T, wie in den Schritten 1.5-1.6 beschrieben.
  9. Entfernen Sie den Puffer mit einer 200-μl-Pipette und übertragen Sie die Thorazen mit einem Pinsel oder einer Pinzette auf einen Tropfen von 0,05 % PBS-T auf einem Objektträger unter einem Stereo-Präpariermikroskop unter 10-facher Vergrößerung.
  10. Trennen Sie eine Probe von der Probe und richten Sie sie mit der Bauchseite nach unten und stabilisiert zwischen einem Paar Dumont #3 Pinzetten aus (Abbildung 3N).
  11. Schieben Sie eine Kryostat-Klinge über den Thorax, bis die Basalmembran und die Nagelhaut aufgeschlitzt sind, und schneiden Sie dann in einem sanften Abwärtsstrich entlang der Mittellinie nach unten (Abbildung 3O), um die Thorax-Hemisektionen zu erzeugen, die die IFMs freilegen (Abbildung 3P).
    HINWEIS: "Sägen" Sie die Klinge nicht hin und her, da diese Bewegung die IFMs mechanisch beschädigt, was zu ausgefransten Myofibrillen führt. Zu viel Puffer destabilisiert den Thorax zwischen den Pinzetten und erschwert den Schnitt. Puppenthoraken können mit aufgesetztem Kopf geschnitten und entweder nach links oder rechts ausgerichtet werden.
  12. Bewegen Sie die beiden Hälften des Brustkorbs in eine Position auf dem Objektträger, an der sie mit Puffer bedeckt bleiben, um ein Austrocknen zu vermeiden, aber zukünftigen Schnitten nicht im Weg stehen. Wiederholen Sie die Schritte 2.10-2.12, bis alle Durchgänge durchtrennt sind.
  13. Verwenden Sie eine Pinzette, um Thorax-Halbschnitte vom Objektträger auf 500 μl 0,05 % PBS-T in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte zu übertragen, und fahren Sie mit der Blockierung und Immunfärbung fort (siehe Schritt 4 unten).

3. Open-Book-Dissektion der frühen Puppen-IFM (~15 h bis 48 h APF) (Abbildung 4)

  1. Stadien der Puppen des gewünschten Genotyps und Alters bis zum ausgewählten Punkt in der Puppenentwicklung (Abbildung 2), wie oben beschrieben (Schritt 2.1).
    HINWEIS: Bei der Sektion mit offenem Buch sollten die Puppen in Gruppen von nicht mehr als 8-10 Fliegen präpariert werden.
  2. Stellen Sie die notwendigen Vorräte zusammen, darunter einen Pinsel, zwei Dumont #5-Pinzetten mit Biologietipps, eine Vannas-Federschere, ein Doppelklebeband, einen Objektträger, eine Plastikpipette, eine Präparierschale aus schwarzem Silikon, eine Färbeschale aus schwarzem Glas, Insektennadeln und fusselfreie Tücher (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie 1x PBS, 0,05% PBS-T und Fixierlösungen vor (siehe Zusatzdatei 1). Eine Übersicht über das Flussdiagramm der folgenden Puppen-Open-Book-Dissektion ist verfügbar (Ergänzende Abbildung 3).
  3. Entfernen Sie zum gewünschten Zeitpunkt die Puppen aus dem Puppengehäuse, wie in den Schritten 2.3-2.6 beschrieben. Übertragen Sie die Puppen nach der Entnahme aus der Puppenhülle in eine schwarze Silikon-Präparierschale, die mit 1x PBS gefüllt ist (Abbildung 4A).
  4. Nachdem alle Puppen aus der Puppenhülle befreit wurden, verwenden Sie eine Dumont #5 Pinzette, um die Oberflächenspannung zu überwinden, und drücken Sie die präparierten Puppen vorsichtig auf die Oberfläche des Silikons. Ordnen Sie die Puppen in einer Linie in der Nähe der Mitte der Schale an (Abbildung 4B).
  5. Führen Sie zwei Insektennadeln mit einer Dumont #5 Pinzette durch den Bauch jeder Puppe ein, um sie an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 4C,D). Achten Sie darauf, dass die Puppen mit der Bauchseite nach oben ausgerichtet sind.
  6. Schneiden Sie mit einer Vannas-Federschere die Basalmembran und die vordere Kopfregion jeder Puppe auf (Abbildung 4E).
  7. Führen Sie die Schere in die Öffnung ein und schneiden Sie entlang der rechten und linken Seite jeder Puppe (Abbildung 4F, G, Q). Positionieren Sie die Schere und schneiden Sie knapp unterhalb des sich entwickelnden Notums zurück zum Übergang zwischen Thorax und Bauch, um die Beine und Flügel mit dem ventralen Teil zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Schere horizontal eingeführt wird und den dorsalen Teil des Thorax nicht berührt (Abbildung 4Q).
  8. Verwenden Sie eine Dumont #5 Pinzette, um den ventralen Teil der Puppe zu greifen und anzuheben und ihn mit einer Vannas-Federschere zu entfernen (Abbildung 4H, I, Q).
  9. Entfernen Sie das Gehirn, den ventralen Nervenstrang (VNC), die Luftröhre und den Darm mit einer Dumont #5-Pinzette (Abbildung 4J,K,Q). Achten Sie darauf, die sich entwickelnden IFMs nicht zu stören, die sich direkt unter der Luftröhre und dem VNC befinden, das an der Epidermis am dorsalen Teil des Thorax befestigt ist.
  10. Schneiden Sie die Spitze einer 200-μl-Pipettenspitze ab, um eine breitere Öffnung zu schaffen. Verwenden Sie eine 200-μl-Pipette mit der abgeschnittenen Spitze, um 1x PBS-Puffer vorsichtig über den Thorax zu spülen, um die meisten der verbleibenden Fettkörper zu entfernen und die IFMs freizulegen (Abbildung 4L,M). Seien Sie vorsichtig, um ein Reißen der Sehnenansätze zu vermeiden, die die Myofasern mit der Epidermis verbinden.
  11. Schneiden Sie mit einer Vannas-Federschere die Mittellinie des dorsalen Thorax ab, so dass zwei "Blättchen" mit IFMs entstehen (Abbildung 4N).
  12. Schneiden Sie die Segel des dorsalen Thorax mit einer Schere vom Bauch ab (Abbildung 4O, Q) und übertragen Sie die Segel mit einer Dumont #5 Pinzette in eine schwarze Glasschale mit 300 μl Fixierlösung (Abbildung 4P). Fassen Sie die Segel mit der Pinzette am Kopfgehäuse an, um eine Beschädigung der IFM-Myofasern oder -Sehnen zu vermeiden.
  13. Fixieren Sie für die gewünschte Zeit (typischerweise 15 Minuten). Verwenden Sie eine 200-μl-Pipette, um das Fixiermittel vorsichtig zu entfernen, und waschen Sie 500 μl 0,05 % PBS-T ein. Fahren Sie mit der Blockierung und Immunfärbung fort (siehe Schritt 4 unten).
    HINWEIS: Proben nicht in schwarzen Glasschalen nutatisieren oder steinen. Muskel-Sehnen-Ansätze in frühen Puppenstadien sind sehr zerbrechlich und reißen bei ständiger Pufferbewegung, was zum Verlust von IFMs führt. Pipettieren Sie langsam und vorsichtig um die Ränder des Puffers in der Schale, um zu vermeiden, dass beim Lösungswechsel Proben in die Pipettenspitze gesaugt werden.

4. Immunfärbung und Histochemie von fixierten IFM-Proben

  1. Stellen Sie die erforderlichen Verbrauchsmaterialien zusammen, einschließlich einer Pipette, Pipettenspitzen und der erforderlichen Antikörper oder Färbungen. Bereiten Sie 0,05 % PBS-T, Blockierungslösung und Antikörper-/Farbstoffgemische vor (siehe Zusatzdatei 1).
  2. Pipettieren Sie die Waschlösung (0,05 % PBS-T) von den Proben ab und fügen Sie die Blocklösung hinzu. Inkubieren Sie die Proben mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in Blockierlösung (mit Schaukeln in den Schritten 1-2, ohne Schaukeln in Schritt 3).
    HINWEIS: Die Proben können alternativ über Nacht bei 4 °C blockiert werden. In diesem Protokoll wurden die Proben in 5 % normalem Ziegenserum (NGS) in 0,05 % PBS-T blockiert. Weitere Informationen zu den Möglichkeiten der Blockierungslösung finden Sie in der Zusatzdatei 1.
  3. Entfernen Sie die Blockierlösung mit einer Pipette von den Thorasen. Fügen Sie eine primäre Antikörpermischung hinzu und inkubieren Sie sie mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C (mit Schaukeln in den Schritten 1-2, ohne Schaukeln in Schritt 3).
    HINWEIS: Dieses Protokoll ist mit den meisten Primärantikörpern kompatibel. Antikörper sollten in Blockierungslösung verdünnt werden. Die mit diesem Protokoll getesteten primären Antikörperverdünnungen reichen von 1:10 bis 1:2000 und werden experimentell für jeden einzelnen Antikörper bestimmt. Weitere Einzelheiten zur Optimierung der Primärantikörperfärbung finden Sie in der Zusatzdatei 1.
  4. Entfernen Sie das primäre Antikörpergemisch mit einer Pipette und waschen Sie die Proben 3x für jeweils 10 min in 0,05 % PBS-T.
  5. Geben Sie der Probe einen sekundären Antikörper oder eine Färbemischung zu. Decken Sie die Probe mit einem Stück Alufolie ab, um das Ausbleichen zu minimieren. Mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren (mit Schaukeln für Schritt 1-2, ohne Schaukeln für Schritt 3).
    HINWEIS: Die meisten Sekundärantikörper und fluoreszierenden Zellfärbungen können mit diesem Protokoll verwendet werden. Viele Sekundärantikörper werden in einer Verdünnung von 1:500 verwendet. In den nachstehenden repräsentativen Daten (siehe Repräsentative Ergebnisse) wurden die Zellkerne mit DAPI (1 mg/ml-Stamm, verdünnt 1:1000 in 0,05 % PBS-T) und F-Aktin mit Rhodamin-Phalloidin (300 Einheiten/ml-Stamm, verdünnt 1:500 in 0,05 % PBS-T) markiert.
  6. Entfernen Sie das Sekundär-/Fleckengemisch mit einer Pipette und waschen Sie die Proben 4x für jeweils 10 Minuten in 0,05 % PBS-T bei Raumtemperatur. Fahren Sie direkt nach dem Waschen mit der Montage (Schritt 5) fort.

5. Einbetten von gefärbten Proben auf Objektträger für die Mikroskopieanalyse (Abbildung 5)

  1. Stellen Sie die notwendigen Verbrauchsmaterialien zusammen, darunter einen Pinsel, eine Pinzette, mattierte Objektträger, Deckgläser (#1 Dicke), klaren Nagellack, Eindeckmedium und fusselfreie Tücher (siehe Materialtabelle).
  2. Beschriften Sie den mattierten Schreibbereich eines Objektträgers mit der relevanten Probennummer oder bevorzugten Identifikationsinformationen (Datum, Genotyp, Antikörper, Objektträgernummer usw.).
  3. Fügen Sie Deckglasabstandshalter (#1 Deckgläser) hinzu und lassen Sie zwischen den Deckgläsern etwa 1 cm für die Probenplatzierung (Abbildung 5A-C). Verwenden Sie einen kleinen Tropfen 50 % Glycerin, um die Abstandshalter an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 5A, D).
    HINWEIS: Abstandshalter verhindern Probenverzerrungen beim Einbetten dicker Proben. Erwachsene Thorasen benötigen in der Regel einen 2-Deckglas dicken Abstandshalter, 48 h APF-Thorax einen 1-Deckglas dicken Abstandshalter und Open-Book-Broschüren keinen Abstandshalter.
  4. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium in die Vertiefung zwischen den Abstandshaltern oder in die Mitte des Objektträgers, wenn frühe Puppenproben eingelagert werden (Abbildung 5C-D). Legen Sie den Objektträger unter ein Stereo-Präpariermikroskop.
    HINWEIS: Es stehen mehrere Arten von Einhängemedien zur Verfügung. Wenn Sie ein selbsthärtendes Medium verwenden, sollten Sie ein Medium mit einer Aushärtungszeit von mehreren Stunden in Betracht ziehen, um genügend Zeit für die richtige Ausrichtung der Proben zu haben, bevor das Medium aushärtet. Es wurde gezeigt, dass Einbettmedien die Sarkomerabmessungen 43,44,45 beeinflussen, daher sollte für alle Proben in einem Experiment dasselbe Reagenz verwendet werden.
  5. Verwenden Sie eine Pipette, um so viel Waschpuffer wie möglich aus den Proben zu entfernen. Übertragen Sie die Proben sofort mit einer Pinzette oder einem Pinsel auf den Tropfen des Einbettmediums auf dem Objektträger (Abbildung 5E).
  6. Ordnen Sie die Proben mit der Dumont #5-Pinzette in Reihen und Spalten an, stellen Sie sicher, dass sich die Proben nicht überlappen, und richten Sie die Thorasen mit den IFMs nach oben aus (Abbildung 5F,J,Q,S). Die Ausrichtung kann ein vorsichtiges Wenden der Proben an der Stelle erfordern, an der die Borsten/Nagelhaut nach oben zeigt (Abbildung 5G,H,K, L,R). Achten Sie darauf, die IFMs nicht zu berühren, da der Kontakt die Sarkomerstruktur beschädigen kann (siehe Repräsentative Ergebnisse).
  7. Tragen Sie vorsichtig ein Deckglas #1 (18 x 18 mm oder 22 x 22 mm) über die Thoraxproben auf (Abbildung 5M). Wenn Sie Abstandshalter verwenden, drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas, bis es die Abstandshalter auf beiden Seiten der Proben berührt (Abbildung 5N).
  8. Verwenden Sie eine Pipettenspitze oder eine Pipette, um den Probenbereich mit Eindeckmedium zu vfüllen, bis alle Thrazen umschlossen sind (Abbildung 5O). Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, die die Bildaufnahme stören.
  9. Verwenden Sie klaren Nagellack, um die Nasshalterung zu versiegeln. Denken Sie daran, sowohl das Musterdeckglas als auch die Abstandsgläser abzudichten (Abbildung 5P,S).
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Top Coat oder schnell trocknendem Nagellack, da diese schlecht abdichten und sich beim Verdampfen des Einbettmediums Luftblasen bilden.
  10. Trocknen Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. In einem Objektträger bei 4 °C lagern. Folien können über mehrere Tage oder Wochen hinweg abgebildet werden.
  11. Bilden Sie Proben auf einem Fluoreszenzmikroskop, einem konfokalen Mikroskop oder einem anderen System entsprechend dem Versuchsdesign ab. Protokolle für die Erfassung und Bildanalyse sind an anderer Stelle verfügbar 14,30,46,47,48.

Ergebnisse

Das oben vorgestellte Dissektionsprotokoll kann verwendet werden, um qualitativ hochwertige Proben für die mikroskopische Analyse der IFM-Myofaser- und Sarkomer-Morphologie bereits ab 8 h nach der Pupariumbildung (APF) mit der Open-Book-Methode (Schritt 3) über die adulten Stadien mit dem Hemithorax-Dissektionsansatz (Schritte 1 und 2) zu generieren. Diese Dissektionen wurden unter anderem zur Untersuchung der Muskel- und Sarkomerbildung 18,42,49, der Transkriptionsfaktorfunktion50,51 und der RNA-Regulation37,38 angewendet. Die unten aufgeführten repräsentativen Ergebnisse zeigen die Kompatibilität dieses Protokolls mit verschiedenen Fixationsmethoden, beschreiben häufige Dissektionsartefakte und verwenden den Smn E33-Mutanten-Phänotyp, um den Nutzen dieses Protokolls zur Beantwortung morphologischer und zellbiologischer Fragen im IFM-Modell zu veranschaulichen.

Die IFM-Dissektion ist mit mehreren Fixationsmethoden kompatibel

Ein kritischer Aspekt bei der Probenvorbereitung für histochemische oder Immunfluoreszenzproben ist die genaue Konservierung zellulärer Strukturen durch Fixierung. Fixiermittel bewahren die Gewebestruktur und -morphologie, indem sie den Abbau verhindern und Protein- und Lipidstrukturen durch Vernetzung stabilisieren52,53. Unterschiedliche Klassen von Fixiermitteln, z. B. aldehydbasierte und organische Lösungsmittel, weisen unterschiedliche Penetrations- und Vernetzungseffizienzen auf und beeinflussen die Erkennung von Antikörperzielen unterschiedlich, indem sie auf unterschiedliche funktionelle Gruppen abzielen53,54. IFM-Dissektionen sind mit mehreren Fixierungsmethoden kompatibel, einschließlich der Fixierung von 4 % Paraformaldehyd (PFA), 9 % Glyoxal und Methanol (Abbildung 6), was den allgemeinen Nutzen dieses Dissektionsprotokolls unterstreicht.

Um die Größe und Morphologie der Sarkomere mit der Anwendung verschiedener Fixationsmethoden zu vergleichen, wurden Hemithorax-Dissektionen von 1 Tag adulten Fliegen mit1118 Fliegen durchgeführt. Die 4%ige PFA-Fixierung entweder in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Abbildung 6A,E) oder entspannender Lösung (RS) (Abbildung 6B,F) wurde verglichen. Die entspannende Lösung enthält ATP und wird zur Quantifizierung der Sarkomerabmessungen empfohlen, um Sarkomere in ihrem entspannten Zustand zu erhalten20,55 (siehe Zusatzdatei 1). Eine 4%ige PFA-Fixierung bewahrt effektiv die Sarkomer-Morphologie, aber es wurde ein signifikanter Unterschied in der Sarkomerbreite zwischen 4% PFA-Fixierung bei PBS und RS beobachtet (Abbildung 6I,J). Die Fixierung in Methanol bewahrte die Myofaser- und Sarkomerstruktur (Abbildung 6C,G), aber die Sarkomere waren signifikant kürzer und dünner als bei 4% PFA-Fixierung (Abbildung 6I,J). IFMs konnten mit einer 9%igen Glyoxalfixierung über Nacht (Abbildung 6D,H) wirksam konserviert werden (3%ige Glyoxalfixierung war unwirksam), was auch die Sarkomerbreite im Vergleich zu einer 4%igen PFA-Fixierung signifikant veränderte (Abbildung 6I,J). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass IFM-Hemithoraces mit mehreren Fixiermitteln effektiv konserviert werden können. Da jedoch sowohl das Fixiermittel als auch der Puffer die Messung der Sarkomerdimensionen beeinflussen können, sollten die Experimente mit geeigneten Kontrollen und einem klar definierten und konsistenten Fixierungsprotokoll konzipiert werden.

Häufige Präparierungs- und Fixationsartefakte in IFMs

Eine Herausforderung bei der Mikroskopie, insbesondere für neue Anwender und Auszubildende, besteht darin, technische Artefakte von Knochen-Phänotypen zu unterscheiden. Um diese Unterscheidung bei Drosophila-IFMs zu erleichtern, werden repräsentative Daten der am häufigsten beobachteten Artefakte und Dissektionsfehler präsentiert (Abbildung 6). Fixationsprotokolle erfordern eine Optimierung der Art, Konzentration und Länge der Fixierung, um eine Unter- oder Überfixierung zu vermeiden 52,53,54. Unter Verwendung eines Fixationszeitverlaufs von w1118 1-Tages-Hemithorax-Dissektionen bei Erwachsenen, die in 4% PFA in entspannender Lösung inkubiert wurden, wurde beobachtet, dass eine 15- oder 30-minütige Fixationszeit die Sarkomermorphologie genau bewahrt, während eine 7-minütige Fixierung zu inkonsistenten Sarkomermorphologien führt (Abbildung 6K-M). Darüber hinaus ist das Gewebe weniger steif und hat eine kürzere Fixierungszeit, was es schwieriger macht, den Thorax zu schneiden und zu halbieren, ohne die IFMs zu beschädigen. Sowohl beim Schneiden als auch beim Einbetten können zusätzliche Artefakte entstehen. Die IFM-Myofaserstruktur kann unregelmäßig erscheinen, wenn die Klinge stumpf ist und Risse oder Ausfransungen verursacht (Abbildung 6N) oder wenn die Klinge verrutscht oder der Schnitt abgewinkelt ist (Abbildung 6O). Kommen Pinzetten während der Handhabung oder Montage in direkten Kontakt mit festen IFMs, machen sie einen Abdruck, der zu Vertiefungen oder Dehnungen führen und die Sarkomere auseinanderziehen kann (Abbildung 6P). Auch die Dehnung oder Verformung des Thorax, sei es beim Schneiden, bei der Handhabung oder bei der Montage, zieht die Sarkomere auseinander und führt zum Verlust einer klar abgegrenzten Z-Scheibe (Abbildung 6Q). Schließlich führt das "Sägen" oder "Reiben" der IFMs mit einer Pinzette oder Klinge zum Abrieb und Entwirren, Ausfransen und Desorganisieren der Myofibrillen, insbesondere an der Oberfläche der Myofaser (Abbildung 6R). Potentielle Nutzer sollten sich mit diesen technischen Artefakten vertraut machen und sie von der phänotypischen Analyse ausschließen.

Entwicklungsprogression des Smn E33-Phänotyps bei IFMs

Open-Book- und Hemithorax-Dissektionen sind besonders nützlich, um den Entwicklungsverlauf eines Muskelphänotyps zu verfolgen und um genau zu bestimmen, wann in der Entwicklung ein interessierendes Gen wirkt oder Myofibrillen-Phänotypen auftreten. Der IFM-Entwicklungsphänotyp von SmnE33, einem hypomorphen Allel des RNA-bindenden Proteins Survival motor neuron (Smn)39 , wird als repräsentative Daten präsentiert, die den breiten Nutzen von Open-Book- und Hemithorax-Dissektionen verdeutlichen.

Die kleinen nukleären Ribonukleoproteine (snRNPs), die das Spleißosom bilden, den makromolekularen Komplex, der die Spleißreaktion zur Erzeugung von mRNAskatalysiert 7, werden durch den SMN-Komplex zusammengesetzt. Der SMN-Komplex, bestehend aus Survival-Motoneuron (Smn) und Gemin-Proteinen, ist für die Lebensfähigkeit in allen Organismen erforderlich56. Reduzierte SMN-Spiegel beim Menschen führen zu der schweren erblichen neuromuskulären Störung Spinale Motorische Atrophie (SMA)21. Drosophila wurde als Modell verwendet, um die Ätiologie von SMA und die zelluläre Funktion von Smn zu verstehen, einschließlich der Entwicklung des hypomorphen Allels SmnE33. SmnE33 Fliegen sind lebensfähig und fruchtbar, können aber nicht fliegen oderspringen 39. Während SmnE33-Fliegen Defekte bei der Arborisierung von Motoneuronen aufweisen, weisen sie auch eine unorganisierte IFM-Struktur und einen Verlust der flugmuskelspezifischen Actin88F-Expression auf39,57. SMN ist bei Fliegen und Mäusen an der Z-Scheibe co-lokalisiert39, was darauf hindeutet, dass Smn eine muskelspezifische Funktion haben könnte.

Um ein besseres Verständnis dafür zu erlangen, wann die Myofibrillenstruktur verloren geht und die Smn-Funktion für die Muskelentwicklung erforderlich ist, wurde eine Entwicklungsverlaufsanalyse des Smn E33-Phänotyps bei IFMs bei 26 h APF, 72 h APF und 1 bis 5 Tage adulter Haut durchgeführt. Während Kontroll-w1118 IFMs sowohl bei 72 h APF als auch bei Erwachsenen ein starkes Phalloidin-gefärbtes F-Aktin-Signal (Abbildung 7E,E',I,I') und eine reguläre Sarkomerstruktur (Abbildung 7G,G',K,K') aufweisen, ist das Phalloidinsignal in SmnE33 dramatisch reduziert (Abbildung 7F,F',J,J') und Sarkomerstrukturen fehlen (Abbildung 7H,H',L,L') IFMs. F-Aktin wird stattdessen in netzartigen Strukturen um Zellkerne herum oder in unregelmäßigen Bündeln oder "Starburst"-Strukturen im Zytoplasma beobachtet (Abbildung 7H,H',L,L'), was mit einem Verlust der Act88F-Expression18, 39 und einer Unfähigkeit, dünne Filamente zusammenzusetzen, übereinstimmt. Open-Book-Dissektionen wurden durchgeführt, um den Phänotyp von SmnE33 bei 26 h APF zu untersuchen, und zeigten, dass die frühe IFM-Entwicklung in SmnE33 normal verläuft. Vergleichbar mit w1118 Kontroll-IFMs (Abbildung 7A,A',C,C') haben SmnE33-Fliegen 6 dorsale longitudinale IFM-Fasern pro Hemithorax, bilden vor der Myofibrillogenese organisierte F-Aktin-Kabel an der Myofaserperipherie (Abbildung 7B,B') und weisen ein netzartiges F-Aktin-Netzwerk in der gesamten Myofaser auf (Abbildung 7D,D'). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Anfangsstadien der IFM-Differenzierung normal ablaufen, während Smn in späteren Stadien der IFM-Entwicklung notwendig ist, um die Act88F-Expression aufrechtzuerhalten und Sarkomere zu bilden. Wichtig ist, dass diese repräsentativen Ergebnisse die phänotypische Detailgenauigkeit und Auflösung veranschaulichen, die durch Open-Book- und Hemithorax-Dissektionen erreicht werden können.

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Abbildung 1: Hemisektionsdissektion von adulten IFMs. (A) Positionieren Sie eine adulte Fliege in 1x PBS auf einem Objektträger. (B) Verwenden Sie eine Pinzette (cyan, Punkt), um die Fliege zu stabilisieren, und entfernen Sie den Kopf mit einer Schere (orange). (C-E) Entferne den linken (C) und rechten (D) Flügel sowie den Bauch (E). (F) Entsorgen Sie den Kopf, den Bauch und die Flügel und übertragen Sie den Thorax in das Fixiermittel. (G,H) Richten Sie einen fixierten Thorax auf einem Objektträger in einem Tropfen von 1x PBS-T aus, wobei das hintere (P) und das Scutellum nach oben zeigen (G), wobei Sie eine Pinzette verwenden, um die Orientierung (H) zu stabilisieren. (I-K) Schneiden Sie den Thorax mit einer Kryostat-Klinge in zwei Hälften (I-J), um zwei Thorax-Halbsektionen (K) zu erzeugen. (L) Diagramm einer Kryostatenklinge und eines Thorax, das die Position des sagittalen Schnitts zur Herstellung von Halbschnitten veranschaulicht. Die Klinge wird nach rechts geschoben, um das Scutellum des Thorax einzukerben, und dann in einer gleichmäßigen Bewegung nach unten bewegt (gelbe Pfeile), um den Thorax zu durchtrennen (gestrichelte rote Linie). (M,N) Schematische Darstellung einer koronalen (M) und transversalen (N) Ansicht des Thorax, die die Position der Hauptmuskelgruppen und die Position des Schnitts (zwischen den gelben Dreiecken) veranschaulicht. Die Ausrichtung des Thorax ist angedeutet (L, links; R, rechts; V, ventral; D, dorsal; A, anterior; P, posterior). Maßstabsleisten = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Puppenstadium und Merkmale der Puppenentwicklung. (A) Männliche und (B) weibliche Puppen können bei 0-2 h APF als weiße Vorpuppen unterschieden werden. Männliche Puppen haben paarige, runde, durchscheinende Strukturen (der sich entwickelnde Hoden) nach hinten (Pfeile). (C) Tabelle der Merkmale, die als Kennzeichen der Puppenentwicklung dienen. Zu den Merkmalen gehören die Reifung der Puppenhülle, die Kopfeversion und die Ablösung der Puppe von der Puppenhülle, die Entwicklung der Augenpigmentierung, die Pigmentierung der Borsten, Flügel, Beine, des Epandriums und der Kutikula sowie die Sichtbarkeit des jungfräulichen Flecks (Mekonium). Augenfarbe und Pigmentierung verdunkeln sich zunehmend. Der Zeitpunkt und die Stadien der Puppenentwicklung, die oben in jeder Spalte der Tabelle gekennzeichnet sind (Zeitpunkte in schwarzer Schrift, entsprechendes Stadium der Puppenentwicklung unten in blauer Schrift), wurden zuvor von Bainbridge und Bownesdefiniert 19,41. (D-E) Zeitverlauf der Puppenentwicklung bei 0-2 h, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h APF bei einer intakten Puppe mit roten Augen (D; Mef2-Gal4, fln-GFP) und in einer Puppe mit orangefarbenen Augen, die aus der Puppenhülle herausseziert sind (E; Fln-Gal4). Beachten Sie die fortschreitende Verdunkelung der Augen und Borsten von 48 h bis 96 h APF. (F) Beispiele für die Letalität der Puppen zu frühen, mittleren und späten Zeitpunkten der Entwicklung. Pharate letale Fliegen sind voll ausgebildet, schließen sich aber nicht vollständig von der Puppenhülle ab. Maßstabsleisten = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Hemisektionsdissektion von Puppen-IFMs (>48 h APF). (A-H) Entnahme einer Puppe aus dem Puppengehäuse. Befestigen Sie die Puppen an einem Streifen Doppelklebeband (A,B). Ziehen Sie den vorderen Kamm (C) auf und entfernen Sie das Operculum (D) mit einer Dumont #5 Pinzette (blau, Pfeil zeigt Bewegungsrichtung, Punkt ist stationär). Schneiden Sie die Puppenhülle mit einer Pinzette in Streifen (G) auf (E) und ziehen Sie sie ab (F). Streifen der Puppenhülle werden auf das Doppelklebeband geklebt. Nachdem du den Bauch freigelegt hast, hebe die Puppe aus dem Etui (H). (I) Schematische Darstellung des Prozesses des Sezierens einer Puppe aus der Puppenhülle. Die Abbildungsfelder, die den einzelnen Schritten im Schaltplan entsprechen, sind beschriftet (unten). Die rot gestrichelte Linie markiert, wo die Pinzette eingeführt werden kann, ohne die Puppe zu beschädigen, um die Puppenhülle aufzuschneiden. (J-L) Nachdem Sie die Puppe aus dem Gehäuse (J) genommen und in einem Tropfen von 1x PBS (K) auf einen Objektträger übertragen haben, verwenden Sie eine Schere, um den Bauch (L) zu entfernen. (M) Entsorgen Sie den Bauch und übertragen Sie den Thorax in das Fixiermittel. (N) Nach der Fixierung die Puppenthoraken in einem Tropfen von 1x PBS-T auf einen Objektträger übertragen. Richten Sie die Puppe mit der Rückenseite nach oben aus und stabilisieren Sie sie mit einer Pinzette. (O-P) Verwenden Sie eine Kryostat-Klinge (O), um einen Puppen-Halbschnitt (P) zu schneiden. Die Platzierung des Schnitts ist die gleiche wie in Abbildung 1 M-N. Maßstabsleisten = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Open-Book-Dissektion von Puppen-IFMs (<48 h APF). (A) Nach der Entnahme der Puppe aus dem Puppengehäuse, wie in Abbildung 3 A-I gezeigt, wird die Puppe in einer schwarzen Silikon-Präparierschale auf 1x PBS übertragen. (B-D) Drücke die Puppe vorsichtig mit einer Pinzette (B) auf die Oberfläche der Silikonschale und stecke sie mit der Bauchseite nach oben mit zwei Insektenstiften (C, D) fest. (E) Öffnen Sie die Basalmembran (bm) und die Nagelhaut des Kopfes mit einer Schere (orange). (F,G) Entlang der rechten (F) und linken (G) Seite schneiden. Die Position des Schnitts ist in (Q) dargestellt. (H,I) Heben Sie den ventralen Teil mit einer Pinzette (H) an und entfernen Sie ihn mit einer Schere (I). (J,K) Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gehirn (J), die laterale Rumpfluftröhre und den Darm (K) zu entfernen. (L-M) Verwenden Sie einen sanften Pufferstrahl aus einer Pipette, um Fettkörper zu entfernen und die IFMs freizulegen. (N) Den Thorax in zwei Blättchen schneiden. (O,P) Schneiden Sie die Packungsbeilagen ab und geben Sie sie in ein Fixiermittel. (Q) Schematische Zusammenfassung der Schritte in einer Open-Book-Sektion. Die Abbildungsfelder, die den einzelnen Schritten entsprechen, sind beschriftet (unten). Die Draufsicht und die Seitenansicht veranschaulichen die Platzierung der Schnitte (gestrichelte rote Linie) auf der linken und rechten Seite der Puppe. Die Flügel, Beine und der Rüssel (beschriftet) werden verwendet, um die dorsale und ventrale Seite der Puppe zu unterscheiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Probenmontage auf Objektträgern. (A-D) Deckglas-Abstandshalter werden zur Aufnahme von dicken Thorax-Halbschnittproben verwendet. Glycerin (A) wird verwendet, um Abstandshalter (#1 Deckgläser) auf einem beschrifteten Objektträger (B) zu befestigen, und die Proben werden in Einbettmedium im Raum zwischen den Abstandshaltern (C) montiert. Späte Puppen und erwachsene Thorasen benötigen zwei #1 Deckglas-Abstandshalter (D). Zeitpunkte in der Mitte der Puppe erfordern einen einzigen #1 Deckglas-Abstandshalter, und frühe Puppendissektionen können ohne Abstandshalter montiert werden. (E-H) Adulte Hemithorax-Proben werden mit einer Pinzette oder einem Pinsel (E) in Einbettmedium überführt. Die Thomasen sind zunächst zufällig orientiert (F) und müssen möglicherweise mit einer Pinzette (G) umgedreht werden, so dass die IFMs nach oben zum Deckglas (H) ausgerichtet sind. (I-L) Fiederblättchen aus frühpuppenartigen Sektionen aus offenen Büchern werden zur Montage mit einer Pinzette (I) übertragen. Die Fiagblätter sind zufällig ausgerichtet (J) und können mit einer Pinzette (K) so umgedreht werden, dass die IFMs nach oben zum Deckglas (L) zeigen. (M-P) Nachdem die Proben richtig ausgerichtet sind, legen Sie ein Deckglas über die Proben (M) und klopfen Sie es auch gegen die Abstandshalter (N). Füllen Sie die Proben mit Eindeckmedium (O) und achten Sie darauf, dass sich keine Blasen bilden. Versiegeln Sie alle offenen Kanten des Deckglases und der Abstandshalter mit Nagellack (P), um ein Verdampfen des Eindeckmediums zu vermeiden. (Q-R) Bilder von korrekt montierten adulten Thoraxproben (Q, 10-fache Vergrößerung), die mit den IFMs nach oben zum Deckglas (R, 20-fache Vergrößerung) ausgerichtet sind. (S) Ein Schema der fertigen Folie, mit Proben, die zwischen Abstandshaltern und Nagellack nach IFM-up ausgerichtet sind und alle offenen Kanten versiegeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: IFM-Dissektionen sind mit verschiedenen Fixiermitteln kompatibel. (A-H) Konfokale z-Projektion der Myofaserstruktur (A-D) oder Einzelebenenbilder der Myofibrillen- und Sarkomerstruktur (E-H) der Kontrollgruppe w1118 adulter IFM. Die Hemithorax-Dissektion ist mit mehreren Fixierungsmethoden kompatibel, einschließlich 4 % Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (A,E) oder entspannender Lösung (RS) (B,F), Methanol (C,G) oder 9 % iger Glyoxallösung (D,H). DAPI (1:1000), blau; Phalloidin (1:500) gefärbtes F-Aktin, grau. (I,J) Quantifizierung der Sarkomerlänge (I) und -breite (J) von E-H. Die Fixierungsmethode und der Puffer können die Messung der Sarkomerlänge und -breite erheblich beeinflussen. Eine Sarkomerlänge von 3,040 ± 0,2935 μm mit Methanolfixierung war signifikant kürzer als die gemessenen Längen von 3,271 ± 0,2736 μm, 3,190 ± 0,2586 μm und 3,217 ± 0,2023 μm mit PFA (PBS), PFA (RS) bzw. 9% Glyoxalfixierung (p < 0,001). Die Sarkomerbreite unterschied sich signifikant zwischen allen getesteten Fixationsmethoden (PFA (PBS), 1,410 ± 0,1331 μm; PFA (RS), 1,284 ± 0,2514 μm; Methanol, 1,280 ± 0,1538 μm; und 9 % Glyoxalfixierung, 1,137 ± 0,2032 μm). Boxplots werden mit Tukey-Whiskern dargestellt, wobei Ausreißerdatenpunkte als schwarze Punkte markiert sind. Die Signifikanz wurde mittels ANOVA mit einem Post-hoc-Tukey-Test bestimmt (**, p < 0,01; ****, p < 0,001). (K-M) Konfokale Einzelebenenbilder eines Fixationszeitverlaufs von adultem w1118 in 4% PFA in RS-Fixation, die zeigen, dass Fixationszeiten von 15 (L) oder 30 (M) min, im Vergleich zu 7 min (K), zu einer gut erhaltenen und konsistenten Sarkomerstruktur führen. (N,O) Z-Stapel-Projektionen von adulten Act88F-Gal4-IFMs, die in 4% PFA fixiert sind, zeigen Dissektionsartefakte in Myofasern. Häufige Artefakte sind geschnittene, ausgefranste oder partielle Myofasern von einer stumpfen Klinge (N) oder einem abgewinkelten Schnitt (O). (P-R) Konfokale Einzelebenenbilder von erwachsenen w1118 Proben, die in 4 % PFA in PBS fixiert waren, zeigen häufige Dissektionsartefakte in Sarkomeren und Myofibrillen. Häufige technische Artefakte sind die unregelmäßige Dehnung von Sarkomeren aufgrund des Kontakts mit der Pinzette während der Montage (P), das Herausziehen von Z-Scheiben aus dem Register durch Dehnen von Myofasern während des Längsschnitts (Q) und ausgefranste, unorganisierte oder sich kräuselnde Myofibrillen aufgrund von Abrieb oder einer stumpfen Klinge (R). DAPI (1:1000), blau; Phalloidin (1:500) gefärbtes F-Aktin, grau. Maßstabsleiste = 100 μm (A-D, N-O), 5 μm (E-H, K-M, P-R). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Anwendung von Dissektionen zur Untersuchung des entwicklungsbedingten IFM-Phänotyps von SmnE33. (A-D) Muskelstruktur in frühen Puppen bei 26 h APF. Konfokales Einzelebenenbild der Myofaserstruktur (A, A', B, B') und der Myofibrillen- und Sarkomerstruktur (C, C', D, D') in Kontrolle (A, A', C, C') und SmnE33(B, B', D, D'). Sowohl control als auch SmnE33 haben sechs IFM-Myofasern pro Hemithorax und bilden F-Aktin-Kabel. (E-H) Muskelstruktur in späten Puppen bei 72 h APF. Z-Projektionsbild der Myofaserstruktur in Kontrolle (E, E') und SmnE33 (F, F'). IFMs in SmnE33 sind basierend auf der DAPI-Färbung vorhanden, aber es fehlt ein starkes F-Aktin-Signal. Konfokale Einzelebenenbilder zeigen, dass Kontroll-IFMs eine hochorganisierte Sarkomerstruktur (G, G') aufweisen. Im Gegensatz dazu weisen SmnE33 IFMs (H, H') abnormale sternähnliche F-Aktin-Strukturen (gelbe Pfeile) auf und es fehlt die organisierte Sarkomerstruktur, die bei Kontroll-IFMs beobachtet wurde. (I-L) Adulte Muskelstruktur in Kontrolle (I, I', K, K') und SmnE33(J, J', L, L'). Z-Projektion (I,J) und konfokale Einzelebenenbilder (K,L) zeigen einen stark reduzierten F-Aktingehalt und abnormale Aktinstrukturen (gelbe Pfeile) in SmnE33IFMs. DAPI (1:1000), blau; Phalloidin (1:500) gefärbtes F-Aktin, magenta oder grau. Maßstabsleiste = 50 μm (A, B), 10 μm (C, D, G, H, K, L), 100 μm (E, F, I, J). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Eine detaillierte Beschreibung der Fixierungs- und Färbemethoden, die im Text verwendet werden, insbesondere zur Generierung der in Abbildung 6 und Abbildung 7 gezeigten Daten. Zusätzliche Informationen zur Bestimmung der Verdünnungen von Primärantikörpern sind enthalten. Eine Liste der Pufferkomponenten und Rezepte, die in diesem Protokoll verwendet werden, wird ebenfalls bereitgestellt. Diese Daten motivieren das Dissektionsprotokoll und zeigen seinen Nutzen für die konfokale Mikroskopie und die Analyse entwicklungsbedingter IFM-Phänotypen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Flussdiagramm der Schritte bei der Hemithorax-Dissektion von adulten IFMs. Textuelle Zusammenfassung der Schritte in Abbildung 1 zur Vorbereitung von Hemithorax IFM-Schnitten. Nach der Dissektion, Fixierung und Thoraxhalbsektion werden die Schnitte für die mikroskopische Analyse gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Flussdiagramm der Schritte bei der Hemithorax-Dissektion von Puppen-IFMs. Textuelle Zusammenfassung der Schritte in Abbildung 3 zur Vorbereitung von Hemithoraxschnitten von Puppen-IFMs. Nach der Entnahme aus der Puppenhülle werden die Puppen fixiert, halbiert und für die Mikroskopie gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Flussdiagramm der Schritte bei der Open-Book-Dissektion von frühen Puppen-IFMs. Textuelle Zusammenfassung der in Abbildung 4 gezeigten Schritte zur Durchführung einer Open-Book-Dissektion von Puppen-IFMs vor 48 h APF. Nach der Dissektion und Fixierung werden epitheliale Segel mit angehängten IFMs für die Mikroskopie angefärbt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren für die Hemithorax-Dissektion von adulten (Abbildung 1) und späten Puppen (48 h - 96 h APF) (Abbildung 3) IFMs sowie für die Open-Book-Dissektion von IFMs zu frühen Zeitpunkten (8 h - 48 h APF) (Abbildung 4) vor. Dieses Protokoll ist optimal für Anwendungen in der Immunhistochemie und Fluoreszenzmikroskopie. Das Protokoll wird mit schematischen Diagrammen und schrittweisen Fotos des Präpariervorgangs illustriert. Übersichtsdiagramme machen das Protokoll sowohl für Wissenschaftler, die neu auf dem Gebiet der Drosophila sind, als auch für Forscher im Grundstudium und Praktikanten im Frühstadium zugänglich. Repräsentative Beispiele für Artefakte der schlechten Fixierung und Probenvorbereitung sind enthalten, um es den Protokollbenutzern zu ermöglichen, Artefakte von echten Sarkomer-Phänotypen zu unterscheiden.

Der schwierigste Schritt bei der IFM-Hemithorax-Dissektion ist die Halbierung des Thorax (Abbildung 1I, J, L und Abbildung 3O). Dieser Schritt erfordert Zeit und Übung, um ihn zu meistern. Für zusätzliche Stabilität beim Schneiden können einzelne Durchhänge auf ein Doppelklebeband gelegt und36 geschnitten werden, wobei jedoch darauf geachtet werden sollte, dass die IFMs nicht austrocknen. Es ist auch möglich, von der ventralen Seite des Thorax aus zu schneiden, wobei die dorsale Seite nach unten zeigt, so dass neue Benutzer testen können, welcher Ansatz mit ihrem Setup am effektivsten ist. Schnitte sollten mit neuen, scharfen Klingen durchgeführt werden, um eine Beschädigung der IFMs zu vermeiden, und eine Klinge sollte ausgetauscht werden, wenn sie stumpf wird. Mikrotom-Klingen (Kryostaten) werden verwendet, um den Thorax in diesem Protokoll sauber zu schneiden, im Vergleich zu anderen Protokollen, die eine Nadel, eine Pinzette oder eine Skalpellklinge verwenden24, 32, 36. Rasierklingen sind eine weitere Alternative, um den Brustkorb sauber zu halbieren. Die Fixierung ist auch vor der Bisektion wichtig, da leicht fixiertes Gewebe, obwohl es stabil erhalten bleibt, "matschig" und schwieriger zu schneiden sein kann. Fixationszeiten von 30-60 min gleichen die Verfügbarkeit von Antigenen und die Gewebesteifigkeit aus, was Schnitte erleichtert, und können mit Erfahrung auf 15 min verkürzt werden.

Eine Einschränkung von Hemithorax-Präparaten ist die Antikörperpenetration. Hemithoraces sind dicke Proben32, und die besten konfokalen Mikroskopaufnahmen werden aus den oberen 10-20 μm der IFMserhalten 42, 58. Eine zu niedrige Waschmittelkonzentration oder eine zu kurze Permeabilisierungszeit können zu einer schwachen und ungleichmäßigen Färbung führen. Die Antikörperpenetration kann auch durch eine längere Inkubation (2-3 Tage) im Primärantikörper verbessert werden. Ein Zwei-Photonen-System oder ein Objektiv mit größerem Arbeitsabstand kann ebenfalls die Abbildungstiefeerhöhen 59. Wenn der Experimentator den vollen Durchmesser der IFM-Myofaser abbilden muss, sollte ein alternativer Ansatz wie Mikrotom24, 58 oder Kryosektion27 in der Sagittalebene in Betracht gezogen werden.

Ein wichtiger Aspekt, der im Hauptprotokoll nicht behandelt wird, ist die Bilddatenanalyse. Für die Analyse von IFM-Myofasern in 10x- oder 20x-Bildern (Abbildung 6A-D, Abbildung 7A,B,E,F,I,J) umfasst die Standardanalyse die Bestimmung, ob die Myofasern anhaftet sind und ob die grobe Morphologie der Myofaser intakt ist37, 38. Beispiele für Parameter, die je nach Experiment quantifiziert werden können, umfassen die Länge, Breite, Anzahl, Anzahl der angehängten Myofasern oder die Anzahl der gerissenen Myofasern37, 60. Ein großer Vorteil dieses Protokolls ist die Kompatibilität mit der Fluoreszenzmikroskopie und die Möglichkeit, die Morphologie von Sarkomeren und Myofibrillen bei höheren Vergrößerungen von 60x oder 100x zu analysieren (Abbildung 6E-H, Abbildung 7C,D,G,H, K,L). Die Sarkomermorphologie sollte in Proben analysiert werden, die frei von technischen Artefakten sind (Abbildung 6K-P). Eine Reihe von Kategorien möglicher Myofibrillen- und Sarkomer-Phänotypen wurde zuvor definiert60. Am häufigsten werden Sarkomerlänge und -breite entweder durch Zeichnen und Messen einer Linie von Z-Scheibe zu Z-Scheibe in einer Bildverarbeitungssoftware oder alternativ unter Verwendung eines von mehreren automatisierten Werkzeugen gemessen, die frei verfügbar sind18, 45, 61. Die Beurteilung der Sarkomermorphologie kann durch Einschluss von Markern verbessert werden, die die Z-Scheibe oder M-Linie oder die dicken oder dünnen Filamentemarkieren 30, 34, 58. Diese Daten können verwendet werden, um Myofaser-, Myofibril- und Sarkomer-Phänotypen zwischen einer Kontroll- und einer Testprobe, die mit diesem Dissektionsprotokoll hergestellt wurde, quantitativ zu beschreiben.

Die Benutzer des Protokolls sollten sich darüber im Klaren sein, dass die Fixierung zwar die Morphologie von Myofasern und Sarkomeren beibehält, dass jedoch Fixiermittel sowie Puffer und das Eindeckmedium eine Gewebeschrumpfung oder -schwellung verursachen und die Messung morphologischer Parameter beeinflussen können45. Es ist bekannt, dass die für die Elektronenmikroskopie erforderliche Glutaraldehyd-Fixierung und -Dehydrierung den Sarkomerdurchmesser43 schrumpft, während Faserhäutung und Glyceration nachweislich den Sarkomerdurchmesser44,45 erhöhen. Dieses Phänomen könnte den Unterschieden in den Sarkomerparametern in der Literatur zugrunde liegen und unterstreicht, wie wichtig es ist, Kontroll- und Testproben in jedes Experiment einzubeziehen. Kontroll- und Test-IFMs sollten gleichzeitig in denselben Puffern verarbeitet werden, um einen genauen Vergleich der quantitativen Sarkomer-Parameter zu ermöglichen.

Dieses detaillierte Protokoll zielt darauf ab, die IFM-Dissektion bei Erwachsenen und Kindern für die Immunhistochemie und Fluoreszenzmikroskopie für Anfänger und fortgeschrittene Drosophilisten zugänglicher zu machen. Dieses Protokoll kann sowohl für die Verwendung mit anderen Insekten als auch für andere bildgebende Verfahren wie Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), Einzelmolekül-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) oder räumliche Transkriptomik angepasst werden. Die Kombination von leistungsstarken Drosophila-Genetik-Werkzeugen mit Fluoreszenzmikroskopie bietet einzigartige Möglichkeiten, konservierte Prinzipien der Myogenese und Muskelfunktion zu untersuchen. Da IFMs auch für molekulare und biochemische Ansätze zugänglich sind26, 27, werden zukünftige Studien, die molekulare Phänotypen mit Muskelmorphologie, Zellbiologie und Funktion in Verbindung bringen, ein tieferes Verständnis der Myogenese und der Ätiologie von Muskelerkrankungen ermöglichen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Gregory Matera für die Bereitstellung des SmnE33-Allels und für hilfreiche Diskussionen über Smn. Die Autorinnen und Autoren danken Frank Schnorrer, Cornelia Schoenbauer, Manuela Weitkunat und Aynur Kaya-Copur für die hilfreichen Gespräche und die Unterstützung. Die Autoren würdigen das Bloomington Stock Center für die Bereitstellung von Fliegen. Diese Arbeit wurde durch eine Anschubfinanzierung der University of Missouri Kansas City (UMKC) School of Science and Engineering, Division of Biological and Biomedical Systems (MLS), des UMKC Funding for Excellence Program (MLS) und des UMKC Office of Undergraduate Research and Creative Scholarship (SF, MLS) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
60 mm GewebekulturschalenFisher ScientificFB01292160 mm, Polystyrol
Essigsäure, glazial (zertifizierte ACS)Fisher ScientificA38S-212
Adenosintriphosphat (ATP)Millipore SigmaA1852
Alufolie, schwerAmazonas12 Zoll. x 1000 Fuß.
Schwarze Silicium-Dissektionsschalen: AktivkohlepulverMillipore SigmaC9157Auch in den meisten Apotheken erhältlich
Schwarze Silicium-Dissektionsschalen: Sylgard 184Millipore Sigma761036Um Silizium-Dissektionsschalen herzustellen, mischen Sie Sylgard-Komponenten in einem Ziploc-Beutel und mischen Sie sie gut. Aktivkohlepulver (~200 mg) zu Sylgard geben (~50 g), gut mischen, die Ecke des Beutels abschneiden, 60 mm Kulturschalen füllen, Blasen mit einer Pipettspitze entfernen und über Nacht aushärten. 
Karton-Schlittenfach, Research Products International CorpFisher Scientific50-136-7558
Konfokalmikroskop, Nikon AXR invertiertes KonfokalmikroskopNikonwww.microscope.healthcare.nikon.com/
Konfokalmikroskop, Zeiss LSM 780 invertiertes konfokales MikroskopZeisswww.zeiss.com
Darwin Insektenaufzuchtkammer (Brutkasten)Fisher Scientific/Darwin ChambersIN034Licht-, Temperatur- und Luftfeuchtigkeitskontrollierter Brutkasten
Dissektionsschale (schwarzes Glas)Mikroskop Technik Diethelm398011Lymphbecken (Färbeschalen/Lymphtanks), schwarzes Glas, 4x4 cm, mit klarem Glasabdeckel
Dumont #3 ZangeFeine wissenschaftliche Werkzeuge11231-30Dumoxel gerade Spitze 12 cm Tange mit 0,17 x 0,1 mm Spitze 
Dumont #5 ZangeFeine wissenschaftliche Werkzeuge11252-20Inox gerade Spitze 11 cm Zange, Biologie-Qualität mit 0,05 x 0,02 mm Spitze 
EGTA (Egtazsäure)Millipore Sigma324626
Ethanol, Absolut (200 Proof)Fisher ScientificBP28184Molekularbiologie-Qualitätsstufe
Fisherbrand Premium Cover Glass (18 x 18 mm), CoverslipsFisher Scientific12548AGlas, quadratisch, #1 Dicke (0,13 - 0,16 mm)
Fisherbrand Premium Cover Glass (22 x 22 mm), DeckscheibenFisher Scientific12548BGlas, quadratisch, #1 Dicke (0,13 - 0,16 mm)
Flachboden-Zellkulturplatten (24-Well)Fisher Scientific7200740
Fluoreszierende Mikroskopkamera, Infinity8-KameraTeledyne (Visual Dynamix)6 Megapixel, wenig Licht, monochromatisch
Fliege: Smn[E33]Fliegentiere; Geschenk von Gregory Matera
Fliege: w[1118]Bloomington Stock CenterRRID:BDSC_3605Fliegentiere
GlycerolFisher ScientificBP229-1Molekularbiologie-Qualitätsstufe
Glyoxallösung (40 Gewicht % in H2O)Millipore Sigma128465  Das ist eine 40%-Standardlösung
Bildverarbeitungssoftware, Affinity Designer 2Affinitäthttps://affinity.serif.com/en-us/
Bildverarbeitungssoftware, Image J (Fidschi)ImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
InsektennadelnFeine wissenschaftliche Werkzeuge26002-10Edelstahl, 0,1 mm Durchmesser (winzige Pins)
Magnesiumchlorid (MgCl2)Fisher ScientificAA12315A1
Methanol (HPLC)Fisher Chemical (Fisher Scientific)A452-4Bei -20 entspannen? Vor der Nutzung
Mikroskop-Objektträger, mit FrostFisher Scientific12-550-400Schreibfläche, ungeladen, 75 mm x 25 mm x 1 mm
Mikroskopobjektträger, einfaches GlasFisher Scientific12-544-4Vorgereinigt, 75 mm x 25 mm
MX35 Ultra Mikrotom-KlingenEpredien (Fisher Scientific)3053835Niedriges Profil, 34°F; Schneidwinkel; C35-Feder-80mm-Blätter funktionieren gut
Nagellack, klar (Sally Hansen Xtreme Wear Nail Lack)Amazonas0,4 fl. Unzen.
Normales ZiegenserumMillipore SigmaS26-LITER
Nutator (Mini-Nutating Rocker, Benchmark)Midwest ScientificH3D102024 U/min, fixiert; 8 x 6 Zoll. Plattform mit Vertiefungsmatte
Paintbrush (Runde Nr. 0)AmazonasRunde Nr. 0 oder ein ähnlicher Pinsel aus jedem Kunstmaterial
Paraformaldehyd (PFA)Millipore Sigma158127-500G
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): KClMillipore Sigma529552-250GMBereite PBS gemäß Cold Spring Harb Protoc vor; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): KH2PO4Millipore SigmaP0662-500GBereite PBS gemäß Cold Spring Harb Protoc vor; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): Na2HPO4Millipore SigmaS9763-500GBereite PBS gemäß Cold Spring Harb Protoc vor; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): NaClFisher Chemical (Fisher Scientific)S271-1Bereite PBS gemäß Cold Spring Harb Protoc vor; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
PR1MA Pipettenspitzen (10 & micro; L)Midwest ScientificPR10XLRK-NSUniversal 10 & Mikro; L-Pipettenspitzen
PR1MA Pipettenspitzen (1000 & micro; L)Midwest ScientificPR-1000RK-FLUniversal 1000 & Mikro; L-Pipettenspitzen
PR1MA Pipettenspitzen (200 & micro; L)Midwest ScientificPR-200RK-NSUniversal 200 & Micro; L-Pipettenspitzen
Rhodamin-PhalloidinInvitrogen, molekulare SondenR415
Doppelseitiges Scotch-KlebebandScotch/3M (Staples)649280Beide Seiten sind mit Kleber beschichtet, 0,5" x 7 Yards, erhältlich bei den meisten Büromaterialhändlern
Natriumdihydrogenphosphatdihydrat (NaH2PO4)Fisher ScientificAAA1131636
Software: GraphPad PrismGraphPad-Prismawww.graphpad.com
Software: Infinity Analyze 7Teledyne (Visual Dynamix)https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/
Software: Microscoft ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Taschentücher/ Kimtech Science Kimwipes Sensitive Task Wiper, 1 LagFisher Scientific06-666Standard-Taschentücher
ÜbertragungspipetteFisher Scientific13-711-9AMMDKunststoffpipette
Trition X-100Millipore SigmaT9284-100ML
Vannas FrühlingsschereFeine wissenschaftliche Werkzeuge15000-003 mm Schneide, Spitzendurchmesser 0,05 mm, Länge 8 cm
Vectashield mit DAPIVektorlaboreH-2000
Vectashield ohne DAPIVektorlaboreH-1900
Whatman-PapierMillipore SigmaWHA1004070Filterpapierkreise, Grade 4, 70 mm
Z10 Fluoreszierendes Stereo-SektionsmikroskopVisual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/
Z850 ergonomisches Stereo-Zoom-SeziermikroskopVisual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/

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