Method Article

Modell des halbsegmentalen diaphysären Knochendefekts bei Ratten zur Bewertung der Knochensubstitutionsleistung in belastenden Bereichen

DOI:

10.3791/69211

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December 30th, 2025

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1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Cariology and Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 3Department of Jinjiang Outpatient, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie etablierte ein Modell des Ratten-Femoral-Halbsegmentdefekts, um die mechanische und osteogene Leistungsfähigkeit von Knochenersatzmaterialien unter lasttragenden Bedingungen ohne interne oder externe Fixation zu bewerten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine genaue präklinische Bewertung von Knochenersatzmaterialien erfordert Modelle, die nicht nur die Geweberegeneration unterstützen, sondern auch die mechanischen Herausforderungen physiologischer lasttragender Bedingungen widerspiegeln. Die meisten herkömmlichen Tierknochendefektmodelle liegen jedoch in dieser Hinsicht hinterher. So werden beispielsweise Kalvarialdefektmodelle, obwohl weit verbreitet, in nicht tragenden Bereichen erstellt. Ähnlich konzentrieren sich Bohrloch- oder Teildefekte in langen Knochen hauptsächlich auf lokale Heilung, da eine ausreichende Lastübertragung zur Beurteilung der mechanischen Unterstützung fehlt. Diese Studie etablierte ein standardisiertes Modell des halbsegmentalen diaphysären Knochendefekts im Rattenfemur, um sowohl die mechanische als auch die biologische Leistungsfähigkeit von Knochenersatzmaterialien in einem lasttragenden Kontext ohne Verwendung von Fixationsgeräten zu bewerten. Mit einem Hochgeschwindigkeitshandstück und einem speziellen zylindrischen Zahnbohrer wurde im lateralen Mittelschaft des Oberschenkelknochens ein halbzylindrischer Defekt von 4 mm Länge und 1,5 mm Radius erzeugt. Zwei repräsentative Materialien mit unterschiedlichen Eigenschaften – Gelatine-Methacryloyl (GelMA)-Hydrogel und 3D-gedrucktes Polymethylmethacrylat (3DP-PMMA) – wurden implantiert, um die Fähigkeit des Modells zur Differenzierung der mechanischen Eigenschaften von Materialien zu validieren. Röntgen-, histologische und immunfluoreszente Analysen, die 4 Wochen nach der Implantation durchgeführt wurden, zeigten, dass aufgrund unzureichender mechanischer Unterstützung die GelMA-Implantation zu einer Malunion mit faserigem Gewebe und eingeschränkter Knochenintegration führte. Im Gegensatz dazu erleichterte 3DP-PMMA die Organisation neuer Knochenbildung, periostale Kontinuität und die Rekrutierung von piezo-typ-mechanosensitiven Ionenkanalkomponenten 1-exprimierenden (Piezo1+) und Leptinrezeptor-exprimierenden (LepR+)-Zellen. Dieses Modell bietet eine praktische und reproduzierbare Plattform zur Bewertung der Tragfähigkeit, der Osteoinduktivität und des Osseointegrationspotenzials von Biomaterialien. Es kann als wertvolles Werkzeug dienen, um geeignete Materialien für orthopädische Anwendungen wie die Rekonstruktion oder Reparatur von Langknochen zu überprüfen.

Introduction

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Unter physiologischen Bedingungen spielt der Knochen eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität und mechanischen Funktion des Körpers. Sie unterstützt das Körpergewicht, ermöglicht Bewegung und schützt innere Organe. Wenn Knochen durch Trauma, Tumorentfernung oder Infektion, insbesondere in tragenden Bereichen, geschädigt wird, wird die mechanische Kontinuität unterbrochen. Diese Störung führt häufig zu Komplikationen wie Knochendeformität, eingeschränkter Beweglichkeit, Instabilität der Gliedmaßen, chronischen Schmerzen und sogar lebensbedrohlichen Problemen durch schwere Brüche und Blutungen 1,2. Heutzutage werden Knochenersatzstoffe wie Knochentransplantationen und Biomaterialien klinisch eingesetzt, um schwer beschädigtes Knochengewebe zu ersetzen oder großflächige Knochendefekte zu beheben. Ähnlich kann bei den implantierten Knochenersatzstoffen deren eingeschränkte mechanische Leistung zu einem Implantatversagen führen, was zu Nicht-Zusammenbruch oder sogar katastrophalen Brüchen an der Defektstelle 3,4 führt. Um sowohl Struktur als auch Funktion wiederherzustellen, müssen Knochenersatzmaterialien nicht nur die Knochenregeneration fördern, sondern auch über ausreichende mechanische Festigkeit verfügen, um physiologische Belastungen auszuhalten5.

Ein entscheidender Schritt vor der klinischen Übersetzung ist die realistische Einschätzung, ob ein Biomaterial, einmal in vivo implantiert, die mechanischen Anforderungen für die strukturelle Unterstützung in tragenden Knochenregionen erfüllen kann. Obwohl viele Biomaterialien in vitro oder in kleinen, nicht tragenden Modellen vielversprechend sind, wird ihre Umsetzung in die klinische Praxis oft durch das Fehlen zuverlässiger präklinischer Modelle erschwert, die mechanische Zustände in vivo simulieren. Derzeit verwendete Tiermodelle für Knochendefektstudien umfassen Unterkieferdefekte6, Kalvarialdefekte7, Bohrlochdefekte in langen Knochen8, Postextraktions-Sockets9 und so weiter. Diese Modelle bewerten hauptsächlich die osteogene Kapazität eines Materials und konzentrieren sich auf histologische oder radiologische Regenerationsendpunkte. Da diese Stellen jedoch entweder nicht tragend oder mechanisch geschützt sind, können sie die dynamischen Spannungsbedingungen der langen Knochen12 nicht nachbilden. Selbst wenn mechanische Eigenschaften durch in-vitro-Techniken wie Druck- oder Zugfestigkeitstests getestet werden, gelingt es diesen nicht, die dynamische Belastung und die Wirtsgewebe-Interaktionen zu replizieren, die in vivo-Umgebungen innewohnen13.

Eine große Lücke in der präklinischen Forschung bleibt das Fehlen eines standardisierten, reproduzierbaren Tiermodells, das eine mechanische Bewertung von Knochenersatzstoffen unter belastenden Bedingungen in vivo ermöglicht. Um dem entgegenzuwirken, hat die aktuelle Studie ein halbsegmentales diaphysäres Knochendefektmodell bei Ratten etabliert. Dieses Modell bietet eine stabile und reproduzierbare Defektstelle in einer tragenden Region, die eine direkte Bewertung der mechanischen Unterstützungskapazität von Knochenersatzmaterialien unter physiologischer Belastung ermöglicht und gleichzeitig die Bewertung osteogener Ergebnisse ermöglicht. Darüber hinaus kann das Modell auf verschiedene Tierarten angewendet werden, wobei Defektgröße und -standort je nach verwendetem Tier angepasst werden. Dennoch repliziert sie nicht vollständig die komplexe biomechanische Umgebung menschlicher Knochen, und für Studien, die sich ausschließlich auf nicht tragende Defekte, Schädelknochenheilung oder sehr große strukturelle Implantate konzentrieren, könnten alternative Modelle geeigneter sein.

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Protocol

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Alle in dieser Studie durchgeführten Tierverfahren erhielten die Genehmigung des Ethischen Ausschusses der West China School of Stomatology der Universität Sichuan (WCHSIRB-AT-2025-342). Männliche Sprague-Dawley-Ratten (je 180 g) wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen und zufällig in zwei Gruppen (n = 6 pro Gruppe) je nach implantiertem Material zugeteilt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Präoperative Vorbereitung

  1. Chirurgische Gegenstände
    1. Bereiten Sie chirurgische Instrumente vor, basierend auf Abbildung 1A, die den nummerierten Etiketten in der Abbildung entspricht, in folgender Reihenfolge: gebogene Pinzette, einwegsteriles Skalpell, gerade Schere, periostealer Aufzug, Bewässerungsnadel, ein bestimmter zahnärztlicher Diamantbohrer (siehe die vergrößerte Ansicht in Abbildung 1B), Hochgeschwindigkeitshandstück, Vernier-Bremssattel, chirurgischer Motor, Monofilamentnaht (4-0) und Nadelhalter.
    2. Bereiten Sie 0,9 % sterile Kochsalzlösung zur Bewässerung vor.
  2. Sterilisation und Desinfektion
    1. Sterilisiere chirurgische Instrumente, die dem Autoklavieren standhalten, darunter gebogene Zangen, Schere, Periostal-Aufzug, Zahndiamantbohrer, Hochgeschwindigkeitshandstück und Nadelhalter.
      HINWEIS: Instrumente sollten in medizinische Nichtgewebe gewickelt und mit Autoklavenband für die Dampfsterilisation bei 121–134 °C für 20–25 Minuten versiegelt werden.
    2. Bei hitzeempfindlichen Instrumenten wie Vernier-Bremssätteln und chirurgischem Motor sollte man sie mindestens 30 Minuten ultraviolettem Licht zur Desinfektion aussetzen. Einwegartikel wie das einweg-sterile Skalpell, die Bewässerungsnadel und Nähte sollten bis zur Verwendung in ihrer ursprünglichen sterilen Verpackung versiegelt bleiben.
    3. Stellen Sie sicher, dass die chirurgische Umgebung steril und temperaturkontrolliert ist. Wischen Sie die OP-Bank und die umliegenden Oberflächen mit 75 % Ethanol ab. Verwenden Sie sterile, medizinisch hochwertige Non-Woven Stoffe zur Abdeckung des Operationstisches.
      VORSICHT: Ethanol ist brennbar; Entfernen Sie sich von Zündquellen und lagern Sie sie in geschlossenen Behältern. Sammeln Sie Ethanolabfälle in ausgewiesenen chemischen Abfallbehältern für eine ordnungsgemäße Entsorgung. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, darunter Handschuhe, einen Laborkittel und eine Schutzbrille.
  3. Anästhesie
    1. Wiegen Sie die Ratte und berechnen Sie die Anästhetikumsdosis (100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin, intraperitoneal).
    2. Führen Sie 20 Minuten vor der Operation eine Anästhesie ein (nach institutionell genehmigten Protokollen) und überprüfen Sie deren Tiefe, indem Sie auf das Ausbleiben einer Reaktion auf das Zehenkneifen und den Verlust des Aufrichtreflexes prüfen.
    3. Tragen Sie beide Augen mit einer Augensalbe auf, um das Trocknen der Hornhaut während des Eingriffs zu verhindern.

2. Chirurgischer Eingriff

  1. Standortvorbereitung
    1. Setzen Sie die Ratte in eine seitliche liegende Position auf die sterile chirurgische Bank. Rasieren Sie den Bereich des lateralen Oberschenkels, der der Oberschenkelprojektion entspricht, und desinfizieren Sie die Haut mit 2 % Jod-Tinktur, gefolgt von 75 % Ethanol (Abbildung 2Ba).
      VORSICHT: Jodtinktur ist entflammbar und reizend. Behandle sie in einem gut belüfteten Bereich mit Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille. Entsorgen Sie gebrauchte Feuchttücher und Lösungen in ausgewiesenen chemischen Abfallbehältern gemäß institutionellen Sicherheitsvorschriften.
    2. Decken Sie die Operationsstelle mit dem sterilen fenestrierten Laken ab, um die Asepsis aufrechtzuerhalten.
  2. Öffnung der Operationsstelle
    1. Verwenden Sie gebogene Pinzetten, um das Gewebe zu stabilisieren, die Muskeln zu halten und den Oberschenkelknochen während des gesamten chirurgischen Eingriffs vorsichtig zu sichern (Abbildung 2Bb-h).
    2. Machen Sie mit einer geraden Schere einen 2–3 cm langen Längsschnitt auf der Seite des Oberschenkels, um die darunterliegenden Muskeln freizulegen (Abbildung 2Bb).
    3. Identifizieren Sie die Musculus rectus femoris und vastus lateralis und trennen Sie sie sorgfältig entlang der sichtbaren weißen Faszie (angezeigt durch den gelben Pfeil in Abbildung 2Bb) mit einer geraden Schere (Abbildung 2BC).
    4. Lokalisieren und legen Sie die Muskelansätze auf der Seitenfläche des Oberschenkelknochens frei (Abbildung 2Bd).
    5. Machen Sie mit einem einweg-sterilen Einwegskalpell einen Längsschnitt entlang der Muskelansätze, um Zugang zur Oberschenkeloberfläche zu erhalten (Abbildung 2Be).
      HINWEIS: Bei einer scharfen Dissektion (mit Schere oder Skalpell) zur Weichteiltrennung sollten Sie darauf achten, die darunterliegenden Blutgefäße und Nerven nicht zu schädigen. Wenn Sie mit den anatomischen Strukturen nicht vertraut sind, verwenden Sie eine fein gespitzte Zange und einen periostalen Aufzug zur stumpfen Sektion.
    6. Führen Sie eine stumpfe Sektion mit einem periostealen Elevator durch, um Muskelansätze zu lösen und die mittlere Diaphyse des Oberschenkelknochens vollständig freizulegen (Abbildung 2Bf).
    7. Trennen Sie den Oberschenkelknochen weiter von den umliegenden Muskeln und halten Sie den Mittelschaft des Oberschenkelknochens mit gebogener Pinzette fest (Abbildung 2Bg).
  3. Etablierung eines halbsegmentalen diaphysären Knochendefektmodells
    1. Befestigen Sie den flachen, zylindrischen spezifischen Zahndiamant (Abbildung 1B) Bohrer am Hochgeschwindigkeitshandstück, das vom chirurgischen Motor angetrieben wird. Stellen Sie den Operationsmotor auf 35.000 U/min ein.
    2. Identifizieren Sie bei der direkten Visualisierung den höchsten Punkt des Oberschenkelmittels als anatomisches Zentrum für die Entstehung von Defekten. Bohren Sie an dieser Stelle vertikal nach unten mit dem Bohrer, bis ein plötzlicher Widerstandsverlust festgestellt wird, begleitet vom Auftreten eines Blutergusses im Defekt, was auf vollständige kortikale Durchdringung und Zugang zur Medullärhöhle hinweist (Abbildung 2Bh).
      HINWEIS: Angesichts der Unterschiede in der kortikalen Dicke zwischen Tieren wird Bedienern empfohlen, sich mit der Oberschenkelanatomie vertraut zu machen und vorexperimentelle Schulungen zur Standardisierung dieses Schrittes durchzuführen.
    3. Vergrößern Sie den Defekt, indem Sie kontrollierte horizontale Push-Pull-Bewegungen rund um den anfänglichen Durchschlagspunkt anwenden. Verlängern Sie den Defekt längs (entlang der Oberschenkelachse) und seitlich (entlang des Oberschenkeldurchmessers), um allmählich einen standardisierten halbzylindrischen Defekt von 4 mm Länge und 1,5 mm Radius zu bilden (Abbildung 2Bi, siehe Abbildung 2A zur Morphologie und Position des Defekts).
      HINWEIS: Sobald der Mittelpunkt etabliert ist, verwenden Sie einen Vernier-Bremssattel, um die schrittweise Defektvergrößerung zu unterstützen und so gleichmäßige Abmessungen über alle Proben zu gewährleisten. Das flache zylindrische Design des spezialisierten Zahnbohrers passt zum halbzylindrischen Defekt und ermöglicht eine effiziente und reproduzierbare Vorbereitung.
    4. Spülen Sie die Operationsstelle kontinuierlich mit steriler Kochsalzlösung mit der Spülnadel, um thermische Nekrose während des Knochenschnitts zu verhindern.
  4. Knochenersatzimplantation
    1. Entfernen Sie vorsichtig Knochenreste und spülen Sie die Stelle, um Restpartikel zu entfernen.
    2. Implantieren Sie nicht tragende Gelatine-Methacryloyl-(GelMA)-Hydrogele (siehe Materialtabelle) oder tragendes 3D-gedrucktes Polymethylmethacrylat (3DP-PMMA), die für mechanische Leistungstests an der Defektstelle vorgesehen sind, um eine feste Passform zu gewährleisten (Abbildung 2Bj).
      HINWEIS: Die beiden hier verwendeten Biomaterialien wurden bewusst ausgewählt, um gegensätzliche mechanische und biologische Eigenschaften darzustellen: GelMA-Hydrogel dient als weiches, nicht tragendes Material mit begrenztem osteogenem Potenzial, während 3DP-PMMA als starres, belastendes Gerüst wirkt, das eine effektive Spannungsübertragung und eine unterstützende Knochenbildungermöglicht 14 (Abbildung 2A). Dieser Kontrast unterstreicht die Fähigkeit des Modells, Implantate mit einem breiten Bereich an mechanischer Festigkeit und biologischer Leistungsfähigkeit zu bewerten, und in der Praxis kann das Defektmodell angewendet werden, um andere Kandidatenmaterialien mit mechanischen Eigenschaften zu testen.
  5. Schließung der Operationsstelle
    1. Nähen Sie die Muskelschichten mit 4-0 Monofilamentnähten und einem Nadelhalter, wobei Sie darauf achten, übermäßige Spannungen zu vermeiden (Abbildung 2Bk).
    2. Führen Sie den Hautverschluss mit unterbrochenen Nähten durch und desinfizieren Sie die Operationsstelle mit einer 2%igen Iodophorlösung (Abbildung 2Bl).

3. Postoperative Versorgung

  1. Übertragen Sie die Ratten auf ein desinfiziertes, konstantes Heizkissen (37 °C), um eine postoperative Genesung zu ermöglichen.
  2. Geben Sie eine angemessene postoperative Analgesie (z. B. Buprenorphin mit 0,03 mg/kg subkutan alle 12 Stunden für 48–72 Stunden).
  3. Sobald die Ratten wieder zu Bewusstsein kommen, setzen Sie sie in saubere Käfige mit weicher Einstreu und einfachem Zugang zu Futter und Wasser.
  4. Überwachen Sie die Operationsstelle täglich auf Anzeichen von Infektion, Dehiszenz oder abnormaler Schwellung. Beobachten Sie das Verhalten, Gewicht und die Beweglichkeit der Ratten mindestens 7 Tage nach der Operation, um die Genesung sicherzustellen und das Wohlbefinden zu beurteilen.

4. Probenentnahme und Datenerhebung

  1. Probenentnahme
    1. Euthanasiere die Ratten mit Kohlendioxidinhalation und anschließend eine Sekundärbestätigung (nach institutionell genehmigten Protokollen).
    2. Entnehmen Sie die Oberschenkelproben 4 Wochen nach der Einpflanzung, wobei Tiere zunächst zufällig in zwei Materialgruppen (n = 6 pro Gruppe) eingeteilt werden, um die mechanische Leistungsfähigkeit der Materialien zu bewerten.
      HINWEIS: In der GelMA-Gruppe entwickelten drei Tiere kurz nach der Operation vollständige Brüche und wurden ausgeschlossen, sodass drei Proben für spätere Analysen verfügbar blieben.
    3. Fixieren Sie die Oberschenkelproben in 4 % Paraformaldehyd für 48 Stunden bei 4 °C.
      VORSICHT: Paraformaldehyd ist giftig und sollte in einer zertifizierten Abzugshaube behandelt werden. Tragen Sie Handschuhe, einen Laborkittel und eine Schutzbrille oder ein Gesichtsschutz. Sammeln Sie Abfalllösungen in etikettierten Behältern für gefährliche chemische Abfälle zur Entsorgung.
  2. Mikro-Computertomographie (μCT) Bewertung
    1. Durchführung von μCT-Scans an Femurproben, die 4 Wochen nach der Einnistung entnommen wurden, mit folgenden Scanparametern: Röntgenröhrenpotential, 70 kVp; Röntgenintensität, 0,2 mA; Filter, AL 0,5 mm; Integrationszeit, 1 x 300 ms; und Voxelgröße 17 μm.
    2. Führen Sie 3D-Rekonstruktionen mit den vordefinierten Skripten durch, die in der μCT-Maschinensoftware bereitgestellt werden. Erzeugen Sie Querschnittsbilder der Defektstelle mit der Reslice-Funktion einer speziellen Bildverarbeitungssoftware. Folgen Sie den Standardabläufen, wie sie in den jeweiligen Softwarehandbüchern beschrieben sind.
  3. Histologische Färbung
    1. Entkalken Sie die Proben bei 4 °C mit 12 % Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA) (pH 7,2) für 6 Wochen auf einem Shaker.
      HINWEIS: Ersetzen Sie die EDTA-Lösung alle 2 Tage. Überprüfen Sie regelmäßig den Fortschritt der Entkalkung. Die Entkalkung ist abgeschlossen, wenn die Probe unter Druck biegsam ist oder eine Nadel durchführt.
      VORSICHT: Entsorgen Sie EDTA-Lösungen gemäß den institutionellen Richtlinien für wässrige chemische Abfälle. Kontaminiertes biologisches Material sollte als biologisch gefährlicher Abfall behandelt werden.
    2. Trocknen Sie die Proben in einer abgestuften Reihe von Ethanolverdünnungen und legen Sie sie dann in Paraffin ein.
    3. Schneiden Sie die paraffinhaltigen Proben sagittal in 6 μm dicke Scheiben.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte die Schnittstelle zwischen dem implantierten Material und dem Wirtsgewebe enthalten.
    4. Führen Sie Hämatoxylin-Eosin (H&E) und Massons Trichromfärbung mit handelsüblichen Bausätzen durch (siehe Materialtabelle). Führen Sie alle Verfahren strikt nach den Standardprotokollen des Herstellers ohne Abweichungen durch. Beobachten Sie die Heilung der Defektstellen mittels Histopathologie.
      VORSICHT: Entsorgen Sie Färbungslösungen und kontaminierte Verbrauchsmaterialien gemäß institutionellen Biosicherheits- und Entsorgungsprotokollen für gefährliche Abfälle.
  4. Immunfluoreszierende (IF) Färbung
    1. Deparaffinisieren und rehydratisieren 6 μm dicke Paraffinsektionen mit einer Reihe von Xylen- und gradierten Ethanollösungen.
      VORSICHT: Xylol ist entflammbar und giftig. Führe Xylol in einer Abzugshaube, während du Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille trägst. Sammeln Sie Abfalllösungsmittel separat in Chemikalienbehältern zur angemessenen Entsorgung.
    2. Führen Sie Antigenentnahme durch Inkubation der Objektträger im Citratpuffer (pH 6,0) bei 95–100 °C für 15–20 Minuten durch. Lassen Sie die Objektträger natürlich auf Zimmertemperatur abkühlen.
    3. Waschen Sie die Schnitte 5 Minuten lang mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und behandeln Sie die Schnitte 20 Minuten lang mit 0,1 % Triton X-100 in PBS, um die Antikörperpenetration zu erleichtern. Dann blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
      VORSICHT: Triton X-100 ist ein Reizstoff; Wird mit Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille in einem belüfteten Bereich behandelt. Entsorgen Sie Triton X-100-Lösungen als chemischen Abfall in bestimmten Behältern. Für alle Verfahren sollten Lösungen, die mit Gewebeschnitten in Kontakt gekommen sind, wie BSA und PBS, als biologischer Abfall betrachtet werden und gemäß institutionellen Biosicherheitsprotokollen gesammelt und entsorgt werden.
    4. Inkubieren Sie die Schnitte mit primären Antikörpern (anti-Piezo-Typ mechanosensitiver Ionenkanalkomponent 1 (Piezo1), verdünnt 1:200; Anti-Leptinrezeptor (LepR), verdünnt 1:50) im Antikörperverdünnungspuffer. Auf jeden Abschnitt werden 50 μL verdünnte Antikörperlösung aufgetragen und 12–18 Stunden bei 4 °C im Dunkeln in einer befeuchteten Kammer inkubiert.
    5. Waschen Sie die Objektträger mit PBS (3 × 5 Minuten und inkubieren Sie sie dann mit fluorophorkonjugierten sekundären Antikörpern (verdünnt 1:200). Auf jeden Abschnitt werden 50 μL verdünnte Antikörperlösung aufgetragen und 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer inkubiert.
    6. Spülen Sie die Objektträger erneut mit PBS (3 × 5 Minuten ab), dann Gegenfärbungskerne mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) (verdünnt 1:50) für 5 Minuten.
    7. Die Abschnitte mit Antifade-Montagemedium montieren und mit einem Deckdeckel abdecken.
    8. Visualisieren und erfassen Sie Bilder mit einem Laser-Scanning-Konfokalmikroskop mit geeigneten Filtereinstellungen.

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Results

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In dieser Studie wurde das Modell des halbsegmentalen diaphysären Knochendefekts bei Ratten durch das Bohren eines Defekts mit 4 mm Länge und 1,5 mm Radius am Oberschenkelmittelschaft mit einem flachen, zylindrischen spezifischen dentalen Diamantbohr (Abbildung 2A) etabliert. Um die Fähigkeit des Modells zur Prüfung der mechanischen und biologischen Leistung von Materialien zu demonstrieren, stellen wir zwei Vergleichsgruppen zusammen, mit Defekten, die entw...

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Discussion

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Neben den weithin betonten Eigenschaften wie Osteoinduktivität, Osteointegration und Biokompatibilität5 sind die mechanische Reaktionsfähigkeit und Tragfähigkeit von Knochensubstituten ebenso entscheidend, insbesondere zur Reparatur von Defekten in gewichttragenden Knochen22. Konventionelle Beurteilungen der mechanischen Leistung basieren typischerweise auf In-vitro-Methoden wie universellen Prüfmaschinen, Druckprüfungen oder Zugfe...

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Disclosures

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Alle Originaldaten und Bilder sind in diesem Artikel enthalten. Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Diese Studie wurde von der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Sichuan unterstützt (2025ZNSFSC0754).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2%-Iodophor-LösungChengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.Keine
3D-gedrucktes Polymethylmethacrylat (3DP-PMMA)freundlicherweise bereitgestellt vom College of Polymer Science and Engineering der Universität SichuanKeine
4 % ParaformaldehydBiosharpBL539A
75 % EthanolChengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.Keine
WattebäuscheHaishi Hainuo Group Co.,   Ltd.Keine
BaumwollstäbchenLakong Medical Devices Co., Ltd.Keine
DAPI-FärbelösungBeyotime Kat#C1005
Einwegsteriles SkalpellHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.20100227
Gelatine-Methacryloyl (GelMA) Hydrogelefreundlicherweise bereitgestellt vom College of Polymer Science and Engineering der Universität SichuanKeine
GelMA 20%CellinkIKG125000005
Ziegen-Anti-Maus IgG H& L (Alexa Fluor® 594)Abcamab150116
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H& L (Alexa Fluor® 488)Abcamab150077
Hämatoxylin- und Eosin-Flecken-KitBiosharpC1005
HochgeschwindigkeitshandstückFoshan SCS Medical Instrument Co., Ltd.9018499000
BewässerungsnadelSichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.Keine
Masson' s Trichrome Stain KitSolarbioG1340
Medizinische NonwlochstoffeHenan Yadu Industrial Co., Ltd. Keine
Medizinische NonwlochstoffeHenan Yadu Industrial Co., Ltd. Keine
Mikro-Computertomographie (& Mikro; CT) Scanco Medical AGμ CT 45
Mimics 20.0 für Querschnittsbilder (Reslice-Funktion)MaterialisiereKeine
NadelhalterChengdu Shifeng Co., Ltd.Keine
Ob-R/Leptinrezeptor-Antikörper (B-3)Santa CruzSC-8391
Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200Chengdu Knowledge Technology Co., LtdVS200
Periostale AufzugChengdu Shifeng Co., Ltd.Keine
PIEZO1-AntikörperNovusNBP1-78446
KochsalzlösungSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.Keine
Scanco Medical Visualizer-Software für 3D-Bildrekonstruktion (vordefinierte Skripte)Scanco Medical AGKeine
Spezifischer Zahndiamantbohrer (TF-22/170-021m/845-021m)Diantong Dental Materials CompanyKeine
Sprague-Dawley-Ratten Byrness Weil Biotech LtdKeine
Gerade SchereChengdu Shifeng Co., Ltd.Keine
Chirurgischer MotorMARATHONN3-140232
Chirurgische Nähte (4-0 Monofilament)Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.Keine
Vernier-BremssattelDeliDL91150

References

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