Erforschung der Anwendung oberflächenverstärkter Raman-Streuung-basierter Biosensierung einzelner sEVs in der Krankheitsdiagnose und -therapie

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Analyse einzelner kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs) mittels label-freier, oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS), was minimalinvasive Krankheitsdiagnostik und Bewertung von sEVs als therapeutische Verabreichungsmittel ermöglicht.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende, labelfreie Plattform, die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) mit maschinellem Lernen (ML) integriert, um einzelne kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) für diagnostische und therapeutische Anwendungen zu erkennen und molekular zu profilieren. Die Methode beginnt mit der sEV-Isolierung entweder durch Größenausschlusschromatographie oder Ultrazentrifugation. Isolierte Vesikel werden anschließend auf konstruierten plasmonischen Gold-Nanopyramiden-2D-Array-Substraten analysiert, die eine Einzelvesikelsensitivität aufweisen. Durch die Nutzung intrinsischer Raman-biochemischer Fingerabdrücke ermöglicht das Protokoll eine hochspezifizierte Detektion ohne externe Etiketten. Nach der spektralen Erfassung werden die Daten vorverarbeitet und mit trainierten maschinellen Lernalgorithmen (z. B. LDA, SVC) analysiert, um Krankheitszustände zu klassifizieren, wobei Magenkrebs erfolgreich von gesunden Kontrollpersonen mit sEVs aus Gewebe, Plasma und Speichel mit entsprechenden Klassifikationsgenauigkeiten von 90,1 %, 70,9 % und 60,7 % unterschieden wird. Zusätzlich zeigt sich ihre therapeutische Anwendung durch die Quantifizierung der Doxorubicin-Belastung in einzelnen sEVs, eine Messung, die durch die Verwendung von graphenbeschichteten Substraten als internen Standard verbessert wird. Dieser Ansatz ermöglicht eine Hochdurchsatzanalyse, die die Populationsheterogenität erfasst, die für die frühzeitige Erkennung der Krankheit und das Verständnis der Effizienz der Arzneimittelbeladung auf Einzelvesikelebene unerlässlich ist.

Introduction

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), typischerweise mit einem Durchmesser von 30 bis 200 nm, werden von Zellen auf natürliche Weise in biologische Flüssigkeiten ausgeschieden und enthalten Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die auf ihre Ursprungszelle ^1,2,3 hinweisen. Da nicht-invasive Biomarker in Speichel, Urin und anderen Körperflüssigkeiten^vorhanden sind, bieten sie vielversprechende Möglichkeiten für frühzeitige Krankheitsdiagnose, Prognose und therapeutische Überwachung, insbesondere in der Onkologie

Protocol

Die Sammlung menschlicher Proben erfolgte gemäß der Erklärung von Helsinki und wurde vom Institutional Review Board (IRB) der UCLA genehmigt. Alle Spender gaben vor ihrer Teilnahme an der Studie eine schriftliche informierte Einwilligung.

HINWEIS: In dieser Studie wurden insgesamt 4 Zelllinien verwendet: AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), alle von einem kommerziellen Anbieter gekauft. Diese Zelllinien wurden kultiviert und strikt nach den Anweisungen und Reagenzien des Anbieters durchführt. Das konditionierte Medium wurde gesammelt und bei -20 °C gelagert, bevor es....

Results

Die erfolgreiche Umsetzung des Single-Vesicle-SERS-Protokolls ergibt unterschiedliche Raman-Spektren von einzelnen sEVs, was eine nachgelagerte diagnostische Klassifikation und Überwachung der therapeutischen Arzneimittelbelastung ermöglicht. Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf der diagnostischen Studie für Magenkrebs bzw. der medikamentengeladenen sEVs-Überwachungsanwendung, die unser hier beschriebenes Protokoll verwendet.

Discussion

Ein zentraler Aspekt dieses Protokolls ist die Substratvorbereitung und die Reinigung von sEV. Die Leistung von labelfreien SERS hängt stark davon ab, gleichmäßige, hochkonforme plasmonische Substrate mit starkem Enhancement-"Hot Spot" zu erzeugen. Ebenso ist eine hochreine sEV-Isolierung mittels Größenausschlusschromatographie unerlässlich, um zuverlässige und reproduzierbare SERS-Spektren zu erzeugen. Verunreinigungen wie Proteinaggregate oder Lipoproteine schwächen nicht nur .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fisher Scientific	J61196. AP
300-Mesh Kupfergitter	Elektronenmikroskopiewissenschaften	EMS200-Cu
4%-Paraformaldehydlösung	Sigma Aldrich	1004960700
4″ Si wafers	MSE-Lieferungen	WA0810	(100) orientiert
A549-Zelllinie	ATCC	CCL-185
AGS-Zelllinie	ATCC	CRL-1739
Zentrifugenrotor F-35-6-30, 5430	Eppendorf	22654306
CHA Mark 40	CHA Mark 40	https://chaindustries.com/mark-40-system/	E-Strahl-Verdampfung
Cr-Ätzmittellösung	Sigma Aldrich	651826-500ML
Doxorubicin  D-4000	LC Laboratories	D-4000_3g
ExoView R100 System und ExoView Human Tetraspanin Kit	NanoView Biowissenschaften	https://www.nowmedicalstudios. com/portfolio/nanoview- biosciences-3d-product-illustrations
FeCl3 Lösung	Sigma Aldrich	451649
HF-Lösung	Sigma Aldrich	695068-500ML
Hs 738.St/Int Zelllinie	ATCC	CRL-7869
inÜber das konfokale Raman-Mikroskop	Renishaw	https://www.renishaw.com/en/ invia-confocal-raman-microscope --6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0 GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
KOH-Lösung	Sigma Aldrich	417661
MaxQ 4000 Benchtop-Inkubatier-/Kühlshaker	Thermowissenschaftlich	SHKA4000 (4320)
MCO-19AIC-Inkubator	SANYO	8380-30-0035
Millex-GP-Filter	MilliporeSigma	SLGPM33RS	0,22 &mikro; m
NanoSEM 230 Mikroskop	FEI	SEM-FEI-014
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	https://www.malvernpanalytical .com/en/support/product-support /nanosight-range/nanosight-ns300
NCI-N87-Zelllinie	ATCC	CRL-5822
Optima TLX Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 Plus	Oxford Plasmalab	https://plasma.oxinst.com/ Produkte/RIE/PlasmaPro-800-RIE
Polystyrolkugeln	Alfa Aesar	AA42711AB	500 nm
qEVoriginal/35 nm	Izon	ICO-35
Einschichtiges Graphen	MSE-Lieferungen	ME0408
T-75-Kolben	VWR	156800
TF20 Hochauflösende EM	FEI	https://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Uranylacetatlösung	Elektronenmikroskopiewissenschaften	22400-1