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Lange nicht-kodierende RNA PVT1 verbessert die Glykolyse beim Schilddrüsenkarzinom, indem sie HIF-1α stabilisiert und die glykolytische Gentranskription aktiviert

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DOI:

10.3791/69294

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17. Oktober 2025

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1Department of Nuclear Medicine, The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University, 2Department of Gastroenterology, The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University, 3Department of Pathology, The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um zu untersuchen, wie lncPVT1 die HIF-1α-Stabilität und die glykolytische Genexpression in Schilddrüsenkrebszellen reguliert, was die Untersuchung der metabolischen Regulation und potenzieller therapeutischer Ziele ermöglicht.

Zusammenfassung

Als wichtigste Krebserkrankung des endokrinen Systems zeigt das Schilddrüsenkarzinom einen sich beschleunigenden epidemiologischen Trend in der gesamten Bevölkerung. Trotz Fortschritten bei den Behandlungsmodalitäten bleiben Rezidive und Metastasierung Herausforderungen. Die lange nicht-kodierende RNA PVT1 (lncPVT1) hat sich bei mehreren Krebsarten als konservierter onkogener Regulator erwiesen, doch ihre spezifische Funktion bei TC bedarf weiterer Forschung. Unsere Forschung konzentrierte sich auf die Untersuchung, wie lncPVT1 die Glykolyse sowohl unter normoxischen als auch unter hypoxischen Bedingungen mit den TC-Zelllinien TPC-1 und K1 beeinflusst. Die Überexpression von lncPVT1 erhöhte den Glukoseverbrauch und die Laktatproduktion unter Hypoxie signifikant, was seine Fähigkeit zur Steigerung der Glykolyse bestätigt. Darüber hinaus regulierte lncPVT1 wichtige glykolytische Gene wie GLUT1, HK1, HK2 und PGK1 hoch und erleichterte die Proliferation von TC-Zellen. Mechanistisch stabilisierte lncPVT1 den Hypoxie-induzierbaren Faktor 1α (HIF-1α), indem es seinen Abbau behinderte und zu seiner Akkumulation führte. Dieses akkumulierte HIF-1α bindet dann an spezifische regulatorische Sequenzen, die die Expression von Genen steuern, die an der Glykolyse beteiligt sind, wodurch diese Gene letztendlich aktiviert und die glykolytische Aktivität gesteigert wird. Unsere Ergebnisse zeigen, dass lncPVT1 die HIF-1α-Stabilität und die glykolytische Genexpression reguliert, was unser Verständnis des TC-Stoffwechsels verbessert und möglicherweise neue therapeutische Ziele aufdeckt.

Einleitung

Schilddrüsenkrebs (TC), eine weit verbreitete endokrine Malignität, hat einen raschen Anstieg der Inzidenzraten erlebt1. Trotz Fortschritten bei therapeutischen Strategien, einschließlich chirurgischer Eingriffe, Strahlentherapie und Schilddrüsenhormonsuppressionstherapie, ist ein erheblicher Teil der TC-Patienten immer noch dem Risiko eines Tumorrezidivs und einer Metastasierung ausgesetzt, was die Notwendigkeit eines tieferen Verständnisses der molekularen Pathogenese unterstreicht 2,3. Die Entwicklung von TC ist mit mehreren etablierten Risikofaktoren verbunden, darunter Exposition gegenüber ionisierender Strahlung, Kontakt mit chemischen Karzinogenen, Tabakkonsum und Fettleibigkeit; Die komplizierten zugrundeliegenden Mechanismen bleiben jedoch schwer fassbar4. Angesichts des begrenzten Verständnisses der molekularen Mechanismen von TC wurde nicht-kodierenden RNAs, insbesondere lncRNAs, aufgrund ihrer regulatorischen Rolle bei Krebs zunehmend Aufmerksamkeit geschenkt.

Neue Erkenntnisse belegen, dass lncRNAs durch Mechanismen wie alternatives Spleißen, transkriptionelle Regulation und microRNA (miRNA)-Schwamm als zentrale Regulatoren vielfältiger biologischer Prozesse, insbesondere bei der Tumorentwicklung, etabliertsind 5,6,7. Die Translokation 1 der Plasmazytomvariante (PVT1) befindet sich stromabwärts des Chromosoms 8q24.21 und des Onkogens C-myc8. Unter diesen hat lncPVT1, eine lncRNA, die sich stromabwärts des C-myc-Onkogens am Chromosom 8q24.21 befindet, aufgrund ihrer onkogenen Rolle bei mehreren Malignomen, darunter Leberkrebs9 und Nierenzellkarzinom10, große Aufmerksamkeit erregt. Dennoch sind die funktionellen Implikationen von lncPVT1 in TC noch weitgehend unerforscht.

Krebszellen durchlaufen eine metabolische Reprogrammierung, ein Schlüsselmerkmal der Tumorgenese, bei der sie eine erhöhte glykolytische Aktivität in Verbindung mit einer verminderten oxidativen Phosphorylierung aufweisen, nämlich den Warburg-Effekt11. Hypoxie, ein häufiges Merkmal der Mikroumgebung bei soliden Tumoren, beeinflusst das Tumorverhalten tiefgreifend, fördert die Glykolyse und Aggressivität und verleiht eine schlechte Prognose12. Der Hypoxie-induzierbare Faktor 1 (HIF-1), ein Schlüsselfaktor, der die Reaktion der Zelle auf niedrige Sauerstoffwerte reguliert, orchestriert eine Vielzahl von adaptiven Veränderungen, die das Überleben und Fortschreiten des Tumors unterstützen13. Frühere Studien haben gezeigt, dass lncPVT1 die Glykolyse bei mehreren Malignomen moduliert, darunter Brustkrebs14, duktales Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse15 und Osteosarkom16. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass lncPVT1 die Zellproliferation verbessert, indem es HIF-1α beim Nasopharynxkarzinomstabilisiert 17. Die Korrelation zwischen der lncPVT1-Expression und klinischen Parametern wurde jedoch bei Krebs nicht berichtet. Darüber hinaus sind die spezifischen Funktionen und Mechanismen oder einzigartigen klinischen Implikationen von lncPVT1 in der TC unklar. Daher war es das Ziel dieser Studie zu untersuchen, wie lncPVT1 den Glukosestoffwechsel in TC-Zelllinien TPC-1 und K1 beeinflusst, die Normoxie und Hypoxie ausgesetzt sind. Wir untersuchten den Einfluss der Überexpression von lncPVT1 auf den Glukoseverbrauch, die Laktatproduktion und die Zellproliferation. Darüber hinaus entschlüsselten wir lncPVT1-regulierte HIF-1α-Stabilisierungsmechanismen und ihre daraus resultierenden Auswirkungen auf die Glykolyse-bezogene transkriptionelle Programmierung. Diese umfassende Untersuchung bietet neue Perspektiven darauf, wie lncPVT1 zur Tumorentstehung beiträgt, insbesondere im Zusammenhang mit metabolischer Reprogrammierung und hypoxischer Anpassung.

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Protokoll

Zellkultur und Transfektion

Die humanen Schilddrüsenkarzinom-Zelllinien TPC-1 und K1 wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) kultiviert, das 4,5 g/l Glukose enthielt, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 100 μg/ml Penicillin-Streptomycin. Die Zellen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 gehalten. Für die Hypoxiebehandlung wurden 1 x 105 Zellen 24 h lang bei 37 °C in eine versiegelte hypoxische Kammer gebracht, die mit 1 % O2, 5 % CO2 und 94 % N2 äquilibriert war, sofern nicht anders angegeben. Die stabile Überexpression von lncPVT1 (lncPVT1 OE) und die entsprechende Negativkontrolle (NC) wurden in TPC-1- und K1-Zellen unter Verwendung eines lentiviralen Expressionssystems gemäß den Anweisungen des Herstellers erzeugt.

Bewertung des Glukosespiegels

Zur Beurteilung des Glukoseverbrauchs wurden Schilddrüsenkarzinomzelllinien unter normoxischen Bedingungen (21% O2) und hypoxischen Bedingungen (1% O2) für 24 h kultiviert. Die Glukosekonzentrationen im Kulturmedium wurden mit einem Glukose-Assay-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, wurden 2 μl konditioniertes Medium mit frisch zubereitetem Glukose-Arbeitsreagenz gemischt und 10 min lang bei 37 °C inkubiert. Die Extinktion wurde bei 530 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, um den Glukosespiegel zu quantifizieren.

Bewertung des Laktatspiegels

Die Schilddrüsenkarzinom-Zelllinien TPC-1 und K1 (2 x 104 Zellen/Well) wurden unter normoxischen Bedingungen (21% O2, 5% CO2, 37 °C) und hypoxischen Bedingungen (1% O2, 5% CO2, 37 °C) für 24 h kultiviert. Nach der Inkubation wurden die Kulturplatten bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, um Zellen und Ablagerungen zu pelletieren. Anschließend wurden 2 μl des geklärten Überstands aus jeder Vertiefung entnommen und mit 200 μl Laktat-Assay-Reagenz in einer 96-Well-Platte gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 min lang bei 37 °C inkubiert, danach wurde eine Stopplösung zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Die Extinktion wurde bei 530 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Die Laktatkonzentrationen wurden durch Vergleich der Absorptionswerte mit einer Standardkurve bestimmt, die aus bekannten Laktatstandards (typischerweise von 0 bis 20 nmol) erstellt wurde. Alle Messungen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Zellproliferations-Assay

Schilddrüsenkarzinomzellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 3 x 103 Zellen pro Well in 100 μl Kulturmedium ausgesät. Die Zellen wurden dann unter normoxischen (21 % O2, 5 % CO2, 37 °C) oder hypoxischen (1 % O2, 5 % CO2, 37 °C) Bedingungen für 0 h, 24 h oder 48 h inkubiert. Zu jedem Zeitpunkt wurden 10 μl Zellproliferationsreagenz in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte gegeben. Die Platte wurde dann bei 37 °C für 40 min inkubiert. Nach der Inkubation wurde die optische Dichte bei 450 nm (OD450) mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, um die Zellproliferation zu quantifizieren. Alle Messungen wurden in mindestens drei technischen Replikaten durchgeführt.

qRT-PCR-Analyse

Die Gesamt-RNA wurde aus 1 x 106 Schilddrüsenkarzinomzellen unter normoxischen Bedingungen (21 %O2, 5 % CO2, 37 °C) und hypoxischen Bedingungen (1 %O2, 5 % CO2, 37 °C) unter Verwendung eines Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsreagenzes gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Die Reinheit und Konzentration der RNA wurde spektrophotometrisch durch Messung der Absorptionsverhältnisse bei 260/280 nm bewertet. Für die komplementäre DNA-Synthese (cDNA) wurden 500 ng Gesamt-RNA in einem 20-μl-Reaktionsvolumen reverse-transkribiert, das Reverse Transkriptase, zufällige Hexamer-Primer, dNTPs, RNase-Inhibitor und Reaktionspuffer enthielt. Die reverse Transkription wurde 10 min lang bei 25 °C durchgeführt, gefolgt von 42 °C für 50 min und endete mit einer Erwärmung bei 70 °C für 15 min.

Die quantitative PCR wurde unter Verwendung eines SYBR Green-basierten Detektionssystems in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl durchgeführt, das einen cDNA-Template (1:5 bis 1:20 Verdünnung der ursprünglichen cDNA-Synthese), einen SYBR Green PCR-Mastermix, Forward- und Reverse-Primer (jeweils bei 0,2 μM) und nukleasefreies Wasser enthielt. Die PCR-Amplifikation wurde auf einem Thermocycler unter den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten; 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 15 s, Glühen bei 60 °C für 30 s und Ausdehnung bei 72 °C für 30 s; gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse, um die Spezifität der Amplifikation zu überprüfen.

Primersequenzen für GLUT1, HK1, HK2, PGK1 und GAPDH (Tabelle 1) wurden auf der Grundlage der veröffentlichten Sequenzen18 entworfen und kommerziell synthetisiert. Die Expressionsniveaus der Zielgene wurden auf GAPDH normiert und mit der 2-ΔΔCt-Methode 19 berechnet.

Western-Blot

Nach der Behandlung wurden die Schilddrüsenkarzinomzellen 2x mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit einem Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Puffer lysiert, der mit einem Proteasehemmer-Cocktail ergänzt wurde. Die Zelllysate wurden 30 Minuten lang unter intermittierendem Mischen auf Eis inkubiert und dann 15 Minuten lang bei 4 °C bei 12.000 x g zentrifugiert, um unlösliche Ablagerungen zu entfernen. Die Proteinkonzentration des Überstands wurde mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay gemäß den Herstellerangaben bestimmt. Gleiche Mengen an Protein (30 μg pro Probe) wurden mit 5x Ladepuffer gemischt, 5 min lang bei 95 °C gekocht und zur elektrophoretischen Trennung auf 10 % SDS-Polyacrylamid-Gele geladen. Die Proteine wurden durch Elektrophorese bei 120 V für etwa 90 min getrennt und dann mit einem Nasstransfersystem bei 100 V für 90 min bei 4 °C auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen übertragen. Die Membranen wurden 1 h lang bei Raumtemperatur mit 5 % fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBST) blockiert, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Anschließend wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C inkubiert, wobei die Primärantikörper in einem Blockierungspuffer verdünnt wurden: Anti-HIF-1α-Antikörper (1:3.000) und Anti-Beta-Aktin-Antikörper (1:8.000). Nach 3x Waschen mit TBST (jeweils für 10 min) wurden die Membranen mit geeigneten Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert, die 1:5.000 in Blockierungspuffer für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt wurden. Nach drei weiteren TBST-Waschungen wurden die Proteinbanden mit einem erweiterten Chemilumineszenz-Detektionssystem (ECL) sichtbar gemacht und mit einem Geldokumentationssystem abgebildet.

Dualer Luciferase-Assay

Um die transkriptionelle Regulation von Glykolyse-bezogenen Genen durch lncPVT1 zu untersuchen, wurden TPC-1-Zellen in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen pro Well ausgesät und in DMEM mit 4,5 g/l Glukose kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 100 μg/ml Penicillin-Streptomycin über Nacht. Die Zellen wurden mit 500 ng eines Hypoxia-Response-Elements (HRE)-getriebenen Glühwürmchen-Luziferase-Reporterplasmids und 50 ng Renilla-Luziferase-Kontrollplasmid unter Verwendung eines lipidbasierten Transfektionsreagenzes in einer Endkonzentration von 2 μl pro Vertiefung gemäß den Anweisungen des Herstellers co-transfiziert. Die Wirksamkeit der Transfektion wurde bestätigt, indem eine parallele Transfektion mit einem GFP-exprimierenden Plasmid eingeschlossen und die GFP-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop 24 h nach der Transfektion untersucht wurde. Nach 24-stündiger Inkubation unter normoxischen (21 % O2) oder hypoxischen (1 % O2) Bedingungen wurden die Luziferase-Aktivitäten mit einem Dual-Luciferase-Reporter-Assay-System gemessen. Die Luciferase-Aktivität von Firefly wurde auf die Renilla-Luciferase-Aktivität normalisiert, und das Verhältnis wurde für die vergleichende Analyse zwischen den Proben verwendet.

Datenanalyse

Alle Daten wurden als mittlere ± SD dargestellt. Die statistischen Auswertungen wurden in einer statistischen Analysesoftware durchgeführt. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit unabhängigen t-Tests durchgeführt, und die statistische Signifikanz wurde auf der Grundlage eines p-Wert-Schwellenwerts von weniger als 0,05 bestimmt.

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Ergebnisse

Verbesserte Glykolyse in TC-Zelllinien, vermittelt durch lncPVT1

Wir etablierten zunächst lncPVT1 OE und NC in TPC-1- und K1-Zellen unter Verwendung eines lentiviralen Expressionssystems. Die erfolgreiche Überexpression von lncPVT1 wurde durch qRT-PCR bestätigt (Abbildung 1A-B). Um den Einfluss auf die Glykolyse zu bewerten, wurden die Zellen unter Normoxie und Hypo...

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Diskussion

Als häufigste endokrine Malignität stellt die TC erhebliche Herausforderungen in Bezug auf ihr Wiederauftreten und ihre Metastasierungdar 22. Die mechanistische Landschaft der Schilddrüsenkarzinogenese ist nach wie vor unvollständig definiert, insbesondere im Hinblick auf die lncRNA-vermittelte Regulation der onkogenen metabolischen Reprogrammierung und grundlegender zellulärer Verhaltensweisen23 . In dieser Studie konzentrierten wir uns au...

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Offenlegungen

Die Autoren behaupten keine Interessenkonflikte, weder finanzieller noch nichtfinanzieller Art.

Danksagungen

Die Forschungsförderung erfolgte im Rahmen des Fujian Science and Technology Plan Project (2022J01784).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BCA-Protein-Assay-KitMeilunbioMA0082-2WB-Protein-Quantifizierungs-Assay
BiosicherheitswerkbankLishenHFsafe-1200LCZellpassage und -expansion
ZentrifugeBaiyangB320AZentrifugen-Zellen
Chemilumineszenz-BildgebungssystemBIO-RAD (USA)ChemiDoc BerührungWB-Entwicklung
CO2 InkubatorThermo (USA)311Zellkultur
ECL-Chemilumineszenz-DetektionskitMeilunbioNr. MA0186-1WB-Entwicklung
DurchflusszytometerBDFACSCalburApoptose-Assay für Durchflusszytometrie
Inverses FluoreszenzmikroskopNIKON(Japan)TS2-FLZellbeobachtung
Quantitatives Fluoreszenz-PCR-InstrumentABI(USA)7300PCR-Experiment
GAPDHProteintech60004-1-IGWB-interner Referenz-Antikörper
Glukose-Assay-KitJianchengNr. A154-1-1Biochemischer Assay
HIF1ABOSTERNr. A00013WB Antikörper
HRP-konjugiertes Affinipure Ziege Anti-Maus IgG(H+L)ProteintechSA00001-1Experiment zur Immunhistochemie (IHC)
HRP-konjugiertes Affinipure Ziege Anti-Kaninchen IgG(H+L)ProteintechSA00001-2Experiment zur Immunhistochemie (IHC)
K1-ZelllinieZellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China)NAZelllinie des humanen papillären Schilddrüsenkarzinoms
Milchsäure-Assay-KitJianchengNr. A019-2-1Biochemischer Assay
Mikroplatten-ReaderThermo (USA)K3ELISA-Nachweis
PAGE Gel Ultra-Fast Vorbereitungskit (15%)MeilunbioNr. MA0384WB-Elektrophorese
PCR-GerätBIO-RAD (USA)PTC100PCR-Experiment
Vorgefärbter Rainbow Protein MarkerMeilunbioMA0342WB-Elektrophorese
Vertikales Elektrophoresesystem für ProteineBIO-RAD (USA)POWER PAC 200WB-Elektrophorese
SDS-PAGE Protein-Ladepuffer (5X)BeyotimeP0015LWB-Elektrophorese
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma151-21-3WB-Elektrophorese
TPC-1-ZelllinieZellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China)NAZelllinie des humanen Schilddrüsenkarzinoms

Referenzen

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HIF 1 AlphaHypoxieGlucoseverbrauchLaktatproduktionKrebsstoffwechsel

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