Method Article

Analyse basierend auf TCGA-Daten und Einzelzelldaten, wobei TRPM4 als Beispiel genommen wird

DOI:

10.3791/69304

⸱

December 5th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Clinical Medical College, Nanjing Medical University, 2School of Pediatrics, Nanjing Medical University, 3Department of Neurology, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 4Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Rolle eines einzelnen Gens bei Blasenkrebs (BLCA) gründlich zu analysieren, basierend auf Transkriptomanalyse und Einzelzellanalyse sowie der Nutzung von 101 maschinellen Lernalgorithmen, um ein prognostisches Modell für das genannte einzelne Gen zu erstellen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Artikel wird eine Analysemethode vorgestellt, die auf öffentlichen transkriptomischen Datensätzen und Einzelzelldatensätzen basiert, die verwendet werden könnte, um die Rolle einzelner Gene in Tumoren umfassend zu beschreiben, einschließlich der Formung des Tumor-Immunmikromilieus, der Formung molekularer Subtypen und der Vorhersage der Prognose von Tumorpatienten. Gleichzeitig kann die Einführung von Einzelgendaten nicht nur die Zufälligkeit und Heterogenität vermeiden, die durch die Analyse eines einzelnen Transkriptoms entstehen, sondern auch eine tiefere Erforschung der spezifischen Zellcluster ermöglichen, in denen das Gen exprimiert wird, sowie weitere Forschungen zur Rolle des Gens im Signalweg. Da viele Forscher möglicherweise nicht versiert in der Einzelzellanalyse sind, wird in diesem Methodenartikel eine Online-Website vorgestellt, die TISCH2 (http://tisch.compbio.cn/) heißt und so allen hilft, die Einzelzellanalyse abzuschließen. Darüber hinaus hat die Anwendung von 101 Methoden des maschinellen Lernens eine unverzichtbare Rolle bei der Erstellung des genauesten prognostischen Modells gespielt. Abschließend wird angenommen, dass diese integrierte Einzelgenanalysemethode, die bioinformatische Analyse, maschinelles Lernen und Einzelzellanalyse kombiniert, eine unverzichtbare und entscheidende Rolle bei der Untersuchung der Funktionen einzelner Gene im Tumorfortschreiten sowie bei der Untersuchung der Funktionen einzelner Gene in Signalwegen spielen kann.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wie wir alle wissen, ist Blasenkrebs (BLCA) einer der aggressivsten und metastasierendsten bösartigen Tumore der Welt, und es gibt weiterhin Probleme mit den aktuellen Biomarkern für Blasenkrebs, wie Ungenauigkeitusw. Um die Prognose von BLCA-Patienten zu bestimmen und die Ergebnisse der BLCA-Patienten vorherzusagen, sind die Suche nach Biomarkern für Blasenkrebs und die Entwicklung prognostischer Modelle von großer Bedeutung. Obwohl einige Forschungsmethoden für Biomarker entwickelt wurden, sind die meisten dieser Methoden derzeit auf Transkriptomik beschränkt, was zwangsläufig zu Heterogenität in Proben2 führt. Außerdem versäumt die bloße Untersuchung von Transkriptomikdaten oft die Rolle verschiedener Zellsubpopulationen sowie die Funktionen von Genen in unterschiedlichen Signalwegen auf Einzelzellebene, was frühere Forschung weniger präziseund effektiv macht. Da Einzelzellanalyse für Anfänger herausfordernd sein könnte, wurde eine Online-Plattform für Einzelzellanalyse eingeführt, um ihnen zu helfen, die Fähigkeiten schnell zu erlernen4. Zu guter Letzt gibt es selbst dann keine Garantie, dass der Biomarker auf alle Kohorten anwendbar ist, selbst wenn ein einzelnes Gen durch Transkriptom- und Einzelzellanalyse als geeigneter Biomarker identifiziert wird, daher ist es notwendig, prognostische Modelle zu erstellen, die mit dem Biomarker verbunden sind, um die Schlussfolgerungen universeller anwendbarzu machen 5. Der 101-Algorithmus für maschinelles Lernen bezieht sich auf die Erstellung von 101-Prognosmodellen mit einer Kombination von 10 verschiedenen maschinellen Lernalgorithmen, mit dem Ziel, das optimale Prognosemodell zu identifizieren. Die Einbeziehung von Algorithmen wie Random Forest, XGBoost und SVM, die in der Lage sind, komplexe Daten besser zu verarbeiten und eine größere Stabilität aufweisen, hat dazu geführt, dass dieser kombinierte Algorithmus bemerkenswerte Stabilität zeigt. Um dieses prognostische Modell genauer und relevanter für den Biomarker zu machen, wird zunächst eine Korrelationsanalyse zwischen allen Genen und dem Biomarker durchgeführt, dann werden etwa 20–30 Gene je nach Anforderungen ausgewählt und anschließend ein 101-Algorithmus verwendet, um das prognostische Modell zu erstellen, gefolgt von einer Reihe von Analysen zur Finalisierung der Ergebnisse.

Im Vergleich zu den Biomarkern, die durch die einfache Transkriptomik-Analyse der letztensechs vorhergesagt wurden, ermöglichen die Biomarker der Einzelzell- und Transkriptomik-Analyse eine unvoreingenommene Aufteilung von Geweben oder Proben in ihre grundlegenden zellulären Bestandteile. Sie ermöglicht die klare Differenzierung verschiedener Zelltypen (wie T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen) sowie die Entdeckung neuer Subpopulationen (wie erschöpfte T-Zellen und regulatorische T-Zellen) sowie die Erfassung kontinuierlicher dynamischer Prozesse (wie Zelldifferenzierungstrajektorien)4. Es ist vergleichbar damit, Früchte und Milch separat zu arrangieren, was eine klare Visualisierung jeder Komponente und ihrer Menge ermöglicht. Im Vergleich zu Cox-Modellen7 aus einer einzelnen Kohorte ist das prognostische Modell, das mit 101 Machine Learning erstellt wurde, ebenfalls genauer und wissenschaftlich fundierter, da es automatisch die komplexen, nichtlinearen Wechselwirkungen zwischen Variablen aus den Daten lernen kann. Beispielsweise könnte die Wirkung einer bestimmten genetischen Mutation nur bei Patienten eines bestimmten Alters und Tumorgrößen signifikant sein. Maschinelle Lernmodelle wie Zufallswälder und neuronale Netze können diese hochstufigen Interaktionen automatisch erfassen, ohne dass manuelle Spezifikation8 erforderlich ist. Die für die Analyse verwendeten Datensatz müssen die überwiegende Mehrheit der Gene umfassen, wobei die Anzahl der Gene nicht zu gering ist und die Zahl der Gene, die für den Aufbau prognostischer Modelle verwendet wird, nicht zu hoch ist und in der Regel bei etwa 20-30 gehalten wird, was optimal ist. Der Qualitätskontrollstandard der Einzelzellmenge sollte höher als 1000 sein, die UMI-Zahl pro Zelle höher als 1000 und die Genzahl pro Zelle höher als 500-9.

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Ansatz zur Identifikation neuartiger Biomarker aus öffentlichen transkriptomischen Datensätzen und Einzelzelldatensätzen vorgelegt, wobei die Rolle von TRPM4 in BLCA als Beispiel genommen wird. Es werden verschiedene Forschungsmethoden eingesetzt und vielfältige Datensätze – darunter der Cancer Genome Atlas-Bladder Cancer (TCGA-BLCA)-Datensatz, der Einzelzelldatensatz GSE145281 und BLCA-Datensätze GSE32894 und GSE31684 – um die Präzision und Anwendbarkeit von Biomarkern in der Onkologie aus verschiedenen Perspektiven zu verbessern und die Untersuchung von TRPM4 in BLCA voranzutreiben. Der TCGA-BLCA-Datensatz wurde von der Website der University of California, Santa Cruz Xena (UCSC Xena) bezogen. GSE32894 und GSE31684 wurden aus dem Gene Expression Omnibus (GEO) heruntergeladen, und Einzelzelldaten wurden GSE145281 vom Tumor Immune Single-Cell Hub 2 (TISCH2) bezogen. Zusätzlich wurden Daten zu molekularen Subtypen und Behandlungsreaktionen von BLCA aus ergänzenden Tabellenkalkulationen eines relevanten Artikels extrahiert. Anschließend werden bioinformatische Analysen, Einzelzellanalysen und maschinelles Lernen durchgeführt, wodurch eine integrierte Einzelgen-Forschungsmethodik etabliert wird.

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Protocol

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HINWEIS: Alle in diesem Artikel verwendeten Codes sind auf der Website https://github.com/YaoGeng-nmu/Analysis-of-TRPM4-based-on-TCGA-data-and-single-cell-data-in-BLCA/blob/main/code zu finden.

1. Vorbereitung von Transkriptomik-Daten

  1. Vorbereitung des TCGA-BLCA-Datensatzes
    1. Laden Sie alle TCGA-Datensätze von der Website UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/)10 herunter. Die heruntergeladenen Datensätze sind vorbearbeitet, sodass zusätzliche Arbeit wie Genannotation11 überflüssig wird.
    2. Wählen Sie den TCGA-Datensatz aus und klicken Sie dann auf die TCGA-BLCA-Datensatzt. Dann gehen Sie auf die Seite des TCGA-BLCA-Datensatzes, klicken Sie auf Gene Expression RNA-seq und laden Sie die klinischen Daten sowie Genexpressionsprofile aus dem TCGA-BLCA-Datensatz herunter. In diesem Datensatz wird sichergestellt, dass die mRNA-Expressionsdaten von 400 BLCA-Patienten vorhanden sind.
    3. Um Tumorproben von benachbarten normalen Gewebeproben zu unterscheiden, trennen Sie die Proben mit den Endungen 01 und 11, da Proben mit 01 Tumorproben anzeigen, während Proben mit 11 krebsangrenzende Gewebe (normale Proben) anzeigen.
  2. Vorbereitung von GSE32894 und GSE31684
    1. Klicken Sie auf die GEO-Website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), um den BLCA-Datensatz GSE32894 und GSE3168412,13 herunterzuladen.
    2. Nachdem Sie auf die jeweiligen Einträge oben rechts geklickt haben, gehen Sie unbedingt zu den Seiten für Datensätze GSE32894 und GSE31684.
    3. Als Nächstes laden Sie die jeweiligen mRNA-Daten, klinischen Daten und Überlebensdaten für GSE32894 herunter. Klicken Sie auf die http-Schaltfläche des GSE32894-Datensatzes. Laden Sie außerdem die GPL6947 Plattformdaten mit dem Plattform-Button herunter. Klicken Sie auf die Schaltfläche Series Matrix File(s) und laden Sie GSE32894 herunter, nachdem Sie beim Herunterladen von mRNA-Daten, klinischen und Überlebensdaten für GSE32894 auf die GSE32894_series_matrix.txt.gz-Schaltfläche geklickt haben.
    4. Laden Sie die entsprechenden mRNA-Daten, klinischen Daten und Überlebensdaten für GSE31684 herunter. Klicken Sie auf die http-Schaltfläche im GSE31684-Datensatz. Laden Sie außerdem die GPL570-Plattformdaten über den Plattform-Button herunter. Klicken Sie auf die Schaltfläche Series Matrix File(s) und laden Sie GSE31684 herunter, nachdem Sie beim Herunterladen von mRNA-Daten, klinischen und Überlebensdaten für GSE31684 auf die GSE31684_series_matrix.txt.gz-Schaltfläche geklickt haben.
    5. Im Filterschritt werden bedeutungslose Gene entfernt, wie solche mit einem Ausdrucksgrad von null oder nahe null. Verwenden Sie die ComBat-Methode, die auf dem SVA-Paket14 basiert, zur Batchkorrektur.

2. Vorbereitung einer Einzelzellanalyse

  1. Zubereitung der GSE145281
    1. Um auf Einzelzellebene zu forschen, sollte man den BLCA-Einzelzelldatensatz finden, wobei man bedenkt, dass allein Transkriptomdaten nicht ausreichen, um zu bestimmen, welcher Zellcluster TRPM4 am bedeutendsten exprimiert.
    2. Hier besuchen Sie TISCH2 (http://tisch.compbio.cn/), eine Online-Website zur Einzelzell-Analyse von Tumoren.
    3. Je nach experimentellen Bedürfnissen wählen Sie den benötigten Krebstyp aus, wobei in diesem Fall BLCA als Beispiel verwendet wird.
    4. Klicken Sie auf die BLCA-Schaltfläche und wählen Sie den Datensatz namens GSE145281.

3. Vorbereitung der molekularen Subtypen von BLCA und Reaktionsdaten auf therapeutische Entscheidungen

  1. Laden Sie die Daten zu den molekularen Subtypen und der Reaktion auf therapeutische Entscheidungen von BLCA aus dem hier referenzierten Artikel15 herunter.
  2. Öffnen Sie die PubMed-Website (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/). Suchen Sie nach dem Artikel und klicken Sie auf Supplementary Tables. In diesem komprimierten Dateipaket befinden sich insgesamt 18 Dateien.

4. BLCA-Immunmikroumgebungsanalyse von TRPM4

  1. Heatmap-Diagramm der Expression von 133 Immunmodulatoren in verschiedenen TRPM4-Gruppen
    1. Gemäß der Expression von TRPM4 werden alle BLCA-Proben in die Gruppe mit hohem TRPM4 und die Gruppe mit niedrigem TRPM4 unterteilt.
    2. Kopieren Sie alle Stichprobennamen und TRPM4-Ausdrucksdaten separat, sortieren Sie sie dann in absteigender Reihenfolge nach TRPM4-Ausdruck und kategorisieren Sie die erste Hälfte der Proben in die High-TRPM4-Gruppe und die zweite Hälfte in die Low-TRPM4-Gruppe in der Gruppen-Spalte gemäß TRPM4-Ausdruck. Alle TCGA-BLCA-Patienten-IDs sind in ergänzender Tabelle 1 aufgeführt.
    3. Installieren Sie die für die transkriptomischen Datenanalyse erforderlichen R-Pakete. Nehmen Sie kleine Änderungen am bereitgestellten Code vor, wie z. B. den Dateistandort zu ändern, und führen Sie dann den Code aus. Überprüfen Sie sorgfältig, ob die Gen-IDs und die IDs der Immunmodulatoren korrekt übereinstimmen, um sicherzustellen, dass nach den Gen-IDs keine Lücken oder andere unauffällige Faktoren vorhanden sind, da dies die Hauptursachen für eine fehlgeschlagene Wärmekartengenerierung sind.
  2. Stromal- und immunologische Analyse von Tumorproben mit dem ESTIMATE R-Paket
    1. Stellen Sie sicher, dass alle für die transkriptomischen Datenanalyse erforderlichen R-Pakete installiert sind. Gemäß den Codeanforderungen benennen Sie die erforderlichen Daten mit den entsprechenden Namen und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Ausführen ".
      HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass diese Website auch Online-Analysefunktionen bietet. Obwohl es möglich ist, die gewünschten Ergebnisse durch den Besuch der Website (https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/rpackage.html) zu erzielen, eignet sich diese Methode nicht für die Analyse von selbst gesammelten Daten.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Krankheit und wählen Sie die Option Blasen-Urothelialkarzinom . Wählen Sie dann die RNA-seq-V2-Plattform-Taste . Laden Sie den Stromal-Score, den Immun-Score und den Schätzungswert aller Proben herunter.
  3. Geigendiagramm des Ausdrucks zwischen verschiedenen TRPM4-Gruppen
    1. Installiere alle R-Pakete, die für die transkriptomische Datenanalyse erforderlich sind. Alle benötigten R-Pakete sind in ergänzender Tabelle 2 aufgeführt. Gemäß den Codeanforderungen benennen Sie die erforderlichen Daten mit den entsprechenden Namen und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Ausführen".
    2. Achten Sie darauf, sorgfältig zu überprüfen, dass die Gen-IDs korrekt eingegeben sind, damit am Ende der Gen-IDs keine Lücken oder andere unauffällige Faktoren vorhanden sind, da dies die Hauptursachen für Fehler bei der Erstellung von Geigendiagrammen sind.
  4. Dreiecks-Heatmap-Darstellung zwischen verschiedenen TRPM4-Gruppen
    1. Installiere alle für die transkriptomischen Datenanalyse erforderlichen R-Pakete. Stellen Sie sicher, dass Sie die Expressionsdaten mehrerer Immunkontrollpunktgene wie TIGIT und CD80 vorbereiten. Öffnen Sie die TCGA-BLCA-Transkriptomdaten und durchsuchen Sie dann jeden Eintrag einzeln, da die Anzahl der Immun-Checkpoint-Gene nicht umfangreich ist.
    2. Gemäß den Codeanforderungen benennen Sie die erforderlichen Daten mit den entsprechenden Namen und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Ausführen ".
  5. Korrelationsdiagramm zwischen verschiedenen Genen und TRPM4
    1. Installiere alle für die transkriptomischen Datenanalyse erforderlichen R-Pakete. Fülle TRPM4 als erstes Gen aus und füge das erforschte Gen als zweites Gen hinzu, das in diesem Fall CD3E ist.
    2. Nachdem du auf den Run-Button geklickt hast, solltest du CD3E auf andere Gene umstellen, die analysiert werden müssen, wie zum Beispiel CTLA4.

5. Einzelzellanalyse von TRPM4 im GSE145281-Datensatz

  1. BLCA GSE145281 Datensatzanalyse mittels Einzelzellanalyse
    1. Gehen Sie auf die Website ein und klicken Sie auf BLCA. Die Einzelzellanalyse ermöglicht eine tiefere Untersuchung dessen, welcher Zellcluster eine höhere TRPM4-Expression im Vergleich zur Transkriptomik-Analyse aufweist. Stellen Sie sicher, dass die Einzelzellanalysedaten von GSE130001 erhoben werden, und prüfen Sie mit dem Qualitätskontrollstandard, dass die Zellanzahl pro Datensatz größer als 1000, die UMI-Anzahl pro Zelle größer als 1000 und die Genzahl pro Zelle größer als 500 sein sollte. Die differenziell exprimierten Gene jedes Clusters im Vergleich zu allen anderen Zellen werden anhand der log-transformierten Faltenänderung (|logFC| >= 0,25) identifiziert, und die Clustering-Auflösung sollte 0,5 betragen.
  2. Zellannotation für verschiedene Zellcluster
    1. Stellen Sie sicher, dass alle Zellcluster annotiert sind. Beispielsweise können die B-Zellen mit CD19, MS4A1, CD27, IGHD, IGHM, TCL1A und FCRL5 annotiert werden. Alle für die Zellannotation verwendeten Gene sind in der ergänzenden Tabelle 3 zu finden.
    2. Wählen Sie dann GSE145281 und laden Sie alle Ergebnisse von TRPM4 herunter. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Gesamt" und laden Sie die UMAP-Grafik von GSE145281 verschiedenen Clustern und Zelltypen herunter.
    3. Klicken Sie auf die Gen-Schaltfläche und wählen Sie das einzelne Gen aus, das analysiert werden soll. Klicken Sie auf die GSEA-Schaltfläche und beobachten Sie die Funktionen dieses einzelnen Gens über verschiedene Wege hinweg, wie den KEGG-Weg und den Hallmark-Weg 16,17.
    4. Klicken Sie auf die CCI-Schaltfläche und finden Sie das Zell-Chat-Plot und das Zell-Chat-Bubble-Plot des Clusters, das ein einzelnes Gen hoch ausdrückt.
    5. Klicken Sie auf die TF-Anreicherungs-Schaltfläche , um den angereicherten Transkriptfaktor für jeden Cluster zu sehen.

6. 101 Maschinelles Lernen zur Erstellung eines prognostischen Modells in Bezug auf TRPM4

  1. Installiere alle R-Pakete, die für die transkriptomische Datenanalyse erforderlich sind. Da ein einziger Machine-Learning-Ansatz nicht immer die optimale Methode zur Vorhersage der Prognose ist, kann ein Prognosemodell mit 101 Machine-Learning-Techniken erstellt werden. Führen Sie eine Korrelationsanalyse zwischen allen Genen der TCGA-BLCA-Kohorte sowie GSE32894 und GSE31684 Kohorten sowie TRPM4 durch.
  2. Basierend auf der Anzahl der Gene, die stark mit TRPM4 assoziiert sind, werden alle Gene mit einer Korrelation größer oder gleich 0,6 oder weniger als oder gleich -0,6 mit TRPM4 ausgewählt. Wählen Sie alle Gene aus, die in allen Kohorten stark mit TRPM4 assoziiert sind.
  3. Kombinieren Sie alle Daten von GSE32894 und GSE31684 Kohorten, um ein Validierungsset zu bilden, und verwenden Sie TCGA-BLCA als Trainingsset.
  4. Gemäß den Codeanforderungen benennen Sie die erforderlichen Daten mit den entsprechenden Namen und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Ausführen ".

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Results

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Es ist allgemein bekannt, dass der zentrale Vorteil der Verwendung von Transkriptomik zur Analyse der Immunmikroumgebung für einzelne Gene darin besteht, dass eine direkte Korrelation zwischen einzelnen Genen und den dynamischen Interaktionen mit Immunzellen und Molekülen auf Genexpressionsebene möglich ist, was die direkte Beobachtung der Immunmerkmale und die Identifizierung von Unterschieden im Anteil der Immunzellen zwischen Gruppen mit hoher oder niedriger Expression einzelner Gene ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In früheren Studien stieß die bioinformatische Analyse einzelner Gene häufig auf Probleme wie Oberflächlichkeit, Ungenauigkeit und begrenzte Anwendbarkeit19. Darüber hinaus beschränkte sich frühere Forschungen zu einzelnen Genen meist auf Transkriptomdaten. Zudem können bei einem ausschließlichen Fokus auf Transkriptomdaten Fragen wie Stichprobenheterogenität und Zufälligkeit auftreten, was es erschwert, universelle Musterzu identifizieren....

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten dem BioBean Informatics Consortium für die Entwicklung eines intelligenten analytischen Rahmens danken (verfügbar unter http://www.sxdyc.com/). Ihre innovative Recheninfrastruktur beschleunigte den Forschungsablauf erheblich durch präzise Analysen und automatisierte Dateninterpretationsmodule.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
R 4.3.3nichtsnichtsnichts

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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