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Epigenetisches Engineering von K562-Zellen: Dual-Vektor-Episomalstrategie für eine stabile gezielte DNA-Methylierung mit dCas9-DNMT3A- und -HDAC1-Fusionsproteinen

DOI:

10.3791/69328

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31. Oktober 2025

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1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt ein nicht-integratives, episomales CRISPR/dCas9-basiertes System zur gezielten epigenetischen Editierung in K562-Zellen, das dCas9-DNMT3A- und dCas9-HDAC1-Effektoren mit spezifischen sgRNAs kombiniert, um eine locusspezifische DNA-Methylierung mit Präzision und reduzierten Off-Target-Effekten zu induzieren.

Zusammenfassung

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Die Untersuchung der genauen Rolle der DNA-Methylierung bei der Regulation der Gentranskription und die Entwicklung von Therapien, die auf spezifische Genmethylierungsmuster abzielen, stellt eine große Herausforderung dar, da es an vielseitigen Werkzeugen mangelt, die in der Lage sind, ortsspezifische und langfristige epigenetische Modifikationen zur Modulation der Genexpression zu induzieren. Die Studie zielte darauf ab, ein innovatives episomal-basiertes System zu entwickeln und zu validieren, um eine stabile DNA-Methylierung an einem gezielten Genort zu ermöglichen, das sowohl für die epigenetische Grundlagenforschung als auch für therapeutische Anwendungen nützlich sein könnte. Um dies zu erreichen, wurde die K562-Zelllinie mit zwei unterschiedlichen episomalen Vektoren co-transfiziert. Beide Vektortypen wurden so verändert, dass sie Guide-RNAs (gRNAs) exprimieren, die auf eine 367 bp unmethylierte Region innerhalb der CpG-Insel 326 abzielen, die sich stromaufwärts des ZBTB7A-Gens befindet. Jeder Vektor kodierte für eine deaktivierte Form der Endonuklease Cas9 (tot oder dCas9), die entweder mit der katalytischen Domäne der DNA-Methyltransferase DNMT3A (dCas-DNMT3A-CD) oder der Histon-Deacetylase HDAC1 (dCas-HDAC1) in voller Länge fusionierte. Die dCas-Sequenz enthielt zwei nukleare Lokalisierungssignale (NLS), um den Kernimport des Proteins sicherzustellen. Diese Dual-System-Expressionskassette fördert einen Chromatinzustand, der möglicherweise für ein langfristiges epigenetisches Silencing förderlich ist, und verspricht robuste und dauerhafte epigenetische Ergebnisse. Dieser intervenierende Ansatz für das Wirtsepigenom durch die Nutzung selbstreplizierender episomaler Vektoren bietet mehrere Vorteile: Aufrechterhaltung und Expression von Vektoren bei niedrigen Kopienzahlen über mehrere Zellteilungen hinweg ohne Integration in das Wirtsgenom, wodurch Off-Target-Effekte minimiert und die Integrität des Genoms erhalten werden. Wir berichten über den präzisen und signifikanten Anstieg der DNA-Methylierung an der anvisierten ZBTB7A CpG-Insel 326. Die Ergebnisse bestätigen, dass die manipulierten episomalen CRISPR/dCas-Systeme eine dauerhafte, ortsspezifische DNA-Methylierung hervorrufen können. Daher ist dieses System ein wertvolles Forschungsinstrument zur Bewertung der funktionellen Auswirkungen gezielter Methylierungsänderungen und eine vielversprechende Plattform für die Entwicklung zukünftiger epigenetischer Behandlungen.

Einleitung

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Epigenetische Regulation, einschließlich DNA-Methylierung und Histonmodifikationen, spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Genexpression, der Zelldifferenzierung und der Genomstabilität. Eine Dysregulation dieser Mechanismen ist häufig - entweder als Ursache oder als Folge - bei verschiedenen pathologischen Zuständen beteiligt, insbesondere bei Krebs, neurologischen Störungen und Imprinting-Syndromen 1,2,3. Insbesondere durch den präzisen Eingriff in die epigenetische Landschaft an bestimmten genomischen Loci mit Hilfe der Epigenom-Editing-Technologie Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) können Genrepressionsniveaus erreicht werden, die mit denen vergleichbar sind, die in Gen-Knock-out-Modellen beobachtet werden, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenzzu verändern 4. Infolgedessen hat sich die gezielte epigenetische Editierung als vielversprechende Strategie erwiesen, um genregulatorische Mechanismen zu entschlüsseln und Präzisionstherapeutika zu entwickeln.

DNA-Methyltransferase (DNMT)-Inhibitoren und Histon-Deacetylase-Inhibitoren (HDAC) sind epigenetische Therapien, die derzeit für den klinischen Einsatz zugelassen sind. Diese Wirkstoffe zielen jedoch nicht-selektiv auf epigenetische Marker im gesamten Genom ab, verändern die globalen Chromatinzustände, was zu Off-Target-Effekten und Toxizität bei Patienten führt5. Um die Einschränkungen herkömmlicher epigenetischer Veränderungsmittel zu überwinden, wurden programmierbare epigenetische Editoren entwickelt, die auf katalytisch totem Cas9 (dCas9) basieren, das mit Effektordomänen wie DNA-Methyltransferasen (z. B. DNMT3A), Demethylasen (z. B. TET1), Histon-Acetyltransferasen (z. B. p300) oder Deacetylasen (z. B. HDAC3) fusioniert ist 6,7,8,9 . Das dCas9-Effektorsystem ermöglicht eine Locus-spezifische Epigenommodifikation, die von einem kleinen RNA-Molekül, der sogenannten Single-Guide-RNA (sgRNA), gesteuert wird, ohne doppelsträngige Brüche an der Zielsequenz einzuführen. Neuere Studien haben gezeigt, dass sie bei der Modifikation der Genexpression, der Remodellierung des Chromatinzugangs und sogar bei der Reprogrammierung zellulärer Phänotypen eingesetzt werden 10,11,12.

Trotz rascher Fortschritte stoßen dCas9-basierte Epigenom-Engineering-Systeme weiterhin an einige Einschränkungen. Die häufigste Herausforderung sind Off-Target-Effekte aufgrund der Unspezifischkeit epigenetischer Effektordomänen, insbesondere bei starker oder verlängerter Expression der dCas9-Fusionswerkzeuge13,14. Darüber hinaus stellt die Größe der dCas9-Fusionen eine erhebliche Herausforderung bei der Verabreichung dar. Die Größe der Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)-Sequenz beträgt etwa 4,2 kb15, was mit der maximalen Kapazitätsgröße von Adeno-assoziierten Virusvektoren (AAV) vergleichbar ist. Obwohl lentivirale Vektoren eine relativ große Kapazität (~12-1 kb) haben, die die Verabreichung des mitepigenetischen Effektoren fusionierten Sp Cas9 in voller Länge ermöglicht, behalten sie immer noch die Möglichkeit einer zufälligen genomischen Integration, was eine Insertionsmutagenese riskiert und ihre klinischen Anwendungen einschränkt16. Auf der anderen Seite leiden nicht-virale Ansätze wie die Plasmidtransfektion unter einer schlechten Retention in sich teilenden Zellen. Transiente oder "Hit-and-Run"-Verabreichungsansätze schließen die Möglichkeit einer genomischen Integration aus, können aber oft keine Methylierungsänderungen über Zellteilungen hinweg aufrechterhalten, es sei denn, sie werden mit Chromatin-Remodelern oder kooperativen Effektoren kombiniert 17,18,19.

Um diese Herausforderungen zu bewältigen, setzten wir ein nicht-integratives, selbstreplizierendes episomales Vektorsystem (pEPI-S/MAR) zur Verabreichung von dCas9-fusionierten epigenetischen Effektoren ein. Dieser Vektor persistiert extrachromosomal in sich teilenden Zellen bei niedrigen Kopienzahlen (~1-2 pro Zelle), was eine anhaltende, aber moderate Expression ermöglicht, um unerwünschte Funktionen, die mit einer Überexpression verbunden sind, zu minimieren20,21. Das Scaffold/Matrix Attachment Region (S/MAR)-Element des Episoms interagiert mit der Kernmatrix und trägt so zur stabilen Aufrechterhaltung des Episoms im Zellkern während der Zellteilung bei22,23. Darüber hinaus vermeidet das pEPI-Vektorsystem die mit der viralen Integration verbundenen Risiken und ermöglicht die Verabreichung von Konstrukten ohne Überschreitung der Verpackungsgrenzen.

Neuere Studien haben gezeigt, dass Promotorregionen, die durch aktive Histonmodifikationen, insbesondere H3K27-Acetylierung (H3K27ac), gekennzeichnet sind, oft resistent gegen technische DNA-Methylierung sind. Es wurde gezeigt, dass kombinatorische Ansätze, bei denen Histonmarkierungen entweder entfernt oder hinzugefügt werden, indem sie Schreiber oder Radiergummis von Histonmodifikationen verwenden und gleichzeitig DNA-Methylierung über DNMT3A einführen, die Stabilität und Persistenz der Genrepression erhöhen, selbst bei transienten Ansätzen19,24. Basierend auf diesen Erkenntnissen stellten wir die Hypothese auf, dass die gemeinsame Verabreichung von dCas9-HDAC1 und dCas9-DNMT3A und die Ausrichtung auf benachbarte genetische Bereiche den Chromatinumbau fördern und eine effizientere und dauerhaftere Methylierung an regulatorischen Zielelementen ermöglichen würde.

In dieser Studie haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein System zu entwerfen und zu konstruieren, das in der Lage ist, eine gezielte und stabile DNA-Methylierung an die CpG-Insel 326 von ZBTB7A zu liefern, eine Region, die durch eine geringe endogene Methylierung und aberrante H3K27ac-Markierungen in K562-Zellen gekennzeichnet ist. Das Ziel dieser Studie war es, zwei episomale Konstrukte zu liefern, die für dCas9 kodieren, die mit jedem der unterschiedlichen epigenetischen Effektoren fusioniert sind, zusammen mit sgRNAs, die auf die CpG-reiche regulatorische Region stromaufwärts des ZBTB7A-Gens abzielen, wobei das niedrig expressionierte, stabile, nicht-integrative pEPI-System verwendet wird. Wie in Abbildung 1 dargestellt, ermöglicht die Co-Transfektion von K562-Zellen mit diesen Episomen die duale Rekrutierung der Editierungskomplexe auf der interessierenden CpG-Insel, wobei HDAC1 die lokale Histonacetylierung entfernt, um die nachfolgende DNA-Methylierung durch DNMT3A zu erleichtern, was zu einer koordinierten und ortsspezifischen epigenetischen Modifikation führt.

Das hier beschriebene System eignet sich für Anwendungen, bei denen die Verabreichung von Viren aufgrund der Konstruktgröße, Sicherheitsbedenken oder Kostenbeschränkungen nicht möglich ist. Es unterstützt die modulare Klonierung verschiedener sgRNAs und Effektorfusionen und ist damit an eine Reihe von Zielloci anpassbar. Es eignet sich derzeit am besten für in vitro oder präklinische Studien an Zelllinien, die eine Plasmidtransfektion und Antibiotikaauswahl tolerieren. In unserer Implementierung wurde die episomale Verabreichung in K562-Zellen mit Lipofectamine-basierten Reagenzien erreicht und unter G-418-Selektion aufrechterhalten.

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Protokoll

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1. Design von sgRNAs

  1. Identifizieren Sie die gewünschte CpG-Insel oder regulatorische CpG-Stellen innerhalb der Promotorregion des interessierenden Gens mit einem Genombrowser (z. B. UCSC-Genombrowser). Hier wurde das Design auf die CpG-Insel 326 (GRCh38) des ZBTB7A-Gens angewendet.
  2. Entwerfen Sie Single-Guide-RNAs (sgRNAs) mit einer Online-CRISPR-sgRNA-Designplattform [z. B. CHOPCHOP Web Tool (Version 3)]. Befolgen Sie beim Design von sgRNAs die folgenden Empfehlungen, um eine hohe On-Target-Aktivität und minimale Off-Target-Effekte zu gewährleisten:
    1. Wählen Sie das SpCas9-Protein als Endonukompaktase aus, wobei 5'-NGG-3' als Protospacer-Nachbarmotiv am 3'-Ende (PAM-3') verwendet wird.
    2. Wählen Sie die sgRNA-Länge auf 20 bp (neben der PAM-Sequenz). Erlauben Sie Off-Target-Übereinstimmungen mit nur drei Fehlübereinstimmungen in der Protospacer-Sequenz.
    3. Wenn Sie sich für eine bestimmte Region des Gens entscheiden, wählen Sie die Option "Promotor" und definieren Sie den Upstream-Bereich (z. B. von 1500 bp bis 3000 bp stromaufwärts für die CpG-Insel 326), um die sgRNAs innerhalb der regulatorischen Region zu positionieren.
    4. Verwenden Sie zielgerichtete Effizienzwerte, wie sie von Doench et al.25 entwickelt wurden, um die sgRNA-Aktivität zu bewerten.
  3. Bei der Auswahl von sgRNAs für den experimentellen Einsatz sind folgende Kriterien zu berücksichtigen:
    1. Ordnen Sie alle Kandidaten-sgRNAs nach Effizienz für die Zielregion. Wählen Sie sgRNAs in den oberen 10-20 % der vorhergesagten Effizienz. Vermeiden Sie bei der Auswahl sgRNAs mit Fehlanpassungen (MM0, MM1, MM2, MM3) an potenziellen Off-Target-Stellen.
    2. Wählen Sie sgRNAs, die auf ursprünglich unmethylierte oder schwach methylierte Bereiche für die transkriptionelle Repression mit dCas9-DNMTs abzielen. Für die transkriptionelle Repression mit dCas9-HDACs zielen Sie auf stark acetylierte Regionen ab, um die Effizienz zu erhöhen. Verwenden Sie Online-Datenbanken (z. B. ChIP-Atlas), um DNA-Methylierungs- und Histon-Acetylierungsmarkierungen in K562-Zellen an den Zielorten zu bestätigen.
    3. Verwenden Sie mehrere sgRNAs, um Zielregionen abzudecken, die größer als 100-200 bpsind 26.
      HINWEIS: Epigenetische Modifikationen (Methylierung und Deacetylierung) beeinflussen Regionen vor und hinter der sgRNA-Bindungsstelle, und diese Effekte können auf kurze genomische Spannen beschränkt sein.
    4. Wählen Sie sgRNAs mit einem GC-Gehalt zwischen 40 % und 80 %.
      HINWEIS: Der GC-Gehalt der sgRNA ist wichtig, da ein höherer GC-Gehalt die RNA-Stabilität und die dCas-Bindung verbessert.
    5. Vermeiden Sie sgRNAs, die Abschnitte von vier oder mehr Thymidinen (Ts) enthalten, und wählen Sie sgRNAs mit Adenin- oder Thyminnukleotiden, die sich vier Basen stromaufwärts der PAM-Stelle befinden.
      HINWEIS: Vier oder mehr Ts können zu einem vorzeitigen Abbruch der Transkription führen. sgRNAs mit A oder T, die sich vier Basen stromaufwärts der PAM-Stelle befinden, können eine stärkere dCas-Bindung aufweisen.
    6. Überprüfen und vermeiden Sie sgRNAs mit hoher Selbstkomplementarität, um das Risiko der Bildung von Sekundärstrukturen zu minimieren.
    7. Schließen Sie die Auswahl einiger sgRNA-Sequenzen ab.
      HINWEIS: Es wurden vier sgRNAs entworfen, die sich über die CpG-Insel 326 erstrecken. Die sgRNA1-4-Zielsequenzen und Zielpositionen auf der CpG-Insel 326 sind in der ergänzenden Tabelle 1 dargestellt.
  4. Transformieren Sie die sgRNA-Sequenz Ihrer Wahl (mit Ausnahme des PAM-Tripletts) in ihr umgekehrtes Komplement. Fügen Sie GATCG an das 5'-Ende der Vorwärtssequenz und G an dessen 3'-Ende und AAAAC an das 5'-Ende der umgekehrten Komplementärsequenz und C an dessen 3'-Ende hinzu. Bestellen Sie die beiden finalen Oligos für jede sgRNA bei einem kommerziellen Oligo-Anbieter.

2. Klonen

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Anpassung des Plasmids pEPI-1 an die Erzeugung episomaler Vektoren beschrieben, die sowohl die dCas-epigenetische Effektorfusion als auch die sgRNA-Expressionskassette tragen. In Abbildung 2 finden Sie einen umfassenden Überblick über den Klon-Workflow und die Vektorarchitektur. Alle unten beschriebenen Restriktionsverdau- und Ligationsreaktionen wurden gemäß den vom Hersteller empfohlenen Protokollen für jedes verwendete Enzym und Reagenz durchgeführt, und die Reaktionsspezifikationen sind in der ergänzenden Tabelle 2 ausführlich aufgeführt.

  1. Verdauen Sie das pEPI-1-Plasmid mit AgeI und BspEI, die die eGFP-kodierende Sequenz (enhanced green fluorescent protein) flankieren. Nach dem Restriktionsverdau stumpfen Sie die resultierenden Überhänge mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I ab. Litieren Sie das stumpfe Plasmidrückgrat mit T4-DNA-Ligase, um den eGFP-deletierten Vektor zu erzeugen.
    HINWEIS: Die Deletion des eGFP-Gens wird durchgeführt, um die Gesamtvektorgröße zu reduzieren. Eine größere Vektorgröße könnte die nachgelagerten Klonierungs- und Transfektionsschritte einschränken.
  2. Erhalten Sie die kodierenden Sequenzen für die katalytische Domäne (CD) des DNMT3A-Gens und die volle Länge des HDAC1-Gens . Hängen Sie ein Stoppcodon an das 3'-Ende (stromabwärts) jeder Codierungssequenz an. Ergänzen Sie die Sequenzen mit den Restriktionsstellen BglII (5') und AseI (3').
  3. Verdau den eGFP-deletierten pEPI-1-Vektor mit BglII und AseI. Verdauen Sie getrennt voneinander die vorbereiteten DNMT3A(CD)- und HDAC1-kodierenden Sequenzen mit denselben Enzymen. Führen Sie zwei unabhängige Ligationsreaktionen durch:
    1. Lilizieren Sie das DNMT3A(CD)-Fragment in den verdauten Vektor, um das pEPI-1-DNMT3A-Konstrukt zu erzeugen.
    2. Lilogieren Sie das HDAC1-Fragment in den verdauten Vektor, um das pEPI-1-HDAC1-Konstrukt zu erzeugen.
      HINWEIS: BglII- und AseI-Stellen platzieren die Inserts stromabwärts des pCMV-Promotors und stromaufwärts des S/MAR-Elements, um eine optimale Expression zu gewährleisten.
  4. Transformieren Sie chemisch kompetente Escherichia coli (z. B. NEB 5-alpha Competent E. coli, High Efficiency) mit den Ligationsprodukten von jedem Vektor separat. Die transformierten Zellen werden auf LB-Agar plattiert, der Kanamycin (50 μg/ml) enthält, und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Selektion positiver Kolonien und Isolierung der Plasmid-DNA mit der schnell siedenden Miniprep-Methode27,28.
  5. Rufen Sie die Sequenz ab, die für das katalytisch tote SpCas9 (dCas9) kodiert. Führen Sie die folgenden Elemente in der angegebenen Reihenfolge ein:
    1. Am 5'-Ende: ASCI-Restriktionsstelle, Kozak-Konsensussequenz und Startcodon (ATG).
    2. Am 3'-Ende: NLS, optional ein HA-Tag, gefolgt von einer BamHI-Restriktionsstelle.
  6. Verdauen Sie sowohl pEPI-1-DNMT3A- als auch pEPI-1-HDAC1-Vektoren mit AscI und BamHI. Führen Sie den gleichen Aufschluss auf dem dCas9-Einsatz durch. Ligate das dCas9-Fragment in den jeweiligen Vektor.
    HINWEIS: Die AscI/BamHI-Stellen stellen sicher, dass dCas9 stromaufwärts von DNMT3A oder HDAC1 und direkt stromabwärts des pCMV-Promotors eingefügt wird. Stellen Sie sicher, dass ein kurzer Linker oder einige Nukleotide zwischen dCas9 und dem epigenetischen Effektor vorhanden sind, um den korrekten Leserahmen beizubehalten.
  7. Verwandeln Sie die endgültigen Ligationsprodukte in hocheffiziente, kompetente E. coli-Stämme mit strenger Kontrolle der Plasmidexpression (z. B. NEB 5-alpha F'Iq Competent E. coli, High Efficiency). Wählen Sie Transformanten auf Kanamycin-Platten aus. Bereiten Sie hochwertige Plasmid-DNA aus positiven Klonen mit der schnell kochenden Miniprep-Methode her.
  8. Sequenzieren Sie die endgültigen Plasmidkonstrukte (pEPI-1-dCas9-DNMT3A und pEPI-1-dCas9-HDAC1) mithilfe der Nanoporensequenzierung, um die korrekte Assemblierung aller Komponenten zu bestätigen, verifizieren Sie den Leserahmen mit einem Online-Übersetzungstool (z. B. Expasy translate tool 3.0) und prüfen Sie mit einem Online-Alignment-Tool (z. B. BLAST-Alignment-Tool) auf potenzielle Mutationen oder Rekombinationsereignisse.
    HINWEIS: Große Vektoren sind anfälliger für Rekombination und können Mutationen akkumulieren. Daher ist eine gründliche Sequenzvalidierung unerlässlich.
  9. Phosphorylieren Sie die 5'-Hydroxylgruppen sowohl der vorwärts als auch der reversen sgRNA-Oligonukleotide unter Verwendung der T4-Polynukleotidkinase. Hybridisieren Sie die beiden komplementären Stränge, indem Sie das Gemisch mehrere Minuten lang auf 90 °C erhitzen, um die Sekundärstrukturen zu denaturieren, und dann über Nacht allmählich auf Raumtemperatur abkühlen lassen, um es vollständig zu doppelsträngiger DNA zu glühen.
  10. Verdauen Sie den ausgewählten pGuide sgRNA-Expressionsvektor mit BamHI und Esp3I. Ligate das geglühte doppelsträngige sgRNA-Fragment in den linearisierten Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Ligase.
  11. Unter Verwendung spezifischer PCR-Primer (Ergänzende Tabelle 3) wird die vollständige gRNA-Expressionskassette amplifiziert, die (1) den U6-Promotor, (2) die klonierte sgRNA-Sequenz und (3) das sgRNA-Gerüst umfasst. Verwenden Sie eine High-Fidelity-DNA-Polymerase, die keine 3'-Überhänge erzeugt (d. h. eine Korrektur-Polymerase), um saubere, stumpfe PCR-Produkte zu gewährleisten, die für die nachgelagerte Klonierung geeignet sind.
  12. Die Schritte 2.9 bis 2.11 werden für jede einzelne gRNA in Abschnitt 1 wiederholt. Stellen Sie sicher, dass jede gRNA-Kassette separat vorbereitet und amplifiziert wird, um die Zielspezifität zu erhalten.
  13. Verdauen Sie die Vektoren pEPI-1-dCas9-DNMT3A und pEPI-1-dCas9-HDAC1 mit SacII. Stumpfen Sie die klebrigen Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I. Klonieren Sie die zuvor amplifizierten U6-Promotor-sgRNA-Gerüstkassetten mit T4-Ligase in diese Vektoren.
    HINWEIS: Während der experimentellen Phase wurden mehrere gRNA-epigenetische Effektorkombinationen (z. B. sgRNA1-dCas9-DNMT3A, sgRNA2-dCas9-HDAC1 usw.) konstruiert. Für die in den folgenden Abschnitten vorgestellten Experimente wurden jedoch nur zwei ausgewählte Kombinationen übernommen.
  14. Verwandeln Sie die endgültigen Ligationsprodukte in hocheffiziente, kompetente E. coli-Stämme mit strenger Kontrolle der Plasmidexpression. Wählen Sie Transformanten auf Kanamycin-Platten aus. Bereiten Sie hochwertige Plasmid-DNA aus positiven Klonen mit der schnell kochenden Miniprep-Methode her.
  15. Sequenzieren Sie die endgültigen Plasmidkonstrukte mithilfe der Nanoporensequenzierung, verifizieren Sie den Leserahmen und prüfen Sie auf mögliche Mutationen oder Rekombinationsereignisse.

3. Zellkultur und Transfektion

  1. Bewahren Sie K562-Zellen in T-75-Kulturkolben bei 37 °C, unter 5 % CO2 und Feuchtigkeit auf. Verwenden Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FBS), 1× Penicillin/Streptomycin-Lösung (Pen/Streptomycin).
  2. Plasmide für die Transfektion vorbereiten:
    1. Es werden 8 μg Gesamtplasmid-DNA pro Transfektion verwendet, also 4 μg jedes Plasmids für eine Co-Transfektion von zwei Plasmiden. Quantifizieren Sie die DNA mit Hilfe der Extinktion bei 260 nm und verdünnen Sie dann die erforderliche Menge in 90 μl Reinstwasser.
    2. Geben Sie 10 μl 3 M Natriumacetatlösung und 2,5 Volumen 100 % Ethanol zur verdünnten DNA.
    3. Gründlich mischen und über Nacht bei -20 °C inkubieren, um die DNA auszufällen.
      HINWEIS: Bei der Co-Transfektion von zwei Plasmiden mit unterschiedlichen gRNA-epigenetischen Effektorkombinationen (z. B. gRNA1-dCas9-DNMT3A und gRNA2-dCas9-HDAC1) wird empfohlen, beide Plasmide im selben Fällungsröhrchen zu kombinieren, um die Handhabung für nachgeschaltete Verfahren zu vereinfachen.
    4. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die DNA-Fällungsröhrchen bei 11.000 × g für 15 min bei 4 °C.
      HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank durch, da in dieser Phase auch mit lebenden Zellen umgegangen wird.
    5. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Fügen Sie 500 μl 70 % Ethanol hinzu, um das Pellet zu waschen. Zentrifugieren Sie bei 11.000 × g für 5 min bei 4 °C.
    6. Entfernen Sie den Ethanolüberstand vollständig. Lassen Sie das Pellet an der Luft trocknen, bis kein sichtbares Ethanol mehr übrig ist.
    7. Resuspendieren Sie das getrocknete DNA-Pellet gründlich in 50 μl DMEM. Halten Sie die Plasmid-DMEM-Lösung bis zur Verwendung bei 4 °C.
    8. 400 ng der vorbereiteten episomalen DNA (ca. 2,5 μl der resuspendierten Lösung) werden auf ein 1%iges Agarosegel aufgebracht, um den Erfolg der DNA-Aufreinigung und -Integrität vor der Transfektion zu überprüfen.
  3. Zellen vorbereiten:
    1. Ernten Sie K562-Zellen aus einem T-75-Kolben, wenn die Kulturen eine Konfluenz von 50-60 % erreichen, um die Transfektionseffizienz zu gewährleisten.
    2. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Ein Volumen mit 2 × 105 Zellen wird ohne FBS oder Antibiotika in eine 35-mm-Kulturschale mit 900 μl DMEM überführt.
      HINWEIS: Verwenden Sie für alle Schritte des Transfektionsverfahrens serumfreies DMEM. Die vollständigen Medienkulturbedingungen werden erst nach Abschluss der Transfektionsinkubationszeit wieder aufgenommen.
    3. Stellen Sie die Schale in den Inkubator (37 °C, 5 % CO2), um die Zellen für die Transfektion bereit zu halten.
  4. Verwenden Sie ein Transfektionskit auf Lipofektaminbasis für die Plasmidabgabe. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für das jeweils verwendete Kit und passen Sie die Lautstärke bei Bedarf an.
    1. Geben Sie 3 μl P3000 Reagenz (im Transfektionskit enthalten) in die vorbereitete Plasmid-DMEM-Lösung. Vorsichtig mischen und den Plasmid-P3000-Reagenzienmix 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Fügen Sie 5 μl Lipofectamine 3000 Reagenz (im Transfektionskit enthalten) zusammen mit so viel DMEM hinzu, dass ein Gesamtreaktionsvolumen von 100 μl erreicht wird. Inkubieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    3. Geben Sie die volle 100-μl-Transfektionsmischung in die 35-mm-Schale mit den Zellen. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Mischung zu verteilen, und stellen Sie die Schale dann wieder in den Inkubator.
  5. 24 Stunden nach der Transfektion geben Sie 3 ml Vollmedium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS und 1× Pen/Strepto) in jede 35-mm-Schale, um die Proliferation der transfizierten Zellen zu initiieren. Beginnen Sie 72 Stunden nach der Transfektion das Auswahlverfahren, indem Sie das Antibiotikum G-418 in einer Endkonzentration von 1 mg/ml hinzufügen.
  6. Sobald die Selektion ausreichend etabliert ist und die Gesamtzellzahl 1 × 106 übersteigt, wird mit der Isolierung einzelner Klone (Abbildung 3A) mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) fortgefahren:
    1. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 300 × g für 6 min bei 25 °C geerntet. Einmal mit 1× steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH ~7,4) waschen und unter den gleichen Bedingungen erneut zentrifugieren.
    2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1× PBS und bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer. Verdünnen Sie die Suspension auf 1 × 106 Zellen/ml, um eine gründliche Resuspension zu gewährleisten.
    3. Richten Sie das FCS kürzer auf den Einzelzellmodus ein (stellt sicher, dass 1 Zelle pro Tröpfchen vorhanden ist), wobei eine mit 96-Well-Gewebekulturen behandelte Platte als Entnahmevorrichtung verwendet wird. Passen Sie die Softwareeinstellungen bei Bedarf je nach verwendetem Gerät an (Abbildung 3B).
    4. Gate der primären Grundgesamtheit basierend auf der erwarteten Größe (FSC) und Granularität (SSC). Schließen Sie Schmutz (niedriger FSC/SSC) und hochkörniges oder totes Material (hoher SSC) aus. Verwenden Sie Punktdiagramme von FSC-A vs. FSC-H oder SSC-A vs. SSC-H, um Singuletts zu gaten.
    5. Füllen Sie die 96-Well-Platte mit 100 μl Vollmedium mit 1 mg/ml G-418 pro Well vor. Erwärmen Sie die Platte vor dem Sortieren im Inkubator.
    6. Führen Sie die Sortierung im Einzelzellenmodus durch und halten Sie eine Sortierrate von unter 300 Ereignissen/Sekunde aufrecht, um die Sortiergenauigkeit zu verbessern.
    7. Überprüfen Sie nach dem Sortieren die Wells unter einem Mikroskop, um eine Zelle pro Well zu bestätigen. Stellen Sie die Platte in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2.
  7. Ermöglichen Sie einzelligen Klonen, sich in der 96-Well-Platte individuell auszudehnen. Sobald das klonale Wachstum etabliert ist, reduzieren Sie die G-418-Konzentration auf 400 μg/ml, um die Selektion aufrechtzuerhalten.
  8. Übertragen Sie gut wachsende Klone nacheinander auf 12-Well-Platten, dann je nach Bedarf auf T-25- und schließlich T-75-Kolben, bis jeder Klon ~1 × 106 Zellen erreicht.
  9. Sammeln Sie in regelmäßigen Abständen doppelzellige Pellets. Lagern Sie ein Pellet bei -20 °C für die genomische DNA-Extraktion. Lagern Sie zusätzlich ein in 500 μl Trizol-Reagenz homogenisiertes Pellet bei -20 °C für die RNA-Extraktion und cDNA-Synthese.
    VORSICHT: Trizol-Reagenz sollte aufgrund seiner Toxizität und korrosiven Natur in einem chemischen Abzug mit Vorsicht gehandhabt werden, während persönliche Schutzausrüstung getragen wird, und kontaminierte Materialien müssen für die Entsorgung gefährlicher Abfälle gekennzeichnet werden.
  10. Extrahieren Sie genomische DNA aus ausgewählten Klonen mit traditioneller Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von Ethanolfällung.
    ACHTUNG: Phenol:Chloroform ist giftig und ätzend und sollte in einem chemischen Abzug mit persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden. Phenol- und chloroformhaltige Abfälle sind als chemischer Sonderabfall zu entsorgen.
  11. Stellen Sie sicher, dass die DNA vollständig in nukleasefreiem Wasser oder TE-Puffer resuspendiert ist. Messen Sie die DNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Spektralphotometer, bevor Sie mit nachgelagerten Anwendungen fortfahren.
    HINWEIS: Diese DNA wird in nachgelagerten Experimenten wie PCR und Pyrosequenzierung verwendet, um die Effizienz der epigenetischen Editierung zu bewerten.
  12. Extraktion der Gesamt-RNA aus Zellpellets mit dem Trizol-Reagenz, gefolgt von einer Isopropanol-Fällung29. Gehen Sie mit RNA-Proben vorsichtig um, indem Sie auf RNase-freie Reagenzien und Einwegartikel achten und die Proben während des Eingriffs bei 4 °C halten.
    HINWEIS: Die Gesamt-RNA wird für die cDNA-Synthese unter Verwendung eines reversen Transkriptionskits verwendet.

4. PCR zur Bestätigung des Vorhandenseins beider Episomen in Klonen

  1. Ernten Sie etwa 5 × 105 Zellen aus jedem Kulturklon, nachdem Sie die Zellen gründlich resuspendiert haben. Zentrifugieren Sie bei 7.000 x g für 3 min bei 25 °C. Überstehendes Medium entsorgen.
  2. Waschen Sie die Zelle, indem Sie sie in 1× PBS resuspendieren. Unter den gleichen Bedingungen erneut zentrifugieren.
  3. Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie ein kleines Volumen knapp über dem Pelletspiegel zurück. Verwenden Sie 1 μL der Zellsuspension direkt als Template für die PCR.
  4. Alternativ können Sie 200 ng gereinigte genomische DNA verwenden, die aus den transfizierten Klonen extrahiert wurde.
    HINWEIS: Die direkte PCR aus gewaschenen Zellen bietet eine schnelle Screening-Methode, kann jedoch zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Für eine höhere Spezifität und Sensitivität verwenden Sie gereinigte genomische DNA als Vorlage.
  5. Bereiten Sie den PCR-Mastermix gemäß Tabelle 1 vor.
  6. Verwenden Sie zwei Sätze von Primern, wobei ein gemeinsamer Forward-Primer auf die dCas9-Sequenz abzielt und separate Reverse-Primer, die für jeden epigenetischen Effektorvektor spezifisch sind (Ergänzende Tabelle 3).
  7. Befolgen Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Fahrbedingungen.
  8. Führen Sie PCR-Produkte auf Agarosegel durch oder analysieren Sie mit Kapillarelektrophorese, um die Produktgrößen zu überprüfen: 230 bp für den DNMT3A-haltigen Vektor und 205 bp für den HDAC1-haltigen Vektor (Abbildung 3C). Fügen Sie eine Positivkontrolle (Mischung beider Plasmide in einer Konzentration von 10-20 ng) hinzu, um die erwarteten Bandengrößen zu bestätigen und die PCR-Effizienz zu validieren. Fügen Sie ein No Template Control (NTC) hinzu.
ReagenzEndkonzentration/-menge
10× Puffer1×
Grundierung nach vorne1 μΜ
Umgekehrte Grundierungen0,5 μM
DNS200 ng
Polymerase1,25 HE
dNTPsje 200 μM
Wasser, nukleasefreibis 50 μL

Tabelle 1: PCR-Reaktionsmix zur Episomenverifizierung.

SchrittTemperatur, °CZeitAnzahl der Zyklen
Anfängliche Denaturierung953 Minuten1
Denaturierung9530 Sek.30
Glühen5830 Sek.
Erweiterung72ca. 1 min
Letzte Verlängerung725 Minuten1

Tabelle 2: PCR-Zyklusbedingungen für die Episomenverifizierung.

5. Gezielte Pyrosequenzierungsanalyse

  1. Behandeln Sie gDNA (1,5 μg), die aus transfizierten Klonen extrahiert wurde, mit einem Bisulfit-Umwandlungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  2. Entwerfen Sie Primer, die die CpG-Standorte innerhalb des regulatorischen Bereichs flankieren, auf den die Konstrukte abzielen. Verwenden Sie ein spezielles Designwerkzeug für Bisulfit-Primer. Befolgen Sie diese Designrichtlinien:
    1. Konvertieren Sie die regulatorische Region für die CpG-Insel oder den CpG-Standort in die mit Bisulfit konvertierte Version.
    2. Entwicklung eines Vorwärts- und Rückwärtsprimers für die PCR-Amplifikation von Bisulfit-umgewandelter DNA. Nehmen Sie eine Biotinmarkierung auf einen Primer (normalerweise die Rückseite) auf, um Streptavidin-beschichtete Kügelchen zu immobilisieren.
    3. Entwerfen Sie einen Sequenzierungsprimer (18-25 bp), der dem PCR-Produkt vorgeschaltet ist und dem ersten CpG von Interesse vorausgeht. Wählen Sie als Zielregion ein 100-bp-Fenster stromaufwärts oder stromabwärts der sgRNA-Bindungsstelle, um mögliche lokale epigenetische Modifikationen zu beurteilen.
    4. Vermeiden Sie CpG-Stellen innerhalb von Primersequenzen, um eine unverzerrte Amplifikation zu gewährleisten.
    5. Wählen Sie ein Primerpaar mit einer Assay-Design-Softwarebewertung von mehr als 75 % und einer Qualitätsbewertung von "hoch" (blau), was bedeutet, dass die Softwareanalyse keine Probleme oder Bedenken festgestellt hat.
      HINWEIS: Für Primersequenzen, die auf die CpG-Insel 326 abzielen, siehe Ergänzende Tabelle 3. Die Primer wurden so konzipiert, dass sie in Regionen binden, die die sgRNA1- und sgRNA2-Bindungsstellen flankieren, was die Sequenzierung von CpG-Stellen um die Zielloci ermöglicht.
  3. Richten Sie eine PCR-Reaktion mit einer High-Fidelity-Hot-Start-DNA-Polymerase ein, die für Bisulfit-Templates optimiert ist.
  4. Ablauf der Pyrosequenzierung:
    1. Binden Sie biotinylierte PCR-Produkte an Streptavidin-beschichtete Sepharosekügelchen und isolieren Sie einzelsträngige DNA mit einer Pyrosequenzierungs-Workstation.
    2. Geben Sie den Sequenzierungsprimer zu der einzelsträngigen DNA im Annealing-Puffer. Die Mischung 2 Min. auf 80 °C erhitzen und dann nach und nach auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    3. Führen Sie Sequenzierungsreaktionen mit dem Pyrosequenziergerät und der während des Primer-Designs definierten Dispensierreihenfolge durch.
  5. Datenanalyse:
    1. Verwenden Sie eine spezielle Pyrosequenzierungssoftware, um die prozentuale Methylierung an jeder CpG-Stelle zu quantifizieren.
    2. Vergleichen Sie die Methylierungsgrade zwischen transfizierten und nicht transfizierten Klonen. Bewerten Sie die Bearbeitungseffizienz (Abbildung 3D). Erwägen Sie die Durchführung eines zweiseitigen ungepaarten t-Tests, um die Methylierungsniveaus zwischen unbehandelten Kontrollen und jedem transfizierten Klon an jeder einzelnen CpG-Stelle zu vergleichen.

6. cDNA-Synthese und digitale PCR zur Analyse der dCas-Expression

  1. Bereiten Sie die Gesamt-RNA (1.100 ng pro Reaktion) vor, die aus transfizierten Klonen in 12 μl RNase-freiem Wasser extrahiert wurde. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.
  2. Montieren Sie die genomische DNA-Eliminierungsmischung auf Eis: Mischen Sie 2 μl gDNA-Wipeout-Puffer, eine RNA-Probe mit 1.100 ng Gesamt-RNA und RNase-freies Wasser zu einem Endvolumen von 14 μl. 2 Minuten bei 42 °C inkubieren und dann auf Eis legen.
  3. Bereiten Sie den reversen Transkriptions-Mastermix auf Eis vor: Mischen Sie 4 μl RT-Puffer mit 1 μl RT-Primern und fügen Sie 1 μl reverse Transkriptase hinzu.
  4. Kombinieren Sie 14 μl genomischen DNA-Eliminierungsmix mit 6 μl Reverse-Transkriptions-Mastermix zu einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl. Vorsichtig mischen und 15 Minuten lang bei 42 °C inkubieren. Inaktivieren Sie die reverse Transkriptase, indem Sie sie 3 Minuten lang auf 95 °C erhitzen.
    HINWEIS: Lagern Sie cDNA bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.
  5. Verdünnen Sie cDNA aus allen Proben 1:1 mit nukleasefreiem Wasser. Verwenden Sie die verdünnte cDNA für die nachgelagerte digitale PCR-Analyse unter Verwendung eines digitalen PCR-Systems mit dCas-spezifischen Primern (Ergänzende Tabelle 3):
    1. Bereiten Sie die 4×-Mastermischung und die Reaktionsmischung gemäß Tabelle 3 vor. Geben Sie verdünnte cDNA in die Mischung und pipettieren Sie vorsichtig, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Richten Sie Reaktionen mindestens in Duplikaten für alle Klone ein. Enthalten Sie eine Negativkontrolle (cDNA aus unbehandelten K562-Zellen) und einen NTC.
    2. Laden Sie 9 μl der Reaktionsmischung in jede Vertiefung der PCR-Platte. Richten Sie das PCR-System unter Verwendung der in Tabelle 4 dargestellten Zyklusbedingungen ein.
    3. Wählen Sie den FAM-Farbstoffkanal für die Erkennung aus und starten Sie den Lauf.
    4. Rufen Sie nach Abschluss die Proben ab und analysieren Sie die Daten.
      HINWEIS: Die digitale PCR meldet die Ergebnisse als Kopien pro μl Reaktion.
    5. Multiplizieren Sie den angegebenen Wert (Kopien/μl) mit dem Reaktionsvolumen (10 μl), um die Gesamtzahl der Kopien pro Reaktion zu erhalten. Teilen Sie diesen Wert durch die Menge an cDNA in der Reaktion, um Kopien pro ng cDNA zu erhalten (entspricht der ng-RNA-Eingabe).
      HINWEIS: Wenn das genaue Protokoll befolgt wird, beginnt jede Probe mit 1.100 ng RNA in einer 20 μl RT-Reaktion (55 ng/μl). Nach einer 1:1-Verdünnung beträgt die Arbeitskonzentration 27,5 ng/μL, und da jeder PCR-Reaktion 1 μl zugesetzt wird, entspricht dies 27,5 ng cDNA (RNA-Äquivalent) pro Reaktion.
Mastermix (4×)
ReagenzEndkonzentration/-menge
25× SYBR Grüner Farbstoff2×
5× Digitaler PCR-Mix4×
Wasser, nukleasefreibis 100 μL
Reaktionsmischung
ReagenzEndkonzentration/-menge
4× Mastermix1×
Grundierung nach vorne1 μΜ
Umgekehrte Grundierung1 μΜ
cDNA (verdünnt)1 μL
Wasser, nukleasefreibis 10 μL

Tabelle 3: 4× Mastermix und Reaktionsmix für die digitale PCR-Analyse der dCas-Expression.

SchrittTemperatur, °CZeitAnzahl der Zyklen
Anfängliche Denaturierung96ca. 10 Minuten1
Denaturierung965 Sek.40
Glühen/Verlängern6015 Sek.

Tabelle 4: Zyklusbedingungen für die digitale PCR.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um zu untersuchen, ob unsere gezielten epigenetischen Editierungswerkzeuge ortsspezifische DNA-Methylierungsänderungen an der ZBTB7A CpG-Insel 326 induzieren können, erzeugten wir zunächst episomale Vektoren, die für dCas9 kodieren, das entweder an DNMT3A(CD) oder HDAC1 fusioniert ist, zusammen mit verschiedenen sgRNAs, die mit Zielstellen innerhalb der CpG-Insel 326 ausgestattet sind. Wir haben zunächst K562-Zellen mit Kombinationen dieser Plasmide co-transfiziert, um zu evalui...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll ist das Design hochspezifischer sgRNAs. Off-Target-Effekte sind eine bekannte Einschränkung von CRISPR-basierten epigenetischen Editing-Systemen, die häufig aus der dCas9-Bindungsuntreue sowie der unspezifischen Aktivität der Effektordomänen resultieren können. Um dies zu minimieren, müssen sgRNAs mit bioinformatischen Werkzeugen entworfen werden, die für eine hohe On-Target-Aktivität und eine minimale Off-Target-Bindung optimiert sind

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen oder nicht-finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Irene Dereki und Vasiliki Chondrou werden durch ein dreijähriges Stipendium (Grant No. 80706) des Sonderkontos für Forschungsfonds (ELKE) der Hellenic Open University unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Absolute Q DNA Digital PCR Master Mix (5x)Angewandte BiosystemeA52490
AgeI-HF NEBR3552
AscINEBR0558
AseINEBR0526
BamHI-HFNEBR3136
BD FACS Melodiezell-SortiererBD
BglllNEBR0144
BspEINEBR0540
Desoxynukleotid (dNTP) Lösungsmischung (jeweils 10 mM)NEBN0447
DMEM High Glucose mit stabilem Glutamin und NatriumpyruvatmediumBiowestL0103
DNA-Polymerase I, großes (Klenow-)FragmentNEBM0210
DNMT3A (CD), HDAC1-SequenzenIDT
DreamTaq DNA-Polymerase ThermowissenschaftlichEP0712
EpiTectQiagen59104Bisulfit-Umwandlungskit 
Epitect Bisulfit-KitQiagen59104
Esp3INEBR0734
Fetales RinderserumGibcoA5256701
Geneticin-selektives Antibiotikum (G418-Sulfat)Gibco11811031
Lipofectamin 3000 TransfektionssetInvitrogenL3000015
NEB®   5-alpha Competent E. coli  (Hohe Effizienz)NEBC2987I
NEB®   5-alpha F'Iq  Competent E. coli  (Hohe Effizienz)NEBC2992H
Nukleospin-Gewebe Macherey-Nagel740952.50
PBS, 10x-Lösung pH 7,4LonzaBE17-517Q
Penicillin-Streptomycin-Lösung 100xBiowestL0022
pGuide-VektorOriGene TechnologienGE100042
Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25:24:1 Gesättigt mit 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTASigma-AldrichP2069
Primer, sgRNAs Eurofins
PyroMark Assay Design QiagenVersion 2.0Bisulfit-Primer-Designtool 
PyroMark Gold Q24 ReagenzienQiagen970802
PyroMark PCR-Kit Qiagen978703
PyroMark Q24 MDxQiagenPyrosequencing Workstation 
PyroMark Q24 Software Qiagenv2.0.8Pyrosequenzierungssoftware 
F5® Hochpräzise DNA-PolymeraseNEBM0491
QuantiTect Reverse-Transkriptions-KitQiagen205311
QuantStudio Absolute Q MAP16 PlattenkitAngewandte BiosystemeA52865Digitales PCR-System 
SYBR Green I Nukleinsäure-Gelfärbung, 10.000-fach Konzentrat in DMSOInvitrogenS7563
T4-DNA-LigaseNEBM0202
T4-Polynukleotid-KinaseNEBM0201
TRIzol-ReagenzInvitrogen15596026

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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dCas9 HDAC1episomale Vektorengezielte MethylierungCRISPR EpigenetikDurchflusszytometrieGenregulation

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