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Forschungsartikel

Herz-zerebraler Schutz durch Elektroakupunktur in einem Mausmodell chronischer Hypoxie

268 Ansichten

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DOI:

10.3791/69329

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31. März 2026

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1Heilongjiang University of Chinese Medicine, 2Hebei Medical University, 3Chengde Medical University, 4Hebei Province Key Lab. of Research and Development for Chinese Medicine, Chinese Medicine Research Institute, Chengde Medical University, 5Hebei University of Chinese Medicine, 6The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, 7State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie etablierte ein 12-wöchiges Modell der chronischen Hypoxie-Maus, um den kardio-zerebralen Schutz der Elektroakupunktur zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass Elektroakupunkturstimulation an Akupunkten, die häufig zur Verbesserung der kognitiven Funktion eingesetzt wurde, nicht nur die kognitive Funktion verbesserte, sondern auch die Herzdysfunktion linderte und pathologische Schäden im Myokardgewebe reduzierte.

Zusammenfassung

Diese Studie etablierte ein 12-wöchiges Modell der chronischen Hypoxie-Maus, um die kardio-zerebralen Schutzwirkungen der Elektroakupunktur zu untersuchen. Bestehende therapeutische Ansätze für hypoxiebedingte Erkrankungen, wie die hyperbare Sauerstofftherapie und bestimmte Arzneimittel, sind häufig durch schlechte Zugänglichkeit oder Single-Target-Mechanismen eingeschränkt. Um diese Lücke zu schließen, stellten wir die Hypothese auf, dass die EA-Stimulation an Akupunkten, die traditionell zur kognitiven Verbesserung eingesetzt wurden, sowohl die kognitiven als auch die Herzfunktionen unter chronischen hypoxischen Erkrankungen gleichzeitig verbessern könnte. Dreißig männliche C57BL/6J-Mäuse wurden zufällig drei Gruppen zugeteilt: Kontrollgruppe (Con), Modellgruppe für chronische Hypoxie (CH) und Behandlungsgruppe für chronische Hypoxie plus Elektroakupunktur (CH+EA). Die CH- und CH+EA-Gruppen waren täglich 8 Stunden über 12 Wochen einer hypoxischen Umgebung ausgesetzt (10,0 % ± 0,5 % O₂), wobei die CH+EA-Gruppe in den letzten 2 Wochen zusätzliche tägliche EA-Stimulation bei GV20, GV24 und bilateraler ST36 erhielt. Verhaltenstests, echokardiographische Beurteilungen und histopathologische Analysen zeigten, dass EA nicht nur angstähnliche Verhaltensweisen signifikant linderte und das räumliche Gedächtnis verbesserte, sondern auch mehrere kardiale Funktionsparameter verbesserte und gleichzeitig Schäden an Hippocampusneuronen und Myokardiomstrukturierungen reduzierte. Diese Ergebnisse zeigen, dass EA kardio-zerebrale Schutzwirkungen verleiht, die mit dem "ganzheitlichen Konzept" der traditionellen chinesischen Medizin übereinstimmen und damit eine neuartige nicht-pharmakologische Interventionsstrategie für hypoxiebedingte kardiozerebrale Komorbiditäten bietet.

Einleitung

Hypoxie stellt eine häufige pathologische Herausforderung unter verschiedenen Erkrankungen dar, darunter Höhenumgebungen, chronisch obstruktive Lungenerkrankungen (COPD), kardiozerebrovaskuläre Erkrankungen sowie spezialisierte Szenarien wie Luft- und Raumfahrt- und Tauchoperationen, die potenziell zu funktionellen Beeinträchtigungen bei mehreren Organen führen können. Als Organe mit dem höchsten Sauerstoffverbrauch im Körper sind Gehirn und Herz besonders anfällig für hypoxische Schäden. Studien zeigen, dass die Prävalenz kognitiver Beeinträchtigungen bei COPD-Patienten zwischen 32 % und 88 % liegt, während die Häufigkeit kardialer Funktionsstörungen bis zu 70 % erreicht. Studien haben gezeigt, dass chronische Hypoxie eine zerebrale mitochondriale Dysfunktion auslöst, was wiederum oxidativen Stress, Kalziumüberlastung und Neuroinflammation auslöst, was letztlich neuronale Schäden im Hippocampus und im Großhirnrinde verursacht und Lern- und Gedächtnisfunktionen beeinträchtigt 4,5,6. Gleichzeitig aktiviert Hypoxie sowohl das sympathische Nervensystem als auch das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS), was zu Vasokonstriktion, erhöhtem Blutdruck, erhöhter kardialer Nachlast und zur Förderung von Myokardialhypertrophie und Fibrose führt, was letztlich zu Herzinsuffizienz 7,8,9 führt. Diese gleichzeitige kardio-zerebrale Verletzung erhöht die Schwierigkeit der klinischen Behandlung für Patienten erheblich, sodass die Entwicklung wirksamer und zugänglicher therapeutischer Strategien zu einem kritischen, unerfüllten klinischen Bedarf wird.

Aktuelle therapeutische Strategien für durch Hypoxie induzierte kognitive Beeinträchtigung und Herzstörungen umfassen hauptsächlich hyperbare Sauerstofftherapie, zerebrale Stoffwechselverstärker (z. B. Piracetam, Oxiracetam), neurotrophe Faktortherapie10,11 und β-Blocker (z. B. Metoprolol)12. Diese Ansätze weisen jedoch erhebliche Einschränkungen auf: Hyperbare Sauerstofftherapie erfordert spezielle Geräte und ist nicht zugänglich; Pharmakologische Interventionen verursachen häufig Nebenwirkungen und zielen typischerweise auf einzelne pathologische Signalwege ab; während die neurotrophe Faktortherapie Herausforderungen im Zusammenhang mit der Durchdringung und Stabilität der Blut-Hirn-Schranke hat. Daher ist die Identifizierung effizienter, zugänglicher Strategien für gleichzeitige kardio-zerebrale Behandlung zu einer zentralen Forschungsrichtung geworden.

Akupunktur, ein grundlegender Bestandteil der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM), betont eine ganzheitliche therapeutische Perspektive, die mit der Nachfrage nach einer multizielgerichteten Regulation übereinstimmt. Es zeigt ein einzigartiges therapeutisches Potenzial sowohl für neurologische als auch für kardiovaskuläre Erkrankungen. Die Elektroakupunktur (EA), eine moderne Weiterentwicklung der Akupunktur, die traditionelles Nadeln mit elektrischer Stimulation verbindet, ermöglicht eine präzisere Modulation der neuronalen elektrophysiologischen Aktivität13,14. EA verbessert effektiv die zerebrale Ischämie-Reperfusionsverletzung, reduziert die Freisetzung von Myokardenzymen (GPBB, H-FABP) und übt eine bedeutende kardioprotektionaus 15,16 aus. Zusammenfassend lässt sich zusammenfassen: Als moderne Innovation der traditionellen Akupunktur übt die Elektroakupunktur eine multimechanistische und multizielte Regulation aus, zeigt einen klaren Anwendungswert und klinisches Potenzial in der Behandlung neurologischer und kardiovaskulärer Erkrankungen und verbindet TCM mit moderner Medizin.

Aktuelle Studien zu EA bei hypoxischer kognitiver Beeinträchtigung und Herzverletzung beschränken sich jedoch meist auf einzelne Organ-/Systemeffekte und versäumen es, ihr Potenzial in der gleichzeitigen kardio-zerebralen Behandlung zu erforschen. Basierend auf dem "ganzheitlichen Konzept" der TCM und der klinischen Realität der kardiopulmonal-zerebralen Dysfunktion durch langfristige chronische Hypoxie ausgelöste Komorbidität, zielt diese Studie darauf ab, die Wirkung von EA in der "gleichzeitigen kardio-zerebralen Behandlung" zu untersuchen, ihre Rolle bei der synchronen Verbesserung von hypoxiebedingten Neuronenschäden, Myokardialhypertrophie/Fibrose und damit verbundenen funktionellen Beeinträchtigungen zu klären und bietet ein ganzheitliches, gezieltes nicht-pharmakologische Regime für kardiopulmonal-zerebrale assoziierte Erkrankungen Krankheiten.

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Protokoll

Dreißig männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 7 bis 8 Wochen und mit einem Gewicht von 18 bis 22 g (siehe Materialtabelle) wurden in einer SPF-Einrichtung im New Drug Evaluation Center des Hebei Yiling Pharmaceutical Research Institute untergebracht. Die Umgebungstemperatur wurde bei 20-26 °C gehalten, mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40 % bis 70 %, unter einem 12/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus. Die Mäuse hatten ad libitum Zugang zu standardmäßigem Laborfutter für Nagetiere und sauberem Wasser. Nach einer einwöchigen Akklimatisierungsphase wurden die Mäuse zufällig in drei Gruppen eingeteilt (n = 10): die normale Kontrollgruppe (Con), die chronische Hypoxie-Modellgruppe (CH) und die Behandlungsgruppe für chronische Hypoxie plus Elektroakupunktur (CH+EA). Alle experimentellen Verfahren wurden vom Ethikkomitee für Tierforschung des Hebei Yiling Pharmaceutical Research Institute (Zulassungsnummer: TTN-2025001) genehmigt und streng gemäß den Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt.

Etablierung eines chronischen Hypoxie-Mausmodells (Abbildung 1)

Das Modell der chronischen Hypoxie-Maus wurde auf Basis einer zuvor beschriebenen Methode mit Modifikationen17 entwickelt. Ein automatisiertes Gaskontroll- und Abgabesystem wurde verwendet, um eine hypoxische Umgebung zu erzeugen und aufrechtzuerhalten. Dieses System war so programmiert, dass es Magnetventile präzise regelte, die reinen Sauerstoff und Stickstoff in einem bestimmten Verhältnis mischten und das Gemisch in eine maßgefertigte Edelstahl-Hypoxiekammer brachten. Dieses Setup ermöglichte eine genaue Steuerung sowohl des Zeitpunkts als auch der Gaskonzentration. Die Sauerstoffkonzentration in der Kammer wurde kontinuierlich mit einem digitalen Sauerstoffanalysator überwacht und über einen Rückkopplungsmechanismus bei 10,0 % ± 0,5 % gehalten, der die Gasflussrate entsprechend anpasste. Mäuse in den CH- und CH+EA-Gruppen wurden gemeinsam in der Hypoxiekammer untergebracht und 8 Stunden pro Tag (von 9:00 bis 17:00 Uhr) hypoxischen Bedingungen ausgesetzt, danach wurden sie für den Rest des Tages wieder in normoxische Bedingungen versetzt. Dieses Protokoll wurde täglich 12 Wochen lang wiederholt. Während der hypoxischen Exposition hatten Tiere ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Während der anfänglichen Stickstoffinfusion wurde besondere Sorgfalt gewaltsam, um die Sauerstoffkonzentration zu senken; Dieser Prozess wurde schrittweise durchgeführt, um akuten Tiersterben durch einen raschen Rückgang des Sauerstoffgehalts zu verhindern. Mäuse in der Con-Gruppe wurden unter normoxischen Bedingungen in einer angrenzenden Kammer untergebracht, wobei alle anderen Wohnbedingungen identisch mit denen der experimentellen Gruppen waren.

Anästhesie (Abbildung 2)

Um die Stabilität des Tieres während der Elektroakupunkturintervention zu gewährleisten und die Beeinflussung durch physiologischen Stress auf die Ergebnisse zu minimieren, wurde in dieser Studie eingeatmetes Isofluran für die Anästhesie eingesetzt17. Während der Verfahren wurde allen Mäusen in den Versuchsgruppen eine Anästhesie verabreicht, um eine einheitliche Betriebsbedingung zu gewährleisten. Vor der Anästhesie wurden eine Kleintier-Anästhesiemaschine (siehe Materialtabelle) und ein thermostatisch gesteuertes Heizkissen mit 37 °C vorbereitet, um eine Unterkühlung bei den Tieren während des Eingriffs zu verhindern. Die Anästhesie-Einleitung erfolgte in einer verschlossenen Induktionskammer mit 2–2,5 % Isofluran (siehe Materialtabelle) für etwa 1 Minute. Nach dem Verlust der spontanen Bewegung und einer signifikanten Verringerung des Muskeltonus wurde jede Maus auf das Wärmekissen übertragen. Eine speziell entwickelte Miniaturmaske wurde vorsichtig über die Schnauze gelegt, um die Anästhesie mit 0,5%–1,2% Isofluran aufrechtzuerhalten. Die effektive Tiefe der Anästhesie wurde durch das Fehlen des Blinzelreflexs und das Fehlen eines signifikanten Rückzugsreflexes als Reaktion auf Plantarstimulation bestimmt. Dieses Anästhesieprotokoll hielt über 30 Minuten einen stabilen Anästhesiezustand in den Mäusen, was ausreichte, um alle nachfolgenden Eingriffe abzuschließen.

Elektroakupunkturbehandlung

Die Elektroakupunktur-Intervention für die CH+EA-Gruppe der Mäuse begann in der 11. Woche der chronischen Hypoxie-Exposition. Die ausgewählten Akupunktpunkte waren Baihui (GV20) und Shenting (GV24) am Kopf sowie bilaterale Zusanli (ST36). GV20 befindet sich auf der Mittellinie des Schädelscheitels, ungefähr in der Mitte zwischen den beiden Ohrspitzen18. GV24 befindet sich auf der Mittellinie der Stirn, etwa 1–2 mm oberhalb des Mittelpunkts der Linie, die die inneren Canthi der Augen19 verbindet. ST36 befindet sich an der hinteren Gliedmaße, unterhalb und lateral vom Kniegelenk, in einer Vertiefung etwa 2 mm unterhalb des unteren Rand des Wadenkopfes 20,21. Nachdem die Mäuse einen stabilen anästhetischen Zustand erreicht hatten, hielt der Bediener in der rechten Hand eine einweg-sterile Edelstahl-Akupunkturnadel (Spezifikation: 0,18 × 7 mm; siehe Materialtabelle). Bei den Kopfakupunkten (GV24 und GV20) wurde die Kopfhaut sanft mit der linken Hand angehoben, und die Nadel wurde subkutan in einem Winkel von 15–30° eingeführt, wobei sie nach hinten bis zu einer Tiefe von etwa 2 mm vorrückte. Für den ST36-Akupunkt an der unteren Gliedmaße wurde die Nadel senkrecht auf eine Tiefe von etwa 3–4 mm eingeführt. Die Ausgangselektroden des Elektroakupunkturgeräts (siehe Materialtabelle) wurden dann mit den Nadelhebeln verbunden: Ein Satz Leitungen verband GV20 mit dem linken ST36, während das andere Satz GV24 und das rechte ST36 verband. Die gleichzeitige Elektroakupunkturstimulation erfolgte über zwei Drahtsätze. EA-Parameter wurden wie folgt eingestellt: Dauerwelle, 2 Hz Frequenz22,23. Die Stromintensität wurde allmählich von 0,1 mA erhöht, bis ein leichtes rhythmisches Zucken der lokalen Gliedmaße beobachtet wurde (typischerweise bei etwa 2 mA). Die Elektroakupunktur wurde einmal täglich für 30 Minuten durchgeführt, 6 Tage lang ununterbrochen mit einem Ruhetag, was insgesamt eine zweiwöchige Dauer ergab. Unterdessen unterzogen sich die Mäuse in den Con- und CH-Gruppen einer Anästhesie und Fixierung mit identischer Dauer und Bedingungen, jedoch ohne Nadeleinstich oder Aktivierung des Elektroakupunkturgeräts.

Freifeldtest

Der Open Field Test (OFT) wurde durchgeführt, um die spontane Bewegungsaktivität, das explorative Verhalten und angstähnliche Reaktionen von Mäusen in einer neuen Umgebungzu bewerten. Das OFT-Gerät war eine weiße Kabine (50 cm 50 cm 30 cm), deren Boden praktisch in ein Raster von 25 Quadraten (jeweils 10 cm 10 cm) für die Verhaltensanalyse unterteilt war. Vor dem formellen Test wurden alle Mäuse für eine Stunde an den Testraum gewöhnt, um die Auswirkungen des durch die Umweltveränderung verursachten Stresses auf die Verhaltensergebnisse zu minimieren. Während der Tests wurde jede Maus vorsichtig in die Mitte des Geräts gelegt. Nach einer zweiminütigen Gewöhnungsphase wurde sein Verhalten offiziell für 10 Minuten aufgezeichnet. Die gesamte Sitzung wurde mit einem Video-Tracking-System (siehe Materialtabelle) aufgezeichnet, um die Bewegungsbahn automatisch zu verfolgen. Analysierte Parameter umfassten die gesamte zurückgelegte Strecke, die Zeit in der Mittelzone, die Geschwindigkeit in der Mittelzone und die Anzahl der Einträge in die Mittelzone. Alle Mäuse begannen die Erkundung vom identischen zentralen Ort aus, und jede Maus wurde nur einmal getestet. Um Riechstörungen zu verhindern, wurde das Gerät nach den Tests jeder Maus gründlich mit 75 % Ethanol gereinigt

Morris-Wasserlabyrinth (MWM)

Der Morris-Wasserlabyrinth-Test (MWM), eine Standardmethode zur Bewertung der Gedächtnisfunktion, wurde hauptsächlich verwendet, um räumliches Lernen und Gedächtnisfähigkeiten beiMäusen 25 zu bewerten. Das Gerät bestand aus einem kreisförmigen Becken mit einem Durchmesser von 120 cm und einer Tiefe von 30 cm, das konzeptionell in vier gleich große Quadranten (I, II, III, IV) unterteilt war. Um äußere Ablenkungen zu minimieren, wurden Verdunkelungsvorhänge um den Pool gehängt, und an den Wänden darüber wurden deutliche visuelle Hinweise angebracht, die während des gesamten Experiments konstant blieben. Das Becken wurde mit Wasser gefüllt, das bei 22–24 °C gehalten wurde, und der Wasserspiegel wurde etwa 1 cm über der Plattformoberfläche gehalten. Ungiftiges Titandioxidpulver wurde dem Wasser mit einer Konzentration von 20 % zugesetzt, um es undurchsichtig zu machen, wodurch der Kontrast zwischen Maus und Hintergrund für eine genauere Videoverfolgung verbessert wird. Das experimentelle Verfahren dauerte 6 aufeinanderfolgende Tage und bestand aus einer 5-tägigen Trainingsphase zur räumlichen Erfassung, gefolgt von einer eintägigen räumlichen Sonde-Studie. Während der Ausbildungsphase wurde im Quadranten III eine runde Plattform mit einem Durchmesser von 10 cm platziert, die als Zielort diente. Am ersten Tag wurde die Plattform leicht über der Wasseroberfläche (~1 cm) positioniert, um die Mäuse mit dem Fluchtziel vertraut zu machen. Von Tag 2 bis 5 war die Plattform etwa 1 cm unter der Wasseroberfläche untergetaucht, um das räumliche Lernen zu bewerten. Jeden Tag wurde jede Maus nacheinander aus jedem der vier Quadranten in vorgegebener Reihenfolge ins Wasser gelegt, die der Poolwand zugewandt waren. Der Versuchsleiter verließ den Raum umgehend, nachdem er das Tier platziert hatte, um nicht zu einem unbeabsichtigten räumlichen Hinweis zu werden. Die Zeit, die benötigt wurde, um die versteckte Plattform zu finden (Fluchtlatenz), wurde für jeden Versuch aufgezeichnet. Wenn eine Maus die Plattform innerhalb der 90-Sekunden-Grenzzeit nicht fand, wurde sie sanft zur Plattform geführt und dort 30 Sekunden verweilt, um das räumliche Lernen zu verstärken; ihre Latenz wurde mit 90 Sekunden erfasst. Wenn die Maus die Plattform innerhalb von 90 Sekunden fand, durfte sie 10 Sekunden darauf bleiben. Nach jeder Trainingseinheit wurde die Maus mit einem Handtuch getrocknet und in ihren Heimkäfig zurückgebracht. Die Startquadranten-Sequenz wurde systematisch variiert, mit einem Intertrial-Intervall von etwa 20 Minuten pro Maus. Ein Video-Tracking-System (siehe Materialtabelle) zeichnete automatisch Parameter wie Schwimmstrecke, Geschwindigkeit und Fluchtlatenz auf. Am 6. Tag wurde eine Sondenstudie durchgeführt, um das räumliche Gedächtnis zu bewerten. Die Plattform wurde aus dem Zielquadranten (Quadrant III) entfernt, und jede Maus wurde aus dem dem vorherigen Zielort (Quadrant I) gegenüberliegenden Quadranten freigelassen und konnte 90 Sekunden frei schwimmen. Die im Zielquadranten verbrachte Zeit (wo sich die Plattform zuvor befand), die Anzahl der Überquerungen über den exakten ehemaligen Plattformstandort und die Schwimmbahn wurden aufgezeichnet. Unmittelbar nach dem Probe-Versuch wurde die Maus gründlich getrocknet und unter einer Wärmequelle in ihren Stammkäfig zurückgebracht, um Unterkühlung zu verhindern. Während des gesamten Experiments blieben die Positionen aller visuellen Hinweise rund um das Labyrinth unverändert, um die Konsistenz unter den experimentellen Bedingungen zu gewährleisten.

Echokardiographie

Die Echokardiographie bei Mäusen ist eine nicht-invasive, Echtzeit-Bildgebungstechnik, die für die Beurteilung der Herzstruktur und -funktion entscheidend ist und umfangreich in der Modellforschung für Herz-Kreislauf-Erkrankungen eingesetzt wurde. Die Untersuchung erfolgt unter Vollnarkose, wobei der Anästhesiezustand während des gesamten Eingriffs nach dem zuvor beschriebenen Protokoll erhalten bleibt. Die Maus liegt auf Rücken auf einer thermostatisch gesteuerten Plattform, die bei 37 °C gehalten wird. Nachdem die Gliedmaßen vorsichtig gesichert sind, wird eine Enthaarungscreme gleichmäßig auf den Brust- und Bauchbereich aufgetragen. Alle Haare und die Restcreme werden nach 1-2 Minuten gründlich entfernt, um eine optimale Ultraschallübertragung zu gewährleisten. Für die physiologische Überwachung in Echtzeit werden Elektrodenpatches verwendet, die über leitfähiges Gel mit den Gliedmaßen verbunden sind, um kontinuierlich das Elektrokardiogramm und die Atemfrequenz aufzuzeichnen. Um Standard-Ultraschallaufnahmen zu erhalten, wird die Position der Maus so eingestellt, dass ihr Kopf etwas höher als der Schwanz liegt, sodass die Längsachse des Herzens parallel zur Plattform verläuft. Besondere Vorsicht wird darauf geachtet, mit der Sonde nicht übermäßigen Druck auf die Brustwand auszuüben, da dies die Herzgeometrie verändern und die Messgenauigkeit beeinträchtigen kann. Eine großzügige Menge blasenfreies Ultraschallgel (2–5 mm dick) wird auf die rasierte Stelle aufgetragen. Es wird eine hochfrequente lineare Array-Sonde (30–50 MHz) verwendet, wobei der Orientierungsmarker der Sonde konsequent auf den Mauskopf zeigt. Die Sonde wird zunächst parallel zur Langachse des Mauskörpers positioniert und dann etwa gegen den Uhrzeigersinn um etwa 30°–45° gedreht. Feine Anpassungen werden vorgenommen, um eine klare Parasternal-Langachsenansicht des linken Ventrikels zu erhalten. Die dynamische Bildaufnahme beginnt, sobald das Ultraschallbild die linke ventrikuläre Kammer, Aorten- und Mitralklappen klar zeigt und die horizontale Ausrichtung des Herzapex mit dem Aortenabflusstrakt zeigt. Alle Bilder werden von einem erfahrenen Bediener mit konsistenten Parametereinstellungen aufgenommen, um die Datenvergleichbarkeit sicherzustellen. Nach der Untersuchung wird die Ultraschallprobe gemäß den Standardverfahren gereinigt und etwaige Restgel vom Körper der Maus entfernt. Die Maus wird dann in einen warmen Käfig verlegt, um sie genau zu überwachen, bis sie vollständig von der Narkose erholt und wieder normal ist.

Herstellung von Paraffinschnitten

Nach Abschluss der Verhaltenstests wurden die Mäuse mittels intraperitonealer Injektion von Natriumpentobarbital (20 mg/kg) betäubt. Die systemische Fixierung wurde dann durch transkardiale Perfusion mit Kochsalzlösung erreicht, gefolgt von 10 % Paraformaldehyd (siehe Materialtabelle). Nachdem das Hirngewebe sorgfältig entnommen wurde, wurden sie für 72 Stunden Fixierung bei Raumtemperatur in 10 % Paraformaldehyd eingetaucht. Es ist wichtig zu beachten, dass, da die kardiale Perfusion die Myokardstruktur verändert, die für die histologische Analyse verwendeten Herzproben speziell von Mäusen stammen, die das Perfusionsverfahren nicht durchlaufen haben, während alle anderen Handhabungsbedingungen identisch blieben. Nach Abschluss der Fixierung wurden die Gewebe 6 Stunden lang unter fließendem Wasser gespült. Die anschließende Gradiententtrocknung erfolgte mit einem automatisierten Gewebeprozessor (siehe Materialtabelle), wobei sequentielle Immersion mit 60 %, 70 % und 90 % Ethanol für jeweils 1 Stunde durchgeführt wurde, gefolgt von jeweils 95 % und 100 % Ethanol für jeweils 2 Stunden. Die dehydrierten Proben wurden dann 2 Stunden lang mit Xylol entfernt und 3 Stunden lang mit Paraffin bei 60 °C infiltriert. Schließlich wurden die Gewebe mit einer Einbettungsmaschine in Paraffin eingebettet, um eine standardisierte anatomische Ausrichtung sicherzustellen. Nachdem die eingebetteten Blöcke vollständig erstarrt waren, wurden Serienschnitte von 4 μm Dicke mit einem rotierenden Mikrotom geschnitten, auf Poly-L-Lysin-beschichtete Glasobjekte montiert, lufttrocknet und zur anschließenden Färbung und Analyse gelagert.

Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Die histologische Untersuchung von Gehirn- und Herzgeweben wurde mittels Hämatoxylin- und Eosin-(HE)-Färbung durchgeführt, um hypoxische Schäden zu beurteilen und die therapeutischen Wirkungen der Elektroakupunkturintervention zu bewerten. Gewebeschnitte mit einer Dicke von 4 μm wurden zunächst in Xylol I und Xylol II (jeweils 10 Minuten) deparaffinisiert und anschließend durch eine graduierte Ethanolserie (jeweils 100 %, 95 % und jeweils 80 % 2 Minuten) rehydriert, gefolgt von einer abschließenden Spülung mit destilliertem Wasser. Zur Färbung wurden die Schnitte 3–8 Minuten in Hämatoxylinlösung eingetaucht, bis eine klare Kernfärbung erreicht war, unter fließendem Wasser ausgespült, um das Bläuen zu induzieren, und anschließend 1–3 Minuten mit Eosin gekonfärbt, um eine angemessene rosa Färbung im Zytoplasma zu erreichen. Abschließend wurden die gefärbten Bereiche in absolutem Alkohol dehydriert, mit Xylol gereinigt und mit neutralem Balsam befestigt.

Nissl-Flecken

Um den Überlebensstatus von Neuronen im hippocampalen Bereich zu bewerten, wurde eine Nissl-Färbung eingesetzt, um die Verteilung der Nissl-Körper und die zelluläre Morphologie innerhalb der Neuronen zu beobachten. Nach der Deparaffinisierung und Rehydratisierung der Paraffinabschnitte des Gehirngewebes wurden die Scheiben in eine vorgeheizte Toluidinblau-Färbungslösung eingetaucht und bei 56 °C in einem Inkubator bei konstanter Temperatur 1 Stunde inkubiert. Nach dem Färben wurden die Abschnitte vorsichtig mit destilliertem Wasser abgespült und dann für mehrere Sekunden bis zu 2 Minuten in eine Nissl-Differenzierungslösung übergeben. Der Differenzierungsprozess wurde sorgfältig unter dem Mikroskop überwacht, bis der Hintergrund nahezu farblos wurde. Anschließend wurden die differenzierten Abschnitte schnell durch eine absolute Ethanolserie dehydriert, mit Xylol gereinigt und schließlich mit neutralem Harz für dauerhafte Konservierung und Beobachtung montiert.

Masson-Trichrom-Färbung

Die Masson-Trichrom-Färbung, eine klassische Bindegewebsfärbungstechnik, wurde hauptsächlich eingesetzt, um Kollagenfasern von Muskelfasern im Herzgewebe zu unterscheiden. Nach der Deparaffinisierung und Rehydratation der herzalen Paraffinabschnitte wurde das Färbeverfahren gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt, die dem Masson Trichrome Färbungsset beigefügt wurden (siehe Materialtabelle). Das Färbeprotokoll wurde wie folgt durchgeführt. Anfangs wurden die Abschnitte 4 Minuten lang in eine frisch vorbereitete Eisenhämatoxylin-Arbeitslösung von Weigert eingetaucht, um die Kerne zu färben, wobei sanftes Rühren angewendet wurde, um eine gleichmäßige Färbung zu gewährleisten. Anschließend wurden die Abschnitte unter fließendem Wasser ausgespült, 5–10 Sekunden lang in 1 % Säurealkohol differenziert und anschließend 4 Minuten mit einer Bläulösung behandelt, um eine klare blau-violette Kernfärbung zu erzielen. Die Schnitte wurden anschließend 5 Minuten lang mit Ponceau-Säure-Fuchsinlösung gefärbt, gefolgt von einer Differenzierung in einer 0,2%igen Phosphomolybdiksäurelösung für 1 Minute. Nach einer kurzen Spülung in einer schwachen säurehaltigen Arbeitslösung von 1 Minute wurden die Schnitte mit einer 0,2%igen Anilinblau-Lösung (pH 6,8) für 2 Minuten Gegenfärbung behandelt, um die Kollagenfasern hervorzuheben. Nach Abschluss der Färbungsschritte wurden die Abschnitte durch eine graduierte Ethanolserie dehydriert, mit Xylol gereinigt und schließlich mit neutralem Balsam montiert. Alle montierten Abschnitte wurden digital mit einem vollautomatischen Dia-Scansystem (siehe Materialtabelle) für die spätere Analyse erfasst.

Statistische Analyse

Die erhaltenen Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Daten wurden mittels Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt vom LSD-Post-hoc-Test oder T-Test. Zwei-Wege-ANOVA wurde verwendet, um die Daten von OFT und MWM zu analysieren. p < 0,05 wurde als Signifikanzniveau betrachtet. Die statistische Analyse und die Diagramme wurden von der Software GraphPad Prism 9.0 erstellt.

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Ergebnisse

Die Elektroakupunktur mildert angstähnliches Verhalten und kognitive Dysfunktionen, die durch chronisch anhaltende Hypoxie bei Mäusen ausgelöst werden.

Das angstähnliche Verhalten bei Mäusen, die CH ausgesetzt waren, wurde zunächst mit OFT untersucht (Abbildung 3A). Trajektoriendiagramme zeigten deutliche Verhaltensmuster: Kontrollmäuse zeigten in der neuen Umgebung robuste Erkundungstendenzen, wobei Bewegungsmust...

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Diskussion

Diese Studie bestätigt, dass langfristige chronische Hypoxie bei Mäusen angstähnliche Verhaltensweisen und räumliche Gedächtnisstörungen auslösen kann, was mit früheren Forschungsergebnissenübereinstimmt (26,27). Gleichzeitig fanden wir heraus, dass langfristige chronische Hypoxie auch Herzstörungen und strukturelle Schäden am Myokard verursachen kann. Derzeit fehlen jedoch therapeutische Strategien, die gleichzeitig durch Hypoxi...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Heilongjiang Provincial Natural Science Foundation of China (PL2025H264), der Yanzhao Golden Platform (A20240022) und dem Nationalen Verwaltungsprojekt für traditionelle chinesische Medizin (Projekt Nr. 272 [2021] des Office of Personnel and Education, NAPTCM) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10%-ParaformaldehydlösungBioroyee (Beijing) Biotechnology Co.,
Ltd		RL3234
JEDER-LABYRINTHWissenschaftSA201Video-Tracking-System
C75BL/6J-MäusePEKING HFK BIOSCIENCE
CO., LTD		Nr.110322220103041767Geschlecht: Männlich, & nbsp; Gewicht: 18 mm 22 g
Einweg-AkupunkturnadelnHuatuo246076Sterile Akupunkturnadeln für den Einmalgebrauch (0,25 mm & akut; 13 mm)
ElektroakupunkturgerätGroße MauerKWD-808 I
HistoCore MULTICUT – Halbautomatisches rotierendes MikrotomDeutschland, LeicaRM2245Paraffin-Slicer
Hwato Akupunktur  NadelSuzhou Medizinische Gerätefabrik2655519
IsofluraneRWD Life Science Co., LtdR510-22
Masson' s Trichrome FleckensetSolarbioG1340Masson-Färbungsset
Morris-WasserlabyrinthSansbioSA201Morris-Wasserlabyrinth-Gerät
NanoZoomer Digitale PathologieHamamatsu Photonik K. KC9600-01
NDP. Ansicht 2Japan, SakuraDiascanner-Software
Kleintier-AnästhesiemaschineHeckantriebYL-LE-A106
Tissue Tech Prisma PlusJapan, Sakura20B2X00014000034Vollautomatisches Gerät, das zur Färbung von Proben wie paraffineingebetteten Gewebeschnitten, Tiefkühlschnitten und auf Objektträgern montierten Zellen konzipiert ist.
Tissue-Tek TEC 6 EinbettungsmodulJapan, SakuraM01-021E-02Paraffin-Einbettungsmaschine

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