Alle experimentellen Verfahren wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Institutes of Health für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt und vom Tierethikkomitee der Beijing University of Chinese Medicine genehmigt (Zulassungs-ID: BUCM-2024042505-2065).
1. Tiervorbereitung
- Wählen Sie für das Experiment männliche erwachsene Sprague Dawley (SD) Ratten mit einem Gewicht von 220,0 g ± 20,0 g aus.
- Halten Sie die Tiere im Versuchszentrum der Pekinger Universität für Chinesische Medizin bei kontrollierter Temperatur (24 ± 2 °C) und einem 12-Stunden-Dunkel-/Lichtzyklus, mit sterilem Trinkwasser und einer standardmäßigen Pellet-Diät ad libitum.
- Gewöhnen Sie alle Tiere für 7 Tage an die Umwelt, bevor sie experimentieren.
- Teilen Sie 24 SD-Ratten zufällig in drei Gruppen auf (n = 8 pro Gruppe): die Sham-Operationsgruppe (Sham), die SCI-Modellgruppe (Modell) und die Elektroakupunkturgruppe (EA). Das Zeitachsendiagramm des experimentellen Designs ist in Abbildung 1 dargestellt.
2. Einführung des SCI-Modells
HINWEIS: Die Ratten wurden vor der Operation 8 Stunden lang von Wasser und Nahrung beraubt, und die chirurgischen Instrumente wurden mit Hochtemperaturdampf sterilisiert. Das SCI-Modell wurde mit einer Modifikation von Allens Methode24 konstruiert.
- Setzen Sie die Ratte in die Anästhesie-Induktionsbox und leiten Sie sie mit Sauerstoff ein, der 4 % Isofluran (1 L/min) enthält, bis die Ratte vollständig betäubt ist.
- Nehmen Sie die Ratte aus der Induktionsbox und positionieren Sie Nase und Mund an die Anästhesiemaske. Stellen Sie die Isoflurankonzentration auf 1,5 % bis 2 % an, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
HINWEIS: Während des Rattenanästhesieprozesses ist es unerlässlich, den Zustand der Ratte genau zu überwachen. Wenn die Ratte flache und schnelle Atmung zeigt oder die Körpertemperatur sinkt, sollte die Isoflurankonzentration reduziert werden, um eine Übernarkose zu vermeiden.
- Rasieren Sie die Haare vom Rücken der Ratte, um den Operationsbereich vollständig freizulegen. Sterilisieren Sie den Operationsbereich mit Iodophor und Alkohol.
- Lokalisieren Sie den zehnten Thoraxwirbel (T10). Erzeugen Sie einen 2,5 cm großen mittleren Längsschnitt, der auf T10 zentriert ist.
- Verwenden Sie chirurgische Klingen, um die Rückenmuskeln zu trennen und so den Dornvorsatz sowie die an den Brustwirbeln angrenzenden Muskeln freizulegen. Entfernen Sie den Stachelvorgang und die Lamina von T10 mit einer hämostatischen Pinzette, wodurch etwa ein 10 mm großes Segment des Rückenmarks freigelegt wird.
- Die freiliegende Dura Mater (200 Kilodyne) werden mit einem modifizierten Allen-Gerät präzise getroffen, um eine moderate Prellung zu induzieren.
HINWEIS: Der Erfolg des SCI-Modells ist gekennzeichnet durch Verstopfung und Ödem der Dura Mater an der Verletzungsstelle sowie durch die Schwanzspasmus-Schwung. Bei der Sham-Gruppe unterzogen sich die Ratten demselben chirurgischen Eingriff, einschließlich der Entfernung der Wirbelsäulenlamina, aber das Rückenmark wurde nicht beschädigt.
- Decken Sie die Dura Mater mit einem Gelatineschwamm ab und nähen Sie die Wunde Schicht für Schicht.
- Legen Sie die Ratte auf ein Heizkissen mit konstanter Temperatur, die auf 37 °C eingestellt ist, und beobachten Sie sie, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt.
- Verabreichen Sie einmal täglich für drei Tage nach der Operation eine Penicillin-Natriuminjektion in den Muskel der Ratte, um eine Infektion zu verhindern. Zusätzlich sollten Sie der Ratte 2-3 Mal täglich eine Blasenmassage geben, um das Wasserlassen zu erleichtern.
3. EA-Behandlung
- Führen Sie die EA-Intervention 24 Stunden nach erfolgreicher Etablierung des SCI-Modells durch.
- Bereiten Sie Einweg-sterile Akupunkturnadeln vor (Durchmesser: 0,30 mm; Länge: 25 mm).
- Nach TCM-Theorie und klinischer Erfahrung wählen Sie Baihui (GV20), Dazhui (GV14) und Mingmen (GV4) Akupunkte für die EA-Behandlung aus.
- Bereite schwarze Seidenstrümpfe vor. Führe die Ratte, in die schwarzen Strümpfe zu bohren. Binde die Ratte mit einem Binder an ein Brett und befestige sie.
HINWEIS: Das Seil sollte moderat festgezogen werden, um zu verhindern, dass die Ratte zu fest anbindet oder durch übermäßig lockere Bindungen entkommt.
- Lokalisieren Sie den GV20-Akupunkt im Zentrum des Parietalbeins, an der Schnittstelle der Mittellinie der Stirn und der Mitte der Linie, die die beiden Ohrspitzen verbindet. Lokalisieren Sie GV14 zwischen dem siebten Halswirbel (C7) und dem ersten Thoraxwirbel (T1) auf der mittleren Rückenlinie. Lokalisieren Sie GV4 in der Vertiefung unter dem Spinusfortsatz des zweiten Lendenwirbels (L2), auf der medianen Linie des Rückens (Abbildung 2).
- Desinfizieren Sie die Akupunkte mit medizinischem Iodophor und 75 % medizinischem Alkohol.
- Führen Sie die Nadeln schräg nach unten in einem Winkel von 15° bis zu einer Tiefe von 2–3 mm am GV20 ein. Führen Sie die Nadeln in die Spitzen von GV14 und GV4 in einem Winkel von 45° mit einer Tiefe von 5–7 mm (Abbildung 3A).
- Verbinden Sie die Nadeln mit einer Frequenz von 2 Hz und einer Intensität von 1 mA an das EA-Therapieapparat. Wählen Sie die Wellenform als kontinuierliche Welle aus (Abbildung 3B, C).
HINWEIS: Diese EA-Intervention wurde täglich über 28 Tage durchgeführt, wobei jede Sitzung 20 Minuten dauerte. Ratten in den Sham- und Model-Gruppen erhielten keine Behandlung, wurden aber jeden Tag 20 Minuten auf die gleiche Weise wie in der EA-Gruppe bewegungsunfähig gemacht.
4. Bewertung der motorischen Funktion (Abbildung 4)
HINWEIS: Am 1., 7., 14., 21. und 28. Tag nach der Operation wurde die motorische Funktion der Ratten in jeder Gruppe anhand des Basso-, Beattie- und Bresnahan-(BBB)-Scores bewertet.
- Stellen Sie die Ratte an einen offenen und ruhigen Ort, um freie Bewegung zu ermöglichen.
- Beobachten Sie die Hintergliedmaßenbewegungen der Ratte und bewerten Sie sie nach der festgelegtenSkala 25.
HINWEIS: Zwei Forscher, die die Gruppierung der Ratten nicht erkannten, vergaben unabhängig voneinander die Punktzahl, und die Endpunktzahl für jede Ratte wurde als Durchschnitt ihrer Bewertungen berechnet.
5. Durchführung des Y-Labyrinth-Experiments (Abbildung 5)
HINWEIS: Am ersten Tag nach der EA-Intervention (dem 29. Tag des Experiments) wurde das Y-Labyrinth-Experiment durchgeführt, einschließlich eines spontanen Wechseltests und eines neuartigen Arm-Explorationstests. Das experimentelle Verfahren des Y-Labyrinths ist in Abbildung 5A dargestellt.
- Stellen Sie die Versuchskäfige vor dem Test in die Versuchsumgebung und gewöhnen Sie sich für 30 Minuten daran.
- Reinigen Sie das Y-Labyrinth-Gerät mit Alkohol und stellen Sie zufällig die drei Arme des Y-Labyrinths als Startarm, Romanarm und anderen Arm ein.
- Während der Phase des spontanen Wechsels bedecken Sie den neuen Arm mit einer Schutzwandlung.
- Setze die Ratte vorsichtig ans Ende des Startarms und lass sie 10 Minuten lang frei in beiden Armen erkunden. Notieren Sie die Zeiten, Entfernung und Verweilzeit der Ratte, die in den Startarm und den anderen Arm eintritt.
- Entfernen Sie alle Ausscheidungen in der Kammer, nachdem jede Ratte den Test abgeschlossen hat. Reinigen Sie das Innere der Kammer mit 75 % medizinischem Alkohol und trocknen Sie es mit sauberem Gaze, um Interferenzen durch Gerüche früherer Testsubjekte zu vermeiden. Halten Sie die Innenräume während des gesamten Experiments ruhig.
- Entfernen Sie die Blende und führen Sie das neuartige Arm-Explorationsexperiment 4 Stunden nach dem spontanen Wechselexperiment durch.
- Platziere die Ratte vorsichtig ans Ende des Startarms und lasse sie 5 Minuten lang frei in den drei Armen erkunden.
- Notieren Sie die Reihenfolge, Anzahl der Eingänge, Entfernung und Verweilzeit der Ratte beim Betreten jedes Arms innerhalb von 5 Minuten.
6. Durchführung des neuen Objekterkennungs-(NOR)-Experiments (Abbildung 6)
HINWEIS: Am zweiten Tag nach der EA-Intervention (dem 30. Tag des Experiments) wurde das NOR-Experiment durchgeführt. Das experimentelle NOR-Verfahren ist in Abbildung 6A dargestellt.
- Bereiten Sie ein experimentelles Setup vor, bestehend aus einer Box von 70 cm × 60 cm × 30 cm, blauen kubischen Objekten und roten zylindrischen Objekten.
- Führe die Ratte in die Versuchsbox und lass sie 10 Minuten lang frei die Umgebung erkunden.
- Nachdem das obige Experiment für 1 Stunde abgeschlossen ist, platzieren Sie zwei identische kubische Objekte symmetrisch in zwei Ecken der Versuchsbox, etwa 10 cm von den Wänden entfernt.
- Führe die Ratte in die Versuchsbox ein, wobei ihr Kopf vom Objektblock weg ausgerichtet ist. Erlaube der Ratte, ihre Umgebung 10 Minuten lang frei zu erkunden, um sich mit dem Objektblock vertraut zu machen.
- Nach Abschluss des Versuchs jeder Ratte wird die Versuchsbox gründlich mit Alkohol abgewischt, um die Auswirkungen von Restgerüchen auf das Verhalten der nachfolgenden Ratten zu minimieren. Sobald die Kiste trocken ist, lege die nächste Ratte hinein.
- Nachdem das obige Experiment für 4 Stunden abgeschlossen ist, ersetzen Sie den rechten Objektblock durch ein zylindrisches Objekt.
- Führen Sie die Ratte mit dem Kopf von der Wand des Objektblocks weg in die Versuchsbox ein. Lass die Ratte 5 Minuten lang frei in der Box erkunden.
- Erfassen Sie die Zeit, die Sie mit der Erkundung der zylindrischen und kubischen Objekte verbracht haben, sowie die gesamte Entfernung und Zeit. Berechnen Sie den Präferenzindex mit folgender Formel: (Erkundungszeit für neue Objekte – Zeit der Erkundung alter Objekte)/(Erkundungszeit für neue Objekte + Zeit der Erkundung alter Objekte) × 100%.
7. Durchführung des Saccharose-Präferenztests
HINWEIS: Ein-Käfig-Wohnungen werden genutzt, um sozialen Wettbewerb um Wasser zu verhindern, was das Trinkverhalten beeinträchtigen könnte.
- Bereiten Sie eine Flasche mit 1% Saccharoselösung und eine Flasche mit Leitungswasser vor.
- Stellen Sie die Zuckerlösung und die Leitungswasserflaschen in den Käfig und tauschen Sie alle 12 Stunden die Positionen.
- Lassen Sie die Ratte sich 48 Stunden lang an das Zucker- und Leitungswasser gewöhnen. Beraube der Ratte anschließend 24 Stunden lang das Trinkwasser ohne Fasten.
- Bring eine Flasche Zuckerwasser und eine Flasche Leitungswasser zurück in den Käfig. Ändere die Position der Flaschen nach 2 Stunden und dokumentiere den Konsum jeder Flüssigkeit über einen Zeitraum von 4 Stunden. Berechnen Sie den Prozentsatz der Saccharosepräferenz mit der Formel: (Saccharoselösungsaufnahme/(Saccharoselösungsaufnahme + Wasseraufnahme) × 100 %).
8. HE-Färbung des Hippocampus
- Nach dem Verhaltenstest wird die Ratte mit 3 % Phenobarbitalnatrium (2,0 mL/kg) betäubt. Führen Sie eine kardiale Perfusion mit Paraformaldehyd durch. Nehmen Sie das Gehirngewebe und legen Sie es in Paraffin ein. Bereite Scheiben mit einer Dicke von 5 μm vor.
VORSICHT: Paraformaldehyd ist ein Reizstoff und muss in einer gut belüfteten Umgebung behandelt werden.
- Deparaffinisieren Sie die Scheiben mit Xylol (I) und Xylen (II) für 10 Minuten nacheinander. Weichen Sie die Scheiben zur Dehydrierung in Alkoholgradienten ein, wobei jeder Gradient 3 Minuten hält. Zum Schluss tauchen Sie die Scheiben für 2 Minuten in destilliertes Wasser.
- Färbe die Scheiben 10 Minuten mit Hämatoxylinlösung. Spüle die überschüssige Lösung 1–3 Minuten mit Wasser ab. Tauchen Sie die Objektträger schnell 5–10 Sekunden lang in Salzsäure-Ethanol ein. Spülen Sie den Rutsch erneut mit Wasser ab.
- Übertragen Sie die Scheiben in eine schwache alkalische wässrige Lösung für den blauen Rückfluss. Spüle die Scheiben 1–3 Minuten mit Wasser ab. Die Scheiben 3–5 Minuten in 85 % Ethanol eintauchen.
- Färben Sie die Scheiben 3-5 Minuten mit Eosinlösung und dehydrieren Sie sie nach dem Waschen mit Gradientalkohol. Die Scheiben 5–10 Minuten in Xylol geben. Zum Schluss verwenden Sie neutrales Harz, um die Scheiben zu versiegeln.
- Untersuchen Sie die gefärbten Objektträger unter einem Lichtmikroskop mit 400× Vergrößerung.
9. ELISA-Analyse
- Nach dem Verhaltenstest wird die Ratte mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbitalnatrium (200 mg/kg) eingeschläfert. Entnehmen Sie das Gewebe des Hippocampus.
- Wiegen Sie das Hippocampusgewebe und übertragen Sie es in ein vorgekühltes Homogenisierungsrohr.
- Homogenisiere die Gewebe auf Eis mit einem Gewebehomogenisierer.
- Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 5000 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Sammeln Sie das Supernatant und bestimmen Sie die gesamte Proteinkonzentration.
- Bestimmen Sie die Konzentration von IL-1β und IL-6 im Hippocampus mit ELISA-Kits.
10. Statistische Analyse
- Verwenden Sie eine geeignete Software zur statistischen Analyse. Drücken Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung aus.
- Führen Sie eine zweiseitige Varianzanalyse (ANOVA) mit wiederholten Messgrößen und dem Least Significant Difference (LSD)-Test durch, um Unterschiede zwischen den Gruppen in den BBB-Scoredaten zu analysieren.
- Führen Sie eine Einweg-ANOVA mit der LSD-Methode durch, um die Variabilität zwischen Gruppen in anderen Studien zu vergleichen, wenn die Daten normalverteilt oder homogen variiert waren. Andernfalls führen Sie den nichtparametrischen Test durch.
- Wenn die Daten einer Normalverteilung entsprechen, führen Sie eine Pearson-Korrelationsanalyse durch. Ansonsten führen Sie eine Spearman-Korrelationsanalyse durch.
- Betrachten Sie statistisch signifikante Unterschiede, wenn P < 0,05 liegt.