Amyloid und die Cross-Beta-Architektur

Zusammenfassung

Amyloid-Fibrillen werden von zahlreichen Proteinen gebildet, und die resultierenden Fibrillen teilen eine "Kreuz-β-Blatt"-Struktur. Hier beschreiben wir, wie Amyloidfibrillenproben für die Röntgenfaserbeugung vorbereitet werden können und wie die Muster analysiert werden können.

Zusammenfassung

Amyloidfibrillen bestehen aus einem fehlgefalteten, selbstzusammengesetzten Protein, das zu einer klar definierten, sich wiederholenden Struktur organisiert ist. Sie sind bekannt für ihre wichtige Rolle bei Protein-Fehlfaltungskrankheiten, darunter Alzheimer und Typ-2-Diabetes, bei denen die unlöslichen Amyloidfibrillen im Gewebe abgelagert werden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass sie bei vielen Organismen eine wichtige funktionelle Rolle spielen, indem sie Stärke, Gerüste und Schutz bieten. Die ersten strukturellen Modelle von Amyloid basierten auf der Datenerhebung von Röntgenfaserbeugungsdaten aus Bündeln ausgerichteter Amyloidfibrillen. Dies führte zu frühen Modellen der generischen Kreuz-β-Struktur, die durch detailliertere Beugungsanalysen aus hochorientierten und halbkristallinen Proben ersetzt wurde, was zu Details der Organisation der Peptide in eine repetitive Architektur führte. Hier haben wir uns auf Methoden zur Bestimmung der zugrunde liegenden Architektur dieser Fibrillen konzentriert und die gemeinsamen Merkmale von Amyloid-Fibrillen aus verschiedenen pathogenen, funktionellen und synthetischen Quellen beschrieben. Wir beschreiben die Vorbereitung der Proben, die Datenerhebung und die anschließende Datenanalyse, um eine Modellstruktur zu erstellen, die mit den experimentellen Daten verglichen werden kann.

Einleitung

Amyloidfibrillen wurden erstmals in einer Gruppe von Krankheiten identifiziert, die als Amyloidosen bekannt sind, bei denen sich proteinreiche Fibrillen in den extrazellulären Räumen von Geweben^{ansammeln 1}. Jede Krankheit ist durch ein bestimmtes Vorläuferprotein gekennzeichnet, das eine Konformationsänderung durchläuft und hochgeordnete, stabile Proteinfibrillen^bildet. Die neuere Definition von Amyloidfibrillen umfasst nun Fibrillen, die sich in der zellulären Umgebung ansammeln. In jüngerer Zeit wurden mehrere funktionale Systeme identifiziert, die die Amyloidstruktur nutzen, um Stabilität, Haftung oder sogar Informationsspeicherung zu gewährleisten. Trotz der großen Bandbreite an Proteinstrukturen, die sich selbst zu Amyloidfibrillen zusammensetzen können, teilen sie alle eine Kreuzstruktur^{β 4}. Diese Kreuz-β-Anordnung wurde zuerst von Astbury für Hennen-Eiweiß⁵ beschrieben und später von Geddes für Kreuz-β-Seide⁶ weiter erklärt. In dieser Proteinarchitektur bestehen die Fibrillen aus β-Strängen, die senkrecht zur Fibrillenachse verlaufen und dann zu β-Blättern angeordnet sind, die über die Seitenketten verbinden und das bilden, was später als sterische Reißverschlüsse⁷ bezeichnet wurde. Dies schafft eine hochstabile Organisation, die durch Wasserstoffbrücken, die parallel zur Faser verlaufen, zusammengehalten wird, zusammen mit hydrophoben, elektrostatischen und polaren Wechselwirkungen über Seitenketten⁸.

Frühe strukturelle Studien nutzten Röntgenfaserbeugung, um die Struktur von Amyloidfibrillen zu untersuchen, wobei die Fibrillen ausgerichtet und ausgerichtet wurden, um ein Bündel von Amyloidfibrillen zu bilden, das im Röntgenstrahl eines Diffraktometers ^9,10 platziert werden konnte. Eine generische Struktur von Amyloidfibrillen wurde erzeugt, um die Beugungsmuster mehrerer Amyloidfibrillen zu passen, die aus menschlichem Krankheitsgewebe extrahiert oder in vitro gezüchtet ^wurden, und dies hat die Grundlage für weitere strukturelle Beschreibungen gebildet¹¹. In den letzten Jahren haben Fortschritte in der Festkörperkernresonanz (ssNMR), der Mikrokristall-Röntgenkristallographie und der kryogenen Elektronenmikroskopie (CryoEM) atomare Details für die Kreuz-β-Struktur¹¹ geliefert. Die Methode der Röntgenfaserbeugung bleibt jedoch wichtig und nützlich und liefert Informationen über die wiederholende Organisation der Proteine. Darüber hinaus können in einigen Fällen Informationen zu einer längerfristigen Anordnung zugänglich sein. Grundsätzlich wird die Röntgenfaserbeugung häufig verwendet, um das Vorhandensein von Amyloid-Fibrillen aus verschiedenen Proteinen zu bestätigen, und das Kreuz-β-Muster ist eine der Hauptvoraussetzungen dafür, dass eine faserige Assemblierung als^Amyloid-12 klassifiziert wird.

Hier beschreiben wir die Methodik zur Herstellung von Amyloidfibrillen und richten sie für die Datenerhebung von Röntgenfaserbeugungsdaten aus. Darüber hinaus liefern wir Details, wie die Beugungsdaten weiter analysiert werden können, um eine Modellstruktur zu erstellen, deren vorhergesagtes Beugungsmuster und mit Beugungsdaten von ex-vivo-abgeleiteten Fibrillen verglichen werden können.

Protokoll

1. Vorbereitung von fibrillaren Proben für die Röntgenfaserbeugung

1. Lösen Sie das Protein oder Peptid von Interesse unter optimalen Bedingungen für die Fibrillenbildung für das ausgewählte amyloidogene Peptid auf und bewerten Sie die Fibrillenbildung mittels Elektronenmikroskopie oder Atomkraftmikroskopie. Details zur Herstellung von Proben und Bildgebung sind an anderer Stelle verfügbar¹³. Stellen Sie sicher, dass die Fibrillen lang, gerade und unverzweigt sind, wie in Abbildung 1 gezeigt. Zum Beispiel wurden die in Abbildung 1 gezeigten Fibrillen mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) abgebildet. Setzen Sie einen Tropfen mit Fibrillen auf ein Raster des Elektronenmikroskops und färben Sie dann negativ mit Uranylacetat¹⁴.
   HINWEIS: Eine gleichmäßige Überdeckung und Verteilung der Fibrillen im Gitter ist wünschenswert.
2. Richten Sie sich so aus, dass ein Bündel von Fibrillen entsteht, deren Faserachsen idealerweise alle parallel verlaufen (Abbildung 2A).
   1. Schmelzen Sie Kerzenwachs, bis es flüssig ist, mit einer heißen Platte. Mit einem Glasfräser wie einem Diamantstift schneiden Sie 1 mm Borosilikat-Glaskapillaren auf eine Länge von etwa 2–3 cm und tauchen Sie sie kurz in das flüssige Wachs. Ziehen Sie das Kerzenwachs durch Kapillarwirkung nach oben (etwa 1–2 mm lang innerhalb der Kapillare). Stellen Sie sicher, dass die Wachsoberfläche flach ist, damit die Fibrillaufhängung gleichmäßig ruhen kann.
   2. Verwenden Sie Plastilin, um die versiegelten Kapillaren horizontal in einer Petrischale mit einem Abstand von 0,5 mm bis 2 mm zwischen den mit Wachs gefüllten Enden zu befestigen (Abbildung 2A).
   3. Mit einer Pipette wird ein 10 μL großer Tropfen Lösung vorsichtig zwischen den mit Wachs gefüllten Enden der beiden Kapillaren aufgehängt. Stellen Sie sicher, dass die Lösung beide Wachsenden berührt, aber nicht auf das Glas ausreicht.
   4. Schützen Sie die Probe vor Staub, indem Sie die Petrischale abdecken. Lassen Sie die Probe über Nacht verdampfen, was zu einer Ausrichtung der Fibrillen führt (siehe Abbildung 2A).
      HINWEIS: Es kann mehrere Tage dauern, bis die Probe vollständig getrocknet ist, was von der Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit sowie der Viskosität der Probe abhängt.
   5. Versiegeln Sie den Teller; Inkubieren Sie bei niedrigeren Temperaturen in einem Kühlschrank oder inkubieren Sie die Feuchtigkeit in einer versiegelten Schachtel, um das Trocknen zu verlangsamen, was zu einer besseren Ausrichtung der Probe führen kann.
3. Amyloidfibrillen in einer Glaskapillare ausrichten (Abbildung 2B).
   1. Befestigen Sie am breiten Ende eine 1-ml-Spritze mit einem kleinen Stück Gummischlauch an einem 0,7 mm Durchmesser, silikonierten Glaskapillaren, und saugen Sie 2–3 cm Fibrillfederung an.
   2. Versiegeln Sie ein Ende der Kapillare mit geschmolzenem Wachs und lassen Sie das andere Ende offen bleiben, um die Verdunstung zu ermöglichen. Richten Sie die Kapillare vertikal an und lassen Sie sie mehrere Tage oder Wochen trocknen, bis sich eine getrocknete Scheibe im Kapillarröhrchen gebildet hat (Abbildung 2B).
4. Fibrillen als "Matte" oder Dünnschicht ausrichten (Abbildung 2C).
   1. Geben Sie eine hohe Konzentration (z. B. >10 mg/mL) Fibrillprobe auf einen Glasobjekt, einen Parafilm oder ein Stück Teflon, decken Sie ihn ab und lassen Sie ihn mindestens 24 Stunden an der Luft trocknen. Das sollte trocknen und eine dünne, flache Schicht auf der Oberfläche bilden. Heben Sie diese vorsichtig mit einem Skalpell an und befestigen Sie sie dann mit Kleber oder Plastilin an ein Glas-Kapillarrohr.
   2. Die Matte hat eine zufällige Anordnung von Fibrillen (siehe Abbildung 2C). Montieren Sie die Probe vorsichtig auf einem Goniometerkopf, sodass der Röntgenstrahl durch den Rand der Probe und parallel zur Ebene des Films verläuft (Abbildung 2C).
      HINWEIS: Die Beugung durch die Oberfläche des Films erzeugt aufgrund zufälliger Ausrichtung Beugungsringe (siehe Abbildung 2C).
5. Untersuchen Sie die Probe.
   1. Untersuchen Sie, wie gut die Probe ausgerichtet ist, indem Sie sie durch einen Kreuzpolarisator unter einem Lichtmikroskop untersuchen. Wenn Doppelbrechung vorhanden ist, könnte dies darauf hindeuten, dass eine gute Ausrichtung im Fibrillbündel besteht.
   2. Befestigen Sie die Kapillarfaserprobe mit Plastilin auf einen Goniometerkopf. Betrachten Sie, ob die Probe ein Faserbündel, eine Matte oder eine Scheibe ist, wenn sie in den Röntgenstrahl gelegt wird.
      1. Beachten Sie, dass die Probenrotationsachse um die Faserachse eines Faserbündels verläuft (Abbildung 2A), während sich bei Scheiben die Fasern über den Durchmesser des Rohrs ausrichten (Abbildung 2B). Eine Matte hat zwei unterschiedliche Richtungen (parallel zur Ebene des Films und senkrecht zu ihr) (Abbildung 2C).
   3. Sammeln Sie ein Beugungsmuster (wie in Abbildung 3A dargestellt) mit hauseigenen Röntgengeräten (CuKα für Proteinkristallographie) oder mit Synchrotronstrahlung. Die Belichtungszeiten variieren je nach Intensität des Röntgenstrahls; Passen Sie dies je nach empfohlenen Sammelzeiten der Beugungsquelle an.

2. Datenanalyse

1. Verwendung von CLEARER für Datenanalyse¹⁵.
   HINWEIS: Das Röntgenfaser-Beugungsmuster-Analyseprogramm steht akademischen Nutzern vom korrespondierenden Autor kostenlos zur Verfügung. Weitere Methoden zur Beugungsanalyse sind verfügbar^16,17 (www.esrf.fr/computing/expg/subgroups/data_analysis/FIT2D)¹⁸. Kursiv in Klammern zeigt Menübefehle an.
   1. Konvertiere das Beugungsmuster in eine .tiff-Datei und lade die Datei in CLEARER hoch (Abbildung 4).
   2. Geben Sie die Beugungseinstellungen ein (Diffraction Pattern: Diffraction Settings), einschließlich der Pixelgröße im TIFF-Bild, der Röntgenquelle und der Entfernung zwischen Probe und Detektor.
   3. Stellen Sie sicher, dass das Beugungsmuster so ausgerichtet ist, dass der Meridian vertikal ist (Bildverarbeitung: Drehen). Verwenden Sie das Centering-Modul (Diffraction Pattern: Centre Image), um das Bild zu zentrieren. Definiere die beiden Hauptachsen (Meridian und Äquator): Dieses Modul vergleicht die Intensität entlang dieser beiden Achsen des Musters. Sobald die Zentrierung abgeschlossen ist, speichern Sie das Bild und stellen Sie sicher, dass es für weitere Schritte verwendet wird.
   4. Geben Sie einen geeigneten Winkel an (entlang der beiden Hauptachsen [Meridian und Äquator]) und geben Sie mit dem Radially Average-Modul (Diffraction Pattern: Radially Average) (Abbildung 4A) ein Diagramm aus, das die Position des Beugungssignals im Vergleich zur Intensität zeigt.
   5. Messen und geben Sie automatisch die Beugungssignalpositionen mit dem Peak Find Modul (Diffraction Pattern: Radially Average: Peak Find) (Abbildung 4B) aus. Stellen Sie sicher, dass alle Beugungssignale genau erkannt werden, indem Sie die maximale Suchbreite anpassen und gleichzeitig darauf achten, dass kein Rauschen erkannt wird.
   6. Überprüfen Sie die von Peak Find ausgegebenen Signalpositionen mit dem Zoom & Measure-Modul (Diffraction Pattern: Zoom & Measure). Überprüfen Sie, ob alle Signalpositionen aufgeführt und der korrekten Achse zugeordnet sind.
   7. Untersuchen Sie die Einheitszelldimensionen (b und c), die die beobachteten Beugungssignale erzeugen, mit dem Einheitszell-Optimierungsmodul (Diffraction Pattern: Unit Cell Optimization) (Abbildung 5A). Untersuchen Sie die starken Signale, die am Äquator gefunden werden, um eine erste Vermutung zu erzeugen, die in die Eingangszell-Eingabetabelle eingegeben werden soll, und geben Sie die Min- und Max-[hkl]- Indizes an, über die CLEARER nach potenziellen Zellen sucht (eine Dimension ist meridional und standardmäßig 4,76 Å).
   8. Berechnen Sie die Dimensionen der potenziellen Einheitszelle und vergleichen Sie die vorhergesagten Beugungssignalpositionen mit den beobachteten Reflexionen. Einheitszellen werden je nach dem Ausmaß der Übereinstimmung zwischen den vorhergesagten und experimentellen Signalen bewertet. Anschließend werden die besten zwanzig Matches angezeigt. Betrachten Sie die Länge des Peptidvorläufers und weitere Informationen aus der Elektronenmikroskopie, AFM oder Festkörperkern-Magnetresonanz (ssNMR), um die bestmöglichen Einheitszellen für die Daten und die Probe auszuwählen.

3. Strukturelle Modellierung und Tests des Modells mit CLEARER

1. Konstruktierte Molekularmodelle (PDB-Format).
   HINWEIS: Verwenden Sie Proteinmodellierungsprogramme wie Pymol (DeLano)¹⁹ oder Insight II (Accelerys) und andere, um PDB-Koordinaten des Vorläuferpeptids in β-Strang-Konformation und in einer β-Blatt-Anordnung zu erzeugen. Dieser Abschnitt beschreibt einen einfachen Prozess, der für eine orthorhombische Einheitszelle (alle 90°-Winkel) verwendet wird. Nicht-orthogonale Organisationen sind möglich, wenn mehr Fachwissen über Beugung erforderlich ist. Diese können in CLEARER für komplexere Einheitszellen untersucht werden.
   1. Bauen Sie dreidimensionale Anordnungen der Peptide in einer β-Blatt-Anordnung, die in die festgelegte Einheitszelle(n) passen. Stellen Sie sicher, dass dieses Modell alle symmetriebezogenen Objekte innerhalb der Zelle enthält.
   2. Laden Sie das PDB-Modell in das Structure Chain Generator-Modul (Diffraction Simulation: Structures: Structure Chain Generator), um die konstruierten Strukturkoordinaten zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass die Faserachse und die Strahlachse korrekt zugewiesen sind. Gib die festgelegten Einheitszelldimensionen ein. Prüfen Sie, ob es zu Kollisionen bei den ausgewählten Zelldimensionen kommt (Abbildung 5B).
   3. Laden Sie die Koordinaten des PDB-Modells in das Faserbeugungssimulationsmodul hoch (Diffraction Simulation: Fiber Diffraction Simulation).
      1. Geben Sie die Richtung der Faserachse, die Strahlorientierung, die aus Schritt 3.1.2 ausgewählten Zellmaße, die Einstellungen für Röntgenquelle und Detektor ein und klicken Sie auf simulieren. Für eine orthorhombische Einheitszellsimulation ist die Faserachse durch die kartesische Achse definiert, die mit der Orientierung der Faserachse im verwendeten Modell zusammenhängt.
      2. Stellen Sie sicher, dass die Strahlachsen senkrecht zur Faserachse stehen, also auf einer der beiden anderen möglichen Achsen. Speichere die Simulationseinstellungen als .html Dateien (Datei: Speichern unter). Diese können hochgeladen und später bearbeitet werden, um iterativ die optimale Modellstruktur zu erforschen.
      3. Speichere das resultierende simulierte Muster in einem Rohformat, das später zur weiteren Analyse hochgeladen werden kann, oder als .tiff (in diesem Format werden zusätzliche Kontrastinformationen weggelassen) (Simulation: Das sichtbare Bild als TIFF speichern). Vergleiche diese dann mit dem experimentellen Muster.
2. Vergleichen Sie simulierte Beugungsmuster mit experimentellen Mustern zur Darstellung.
   1. Verwenden Sie die Schritte 2.1.5-2.1.6, um simulierte Beugungssignale zu messen und mit denen aus experimentellen Mustern gemessen zu vergleichen (Abbildung 6). Trage diese in einer Tabelle auf.
   2. Verwenden Sie ein Modul namens Layers (Diffraction Pattern: Layers), um simulierte und experimentelle Muster zu überlagern und Signalpositionen zu vergleichen ( Abbildung 6C).
   3. Vergleichen Sie die Signalpositionen und relativen Intensitäten zwischen dem experimentellen und dem simulierten Muster, indem Sie ein Quadrant des simulierten Musters neben dem experimentellen Muster (wie in Abbildung 6B dargestellt⁾ anordnen^.
   4. Bewerten Sie die Validität einer vorgeschlagenen Einheitszelle und eines Modells und verändern Sie dann iterativ Modell und Zelle, um die Ähnlichkeit zwischen dem simulierten Muster und dem experimentellen Beugungsmuster zu verbessern.
   5. Vergleichen Sie ausführlich die Ergebnisse verschiedener Modelle und Zellen mit dem in Schritt 3.1 beschriebenen Verfahren, um mehrere Alternativen zu testen. Stellen Sie sicher, dass Informationen, die aus anderen Techniken wie TEM, AFM und NMR gesammelt werden, berücksichtigt werden, um die Modellierung einzuschränken und die bestmögliche strukturelle Darstellung zu erhalten, die zu den Daten 8,21,22,23 passt.

Ergebnisse

CcbMet Beispiel²⁴: Abbildung 1 zeigt Elektronenmikroskopographien, die eine hohe Dichte von Amyloidfibrillen auf einem Gitter zeigen, das für die Herstellung einer Röntgenfaserprobe geeignet ist. Abbildung 2 beschreibt die verschiedenen Texturen, die aus faserigen Proben erzeugt werden können: Faserbündel (Abbildung 2A), Disk (

Diskussion

Die Röntgenfaserbeugung kann verwendet werden, um zu bewerten, ob eine Probe eine Amyloidstruktur bildet, und um weitere Einblicke in die molekulare Organisation des Vorläuferproteins oder Peptids innerhalb der Fasern zu gewinnen. Hier haben wir die Methoden beschrieben, mit denen faserige Proben für die Röntgenfaserbeugung vorbereitet, Daten gewonnen und anschließend analysiert werden können. Entscheidend ist, dass die Qualität der gewonnenen Daten sowohl von der Reihenfolge der einzeln...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,7 mm Durchmesser Röntgen  Quarzglaskapillaren	GLAS, W. Muller, D-13503, Berlin, Germany	Q-07-001-80
Glaskapillaren 1,5 mm Borosilikat	Harvard appatus Ltd, (Edenbridge, Kent, UK)	BS4 30-0074	Beispiel, erhältlich bei anderen Herstellern
Proteinkristallographie Röntgendiffraktometer	Verschiedene		Verschiedene Hersteller