Ein umfassender Arbeitsablauf für Plasmaproteomik mittels Massenspektrometrie: Eine Strategie zur Biomarker-Entdeckung bei systemischen menschlichen Erkrankungen

Zusammenfassung

Die Plasmaproteomik ermöglicht die Entdeckung von Biomarkern für systemische Erkrankungen durch minimalinvasive Probenahme. Trotz analytischer Herausforderungen durch die Plasmakomplexität bietet diese Studie einen optimierten Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-(LC-MS/MS)-Workflow, der die Proteomabdeckung verbessert, die Variabilität reduziert und die Reproduzierbarkeit verbessert, wodurch genaue Vergleiche zwischen Krankheits- und Kontrollproben möglich sind.

Zusammenfassung

Plasma, die zellfreie Komponente des Blutes, bietet eine minimalinvasive und reichhaltige biomolekulare Informationsquelle und eignet sich daher ideal zur Untersuchung systemischer Erkrankungen. Das Aufkommen hochdurchsatz-proteomischer Technologien hat die Plasmaanalyse revolutioniert, indem sie die großflächige Identifikation und Quantifizierung zirkulierender Proteine ermöglicht. Diese Fortschritte haben die Entdeckung von Biomarkern für frühzeitige Diagnose, Prognose und therapeutische Zielsetzung verschiedener Erkrankungen, einschließlich Krebs und entzündlicher Erkrankungen, ermöglicht. Die inhärente Komplexität des Plasmas sowie inkonsistente Probenvorbereitungs- und Analysemethoden haben jedoch historisch die Abdeckung und Reproduzierbarkeit des Proteoms eingeschränkt. Frühe Ansätze, die auf Rohplasmaanalysen setzten, litten oft unter schlechter Konsistenz und signifikanten Chargeneffekten, was zuverlässige Vergleichsstudien zwischen klinischen Kohorten erschwerte.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, führt die aktuelle Studie einen robusten und skalierbaren Plasma-Proteomik-Workflow ein. Das Protokoll integriert wichtige vorbereitende Schritte wie Immundepletion, Molekulargewichts-Cutoff-Filtration, Lyophilisierung, Proteinquantifizierung und -normalisierung, enzymatische Verdauung und LC-MS/MS-Profiling. Diese optimierte Strategie verbessert die Proteomtiefe erheblich und verringert die Variabilität, wodurch eine genauere und reproduzierbarere differentielle Proteinexpressionsanalyse zwischen Krankheitsfällen und gesunden Kontrollpersonen ermöglicht wird. Der Workflow bietet Forschern eine wertvolle Plattform, die hochwertige proteomische Daten aus dem Plasma erzeugen und letztlich zur Weiterentwicklung biomarkergesteuerter Diagnostik und personalisierter Medizin beitragen möchte.

Einleitung

Plasma, die zellfreie Komponente des Blutes, gewinnt zunehmend an Anerkennung als Reservoir biologischer Informationen, die für Krankheitsstudien relevant sind. Er enthält eine Vielzahl unterschiedlicher zirkulierender Biomoleküle, die von Proteinen und Metaboliten bis hin zu Lipiden und Nukleinsäuren reichen und ein Spiegelbild des physiologischen und pathologischen Status des Organismus sind. Diese systemische Beschaffenheit des Plasmas macht es zu einem idealen Bioproben für die Untersuchung der Krankheitspathophysiologie, die von Krebs bis hin zu Stoffwechsel- und Entzündungsstörungen reicht. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung von Plasma als Probe liegt in der minimalinvasiven Entnahmemethode, die wiederholte Probenahmen in klinischen Umgebungen ermöglicht, was für die Beobachtung des Krankheitsverlaufs oder der therapeutischen Reaktion wichtig ist. Plasma weist jedoch eine extrem komplexe proteomische Matrix auf, bei der Proteine wie Albumine und Immunglobulinspiegel mehr als zehn Größenordnungen umfassen und so die Identifikation¹ maskiert.

In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Plasmaproteomik die Identifizierung klinisch relevanter Biomarker wie beta-humanes Choriongonadotropin (β-hCG) und Troponin I ermöglicht, angetrieben durch Fortschritte in groß angelegten Proteinanalysetechnologien². Diese Werkzeuge nehmen als Eingabe hochsensible Informationen auf und ermöglichen aufgrund ihrer hohen Durchsatznatur eine großflächige Profilierung von Plasmaproteinen. Mit dem Aufkommen von Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-(LC-MS/MS)-Plattformen ist es nun möglich, Tausende von Proteinspezies mit nur 10–50 μL Plasmaeingang zu analysieren, mit einem dynamischen Detektionsbereich von mehreren Größenordnungen ^3,4. Dies hat den Einsatz der Plasmaproteomik in der translationalen Forschung erhöht: frühzeitige Krankheitserkennung, verbesserte prognostische Modelle und die Entdeckung neuer^{therapeutischer Ziele}.

Ein wichtiger Meilenstein in diesem Bereich war die Gründung des Human Plasma Proteome Project (HUPO-HPPP), das systematisch Plasmaproteine katalogisierte und die Machbarkeit der Plasmaproteomik als etabliertes Fachgebiet⁶ demonstrierte. Anschließend führte das Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) rigoros validierte Protokolle und laborübergreifende Studien ein, um Probleme der Reproduzierbarkeit zu adressieren, die zuvor die proteomische^Forschung erschwerten. Diese Initiativen unterstrichen die Notwendigkeit einer Standardisierung und hoben wichtige Verfahren hervor, darunter einheitliche Plasmabehandlung, Erschöpfung reichlicher Proteine, enzymatische Verdauung und konsistente LC-MS/MS-Parameter. Neuere Studien von Geyer und Kollegen zeigten, dass Plasmaproteomsignaturen zuverlässig bei vielen Personen erzeugt werden können, wenn standardisierte Methoden verwendet werden, was die Grundlage für Populationsstudien und Biomarker-Validierungsprozesse bildet⁸.

Der Fortschritt der Plasmaproteomik wurde maßgeblich durch die Anerkennung von Qualitätskontrolle (QC) und Leistungskennzahlen als entscheidende Komponenten des experimentellen Designs geprägt. Konventionell haben Unterschiede in der Verdauungseffizienz, den Peptididentifikationsraten und der Instrumentenleistung zu Inkonsistenzen in den Forschungsstudien geführt, was die Reproduzierbarkeit beeinträchtigt. Viele Studien wurden durchgeführt, um diese Probleme zu adressieren. Gawor et al. skizzierten messbare Qualitätsindikatoren für die Probenpräparation und die Leistung der Massenspektrometrie und boten damit eine systematische Methode zur Bewertung der Robustheit der Proteinprofiling-Pipeline⁹. Tsantilas et al. stellten computergestützte Benchmarking-Tools vor, die es Forschern ermöglichen, Datensätze über Plattformen und Labore hinweg zu vergleichen und so die Transparenz bei der Präsentation von Proteomics-Daten¹⁰ zu erhöhen. Darüber hinaus haben methodische Fortschritte wie Immundepletion, Größenausschlussfraktionierung und datenunabhängige Erfassung (DIA) die Proteomabdeckung verbessert und den technischen Bias^reduziert. Solche Qualitätssicherungsmaßnahmen stellen sicher, dass plasmaproteomische Daten reproduzierbar sind und dienen als Stütze für zukünftige klinische Übersetzungsstudien.

Trotz dieser bedeutenden Fortschritte birgt die inhärente Komplexität des Plasmas weiterhin Herausforderungen. Es ist üblich, dass eine direkte Analyse von rohem Plasma eine suboptimale Proteomabdeckung ergibt, da sehr reichlich vorhandene Proteine Analyten mit geringer Häufigkeit überlagern, von denen viele die vielversprechendsten Biomarkerkandidaten sind. Darüber hinaus können technische Unterschiede, die durch variable Proteinquantifizierung, unvollständige Verdauung und unzureichende Bereinigung entstehen, zu Chargenartefakten und verringerter Kohortenvergleichbarkeit beitragen¹³. Diese Einschränkungen unterstreichen die Notwendigkeit hochoptimierter Arbeitsabläufe, die Proteomtiefe, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit ausbalancieren. Dieses Studienprotokoll adressiert diesen Bedarf, indem es einen optimierten Plasma-Proteomik-Workflow demonstriert, der Immundepletion, Molekulargewichts-Cutoff-Filtration, Lyophilisation, Proteinnormalisierung und -quantifizierung, enzymatische Verdauung und LC-MS/MS-Profilierung kombiniert. Durch die Erhöhung der Proteomabdeckung und die Reduzierung technischer Unterschiede ermöglicht der methodische Rahmen eine konsistente relative Quantifizierung zwischen den betroffenen und den Kontrollgruppen. Durch die Einführung von Skalierbarkeit und die Anpassung von nachgelagerten Analysen bietet der Workflow eine nutzbare, reproduzierbare Methode, um klinisch bedeutsame Informationen aus der Plasmaproteomik zu extrahieren.

Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Arbeitsablauf, der darauf ausgelegt ist, die Plasmaproteomik für die Biomarker-Entdeckung bei systemischen entzündlichen Erkrankungen zu verbessern^14,15. Die Studie erfolgte gemäß dem institutionellen Ethikausschuss und der Helsinkier Erklärung von 1975, wie sie im Jahr 2000 überarbeitet wurde. Die informierte Zustimmung wurde von den Teilnehmern eingeholt. Anfangs unterziehen sich Plasmaproben einer Immundepletion, um hochhäufige Proteine zu entfernen, gefolgt von molekulargewichtsbasierter Filtration zur Reduzierung der Probenkomplexität. Die Proben werden anschließend gelyophilisiert und quantifiziert, um sicherzustellen, dass die Proteinkonzentration für die nachgelagerte Verarbeitung ausreichend ist. Nach der Normalisierung werden Proteine einer tryptischen Verdauung unterzogen, um Peptide zu erzeugen, die für die Analyse geeignet sind. Schließlich wird Massenspektrometrie eingesetzt, um Proteine mit niedriger Häufigkeit zu erkennen und zu quantifizieren, was zuverlässige Vergleiche zwischen gesunden und Krankheitszuständen ermöglicht (Abbildung 1) zeigt die Pipeline der Blutproteomik.

1. Probensammlung:

1. Erhalten Sie 3 ml Blut von den Teilnehmern der Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA) Vacutainer-Röhrchen durch Venenpunktion aus der Antecubitalvene unter aseptischen Bedingungen. Dies wird von einem ausgebildeten Phlebotomisten durchgeführt.
2. Um das Plasma zu trennen, zentrifugieren Sie die Proben (Rotor mit festem Winkel mit 12 × 15 mL) für 10 Minuten bei 704 g. Lagern Sie die Plasmaproben bis zur nächsten Untersuchung bei -80 °C auf.

2. Immundepletion

HINWEIS: Immundepletion ist eine auf Affinitätschromatographie basierende Methode, die verwendet wird, um selektiv hochhäufige Proteine aus biologischen Flüssigkeiten wie Serum, Plasma und Liquorflüssigkeit (CSF) zu entfernen. Eine Spin-Kartusche mit immobilisierten Antikörpern zielt auf und erfasst 14 häufige Proteine mit hoher Häufigkeit, darunter Albumin, Immunglobuline (IgG, IgA, IgM), Transferrin und Komplement C3. Diese Proteine bleiben in der Kartusche zurück, während Proteine mit niedriger Häufigkeit zur weiteren Analyse durchgehen. Die Technik verbessert die proteomische Profilierung, indem sie die Probenkomplexität reduziert und den Nachweis potenzieller Biomarker verbessert. Dieser Ansatz ist in der Plasmaproteomik weit verbreitet angewandt, um Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit^{zu verbessern 16,17}.

1. Patronenvorbereitung
   1. Nehmen Sie die 0,45-mL Spin-Kartusche aus dem Kühlschrank. Lass es auf Umgebungstemperatur ausgleichen.
   2. Bereite Puffer A Equil/Load/Wash und Buffer B Elution entsprechend der Anzahl der verarbeiteten Proben vor. Trage etwa 5 ml Puffer A und 2 ml Puffer B pro 10 μL Plasmaprobe auf. Dekantieren Sie in 50-mL sterile Zentrifugenröhren.
   3. Beschriften Sie zwei sterile Luer-Lok 5-mL Spritzen als A für Puffer A und B für Puffer B.
2. Plasmaprobenvorbereitung
   1. Verdünnen Sie jede 10 μL Plasmaprobe mit 190 μL Puffer A auf ein Endvolumen von 200 μL.
      HINWEIS: Fügen Sie Puffer A Proteaseinhibitoren hinzu, um den Abbau von Plasmaproteinen während der Verarbeitung zu vermeiden.
   2. Eine Plasmaprobe kann Partikel enthalten. Es kann die Kassette verstopfen. Um Verstopfungen zu vermeiden und die Probenklarheit zu verbessern, zentrifugieren Sie die verdünnte Probe durch einen 0,22 μm Spinfilter für 1 Minute bei 16.000 ×g bei 4 °C.
3. Cartridge-Aufbau
   1. Entfernen Sie die Patronenkappe und die untere Kappe und lagern Sie sie für spätere Gebrauch.
   2. Setze einen Luer-Lok-Adapter auf die Spin-Cartridge.
   3. Ziehen Sie 4 ml Puffer A aus der Spritze mit der Beschriftung "A" und schließen Sie die Spritze an den Luer-Lok-Adapter an.
   4. Lassen Sie Puffer A allmählich durch die Kartusche strömen, damit das Harz sich ausgleichen und eingeschlossene Luft verdrängen kann.
   5. Saugen Sie den überschüssigen Puffer von der Oberseite der Kartusche mit einer sterilen Mikropipette ab.
   6. Entfernen Sie den Luer-Lok-Adapter und setzen Sie die Spin-Patrone in ein Schraubverschluss-Sammelrohr mit der Markierung F1 ein.
4. Probenbelastung und Fraktionsentnahme
   1. Fügen Sie 200 μL gefiltertes, verdünntes Plasma direkt auf das Harzbett hinzu.
   2. Zentrifugiere die Kartusche bei 100 × g für 1 Minute bei 4 °C. Lass die Patrone unverschlüsselt oder locker verschlossen, damit der Fluss gleichmäßig fließt.
   3. Sammeln Sie die Durchflussfraktion F1 im beschrifteten Sammelrohr. Stellen Sie sicher, dass das Harzbett und die Fritte nach der Zentrifugation feucht bleiben.
   4. Lass die Kartusche 5 Minuten bei Zimmertemperatur stehen.
5. Waschen und Rückgewinnung von Durchflussfraktionen
   1. Gib 400 μL Puffer A auf das Harzbett und zentrifugiere bei 100 × g für 2,5 Minuten bei 4 °C. Gib dieses Eluat dem F1-Sammelrohr hinzu.
   2. Übertragen Sie die Patrone in ein neues Sammelrohr mit der Aufschrift F2.
   3. Fügen Sie weitere 400 μL Puffer A hinzu und zentrifugieren Sie bei 100 × g für 2,5 Minuten bei 4 °C. Sammeln Sie das Eluat im F2-Rohr.
6. Elution gebundener Proteine
   1. Nehmen Sie die Kartusche aus dem F2-Rohr und schließen Sie den Luer-Lok-Adapter an.
   2. Fülle die Spritze mit der Beschriftung "B" mit 2,5 ml Puffer B und befestige sie an der Kartusche.
   3. Langsam drücken Sie Puffer B durch die Kartusche, um die gebundenen hochhäufigen Proteine in ein frisches Sammelrohr zu elutieren.
      HINWEIS: Speichern Sie den gebundenen Anteil, falls weitere Analysen erforderlich sind; Ansonsten solltest du es entsprechend abwerfen.
7. Patronen-Neuausgleich
   1. Entfernen Sie die Spritze mit Puffer B aus der Kartusche und befestigen Sie die Spritze mit der Aufschrift "A" mit 5 mL Puffer A.
   2. Puffer A wird langsam durch das Harzbett gedrückt, um die Kartusche mit einer Durchflussrate von 0,5 mL pro Minute wieder auszugleichen.
      HINWEIS: Lassen Sie das Harzbett oder die Fritte nicht trocknen. Lassen Sie während der Lagerung eine kleine Menge Puffer auf der Fritte.
   3. Ist die Patrone ausgegliglibriert, ist sie bereit für die nächste Probe.
8. Flussabwärts genutzte Nutzung
   1. Für die maximale Rückgewinnung von Proteinen mit geringer Häufigkeit werden F1- und F2-Durchflussfraktionen kombiniert.
      HINWEIS: F1 und F2 können ebenfalls separat analysiert werden, wenn eine Differentialanalyse erforderlich ist. Der hinzugefügte Puffer beträgt 1 mL, sodass der kombinierte F1-Anteil bei ~850 μL liegen kann, um eine gute Rückgewinnung zu gewährleisten. Analysiere das rohe Plasma, fließe durch und eluiere mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), um die Entfernung der 14 hochhäufigen Proteine aus dem Durchfluss zu bestätigen. 12,5 μL Durchfluss durch F1, rohes Plasma und Eluat werden zum Laden in Gel verwendet, um ein Bohrlochvolumen von 25 μL zu erzeugen (Laemmli-Probenpuffer: Probenverhältnis 2:1)

3. Proteinkonzentration mit einem 5 kDa Spin-Konzentrator

HINWEIS: Die Konzentration einer Probe mit einem 5-kDa-Spin-Konzentrator basiert auf dem Prinzip der Größenausschluss und molekularer Filtration, um eine schnelle Konzentration und hohe Rückgewinnung der Zielbiomoleküle in einem einzelnen Rohr zu erreichen. Dies ermöglicht die Konzentration von Proteinen durch Entfernung von Lösungsmittel- und Pufferaustausch oder Entsalzung der Proteinlösung.

1. Füllen Sie den Spin-Konzentrator mit bis zu 4 ml der Proteinprobe.
2. Setzen Sie den Spin-Konzentrator in eine gekühlte Zentrifuge.
3. Zentrifugieren Sie mit 5.000 × g bei 10 °C für 30 Minuten oder bis die gewünschte Volumenreduktion (z. B. 30× Konzentration) erreicht ist.
4. Entfernen Sie den Spin-Konzentrator aus der Zentrifuge und gewinnen Sie die konzentrierte Probe mit einer Mikropipette vom Boden der Retentatkammer zurück. Um eine gute Erholung zu gewährleisten, ist mit einer Gewinnung von ~150 μL Konzentrat aus insgesamt 850 μL Proteinprobe zu rechnen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Membran während der Zentrifugation nicht austrocknet, um die Proteinintegrität und die Effizienz der Rückgewinnung zu erhalten.

4. Entsalzen und Pufferaustausch

1. Entsorge das Filtrat aus der unteren Kammer des Konzentrators.
2. Füllen Sie das Zentrifugenrohr mit einem gleichen Volumen von 50 mM Ammoniumbicarbonatpuffer (pH 7,2–7,4) wieder auf. (Zum Beispiel, wenn das Retentat 150 μL beträgt, fügen Sie 150 μL Puffer hinzu.)
3. Zentrifugieren Sie erneut mit 5.000 × g bei 10 °C, bis die ursprüngliche Konzentration erreicht ist.
4. Wiederholen Sie diesen Pufferaustauschvorgang dreimal, um etwa 99 % der kleinen Molekül-Schadstoffe wie Salze oder Harnstoff zu entfernen.
5. Konzentrieren Sie die Proteinproben, indem Sie sie mit einem Schnellvakuum-Lyophilisator gefriertrocknen.
   HINWEIS: Passen Sie die Anzahl der Zyklen entsprechend dem erforderlichen Entsalzungsgrad für nachgelagerte Anwendungen an.

5. Proteinquantifizierung mit Bicinconinsäure (BCA)-Test

HINWEIS: Die Proteinkonzentration der Proben wurde mit dem BCA-Protein-Assay bestimmt, wobei Rinderserumalbumin (BSA) als Standard diente. Der BCA-Test ist eine detergent-kompatible, auf Bicinconinsäure basierende kolorimetrische Methode zur Erkennung und Quantifizierung des Gesamtproteins. Es basiert auf der Reduktion von Cu²⁺ zu Cu⁺ durch Proteine in einer alkalischen Umgebung (Biuret-Reaktion), gefolgt von hochsensitiver und selektiver kolorimetrischer Detektion des kupferiellen Ions (Cu⁺) mit einem Reagenz, das Bicinconinsäure enthält. Der Test erzeugt einen violett gefärbten Komplex, der durch die Chelatierung eines kupferhaltigen Ions mit zwei BCA-Molekülen gebildet wird. Der BCA-Test liefert eine konsistente, lineare Reaktion mit BSA und stellt so eine zuverlässige Standardkurvenreferenz sicher. Obwohl bekannt ist, dass verschiedene Proteine im BCA-Test unterschiedliche Antworten erzeugen, ermöglicht die Verwendung von BSA eine reproduzierbare relative Quantitation über verschiedene Proben. Da unser Ziel die Normalisierung für gleiche Proteinbelastung und nicht eine absolute Quantifizierung jeder Spezies war, bot die BSA-basierte Kalibrierung den robustesten und reproduzierbarsten Ansatz.

1. Vorgehen
   1. Fügen Sie 25 μL jedes BSA-Standards (Arbeitsbereich 20–2000 μg/mL) und die unbekannte Proteinprobe in die vorgesehenen Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu.
   2. Fügen Sie jedem Bohrloch 200 μL BCA-Arbeitsreagenz hinzu.
   3. Gründlich mit einem Mikroplatten-Shaker 30 Sekunden lang mischen.
   4. Den Teller abdecken und 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
   5. Bring den Teller auf Zimmertemperatur.
   6. Messen Sie die Absorption bei 562 nm mit einem Mikroplattenleser.
2. Datenanalyse
   1. Subtrahiert die durchschnittliche Absorption des Blanks (Null-Protein) von allen Proben- und Standardabsorptionswerten.
   2. Zeichnen Sie eine Standardkurve von Absorption versus BSA-Konzentration (Mikrogramm/Mikroliter).
   3. Verwenden Sie die Regressionsgleichung aus der Kurve, um Proteinkonzentrationen in unbekannten Proben zu berechnen.

6. Normalisierung der Proteinkonzentration

1. Vorgehen
   1. Missen Sie die Proteinkonzentration jeder Plasmaprobe mit einer geeigneten Quantifizierungsmethode.
   2. Zeichnen Sie die Konzentration und das Gesamtvolumen jeder Probe auf.
   3. Bereiten Sie 50 mM Ammoniumbicarbonat-Puffer (pH 7,8) als Verdünner vor.
   4. Berechnen Sie die erforderliche Verdünnung mit der Formel C₁V₁ = C₂V₂.
   5. Für eine Probe mit einer Konzentration von 1,3 mg/mL und einem Volumen von 100 μL berechnen Sie das Endvolumen, das benötigt wird, um 1 mg/mL zu erreichen: [V₂ = \frac{1.3 \mal 100}{1} = 130\ \mu L]
   6. Berechnen Sie das zu addierende Puffervolumen, indem Sie das Anfangsvolumen vom Endvolumen subtrahieren: Puffervolumen = 130 μL − 100 μL = 30 μL.
   7. Fügen Sie 30 μL 50 mM Ammoniumbicarbonat (pH 7,8) zur 100 μL Plasmaprobe hinzu.
   8. Mischen Sie die Probe vorsichtig durch Pipetteren oder kurzes Vortexen.
   9. Bestätigen Sie, dass das Endvolumen 130 μL bei einer normalisierten Konzentration von 1 mg/mL beträgt.
   10. Fahren Sie mit der nachgelagerten proteomischen Probevorbereitung fort.
       HINWEIS: Stellen Sie eine genaue Konzentrationsanpassung sicher, indem Sie den erforderlichen Verdünnungsfaktor basierend auf den Ergebnissen des BCA-Tests berechnen. Jeder Schritt wird validiert, und die Daten werden als ergänzende Daten angegeben (ergänzende Tabelle 1).

7. Probenvorbereitung und tryptische Verdauung

1. Proteinreduktion
   1. Fügen Sie ein geeignetes Reduktionsmittel (z. B. 1,4-Dithiothreitol [DTT]) der Proteinlösung im Ammoniumbicarbonatpuffer bis zu einer Endkonzentration von 100 mM hinzu.
   2. Inkubieren Sie die Mischung bei 60 °C für 30 Minuten in einem Thermomixer oder Heizblock.
      VORSICHT: DTT ist ein Reizstoff und sollte mit Handschuhen in einer Abzugshaube behandelt werden.
      HINWEIS: Weitere Informationen zum für die Verdauung verwendeten Trypsin sind in der Materialtabelle enthalten. Kurz gesagt wurde sequenzierungsfähiges Tosylphenylalanyl Chloromethylketon (TPCK)-behandeltes Trypsin (zur Beseitigung der chymotryptischen Aktivität) verwendet, um eine hohe Spezifität der Spaltung von Lysin- und Argininresten sicherzustellen. Die Enzymaktivität wurde anhand der Herstellerspezifikationen bestätigt, die einer N-Benzoyl-L-Arginin-Ethylester (BAEE)-Aktivität von etwa 1 Einheit pro mg Protein entsprechen. Bezüglich der DTT- und Iodo-Acetamid-(IAA)-Konzentrationen bestätigen wir, dass sich die 100 mM DTT und 200 mM IAA auf die Lagerlösungen beziehen, nicht auf die Endkonzentrationen, die in der Reaktion verwendet werden. Die endgültigen Arbeitskonzentrationen während der Reduktion und Alkylation lagen im Standardbereich (typischerweise 5–10 mM DTT bzw. 10–20 mM IAA).
2. Alkylierung von Cysteinresten
   1. Lassen Sie die Probe nach dem Reduzieren 5 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen.
   2. Zentrifugieren Sie kurz, um Kondensat am Boden des Rohrs zu sammeln.
   3. Fügen Sie 200 mM IAA hinzu, hergestellt in 50 mM Ammoniumbicarbonat (ABC)-Puffer, um die reduzierten Cysteinreste zu alkylieren.
   4. Inkubieren Sie die Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um eine Verschlechterung der IAA zu verhindern.
      HINWEIS: Iodoacetamid ist lichtempfindlich und potenziell giftig; Vermeiden Sie die Belichtung und handhaben Sie sie bei gedämpftem Licht.
3. Enzymatische Verdauung
   1. Bereiten Sie Sequenzierungsqualität, modifiziertes Trypsin in 50 mM ABC-Puffer unmittelbar vor der Verwendung vor.
   2. Gib jeder Probe Trypsin mit einem Trypsin-zu-Protein-Verhältnis von 1:25 (w/w) hinzu.
   3. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C für 17 Stunden, um eine vollständige enzymatische Verdauung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Verlängerte Verdauungszeiten können zu Überverdauung führen; Gewährleisten Sie während der gesamten Inkubationsphase Temperaturstabilität.
4. Abschrecken der Reaktion
   1. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie jeder Probe Ameisensäure hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1,0 % (v/v) zu erreichen.
   2. Inkubieren Sie bei 37 °C für 20 Minuten, um das Resttrypsin zu denaturieren und das Peptidgemisch zu stabilisieren.
      VORSICHT: Ameisensäure ist korrosiv; Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) und arbeiten Sie in einer chemischen Abzughaube.
5. Peptidgewinnung
   1. Zentrifugieren Sie das verdaute Peptidgemisch bei 3500 g für 12 Minuten bei Raumtemperatur, um unlösliches Material zu entfernen.
   2. Übertragen Sie vorsichtig das klare Supernatant mit verdauten Peptiden in Autosampler-Phiole, ohne das Pellet zu stören.
   3. Lagern Sie die Peptidlösungen bei -20 °C bis zur weiteren LC-MS/MS-Analyse.
6. Vorbereitung auf die LC-MS-Analyse
   1. Laden Sie die Peptidproben direkt auf das LC-MS-System, das mit Ionenmobilität zur Peptidtrennung und -analyse ausgestattet ist.
   2. Stellen Sie sicher, dass alle Fläschchen ordnungsgemäß versiegelt sind, um Verdunstung und Kontamination zu verhindern.

8. LC MS-MS-Analyse

1. Peptidbeladung und Entsalzung
   1. Laden Sie 1 μg der Peptidprobe in eine Probenschleife im Teilschleifen-Injektionsmodus.
   2. Entsalzte Peptide mit einer C18-Fangsäule durch Waschen mit wässrigem Lösungsmittel, das 0,1 % Ameisensäure enthält, bei einer Durchflussrate von 15 μL/min für 1 Minute.
      HINWEIS: Verwenden Sie während des gesamten Durchlaufs Wasser mit 0,1 % Ameisensäure als Lösungsmittel A und Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure als Lösungsmittel B.
2. Peptidtrennung
   1. Verbinden Sie die Fangsäule in Linie mit einer analytischen C18-Umgekehrtphasen-Säule.
   2. Elutieren Sie Peptide mit einem linearen Gradienten von 3 % bis 40 % Lösungsmittel B über 55 Minuten bei einer Durchflussrate von 300 nL/min.
   3. Spülen Sie die Säule 7,5 Minuten lang mit 80 % Lösungsmittel B ab, um die zurückgebliebenen Komponenten zu entfernen.
   4. Die Säule vor der nächsten Injektion mit 3 % Lösungsmittel B wieder ausgleichen.
   5. Halten Sie den Säulenofen während des Laufs bei 35 °C und den Autosampler bei 4 °C.
      HINWEIS: Fügen Sie Blank-Injektionen zwischen den Proben ein, um die Weiterführung zu minimieren.
3. Massenspektrometrie-Aufnahme-Einstellungen
   1. Massenspektralanalyse eluierender Peptide
      1. Richte das UPLC-System ein und koppele es direkt mit dem High-Definition-MS.
      2. Steuer das System mit MS-Software.
      3. Stellen Sie sicher, dass das Massenspektrometer als hybrides Quadrupol-Ionen-Mobilitäts-orthogonales Beschleunigungszeitinstrument (OA-TOF) konfiguriert ist.
      4. Überprüfen Sie, dass alle Stickstoff- und Verriegelungsgasanschlüsse sicher und undicht sind, bevor Sie den Betrieb aufnehmen.
         VORSICHT: Führen Sie Hochspannungsanschlüsse und Druckgase gemäß den Laborsicherheitsstandards.
   2. Ionisationsaufbau
      1. Betreiben Sie das Massenspektrometer im positiven Elektrosprüh-Ionisationsmodus (ESI) mit einer doppelten Elektrosprüh-Ionenquelle.
      2. Stellen Sie die Nano-ESI-Kapillarspannung auf 3,4 kV ein.
      3. Stellen Sie die Probenkegelspannung auf 40 V und die Extraktionskegelspannung auf 4 V ein.
      4. Stellen Sie den Stickstoffgasfluss der Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) auf 90 mL/min ein.
      5. Überprüfen Sie die Sprühstabilität und stellen Sie sicher, dass der Ionenstrom konstant ist, bevor Sie weitermachen.
   3. Ionenmobilitätstrennung
      1. Stellen Sie die IMS-Ionenführungspuls-Höhe während der Ionenübertragung auf 40 V ein.
      2. Stellen Sie die IMS-Ionenführungsgeschwindigkeit auf 800 m/s ein.
      3. Steigern Sie die Höhe der Wanderwelle linear von 8 V auf 20 V über den gesamten IMS-Zyklus, um eine optimale Ionentrennung durch Mobilität zu erreichen.
         VORSICHT: Sicherstellen Sie einen stabilen IMS-Gasfluss; Fluktuationen können die Ionentrennung und die Reproduzierbarkeit der Driftzeit beeinflussen.
   4. Lock-Massenkalibrierung
      1. Kalibrieren Sie den Time-of-Flight-(TOF)-Analysator mit einer 2-μg/μL-Natriumiodid-(NaI)-Lösung.
      2. Stellen Sie den Kalibrierungsbereich so ein, dass Ionen zwischen 50 m/z und 2000 m/z detektiert werden.
      3. Alle 45 Sekunden werden Lock-Massenreferenzspektren mit dem dualen Elektrospray-Ionenquellenkanal für Echtzeit-Massenkorrektur erfasst.
      4. Überprüfen Sie, dass die Kalibrierungskurve eine Massengenauigkeit innerhalb von ±5 ppm erreicht, bevor Sie mit der Datenerfassung beginnen.
4. Datenerfassung
   1. Daten im Kontinuumsmodus erfassen, wobei zwischen zwei Funktionen abwechselnd abgeschaltet wird:
      1. Funktion 1 (Low Energy MS): Aufnehmen von niedrigenergetischen Vorläufer-Ionenspektren.
      2. Funktion 2 (Hochenergetische HDMSE): Erfassung von Fragmentionenspektren bei erhöhter Kollisionsenergie mit Ionenmobilitätstrennung.
   2. In Funktion 2 stellen Sie die Kollisionsenergie im Fallbereich auf 4 eV ein.
   3. Erhöhen Sie die Kollisionsenergie im Transferbereich von 20 eV auf 45 eV, um eine kontrollierte Peptidfragmentierung zu erreichen.
   4. Stellen Sie die spektrale Erfassungszeit pro Funktion auf 0,9 s und die Interscan-Verzögerung auf 0,024 s ein.
   5. Überwachen Sie das Gesamtionenchromatogramm (TIC), um eine konstante Instrumentenreaktion während des gesamten Laufs zu bestätigen.
   6. Importiere Rohdaten in eine Proteomik-Analysesoftware (z. B. Progenesis QI oder Äquivalent).
   7. Richte Chromatogramme über Läufe hinweg mit der Standard-Ausrichtungsreferenz oder einem manuell ausgewählten Referenzlauf aus.
   8. Identifizieren Sie Peptide und Proteine anhand einer kuratierten Datenbank (z. B. UniProt Human – nur geprüfte Einträge).
   9. Setzen Sie folgende Suchparameter ein:
      Enzym: Trypsin
      Feste Modifikation: Carbamidomethylierung (C)
      Variable Modifikation: Oxidation (M)
      Peptidtoleranz: Je nach Instrumentenauflösung
      Erlaubte verpasste Dekolletés: 1
      Falschentdeckungsrate (FDR): ≤ 1 %
   10. Führen Sie die Normalisierung mit der Methode "Normalisieren auf alle Proteine " durch.
   11. Verwenden Sie Filterschwellenwerte: ≥2 Peptide pro Protein, ≥1 einzigartiges Peptid, Faltungsänderung ≥1,5 und angepasster p-Wert <0,05.
       HINWEIS: Dies sind allgemeine Sicherheitsratschläge für Labore – beachten Sie stets die EHS-Vorschriften (Umweltschutz und -sicherheit) der Institution sowie lokale gesetzliche Vorgaben.
5. Qualitätskontrolle
   1. Führen Sie Vor- und Nachkalibrierungsprüfungen mit dem NaI-Standard durch, um die Massengenauigkeit zu bestätigen.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Lock-Massenreferenz während der gesamten Analyse stabil bleibt.
   3. Replikate Injektionen bewerten, um die Reproduzierbarkeit in Retentionszeit, Driftzeit und spektraler Intensität zu bestätigen.
      VORSICHT: Natriumiodid ist ein Reizstoff. Tragen Sie beim Handling Handschuhe und vermeiden Sie Einatmen oder Hautkontakt.
      HINWEIS: Siehe Supplementary File 1 für Hinweise zur Abfallentsorgung. Arbeiten Sie bei der Handhabung von Plasmaproben immer in kalter Umgebung oder auf Eis, um den Proteinabbau zu verhindern. Tragen Sie Nitryl-Handschuhe, einen Laborkittel und Augenschutz beim Umgang mit biologischen Proben und Puffern. Führen Sie Zentrifugationsschritte mit einer auf 4 °C vorgekühlten Zentrifuge durch. Stellen Sie sicher, dass alle verwendeten Zentrifugenröhrchen und Spritzen steril und ordnungsgemäß gekennzeichnet sind, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verwenden Sie immer proteomhaltiges Wasser zur Herstellung von Puffern.

Ergebnisse

Plasmaproben wurden mit einer Spin-Kartusche verarbeitet, um selektiv 14 hochhäufige Proteine zu entfernen, nämlich Albumin, IgG, IgA, Transferrin, Haptoglobin, Antitrypsin, Fibrinogen, Alpha2-Makroglobulin, Alpha1-Säureglykoprotein, IgM, Apolipoprotein AI, Apolipoprotein AII, Komplement C3 und Transthyretin. Dieser Depletionsschritt war entscheidend, um den Nachweis von Biomarkern mit niedriger Häufigkeit in der nachgelagerten proteomischen Analyse zu verbessern. Jede Plasmaprobe (8–10 ...

Diskussion

Die intrinsische Komplexität des Plasmas als biologische Matrix stellt eine große Herausforderung für die proteomische Analyse dar. Der enorme dynamische Bereich der Proteinkonzentrationen sowie die Vorherrschaft einiger Arten mit hoher Häufigkeit können den Nachweis klinisch relevanter Proteine mit geringerer Häufigkeit überdecken. Für diese aktuelle Studie haben wir diese Nachteile mit einer mehrstufigen, standardisierten Pipeline für die Probenvorbereitung ausgearbeitet, die darauf au...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Spin-Konzentrator	Agilent Technologien	5185− 5991	Verwendet für den Pufferaustausch und die Salzentfernung; behält Proteine über 5 kDa
Ammoniumbicarbonat (ABC)	Sigma Aldrich	Katzennummer: T6567	Verwendet zur tryptischen Verdauung
Buffer A Equil/Load/Wash	Agilent Technologien	5185-5987
Puffer B Elution	Agilent Technologien	5185-5988
Kühle Zentrifuge	CPR-30 Plus Kühlzentrifuge	N/A	Verwendet zum Zentrifugieren von Proteinproben bei niedriger Temperatur
DTT	Sigma Aldrich	CASNo: 3483-12-3	Verwendet zur tryptischen Verdauung
Elektrophoretischer Apparat	BIO RAD	1658004	Verwendet für SDS PAGE
IAA	Sigma Aldrich	CAS-Nr.: 144-48-9	Verwendet zur tryptischen Verdauung
IMS T-Wave	Gewässer	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav eMoreCompleteCharacterizationofMi xturesandMolecules-720004176.pdf	Ionenmobilitätstrennung (IMS)
Infinite M Plex Multimode-Leser	TECAN		Multiplate-Leser
LC-MS-System	Gewässer	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
MassLynx 4.1 SCN781 Software	Gewässer	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.html	Massenspektrometrie-Software
Mehrfache Affinitätsentfernung Spin-Patrone Human 14 (MARS Hu-14)	Agilent Technologien	5188− 6560	Verwendet zum Abbau von 14 hochhäufigen Plasmaproteinen, darunter Albumin, IgG, IgA, Transferrin usw.
nanoACQUITY UPLC-System	Gewässer	https://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
NanoLockSpray	Gewässer	https://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
Operon FDU-7003	Operon	http://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.html	Geschwindigkeits-Vakuum-Lyophilissator
Pierce BCA Protein-Assay-Kit	Thermowissenschaftlich	23225	Verwendet zur Quantifizierung der Proteinkonzentration mittels kolorimetrischer Analyse
Progenese QI für Proteomik	Gewässer	V4.2
R-8C BL Laborzentrifuge, fester Winkelrotor mit 12 & Times; 15 mL	REMI		Zentrifuge
SYNAPT G2 HD-MS	HDMSE-System, Waters Corporation	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2009/720003057/720003057-en.pdf	Hybrid-Quadrupol-IMS-Massenspektrometer mit orthogonaler Beschleunigung (OA-Tof) Massenspektrometer
Totale Erholungsfläschchen	Gewässer	https://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
Trypsin	Sigma Aldrich	Katzennummer: T6567	Verwendet zur tryptischen Verdauung