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Forschungsartikel
Liponsäure aktiviert den zytoprotektiven Weg Nrf2/HO-1 bei Pilzkeratitis und senkt so die Konzentrationen von entzündlichen Zytokinen und Hornhautschäden. Diese wirtsgesteuerte Therapie zeigt überlegene Sicherheitsprofile im Vergleich zu herkömmlichen Antimykotika und liefert mechanistische Einblicke in die Behandlung von durch oxidativen Stress verursachten Augenerkrankungen durch endogen antioxidative Signalwege.
Lipoinsäure (LA), ein Dithiol-Antioxidans mit einem beispielhaften Augensicherheitsprofil, wurde auf ihre Fähigkeit untersucht, das oxidativ-inflammatoriske Milieu, das Pilzkeratitis antreibt, zu temperieren. Menschliche Hornhautepithelzellen tolerierten LA bis zu 60 μM ohne Lebensfähigkeitsverlust, und bei der Aspergillus fumigatus-Herausforderung führte LA zu einer dreifachen Eskalation der nukleären Faktor erythroid 2 (Nrf2) Kerntranslokation sowie einen fünffachen Anstieg ihres nachgeschalteten Effektors Häm-Oxygenase-1 (HO-1). Die pharmakologische Abschaltung von Nrf2 mit ML385 oder die katalytische Blockade von HO-1 mit Tin-Protoporphyrin IX hoben diese molekularen Ereignisse auf und stellten die Expression von Interleukin-1β und Tumornekrosefaktor-α wieder her, wodurch die strikte Nrf2/HO-1-Abhängigkeit bestätigt wurde. Parallele Experimente in einem Modell der Mauskeratitis bestätigten die in-vitro-Beobachtungen : topische LA verringerte die Hornhautopazität und die Entzündungswerte um 47 %, wobei gleichzeitig die Expression von Nrf2- und HO-1-Expression auf der Hornhaut verstärkt wurde und die Zytokin-Transkripte halbiert wurden; die Mitverwaltung von SnPPIX machte diese Vorteile aufgehoben. Zusammen zeichnen die Daten eine kohärente mechanistische Hierarchie dar, in der LA bei klinisch erreichbaren Konzentrationen die Nrf2-Proteinspiegel erhöht und die nukleare Translokation verstärkt, die HO-1-Aktivität verstärkt und dadurch pathogeninduzierte zytokinische Turbulenzen beruhigt. Diese Ergebnisse positionieren LA als leicht übertragbares, wirtsgerichtetes Zusatzmittel, das die antimykotische Chemotherapie ergänzen kann, und deuten auf breitere therapeutische Perspektiven für die Nrf2-zentrierte Modulation der augenbedrohenden Hornhautentzündung hin.
Pilzkeratitis (FK) gilt heute als allgegenwärtiger ophthalmischer Notfall, der jährlich für mehr als 1 Million kulturbewiesene Fälle verantwortlich ist und einen unverhältnismäßig hohen Anteil der Hornhautblindheit in tropischen und subtropischen Regionenverursacht 1,2. Inzidenzschätzungen von etwa 6 bis 8 pro 100.000 in den Vereinigten Staaten und sogar noch höher in Agrarwirtschaften unterstreichen eine wachsende globale Bedrohung, die nach pflanzlichen Verletzungen oder Kontaktlinsennutzung bevorzugt erwerbsfähige Bevölkerungen trifft 3,4. Fadenpilze, insbesondere Arten von Fusarium und Aspergillus, dominieren die ätiologische Landschaft, gedeihen in warmen, feuchten Klimazonen und nutzen okulare Mikroverletzungen, um eine Infektionauszulösen 5.
Trotz eines halben Jahrhunderts klinischer Anwendung bleibt Natamycin 5% das einzige topische Mittel, das speziell für FK zugelassen ist; seine Polyenchemie führt jedoch zu einer schlechten Hornhautdurchdringung, erfordert häufige Dosierung und ist nicht überall verfügbar 6,7. Beunruhigend ist, dass eine aufeinanderfolgende Überwachungsstudie aus Südasien schrittweise Zunahmen der minimalen inhibitorischen Konzentrationen sowohl von Natamycin als auch von Triazolen gezeigt hat, wobei Fusarium-Isolate einen jährlichen Anstieg der Natamycin-Resistenz von ≥6 % und einen parallelen Trend für Voriconazol8 aufweisen. Diese Daten stimmen mit klinischen Berichten über Therapieversagen überein und bestätigen die Prognosen, dass der Markt für FK-Therapeutika von 0,9 Milliarden USD im Jahr 2023 auf 1,48 Milliarden USD bis 2033 wachsen wird, was vor allem durch die Unzulänglichkeiten der aktuellen pharmakologischen Therapie verursacht wird. Ad-hoc chirurgische Maßnahmen wie Bindehautlappen oder penetrierende Keratoplastik retten die Anatomie bei widerspenstigen Geschwüren, sind jedoch ressourcenintensiv und seheinschränkend9. Diese Mängel unterstreichen zusammen die Notwendigkeit wirtsgerichteter oder multitargetierter Strategien, die über die reine fungistatische Aktion hinausgehen.
Oxidativer Stress und die daraus resultierende entzündliche Kaskade gelten heute als entscheidende Faktoren für die Pathogenese des Pilzes und die Narbenbildung der Hornhaut. Nach der Pilzinvasion starten hornhautepithel und ansässige Immunpopulationen, darunter konjunktivale Mastzellen, limbale dendritische Zellen und stromale Keratozyten, angeborene Immunantworten über Mustererkennungsrezeptoren wie Dectin-1 und Toll-ähnliche Rezeptoren10. Neutrophil-abgeleitete reaktive Sauerstoffspezies (ROS) reichen sich im infizierten Stroma als Teil des antimikrobiellen oxidativen Bursts an, während infiltrierende Makrophagen und T-Lymphozyten chronische Entzündungen durch Zytokinamplifikationaufrechterhalten. Paradoxerweise regulieren filamentöse Pilze ihre eigenen antioxidativen Schaltkreise (z. B. Yap1-regulierte Superoxid-Dismutasen), um dieses feindliche Milieu zu überleben. Überschüssiges ROS aktiviert wiederum die NF-κB-abhängige Transkription von IL-1β, TNF-α und anderen pro-inflammatorischen Mediatoren, die die Gewebezerstörung und die Hornhautopacifikation12 vorantreiben. Im Zentrum der endogenen Zytoprotektion befindet sich der Nuklearfaktor Erythroide-2-bezogener Faktor 2 (Nrf2), dessen Translokation in den Kern die Expression von Hämoxygenase-1 (HO-1) und einer Reihe entgiftender Enzyme über mehrere Hornhautzelltypen hinweg orchestriert, darunter Epithelzellen, Keratozyten und Endothelzellen13,14. Alterung, Diabetes und chronische Entzündungen unterregulieren diese Achse, wodurch Augengewebe anfällig für oxidative Schäden werden, während genetische oder pharmakologische Verbesserung von Nrf2 den Epithel-Wundverschluss beschleunigt und den Zytokinschub bei verschiedenen Hornhautverletzungen unterdrückt15.
Proof-of-Concept-Studien haben begonnen, diesen Weg in FK zu nutzen. Natürliche kleine Moleküle wie Perillaldehyd16, Gallensäure17, Hydroxytyrosol18 und die Organoseleniumverbindung Ebselen19 erzielen doppelte antimykotische und entzündungshemmende Wirkungen, indem sie die Nrf2-HO-1-Signalübertragung verstärken und gleichzeitig die Pilzwirksamkeit direkt beeinträchtigen. Nanomedizin-Plattformen, die antimykotische Mittel und Antioxidantien gemeinsam liefern, verdeutlichen zudem das therapeutische Versprechen, die Pathogenbeseitigung mit der Verstärkung der Wirtsabwehrzu kombinieren 20,21. Dennoch stehen viele dieser Kandidaten vor translationalen Hürden in Bezug auf Formulierungskomplexität oder unbewiesene Augensicherheit.
Liponsäure (LA) ist ein allgegenwärtiges Dithial-Antioxidans mit einer gut etablierten systemischen Sicherheitsbilanz und außergewöhnlicher pharmakodynamischer Vielseitigkeit. Basierend auf Studien in Leber- und Neuralgeweben wird vorgeschlagen, dass10,12 LA direkt Cysteinreste (insbesondere Cys151, Cys273 und Cys288) auf Kelch-ähnlichen ECH-assoziierten Protein-1 (Keap1) modifiziert, wodurch die Interaktion mit Nrf2 gestört wird und so die Nrf2-Ubiquitination und proteasomale Abbau verhindert wird, was zu erhöhten Nrf2-Proteinwerten, verstärkter Kerntranslokation und verstärkter HO-1-Transkription führt. Ein direkter Nachweis der Keap1-LA-Wechselwirkung in hornhautepithelzellen rechtfertigt jedoch zukünftige Untersuchungen. LA hat zytoprotektive Vorteile in hepatischen, neuronalen und okulären Modellen oxidativer Verletzungennachgewiesen 13,15. Seine amphipathische Natur erleichtert die Gewebepenetration ohne die bei Polyene beobachtete Membrantoxizität, und klinische Formulierungen existieren bereits für topische und systemische Indikationen. Dennoch wurde die Fähigkeit von LA, die hornhautentzündungsmikro-Umwelt zu modulieren und damit FK zu verbessern, nicht rigoros untersucht.
Die vorliegende Studie untersuchte daher, ob LA die durch A. fumigatus induzierte Keratopathie durch Aktivierung der Nrf2/HO-1-Achse mildern und proinflammatorische Zytokine unterdrücken kann. Mit humanen Hornhautepithelzellen und einem validierten Maus-FK-Modell haben wir die Dosis-Wirkungs-Eigenschaften abgegrenzt, mechanistische Abhängigkeiten mit selektiven Inhibitoren analysiert und therapeutische Ergebnisse gegen uninfizierte Kontrollgruppen und infizierte Vehikelgruppen benchmarket. Soweit wir wissen, stellt dies die erste systematische Untersuchung dar, die die therapeutische Wirksamkeit von Liponsäure bei Pilzkeratitis durch umfassende Dosis-Wirkungs-Charakterisierung, mechanistische Dissektion mit selektiven pharmakologischen Inhibitoren von Nrf2 und HO-1 sowie Validierung in zellulären und tierbasierten Modellen nachstellt. Diese Arbeit integriert auf einzigartige Weise molekulare, zelluläre und translationale Ablesungen, um eindeutige Belege für die Abhängigkeit des NRF2/HO-1-Weges zu liefern, die den entzündungshemmenden Effekten von LA zugrunde liegt. Durch die Integration molekularer, zellulärer und in-vivo-Messungen wollten wir eine umfassende Bewertung von LA als leicht übersetzbare, wirtsgesteuerte Therapie liefern, die die beiden Imperative der Ausrottung von Krankheitserregern und der Entzündungsbegrenzung bei FK adressiert.
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Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (Protokollnummer: IACUC-2024-FK-007) genehmigt und gemäß der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research durchgeführt. Männliche C57BL/6 Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen und mit einem Gewicht von 20 bis 25 g wurden in einzeln belüfteten Käfigen unter kontrollierten Umweltbedingungen von 22 ± 2 °C und 50 %-60 % relativer Luftfeuchtigkeit mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 Stunden gehalten. Diese spezifischen krankheitserregerfreien Tiere stammen aus den Charles River Laboratories (siehe Materialtabelle). Alle Mäuse durchliefen eine einwöchige Akklimatisierungsphase, um sich an die neue Umgebung anzupassen, bevor die experimentellen Verfahren durchgeführt wurden, mit uneingeschränktem Zugang zu Standard-Nagetierfutter und Wasser.
VORSICHT: Aspergillus fumigatus ist ein pathogener Organismus, der eine Eindämmung der Biosicherheitsstufe 2 benötigt. Alle Pilzkulturen müssen in einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhen, Laborkitteln und Augenschutz behandelt werden. Dimethylsulfoxid (DMSO) ist brennbar und kann die Haut durchdringen; Führen Sie in gut belüfteten Bereichen und vermeiden Sie direkten Kontakt. Ketamin und Xylazin sind kontrollierte Substanzen, die eine sichere Aufbewahrung und ordnungsgemäße Dokumentation gemäß institutionellen Vorschriften erfordern.
Experimentelle Vorbereitung
Alle erforderlichen Reagenzien, Medikamente und Materialien wurden gemäß dem experimentellen Arbeitsablauf vorbereitet (siehe Materialtabelle und ergänzende Abbildung 1 für den Schaltplan). Racemische (±)-α-Liponsäure (LA)-Lagerlösungen wurden mit racemischer α-Liponsäure (1,2-Dithiaolin-3-Pentansäure), gelöst in DMSO, zu einer Konzentration von 60 mM hergestellt und in Einweg-Aliquots bei -80 °C gelagert, um oxidativen Abbau zu verhindern. Der Nrf2-Inhibitor ML385 und der HO-1-Inhibitor SnPPIX wurden ähnlich vorbereitet und für den Einweg aliquotiert, um Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Alle Zellkulturmedien und Ergänzungsmittel wurden unter sterilen Bedingungen zubereitet und vor der Anwendung auf 37 °C vorgewärmt.
Alle mit Pilzkulturen kontaminierten Materialien, einschließlich Agarplatten, Kulturröhrchen und Einwegplastik, wurden bei 121 °C für 30 Minuten vor der Entsorgung in Biohazard-Abfallbehältern autoklaviert. Chemische Abfälle, die organische Lösungsmittel enthalten, wurden separat gesammelt und im Rahmen institutioneller Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsprotokolle entsorgt. Tiergewebe und -kadaver wurden durch zugelassene biomedizinische Abfalldienste verbrannt.
Pilzkultur und Infektionsvorbereitung
Aspergillus fumigatus wurde auf Sabouraud-Dextrose-Agar bei 37 °C 5–7 Tage lang kultiviert, bis eine reife Konidalbildung beobachtet wurde. Konidien wurden durch Überflutung ausgereifter Kulturen mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,05 % Tween-80 geerntet, und konidiale Suspensionen wurden durch sterile Gaze gefiltert, um Hyphalfragmente zu entfernen. Die Konidialkonzentration wurde mit einem Hämozytometer bestimmt und auf Grundlage veröffentlichter Modelle der pilzartigen Keratitis an festgelegte Konzentrationen angepasst. Für In-vitro-Experimente wurde 1 x 10 ×6 Konidien/mL (Infektionsmultiplizität von 10:1) ausgewählt, basierend auf früheren Studien, die zeigten, dass diese Konzentration robuste Entzündungsreaktionen in hornhautepithelzellen induziert und gleichzeitig eine ausreichende Zelllebensfähigkeit für nachgelagerte Analysen aufrechterhält16,17. Für In-vivo-Studien wurde 1 x 10× 7 Conidien/mL ausgewählt, da dieses Inokulum eine konstante, moderat schwere Keratitis mit reproduzierbaren Krankheitswerten bis Tag 5 nach der Infektion erzeugt und so eine ausreichende Dynamik bietet, um die therapeutische Wirksamkeit ohne übermäßige Sterblichkeitzu bewerten 16,19.
Tierbehandlung und Hornhautinfektion
Unter Vollnarkose (intraperitoneale Injektion von Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg) wurde die Pilzkeratitis durch das Anlegen von drei 1 mm langen linearen Kratzern auf der zentralen Hornhaut mit einer sterilen 25G-Nadel ausgelöst, gefolgt von der topischen Anwendung von 5 μL A. fumigatus konidialer Suspension. Die Mäuse wurden zufällig Behandlungsgruppen zugeteilt (n=8 pro Gruppe): Kontrollgruppe (nicht infiziert), infizierte Kontrolle, infizierte + LA-Behandlung (60 μmol/L topisch 4x täglich) und infizierte + LA + SnPPIX-Behandlung (LA plus 5 mg/kg SnPPIX intraperitoneal täglich). Am 5. Tag nach der Infektion wurden klinische Untersuchungen und Gewebeentnahme durchgeführt.
Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Tieren: Alle Verfahren mit narkosierten Tieren sollten unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Überwachen Sie die Tiere während der Anästhesie kontinuierlich auf Atemdepression. Entsorge kontaminierte Bettwäsche, chirurgische Abfälle und infizierte Gewebe durch Autoklavierung und anschließend Verbrennung gemäß institutionellen Biohazard-Abfallmanagementprotokollen.
Zellkultur und Behandlung
Humane hornhautepithelzellen (HCECs) wurden aus ATCC gewonnen und in DMEM/F-12-Medium erhalten, das mit 10 % fetalem Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und 1 % L-Glutamin bei gleichmolaren Konzentrationen bei 37 °C in einer befeuchteten 5 % CO₂-Atmosphäre ergänzt wurde. Die Zellen wurden alle 3-4 Tage nach Erreichen der 80%-90%-Konfluenz subkultiviert und zwischen den Durchgängen 3-8 verwendet, um eine Konsistenz sicherzustellen. Bei experimentellen Behandlungen wurden die Zellen mit 5 x 10⁴ Zellen pro Bohrloch in geeigneten Platten ausgesät und vor der Behandlung 24 Stunden haften lassen. Bei allen in-vitro mechanistischen Experimenten wurden die Zellen zunächst Aspergillus fumigatus conidia mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 10:1 für 4 Stunden ausgesetzt, um eine Infektion zu etablieren, gefolgt von der Zugabe von LA (60 μM), ML385 (5 μM) oder SnPPIX (1 μM) allein oder in Kombination für weitere 24 Stunden vor der Probenentnahme. Dieses sequentielle Design ermöglicht die Bewertung der therapeutischen Wirkung von LA auf etablierte pilzbedingte Challenge statt auf eine prophylaktische Behandlung.
Zellviabilitätsbewertung (CCK-8-Analyse)
Die Zelllebensfähigkeit wurde mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) bewertet. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 5 x 104 Zellen pro Bohrloch ausgesät und 24 Stunden vor der Behandlung inkubiert. Nach der Medikamentenexposition wurden 10 μL CCK-8-Lösung zu jedem Bohrloch hinzugefügt, und die Platten wurden 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Absorption wurde bei 450 nm mit einem Multimode-Mikroplattenleser gemessen. Jede experimentelle Bedingung wurde in einem Oktuplicat durchgeführt, und die Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander wiederholt. Die Konzentration der Vehikelkontrolle (DMSO) wurde unter 0,1 % gehalten, um zytotoxische Effekte zu vermeiden.
RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-PCR
Die Gesamt-RNA wurde aus kultivierten Zellen und Hornhautgeweben mit dem RNeasy Mini Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Gewebeproben wurden im RLT-Puffer mit einem Gewebehomogenisator für 2 Minuten bei 50 Hz homogenisiert. Die RNA-Qualität und -Konzentration wurden mit einem Spektrophotometer bewertet, wobei Proben mit 260/280-Verhältnissen von 1,8–2,0 für die nachgelagerte Analyse verwendet wurden. Die Erststrang-cDNA-Synthese wurde mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit mit 1 μg Gesamt-RNA pro Reaktion durchgeführt. Quantitative PCR wurde mit dem SYBR Green-basierten qPCR-Master-Mix auf einem Echtzeit-PCR-System durchgeführt, mit einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 2 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 15 Sekunden und 60 °C für 1 Minute. Eine Analyse der Schmelzkurve wurde durchgeführt, um die Spezifität der Ampliconen zu überprüfen. Alle Primer wurden vor der Anwendung auf Effizienz (90–110%) und Spezifität validiert. Die relative mRNA-Expression wurde mit der 2(-ΔΔCT) -Methode berechnet, wobei GAPDH das Referenzgen war.
Proteinextraktion und Western-Blot-Analyse
Für die vollständige Proteinextraktion wurden Zellen und Gewebe in einem RIPA-Puffer lysiert, der mit Protease- und Phosphataseinhibitor-Cocktails ergänzt wurde. Nukleäre und zytoplasmatische Proteinfraktionen wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers mit den NE-PER Nuklear- und Cytoplasmatischen Extraktionsreagenzien hergestellt. Die Proteinkonzentrationen wurden mittels des Bradford-Tests bestimmt. Gleiche Mengen an Protein (30–50 μg) wurden durch SDS-PAGE getrennt und auf PVDF-Membranen übertragen. Nach dem Blockieren mit 5 % fettarmer Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 für 1 Stunde wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert, gefolgt von geeigneten HRP-konjugierten Sekundärantikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Proteinbänder wurden mit verstärktem chemilumineszenz-Reagenz visualisiert, mit Expositionszeiten von 30–180 Sekunden, abhängig von der Signalintensität. Die Bänder wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert, wobei β-Actin als Ladekontrolle für Gesamtproteine und Lamin B1 für Kernproteine diente.
Klinische Beurteilung und histologische Analyse
Die Schwere der Hornhauterkrankung wurde mit einem standardisierten klinischen Bewertungssystem auf Basis etablierter Protokolle für Mauspilzkeratitis22 bewertet. Das Bewertungssystem bewertet drei Parameter auf einer Skala von 0 bis 4: Hornhautopazität (0 = klar, 4 = vollständig undurchsichtig), Oberflächenunregelmäßigkeit (0 = glatt, 4 = schwere Ulzeration mit Perforation) und Entzündungsreaktion (0 = kein Infiltrat, 4 = dichte Infiltration mit Hypopyon), was Gesamtpunktzahlen von 0 bis 12 ergibt. Alle klinischen Bewertungen wurden von zwei unabhängigen Beobachtern durchgeführt, die bei Behandlungsgruppenzuweisungen maskiert waren, wobei die Übereinstimmung zwischen den Beobachtern über 90 % betrug. Hornhornfotos wurden mit einem Spaltlampen-Biomikroskop aufgenommen, das mit einer Digitalkamera ausgestattet war. Für die histologische Analyse wurden die Augen enukleiert, in 4 % Paraformaldehyd fixiert, paraffinhaltig eingebettet und mit einer Schnittlänge von 5 μm Durchmesser durchschnitten. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, um die allgemeine morphologische Beurteilung durchzuführen.
Enzymgekoppelter Immunsorbent-Test (ELISA)
Die sekretierten Konzentrationen von IL-1β und TNF-α in Zellkultur-Supernatanten und Hornhautgewebe-Homogenaten wurden mit kommerziellen ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Zellkultur-Supernatanten wurden nach 24 Stunden Behandlung gesammelt, während das Hornhautgewebe in PBS-haltigen Proteaseinhibitoren homogenisiert wurde. Die Proben wurden bei 12.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, und Supernatanten wurden für die ELISA-Analyse verwendet. Alle Proben wurden doppelt analysiert, und die Zytokinkonzentrationen wurden anhand der Standardkurven berechnet.
Statistische Analyse
Alle Experimente wurden mit geeigneten biologischen Replikaten durchgeführt (n ≥6 für In-vitro-Studien , n =8 für Tierversuche) und mindestens dreimal unabhängig voneinander wiederholt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Datenanalyse wurde mit GraphPad Prism Version 9.0 durchgeführt. Konkret verwendeten wir die Normalitätstestfunktion (Shapiro-Wilk) zur Bewertung der Datenverteilung, Einweg-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest für Experimente mit mehr als zwei Gruppen und den ungepaarten Student-t-Test für Zweigruppenvergleiche. Graphen wurden als gruppierte Balkendiagramme erzeugt, wobei einzelne Datenpunkte als Streudiagramme überlagert wurden, wobei Fehlerbalken den Standardfehler des Mittelwerts darstellten.
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Der experimentelle Workflow zeigte, dass die Behandlung mit Liponsäure den Nrf2/HO-1-Signalweg effektiv moduliert, um Entzündungen in Pilzkeratitis-Modellen zu unterdrücken.
Zytotoxizitätsbewertung von Liponsäure und wegspezifischen Inhibitoren
Erste Dosis-Wirkungs-Studien wurden durchgeführt, um optimale Konzentrationen für jede in dieser Studie verwendete Verbindung festzulegen. LA zeigte eine ausgezeichnete Biokompatibilität mit HCECs und bewahrte die Zelllebensfähigkeit...
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Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen Liponsäure (LA) als starken Induktor der Nrf2/HO-1-Achse, der Pilzkeratitis (FK) mildert, indem er die proinflammatoriske Zytokinexpression hemmt und die Hornhautstruktur erhält. Im Einklang mit aktuellen Studien, die eine robuste Nrf2-Aktivierung durch Dithiolanverbindungen bei oxidativen Störungenzeigen 15, führte LA zu einem fünffachen Anstieg der HO-1-Transkripte und halbierte die Sekretion von IL-1β/TNF-α, womit sie mehr...
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Die Autoren geben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Werk an. Keine externe Finanzierung oder kommerzielle Beziehungen beeinflussten das Design, die Durchführung oder die Interpretation der Studie.
Diese Forschung wurde durch interne Mittel der Abteilung für Augenheilkunde des Jinan 2. Volkskrankenhauses unterstützt. Die Autoren danken dankbar für die technische Unterstützung des Laborpersonals bei der Erhaltung von Zellkulturen und Tiermodellverfahren. Ein besonderer Dank gilt dem Institutional Animal Care and Use Committee für die Überprüfung und Genehmigung der Protokolle.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anti-HO-1 | Zellsignalisierungstechnologie, Danvers, MA, USA | #8803 | |
| Anti-β-Actin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A5441 | |
| Antilamin B1 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab16048 | |
| Anti-Nrf2 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab62352 | |
| Aspergillus fumigatus | ATCC 204305 | N/A | |
| Bradford Assay Kit | Bio-Rad Labore | 5000006 | |
| C57BL/6 Mäuse | Charles River Laboratories | N/A | |
| Zellzähl-Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan | 343-07623 | |
| DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| ECL-Reagenz | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| Fetales Rinderserum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| GAPDH Vorwärtsprimer | Individuelle Synthese | Gepflogenheit | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hochkapazitäts-cDNA-Reverse-Transkriptions-Kit | Angewandte Biosysteme, Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| HO-1 Vorwärtsprimer | Individuelle Synthese | Gepflogenheit | |
| HO-1 Rückwärtszünder | Individuelle Synthese | Gepflogenheit | |
| HRP-konjugiertes Anti-Maus-IgG | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab205718 | |
| HRP-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab205719 | |
| Menschliche Hornhautepithelzellen (HCECs) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-11135 | |
| IL-1β ELISA-Trikot | R& D Systems, Minneapolis, MN, USA | DY201 | |
| Liponsäure (LA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1395 | |
| ML385 (Nrf2-Inhibitor) | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-100523 | |
| NanoDrop 2000 Spektrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| NE-PER Kern- und zytoplasmatische Extraktionsreagenzien | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Nrf2 Vorwärtsprimer | Individuelle Synthese | Gepflogenheit | |
| Nrf2 Rückwärtszündung | Individuelle Synthese | Gepflogenheit | |
| PBS mit 0,05 % Tween-80 | Individuelle Vorbereitung | Gepflogenheit | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Angewandte Biosysteme, Thermo Fisher Scientific | A25741 | |
| QuantStudio 5 Echtzeit-PCR-System | Thermo Fisher Scientific | A28140 | |
| RIPA-Puffer | Individuelle Vorbereitung | Gepflogenheit | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Deutschland | 74104 | |
| Sabouraud-Dextrose-Agar | Individuelle Vorbereitung | Gepflogenheit | |
| Spaltlampen-Biomikroskop | Sonderausrüstung | N/A | |
| SnPPIX (HO-1-Inhibitor) | Frontier Scientific, Logan, UT, USA | F6140 | |
| Synergy HTX Multi-Mode Mikroplatten-Leser | BioTek Instruments, Winooski, VT, USA | SYNHXTTR | |
| TBS-T (0,1 % Tween-20) | Individuelle Vorbereitung | Gepflogenheit | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 69980 | |
| TNF-α ELISA-Trikot | R& D Systems, Minneapolis, MN, USA | DY210 |
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