1. Herstellung synthetischer Hautproben
Ein kollagenbasiertes synthetisches Hautmodell (VITRO-Skin) Blatt wurde unter aseptischen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank in rechteckige Muster von 5,0 cm × 2,5 cm zugeschnitten. Jede Probe wurde in eine sterile Petrischale gelegt und bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahrt. Vor der Impfung wurden die Proben auf Raumtemperatur ausgeglichen und gemäß den Anweisungen des Herstellers in einer Feuchtigkeitskammer befeuchtet, um den Hydratationsgrad der menschlichen Haut nachzuahmen.
2. Herstellung mikrobieller Kulturen
American Type Culture Collection (ATCC)-Referenzstämme, darunter Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Acinetobacter baumannii (ATCC 19606), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) und Candida albicans (ATCC 10231), wurden verwendet. Einzelne Kolonien wurden unter aseptischen Bedingungen in 5-mL Tryptic Soy Fond (TSB) impft. Bakterienkulturen wurden bei 35 °C für 24 Stunden inkubiert, und Pilzkulturen bei 22 °C für 5 Tage. Nach der Inkubation wurde die Trübung auf 0,5 McFarland Standard (ca. 1,5 × 10⁸ CFU/mL) unter Verwendung steriler Phosphat-Puffersalzlösung (PBS) für antimikrobielle Tests angepasst.
3. Impfung von synthetischen Hautmodellen
Jeder hydratisierte synthetische Hautabschnitt wurde mit 100 μL mikrobieller Suspension impft und gleichmäßig mit einem sterilen Einwegstreuer verteilt. Die geimpften Oberflächen wurden 15 Minuten lang in einer sterilen Kammer unter Umgebungslaborbedingungen (22–24 °C, 60%–70% RH) an der Luft getrocknet. Die Proben wurden drei Gruppen zugeteilt: unbehandelte Kontrolle (Gruppe A), Lichtquelle (Blaulicht-LED, 405 nm) Bestrahlung (Gruppe B) und UV-C-LED (265 nm) Bestrahlung (Gruppe C). Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung der Experimente bei der Bewertung der antimikrobiellen Wirksamkeit der Lichtquelle mittels des synthetischen Hautmodells.
4. Lichtquellenkonfiguration und Bestrahlung
Ein 405 nm Blaulicht-LED-Gerät wurde auf einem Aluminium-Kühlkörper montiert, um Wärmeansammlung zu verhindern und eine thermisch sichere Bestrahlung synthetischer Hautproben zu gewährleisten (Abbildung 2). Die Bestrahlung wurde auf der exakten Behandlungsebene mit einem kalibrierten optischen Leistungsmesser gemessen, wobei die Sondenhochkunft an die Sensordicke angepasst wurde. Die Arbeitsbestrahlung wurde auf 30 mW/cm² standardisiert, indem der Drehabstand der LED angepasst wurde.
Die Beleuchtungsgleichmäßigkeit im gesamten Behandlungsfeld wurde durch Messung der Bestrahlung an 16 gleichmäßig verteilten Punkten bestätigt, was einen Durchschnitt von 30,14 ± 0,78 mW/cm² ergab (Abbildung 3). Für den Basisvergleich der keimtödlichen Effekte wurden UV-C-Behandlungen mit einer 265 nm LED-Quelle durchgeführt, die 3 mW/cm² in 20 cm Abstand für 2 Minuten lieferte.
Fluenz wurde als Bestrahlung × Belichtungszeit berechnet und entsprach 27 J/cm² für Blaulicht (30 mW/cm² × 900 s) und 3,6 J/cm² für UV-C.
Für antimikrobielle Tests wurden hydratisierte, synthetische Hautproben, die mit mikrobiellen Suspensionen impfiert waren, aseptisch in sterile Petrischalen (Deckel entfernt) platziert und direkt unter der Blaulicht-LED positioniert. Proben, die der Bestrahlungsgruppe (Gruppe B) zugeordnet waren, wurden kontinuierlich ausgesetzt, bis der Zielfluenz erreicht war (15 Min.). Die 15-minütige Expositionsdauer (27 J/cm²) wurde anhand von vorläufigen Zeitvertriebsexperimenten ausgewählt, die eine konsistente antimikrobielle Wirksamkeit über verschiedene Arten hinweg zeigten und gleichzeitig eine praktische Expositionsdauer für potenzielle klinische oder Point-of-Care-Anwendungen darstellten. Die Temperatur jeder Probe wurde alle 5 Minuten mit einem kontaktlosen Infrarotthermometer überwacht, um sicherzustellen, dass während der Beleuchtung keine signifikante Erwärmung stattfand. Die Temperaturüberwachung zeigte keinen messbaren Anstieg der Oberflächentemperatur (>2 °C) während der Blaulichtbestrahlung, was bestätigte, dass die beobachteten antimikrobiellen Effekte nicht-thermisch waren.
5. Antimikrobielle Wirksamkeit von blauem Licht, LED und UV-C gegen Wundkrankheitserreger
Nach der Behandlung wurde jede synthetische Hautprobe in ein steriles 15-ml-Rohr mit 9,0 mL PBS (pH 7,4) übertragen. Die Röhren wurden vorzeitig eine Minute lang vortexiert, um oberflächenhaftende Mikroben zu lösen. Es wurden serielle Zehnfach-Verdünnungen hergestellt, und 100-μL-Aliquoten wurden auf Tryptic Soy Agar (TSA) für Bakterien und Sabouraud Dextrose Agar (SDA) für Pilze verschichtet. Platten wurden inkubiert (Bakterien bei 35 °C für 24 Stunden; Pilze bei 22 °C für 5 Tage) und koloniebildende Einheiten (CFUs) wurden aufgezählt. Die mikrobielle Reduktion wurde mit den folgenden Gleichungen quantifiziert:
Log-Reduktion = log10(A) - log10(B)
Prozentuale Reduktion = ((A - B)/A) × 100
Wobei A = CFU-Zählung aus der Kontrolle gilt; B = CFU-Zahl aus behandelten Proben.
Negative Kontrollen bestanden aus reinen Medienplatten und PBS zur Überprüfung der Sterilität, während unbehandelte geimpfte Proben zum Vergleich der Behandlungswirksamkeit verwendet wurden. Die positiven Kontrollplatten bestanden aus inokulierten ATCC-Mikrobiensuspensionen, um die Kulturlebensfähigkeit zu bestätigen. Alle experimentellen Schritte wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.
6. Zeitabhängige antimikrobielle Wirksamkeit der Blaulichtbestrahlung
Um den fluenzabhängigen Effekt zu bewerten, wurden die Expositionsdauern für blaues Licht auf 2 Minuten, 5 Minuten, 10 Minuten, 15 Minuten, 20 Minuten und 30 Minuten gesetzt. Die antimikrobielle Aktivität wurde mittels CFU-Enumeration wie oben bewertet, was eine Analyse dosisabhängiger Zusammenhänge ermöglichte.
7. Blaulicht-LED-Effizienz in einer aerosolisierten Kammer, die nosokomiale Bedingungen simuliert
Eine angepasste Acryl-Aerosolkammer wurde unter kontrollierten Umweltbedingungen verwendet, um nosokomische Luftexposition zu simulieren (Abbildung 4). Aerosolisierte mikrobielle Suspensionen (~1,5 x 106 CFU/mL) wurden mit einem Vernebler eingeführt, und synthetische Hautproben wurden 30 Minuten lang freigelegt. Das blaue Licht wurde während der gesamten Belichtung auf die Muster gerichtet (10 μW/cm², 20 cm Entfernung). Im Kontrollexperiment wurden identische Belichtungsbedingungen angewendet, aber das BL-LED-Gerät blieb ausgeschaltet. Die mikrobiellen Zelldichten in der Aerosolkammer wurden mittels Fall-out-Aktivitätsmessungen überwacht, bei denen die Agarplatten vor der Exposition in die Kammer gelegt wurden. Lebensfähige mikrobielle Zellen, die an den synthetischen Hautproben (2 cm x 2 cm) hafteten, wurden mittels der oben beschriebenen Standard-Plattenzählanalyse quantifiziert. Diese niedrige Bestrahlung (10 μW/cm²) wurde ausgewählt, um reale Umgebungslichtverhältnisse in Gesundheitseinrichtungen nachzuahmen, in denen kontinuierliche Hochintensitätsbestrahlung nicht möglich ist.
8. Optische Transmission und eingebettete Kolonietests
- Optische Transmission durch synthetisches Hautsubstrat
Um die Durchdringung von blauem Licht durch synthetische Haut zu quantifizieren, wurde die Bestrahlung mit einem kalibrierten optischen Leistungsmessgerät gemessen, das auf der Behandlungsebene positioniert war. Die BL-Intensität (405 nm, 30 mW/cm²) wurde mit und ohne hydratisierte synthetische Hautproben aufgezeichnet, die horizontal zwischen LED und Detektor platziert waren. Die Übertragung (%) wurde als das Verhältnis der übertragenen Bestrahlung (mit Haut) zur einfallenden Bestrahlung (ohne Haut) berechnet.
Die Transmission unter wässrigen Bedingungen wurde mit einem UV-Viz-Spektrophotometer bewertet. Ein hydratisierter synthetischer Hautstreifen wurde vertikal in eine Standard-Polystyrol-Cuvette eingesetzt, die mit deionisiertem Wasser gefüllt war. Die mit Wasser gefüllte Cuvette diente allein als Platz. Die Absorption bei 405 nm wurde aufgezeichnet, und die prozentuale Übertragung wurde mit %T = 10(-A) × 100 berechnet.
- Funktionale Validierung mittels eingebetteter Kolonie-Assay
Oberflächen- und eingebettete mikrobielle Reduktionstests wurden als funktioneller Korrelate der Übertragung durchgeführt, bei denen Proben auf einer Oberfläche impften, aber von der gegenüberliegenden (unteren) Seite bestrahlt wurden, um Mikroben unter der Hautoberfläche zu simulieren. CFUs wurden wie oben im Abschnitt zur antimikrobiellen Wirksamkeit quantifiziert.
9. FT-IR-Spektroskopie für den Abbau der synthetischen Haut nach blauem Licht und UV-C-Exposition
Um mögliche chemische und strukturelle Veränderungen an der kollagenbasierten synthetischen Hautmatrix durch Lichteinwirkung zu bewerten, wurde eine Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR) durchgeführt. Synthetische Hautproben (2 cm × 2 cm) wurden gemäß den Herstelleranweisungen hydratisiert, identisch mit den in den mikrobiellen Reduktionstests verwendeten Proben. Hydratisierte Proben wurden entweder 405 nm blauem Licht (30 mW/cm²) oder 265 nm UV-C (3 mW/cm²) für 15 Minuten (Standardbelichtung, 27 J/cm²) oder 60 Minuten (Worst-Case-Stressbedingung) ausgesetzt. Nach der Bestrahlung wurden die Proben vorsichtig getupft, um Oberflächenfeuchtigkeit zu entfernen, und sofort mit FT-IR analysiert.
10. ATR-FTIR-Messung
Die Spektren wurden mit einem IR-Spektrophotometer erfasst, das mit einer kompatiblen Analysesoftware ausgestattet war. Alle Proben wurden mit dem Attenuated Total Reflectance (ATR) iD7-Modul analysiert. Um spektrale Veränderungen zu isolieren, die auf Bestrahlung zurückzuführen sind, (1) wurde ein direkter spektraler Vergleich zwischen unbehandelten Kontrollen und bestrahlten Proben durchgeführt. (2) Basis-subtratrahierte Vergleiche wurden durchgeführt, indem die unbehandelte Kontrollprobe als Hintergrundreferenz verwendet wurde, bevor die bestrahlten Proben gescannt wurden, sodass nur die neuen oder veränderten Spitzen sichtbar werden konnten.
Dieser duale Ansatz reduziert topographisches Rauschen und verbessert die Detektion subtiler Veränderungen in Amid- und Fingerabdruckregionen. Hydrationsniveau, Farbstoffdicke und Orientierung wurden über alle Proben standardisiert, um die spektrale Variabilität zu verringern. Jede Belichtungsbedingung (Kontrolle, BL-15 min, BL-60 min, UV-15 min, UV-60 min) wurde dreifach gescannt.
11. Statistische Analyse
Alle Experimente wurden mit unabhängigen biologischen Dreifacharten durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) oder als Mittelwert mit 95%-Konfidenzintervallen (KI) dargestellt, wie in den Abbildungslegenden angegeben. Die Normalität der Datenverteilung wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test bewertet. Paarweise Vergleiche zwischen zwei Gruppen (z. B. blaues Licht vs. UV-C, Oberflächen- vs. eingebettete Kolonien) wurden mit ungepaarten zweiseitigen Student's t-Tests durchgeführt. Für Vergleiche mit mehr als zwei Bedingungen oder Zeitpunkten wurde eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von geeigneten Post-hoc-Tests angewandt. Der spezifische statistische Test, der für jeden Vergleich verwendet wird, ist in der entsprechenden Abbildung angegeben. Ein p-Wert <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.