Erkennung interindividueller Kontaminationen und Fehlanpassungen in Multiomics Next-Generation-Sequenzierungsdaten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung eines Qualitätskontrollrahmens zur Erkennung interindividueller Kontaminationen und Fehlanpassungen in Next-Generation-Sequenzierungsdaten, indem die genetische Identität von Probenpaaren innerhalb von Individuen überprüft wird.

Zusammenfassung

Die Hochdurchsatzverarbeitung von Patientenbioproben durch Next-Generation-Sequenzierung sowie der Vergleich molekularer Daten mit klinischen Daten auf Patienten- und Probenebene erfordern eine präzise Nachverfolgung und Abgleich der Probenidentifikatoren entlang der gesamten Bioprobenkette und sind entscheidend für eine robuste Interpretation der Biomarker-Studienergebnisse. Neben der Nachverfolgung einzelner Schritte in den Proben- und Datenverarbeitungs-Workflows können bioinformatische Lösungen verwendet werden, um zu bestätigen, dass Proben vom selben Patienten stammen. Hier wird der Einsatz eines bioinformatischen Workflows zur Identifizierung abgestimmter Proben desselben Individuums gezeigt. Der Analyse-Workflow ist geeignet, um zwei oder mehr Paare von NGS-Datensätzen zu vergleichen und hinsichtlich der Ursprünge der Patientenproben zu überprüfen. Ein Bewertungsalgorithmus, der auf genomweiten Probenvergleichen basiert, ermöglicht es dem Nutzer festzustellen, ob zwei Proben vom selben Individuum stammen. Konkret werden Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) innerhalb ausgewählter Kopplungsungleichgewichtsblöcke verwendet, um Proben zu identifizieren und zu vergleichen. Schwellenkombinationen für die permissive und strenge Auswahl von abgestimmten und nicht übereinstimmenden Proben wurden identifiziert. Der Nutzen dieses Protokolls wurde durch seine Anwendung bei der Qualitätskontrolle und Validierung klinischer Tumorgewebe- und Blutproben demonstriert, wobei mehrere Omics-Modalitäten von über 2.000 Patienten umschlossen.

Einleitung

Die groß angelegte Entnahme und Analyse klinischer Proben erfordert die genaue Nachverfolgung der Proben entlang ihrer Verwahrungskette, da eine korrekte Übereinstimmung von molekularen Daten aus denselben oder verschiedenen Modalitäten sowie klinischen Patienten- und Probendaten für eine genaue Interpretation und fundierte Entscheidungsfindung unerlässlich ist. Trotz rigoroser Bemühungen, die Probenverarbeitungsprotokolle nach guter klinischer Praxis zu straffen, kann Probenaustausch oder Fehlkennzeichnung in verschiedenen Phasen auftreten, von der Biopsie/Probenentnahme über die Vorbereitungs- und Verarbeitungsschritte bis hin zur Datenanalyse (Abbildung 1). Mit zunehmender Anzahl von Proben und Probenverarbeitungsschritten steigt die Wahrscheinlichkeit von Probenaustauschen und Kreuzkontaminationen. Dies kann zur Analyse von Daten mit falschen Stichproben-Patienten-Beziehungen führen, was nachgelagerte Analysen und Schlussfolgerungen beeinflusst und daher ein wichtiger Aspekt ist, der in der klinischen Genomforschung berücksichtigt werden sollte. In klinischen Studien kann die falsche Identifikation der Proben die Gesamtergebnisse stark beeinflussen, insbesondere bei Studien mit kleiner Stichprobengröße¹. Eine Kontamination zwischen Personen kann zum Verlust der Kraft bei der Identifizierung von Unterschieden und zu falsch-positiven Ergebnissen beim Vergleich mehrerer Proben desselben Patienten führen. Probentausche beeinflussen die Nachweiskraft genetischer Assoziationen und können zur Unterschätzung der Vererbbarkeit komplexer Merkmale in genomweiten Assoziationsanalysen führen².

Die Krebsforschung ist eines der Bereiche, in denen groß angelegte genomische und transkriptomische^{Analysen durchgeführt werden}, insbesondere die Überwachung der genomischen und phänotypischen inter- und intrapatientischen Heterogenität. Ein Aspekt der Krebsforschung ist, dass Proben desselben Patienten unterschiedliche Mutationen und Veränderungen der Kopienzahl tragen können und somit unabhängige Variantenallelfrequenzen⁴ aufweisen. Insbesondere bei der Interpretation von Daten aus mehreren Omics-Typen ist die korrekte Integration multimodaler Datensätze derselben Individuen wichtig und erfordert daher eine Überwachung der interindividuellen Kontamination 5,6,7,8. Studien zu Datensätzen des Cancer Genome Atlas Program (TCGA) und des Lung Genomic Research Consortium (LGRC) haben durchschnittlich Fehlidentifikationsraten von 3 % und in^{bestimmten Studien bis} zu ~20 % ^{festgestellt.} Diese Beispiele zeigen die Bedeutung der Überwachung des Auftretens von Probenaustauschen und Kreuzkontaminationen¹². Über routinemäßige Überwachung und Qualitätskontrolle in jedem Prozessschritt hinaus fungiert eine vergleichende Analyse der Sequenzierungsergebnisse als abschließende Qualitätskontrolle. Dies stellt eine genaue Stichprobenabgleichung sicher, bevor zur Datenanalyse und -interpretation übergegangen wird.

Eine Reihe bioinformatischer Ansätze wurden entwickelt, um festzustellen, ob Proben vom selben Individuum^stammen: 1,4,13,14,15,16. Erste Ansätze nutzten kurze Tandem-Wiederholungen, um die Stichprobenidentität¹⁷ zu überprüfen. Next-Generation-Sequenzierungsdaten auf RNA- und DNA-Ebene ermöglichen nun den Vergleich zwischen Probenpaaren basierend auf Einzelnukleotid-Polymorphismen¹⁸. Sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit auf verschiedene Sequenzierungsmodalitäten und Datensätze, z. B. für RNA-Sequenzierung¹⁹ oder für Whole-Exom-Sequenzierungsdaten⁵, ihrer Implementierung, z. B. Überprüfung über Sequenzierungslanes²⁰, und ihrer Benutzerfreundlichkeit. Obwohl Proben desselben Individuums anhand von 20–45 Single-Nukleotid-Polymorphismen identifiziert werden können, erfordern die in der Krebsforschung typischen Sequenzierungsmethoden mit niedriger bis mittlerer Abdeckung die Integration einer großen Anzahl von SNPs¹.

Hier werden die Implementierung und Anpassungen eines solchen Ansatzes unter Verwendung von Linkage-Disequilibrium-Blöcken von SNPs¹⁵ beschrieben, die zur Qualitätskontrolle abgestimmter Proben verwendet werden. Der Ansatz hat eine niedrige False-Flag- und Falschübereinstimmungsrate gezeigt, und der Workflow ermöglicht den Vergleich zwischen verschiedenen Modalitäten, z. B. zwischen Whole-Exom-Sequenzierungs- und RNA-Sequenzierungsproben, sowie die Verwendung mit verschiedenen Datenformaten. Für eine großflächige Anwendbarkeit der Methode über Datensätze in klinischen Studienproben hinweg wurde die bioinformatische Pipeline in Common Workflow Language (CWL)^21,22 implementiert. Dank seiner Lesbarkeit und YAML-ähnlichen Syntax können Wissenschaftler mit begrenzter Programmiererfahrung die allgemeine Struktur des Workflows und der Analyseergebnisse leicht interpretieren. Ein weiteres zentrales Merkmal von CWL ist die Scatter/Sammel-Funktionalität, die die Parallelisierung von Prozessen ermöglicht, um die zugewiesenen Rechenressourcen vollständig zu nutzen. Benutzer können die Bedingungen angeben, unter denen bestimmte Schritte ausgeführt werden, was die Flexibilität der resultierenden Analysen erhöht. CWL kann mit anderen Komponenten eines vollständigen Workflow-Management-Systems integriert werden, wie Datenbankspeicherung, einer grafischen Benutzeroberfläche und einem Job Dispatcher, und bildet so eine leistungsstarke Plattform zur Erstellung, Durchführung und Pflege einer reproduzierbaren Reihe wissenschaftlicher Analysen. Diese Implementierung ermöglicht somit einen erleichterten Zugriff auf den Arbeitsablauf und die Hochdurchsatzverarbeitung von Datensätzen im Kontext definierter Workflow-Managementsysteme.

Darüber hinaus wurden die Effekte der Abstimmung der Auswahlparameter-Schwellenwerte zwischen abgestimmten und unübereinanderfolgenden Stichproben untersucht, und Schwellenwerte für die permissive und strenge Auswahl von nicht übereinstimmenden Fällen wurden bestimmt. Die Auswirkungen der Modifikation dieser Parameter auf die Auswahl von Stichprobenpaaren und ihre Anwendbarkeit innerhalb und über verschiedene Omics-Modalitäten hinweg wurden dargelegt. Eine effektive Feinabstimmung dieser Parameter ermöglicht es den Nutzern, die Strenge ihrer Interpretationen anzupassen. Der Workflow wurde auf eine Reihe groß angelegter klinischer Datensätze mit mehreren tausend Stichproben angewendet.

Protokoll

Ethik-Erklärung: Diese Analyse der Kreuzkontamination wurde rückwirkend unter Verwendung individueller Patientendaten aus abgeschlossenen klinischen Phase-I- und Phase-II-Studien durchgeführt, gemäß dem verantwortungsvollen Wiederverwendungsprozess von Roche und in Übereinstimmung mit dem Master-Informed Consent-Formular für jede Studie. Die Genehmigungen des Ethikausschusses/des Institutional Review Board wurden für jede Studie vor deren Durchführung eingeholt. Die Teilnehmer gaben und unterschrieben eine informierte Einwilligung zur Teilnahme an diesen Studien.

Bioinformatik-Workflow
HINWEIS: Die Implementierung des Bioinformatik-Workflows beginnt mit rohen Fastq-Dateien, die aus Next-Generation-Sequenzierungsdaten stammen, z. B. Ganzgenom-, Ganz-Exom- oder Ganz-Transkriptom-Sequenzierung. Die hier beschriebenen einzelnen Schritte sind in den CWL-Workflow integriert.

1. Erforderliche Nachschlagewerke

1. Für den Bioinformatik-Workflow stellen Sie Folgendes bereit:
   1. Menschliches Referenzgenom (GRCh38) in . Fasta-Format .
   2. Entsprechende Indexierungsdatei als .fasta.fai.
   3. Entsprechendes Wörterbuch im .dict-Format .
   4. Eine Haplotyp-Karte, die genomische Regionen von Interesse für SNPs und Verknüpfungs-Disequilibrium-Blöcke (z. B. Picard build_fingerprint_maps, SCR_006525) abstimmt.
2. Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Haplotyp-Abbildung mit dem Referenzgenom übereinstimmt.

2. Ausrichtung auf Referenzgenom, Sortierung und Indexierung

1. Führen Sie den CWL-Workflow aus, um die Ausgaben für die folgenden unten beschriebenen Schritte bereitzustellen (Liste der Werkzeuge in der Materialtabelle) (Abbildung 2).
2. Starten Sie den CWL-Workflow, indem Sie ein Verzeichnis mit gepaarten Fastq-Dateien oder ausgerichteten BAM-Dateien bereitstellen.
3. Geben Sie das Muster, z. B. R1/R2, als Eingabemuster für reguläre Ausdrücke im CWL-Befehl an.
4. Geben Sie zusätzlich den Standort für den Workflow, die Genomreferenz und Haplotyp-Kartierungsdateien an.
   HINWEIS: Für einen Gesamtvergleich wird das vollständige Eingabeverzeichnis verwendet. Wenn eine Teilmenge von Dateien verglichen werden soll, stellen Sie eine kommagetrennte Datei mit den Dateinamen zum Vergleich bereit. Die erweiterte Option erlaubt die Auswahl des Zugriffsspeichers und der Anzahl der Zentralprozessoren, die den Prozess ausführen sollen.
5. Die Fastq-Dateien werden durch Verwendung eines Mapping-Algorithmus auf das menschliche Referenzgenom abgebildet.
   HINWEIS: Je nach Sequenzierungsmodalität wird BWA-MEM für DNA-Sequenzierungsergebnisse²³ verwendet, und der splice-aware mapper STAR für RNA-Sequenzierungsergebnisse²⁴. Ein beispielhafter Code für die STAR-Ausrichtung ist unten angegeben:
   STAR \
   --readFilesCommand zcat \
   --runThreadN 8 \
   --outSAMmapqUnique 60 \
   --outSAMattributes Alle \
   --outReadsUnmapped Fastx \
   --outTmpDir /tmp/STARtmp/ \
   --runDirPerm All_RWX \
   --outSAMtype BAM Unsorted \
   --outFileNamePrefix /FILENAME_ \
   --outSAMattrRGline ID:FILEID. L001 SM:SAMPLE \
   --genomeDir /REF/GENOME/DIR \
   --readFilesIn /path/to/FILENAME. R1.fastq.gz /path/to/FILENAME. R2.fastq.gz
6. Sortiere die resultierenden Dateien der ausgerichteten binären Ausrichtungsmatrix (BAM) nach Lesekoordinate mit SAMtools sort (samtools sort -o FILENAME_OUT.bam FILENAME_IN.bam).
7. Indexiere die sortierten BAM-Dateien mit SAMtools-Index (samtools-Index FILENAME_OUT.bam).
8. Markiere und entferne Duplikate mit Picard MarkDuplicates.
9. Indexiere BAM-Dateien neu und integriere Lesegruppen (RG) mithilfe von SAMtools.
   HINWEIS: BAM-Dateien müssen RG-Tags haben, damit der Workflow funktioniert.

3. Fingerabdrücke extrahieren

1. Verwenden Sie die sortierten und indexierten BAM-Dateien, um SNP-Fingerabdrücke mithilfe von Picard ExtractFingerprints zu identifizieren.
2. Verwenden Sie Zwischenspeicher der resultierenden Variant-Call Format (VCF)-Dateien ausschließlich zum Vergleich zwischen Samples.

4. Berechnung von Ähnlichkeitswerten

1. Verwenden Sie Picard CrossCheckFingerprints, um Log Odds Ratio Scores (LOD) der Ähnlichkeit basierend auf Linkage-Disequilibrium-Blöcken zu berechnen, die in einem crosscheck_metrics Dateiformat als crosscheck_metrics.txt bereitgestellt werden.
   HINWEIS: Die Workflow-Implementierung ermöglicht einen Quervergleich aller möglichen Kombinationen von Probenpaaren oder einen ausgewählten Vergleich zwischen Stichproben aus einer vordefinierten Liste.
2. Zwischen-VCF-Dateien löschen.
3. Die crosscheck_metrics-Datei bietet vier Vergleiche für jedes getestete Stichprobenpaar. Die Interpretation der LOD-Ergebnisse ist wie folgt:
   LOD-Score > 0: Proben stammen wahrscheinlich vom selben Individuum (Stichprobenmatch)
   LOD-Wert ≤ 0: Proben stammen wahrscheinlich von verschiedenen Individuen
4. Validieren Sie den Cut-off-Wert für Stichprobenübereinstimmungen, indem Sie die LOD-Scoreverteilung beispielsweise als Histogramm in R oder Python visualisieren (Abbildung 3).
5. Ein kollaboratives Team mit erfahrener Bioinformatik-Expertise wird vorgeschlagen, um festzustellen, ob die Belege für eine eindeutige Identifikation der Probenidentitäten und eine mögliche Anpassung der verwendeten Schwellenwerte ausreichen, beispielsweise durch Einbeziehung aller drei LOD-Werte oder durch einen Vergleich mit der LOD-Score-Verteilung von Proben, von denen bekannt ist, dass sie von verschiedenen Individuen stammen.
   HINWEIS: Stichprobenverwechslungen können zu mehreren unerwarteten Übereinstimmungen führen (LOD-Wert < 0 für Proben desselben Spenders) und zu Fehlmatchen (LOD-Wert > 0 für Proben verschiedener Spender). Komplexe Interpretationen erfordern einen engen Austausch zwischen dem funktionsübergreifenden Team und dem Bioinformatik-Experten.

5. Codeverfügbarkeit

Der rechnergestützte Workflow wird auf Github: https://github.com/Roche/sample-matching-workflow bereitgestellt.

Ergebnisse

CWL-Workflow-Implementierung
Ein Workflow zur Identifikation von Stichprobenübereinstimmungen, basierend auf einem bereits etablierten Ansatz, der Linkage-Disequilibrium-Blöcke von Single-Nukleotid-Polymorphismen zur Identifikation von Probentauschen verwendet, wurde^{implementiert 15}. Die Autoren haben für diese Methode Klassifikationsraten von 0 % FMR und 0,01 % FFR angegeben. Ein Vergleich mit anderen Ansätzen zeigte eine ähnliche Leistung wie NGSCheckmate bei hoher und mittlerer Abdeckung und verbesserte Leistung gegenüber NGSCheckmate bei niedriger Abdeckung und bei minimaler regionaler genomischer Überschneidung. Beim Vergleich mit Conpair und BAMixChecker 13,15,25 wurden nicht eindeutige Ergebnisse erzielt. Hier wurde der Arbeitsablauf in CWL implementiert, LOD-Schwellenwerte untersucht und optimiert sowie für den Vergleich von RNA-Sequenzierungspaaren und DNA-Sequenzierungspaaren oder über Modalitäten hinweg innerhalb von Gewebeproben und zwischen Proben aus Gewebe und peripherem Blut angewendet (Abbildung 3, Tabelle 1). Die Workflow-Implementierung ermöglichte einen Quervergleich aller möglichen Kombinationen von Stichprobenpaaren oder einen ausgewählten Vergleich zwischen Stichproben aus einer vordefinierten Liste.

Die Workflow-Eingabe verwendet eine ausgewählte Gruppe von Haplotypen. Diese werden verwendet, um Einzelnukleotid-Polymorphismen in Linkage-Disequilibrium-Blöcken zu berechnen. Die Berechnung der Log-Odds-Ratio-(LOD)-Scores dieser SNPs-Blöcke über Stichprobenpaare hinweg ermöglicht eine Unterscheidung zwischen abgestimmten und nicht übereinstimmenden Stichproben. Früher wurde gezeigt, dass LOD-Werte im Bereich von LOD < -5 und LOD > 5 passende Paare von Stichproben¹⁵ korrekt klassifizieren. Zusätzliche LOD-Werte (LOD_SCORE_TUMOR_NORMAL, LOD_SCORE_NORMAL_TUMOR) werden berechnet, wobei ein möglicher Verlust der Heterozygotie in der Tumorprobe für eine der beiden Proben berücksichtigt wird (in einer Probe als homozygot erkannt).

Einfluss von Eingabeparametern und Schwellenwerten auf Match/Mismatch-Raten
Die Bewertung dieses Workflows hob drei entscheidende Aspekte hervor, die seine Leistung und Genauigkeit beeinflussen. Erstens erwies sich die Auswahl der von der Haplotyp-Karte abgedeckten genomischen Regionen als entscheidender Schritt. Die Wahl dieser Regionen beeinflusst direkt die Diskriminierungskraft des Matching-Prozesses. Zweitens beeinflusste die Kombination aus Lese-Ausrichtungsstrategien und den spezifischen Haplotypkarten, die für die Fingerabdruckextraktion verwendet werden, die Endanalyseergebnisse erheblich. Variationen in diesen Upstream-Verarbeitungsschritten können subtile Verzerrungen verursachen, die auf die Matching-Werte übertragen werden (Abbildung 4A–B). Drittens war eine sorgfältige Bewertung und Auswahl der Schwellenwerte zur Bestimmung einer Stichprobenübereinstimmung unerlässlich. Optimale Schwellenwerte können je nach spezifischer Datenmodalität (z. B. Whole-Exome-Sequenzierung vs. Whole-Transcriptom-Sequenzierung) und den bewerteten genomischen Regionen erheblich variieren. Verschiedene Schwellenwerte können die Strenge des Ansatzes anpassen (hohe Falsch-Positiv-Rate vs. hohe Falsch-Negativ-Rate) (Abbildung 4C). Um dies für eine große Kohorte klinischer Stichproben zu adressieren, wurde die Methode angepasst, um sowohl permissive als auch strenge Stichproben-Matching-Score-Kombinationen basierend auf der Kombination der verwendeten LOD-Scores und des Vergleichers zu definieren. Ein erster Schwellenwert (I) wurde erreicht, indem jeder positive Wert über die drei LOD-Werte (LOD_SCORE, LOD_SCORE_TUMOR_NORMAL, LOD_SCORE_NORMAL_TUMOR betrachtet wurde). Durch die Einbeziehung von Informationen zu TUMOR_NORMAL- und NORMAL_TUMOR-Scores können die Auswirkungen des Verlusts der Heterozygotie, der durch Änderungen der Kopienzahl von Krebsproben auftritt, gemildert werden. Umgekehrt wurde eine strengere Schwelle für Fehlanpassungen (II) umgesetzt, indem zwei alternative Filterkriterien angewendet wurden, die darauf zugeschnitten sind, Fehlalarme zu reduzieren: (a) Kategorisierung nur als Match, wenn LOD_SCORE positiv ist, b) Kategorisierung als Match, wenn LOD_SCORE für eine gegebene Stichprobe höher ist als der maximale Wert der anderen paarweisen LOD_SCOREs unter den Stichproben, die nicht übereinstimmen wird (basierend auf dokumentiertem Herkunftspatienten), Auch wenn der LOD_SCORE selbst negativ ist.

In dieser Anwendung wurde zur Erzeugung einer permissiven Schwelle jedes Stichprobenpaar, das durch eines der oben genannten Kriterien (I, IIa, IIb) als Übereinstimmung eingestuft wurde, als Übereinstimmung eingestuft. Dies bot ein hohes Vertrauen in alle identifizierten Mismatches, allerdings auf Kosten der Tatsache, dass einige potenzielle echte Mismatches als Matches (d. h. falsch negative) eingestuft wurden. Ein Vergleich der permissiven Schwelle mit strengeren Schwellenwerten zeigte eine Verschiebung des Prozentsatzes der als Mismatches klassifizierten Paare. Der Unterschied zwischen den Ansätzen lag in allen analysierten Studien zwischen 3,9 % (jeder der drei LOD-Werte positiv (I)), 13,3 % (LOD_SCORE muss positiv sein (IIa)), 9,2 % (LOD_SCORE im Vergleich zu Stichproben, die nicht passenden Paare (IIb)) und 3,6 % (unter Berücksichtigung eines der oben genannten Punkte, um eine Übereinstimmung zu bestimmen) (Abbildung 4C).

Einfluss der Abdeckung der genomischen Region
Der Unterschied zwischen negativen und positiven LOD-Werten für abgestimmte und nicht übereinstimmte Proben ist am höchsten, wenn eine große Bandbreite genomischer Regionen abgedeckt wird (Wholee Genome Sequencing (WGS) oder Vergleich von WGS-Proben mit anderen Modalitäten), was die Schwellenwertselektion erleichtert (Abbildung 5A). Bei Whole-Exom-Sequenzierungen und RNA-Sequenzierungsvergleichen liegen LOD-Scores näher an null, wobei Schwellenwerte die Ergebnisse beeinflussen, was die Bedeutung der Bewertung der Strenge der Schwellenwerte für Modalitäten mit geringerer genomischer Abdeckung unterstreicht. Eine Verteilung der Ergebnisse aus bekannten gepaarten Stichproben mit positiven LOD-Werten ist in Abbildung 5B dargestellt. Javed et al. (2020) haben gezeigt, dass bereits 0,02 % Genomüberlappung ausreichen, um bei Verwendung von Linkage-Disequilibrium-Blöcken¹⁵ zwischen gematchten und nicht gematchten Proben zu unterscheiden.

Validierung
Der Ansatz wurde auf weiteren Brustkrebs-, Kolorektal- und Lungenkrebs-Whole-Exom-Sequenzierungs- (WES) und RNA-Sequenzierungsdatensätzen validiert, für die erwartet wurde, dass ein bekannter Probensatz von denselben Individuen stammt (Abbildung 6A). Paare von Stichproben desselben Individuums zeigten eine 100%ige Übereinstimmung (Abbildung 6B), während weitere Vergleiche mit anderen Stichproben, die von verschiedenen Personen stammen, eine 100%ige Fehlanpassungsrate zeigten. Weder Fehlalarme noch Falsch-Negative wurden in diesen Datensätzen beobachtet.

Zusammenfassend ermöglicht die Implementierung des Qualitätskontroll-Workflows den zwischenmenschlichen Vergleich von Paaren von Next-Generation-Sequenzierungsproben, indem ein standardisierter, reproduzierbarer Ansatz bereitgestellt wird. Die resultierenden LOD-Score-Schwellenwerte führen zu niedrigen Falsch-Positiv- und Falsch-Negativ-Raten für Proben mit großer regionaler Genomüberlappung, und zusätzliche Schwellenoptimierung kann für Proben mit geringer Sequenzierungstiefe oder mit wenig genomischer Überschneidung angewendet werden.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Auftretens von Probentauschen und Fehlkennzeichnungen. (A) Stichprobentausch von jeweils einer Probe zwischen zwei Personen. (B) Darstellung der Probenverarbeitungsschritte von der Biopsieextraktion bis zur Analyse der Sequenzierungsdaten. Erstellt in BioRender. Voith von Voithenberg, L. (2026) https://BioRender.com/xhbp178. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Darstellung der Benutzeroberfläche für Eingabedateien und Parameter, die für die Ausführung des Qualitätskontroll-Workflows zur Sample-Matching in CWL erforderlich sind. Grafische Benutzeroberfläche für Datei- und Parametereingabe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Ergebnisse aus dem Stichproben-Matching-Workflow. Verteilung der LOD-Scores für eine beispielhafte Menge von DNA-Sequenzierungsproben (Ganzgenom- und Ganz-Exom-Sequenzierung) (links), für einen Vergleich zwischen DNA-Sequenzierung und RNA-Sequenzierung (Mitte), um zu zeigen, wie sehr wenige unpassende Proben sich im Vergleich zur Verteilung der abgestimmten Proben verhalten, und für eine beispielhaft größere Kohorte von RNA-Sequenzierungspaaren (rechts) mit Daten, die von verschiedenen Individuen stammen (Mismatches), hellrot) und von derselben Person (Streichhölzer, hellgrün). Abkürzungen; LOD = Log Odds Ratio. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Beispielhafte Unterschiede im LOD-Wert beobachtet. (A) bei Kombination verschiedener Sequenzausrichtungsansätze und Haplotyp-Karten für eine Menge bekannter nicht übereinanderstimmender und abgestimmter Proben sowie (B) für die Bewertung durch Integration von Tumor- und Normalinformationen. (C) Das Auftreten der Anzahl der Stichprobenübereinstimmungen und Fehlanpassungen, die durch Schwellenwerte unterschiedlicher Strenge definiert sind. Abkürzungen; LOD = Log Odds Ratio. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Beispielhafte Verteilung von LOD-Scores zum Vergleich verschiedener Next-Generation-Sequenzierungsmodalitäten. (A) LOD-Score-Verteilung der erwarteten Fehl- und Matchingproben zwischen DNA-Sequenzierung aus Blut und Tumorgewebe sowie RNA-Sequenzierung aus Tumorgewebe. (B) LOD-Score-Verteilung abgestimmter Stichproben für Kombinationen verschiedener Modalitäten. Abkürzungen; LOD = Log Odds Ratio. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Verteilung der LOD-Scores für die Analyse eines BRUSTKREBS-WES- und RNA-Sequenzierungsdatensatzes. Der deidentifizierte Brustkrebsdatensatz stammt von Caris Life Sciences und basiert auf umfassender Tumorprofilierung. (A) Logarithmisches Auftreten von LOD-Werten für Vergleiche zwischen Tumor-WES-Proben (links) und zwischen RNA-Sequenzierungsproben (rechts). (B) LOD-Score-Verteilungen für erwartete Probenpaare derselben Individuen (WES-obere Reihe, RNA-sequenzierende untere Reihe). Abkürzungen; LOD = Log Odds Ratio. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

LEFT_GROUP_VALUE	RIGHT_GROUP_VALUE	ERGEBNIS	LOD_SCORE	LOD_SCORE_ TUMOR_NORMAL	LOD_SCORE_ NORMAL_TUMOR
Beispiel 1	Beispiel 1	EXPECTED_MATCH	38.119266	29.649485	29.649485
Beispiel 1	Beispiel 2	EXPECTED_MISMATCH	-2.552644	-4.57422	5.283698
Beispiel 2	Beispiel 1	EXPECTED_MISMATCH	-2.552644	5.283698	-4.57422
Beispiel 2	Beispiel 2	EXPECTED_MATCH	12.328737	8.796457	8.796457

Tabelle 1: Beispielhafte Ergebnisse durch die Durchführung von Crosscheck-Fingerabdrücken. Die Tabelle zeigt beispielhafte Ergebnisse eines Stichprobenpaares, verglichen mit dem Stichprobenabgleich-Ansatz.

Diskussion

Es gibt verschiedene Methoden zur Identifikation von Stichprobenübereinstimmungen: 1,4,13,14,15,16. Hier wurde die Implementierung eines Ansatzes mit SNP-Verknüpfungs-Ungleichgewichtsblöcken, die über mehrere Omics-Modalitäten mit niedrigen Falsch-Positiv- und Falsch-Negativ-Raten anwandbar ist,^{beschrieben 15}. Die Implementierung erfolgte in CWL, um eine Hochdurchsatzverarbeitung über Datensätze innerhalb einer standardisierten Workflow-Umgebung zu ermöglichen. Die Workflow-Bewertung identifizierte drei zentrale Aspekte, die bei der Anwendung des Ansatzes zu berücksichtigen sind. Ein wichtiger Schritt im Prozess ist die Auswahl der genomischen Regionen, die von der Haplotyp-Karte abgedeckt werden. Zusätzlich kann die Kombination der Leseausrichtung mit der Fingerabdruckextraktion unter Verwendung verschiedener Haplotyp-Karten die Analyseergebnisse beeinflussen. Darüber hinaus ist die sorgfältige Bewertung und Auswahl von Schwellenwerten, die von der Datenmodalität und den abgedeckten Regionen abhängen können, unerlässlich und kann zu mehr oder weniger permissiver Stichprobenabstimmung führen.

Zur Bewertung großer klinischer Probenmengen wurde die Methode angepasst, um Kombinationen von Schwellenwerten für permissive und strenge Stichprobenabgleichswerte zu definieren. Die Methode wurde angepasst, um einen permissiven Schwellenwert einzuschließen, indem ein kombinierter Wert aus einem der LOD-Werte (LOD_SCORE, LOD_SCORE_TUMOR_NORMAL, LOD_SCORE_NORMAL_TUMOR) oder zwei alternativen Filterkriterien bestand, was zu einer strengeren Auswahl der Proben führte. Die Anwendbarkeit des Ansatzes ist auf Proben beschränkt, für die SNP-Informationen über verschiedene genomische Regionen verfügbar sind, z. B. Next-Gen-Sequenzierungsdaten. Außerdem sind mindestens Paare von Proben desselben Individuums für vergleichende Analyse und Stichprobenabgleich erforderlich. Zusätzliche klinische Informationen, wie etwa durch gezielte Methoden gewonnene Mutationsstatus oder Patientenmetadaten wie Geschlecht, können als weitere Belege für eine Übereinstimmung zwischen hochdimensionalen molekularen Daten und patientenbezogenen klinischen Daten dienen.

Die Implementierung dieses Ansatzes in einer Workflow-Management-Umgebung mit Möglichkeit paralleler Datenspeicherung ermöglicht eine Hochdurchsatz-Qualitätskontrollanalyse von Proben auf interindividuelle Kontaminationen. Dadurch erhöht er die Zugänglichkeit und Reproduzierbarkeit des Ansatzes über Datensätze und Stichproben hinweg. Die Anpassungsfähigkeit der Schwellenwerte in diesem Ansatz ermöglicht die Verarbeitung und Analyse von Krebsproben mit niedriger und hoher Tumormutationslast sowie Veränderungen der Kopienzahl, die zum Verlust der Heterozygotie führen und somit die Genotypwahrscheinlichkeit beeinflussen können.

Die Methode findet breite Anwendbarkeit auf jede Art von Projekt, die Next-Generation-Sequenzierungsdaten von Menschen umfassen und für die mehr als eine einzelne Stichprobe pro Person verfügbar ist. Dies kann von personalisierten Ansätzen für einzelne Patienten bis hin zu großen klinischen Studien reichen, die hochdimensionale molekulare Daten für verschiedene Krankheitsgebiete sammeln. Sie kann mit Qualitätskontroll-Workflows, der Untersuchung von Artenkreuzkontaminationen und Ansätzen kombiniert werden, um hochdimensionale molekulare Datensätze mit klinischen Informationen zu verknüpfen, um sie in jede Qualitätskontrollpipeline für Next-Generation-Sequenzierungsdaten zu integrieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
FastQC	v0.11.9	SCR_014583
MultiQC	v1.8	SCR_014982
BWA-MEM	v0.7.17	SCR_010910
STAR	v2.7.9a	SCR_004463
SAMtools	V1.12, V1.19.2	SCR_005227
-  faidx
-  Sortieren
-  Index
- Addreplacerg
Picard	V2.25.5, v3.0.0	SCR_006525
- CreateSequenceDictionary
- MarkDuplicates
- build_fingerprint_maps
- ExtractFingerprints
- CrosscheckFingerprints
CWL	v1.2	SCR_015528
R	R v4.3.1	SCR_001905
DPLYR v1.1.4