In-vitro Rekonstitution der bakteriellen Ubiquitination und VCP/p97-vermittelte Elimination

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Ubiquitinierung von Streptococcus pneumoniae mit Säugetierzelllysat oder einem reinen Ubiquitin-Enzymkomplex, gefolgt von einer Behandlung mit gereinigtem VCP/p97-UFD1-NPLOC4-Proteinkomplex, um dessen bakteriolytische Aktivität zu bewerten, was die Untersuchung ubiquitinabhängiger Immuneffektoren ermöglicht.

Zusammenfassung

Ubiquitination ist eine vielseitige posttranslationale Modifikation, die eine entscheidende Rolle für die zytosolische Immunität spielt. Nach der Invasion der Wirtszellen werden pathogene Bakterien zunächst in einem Endosom eingeschlossen, aus dem sie sich lösen und ins Zytosol entweichen, um den lysosomalen Abbau zu vermeiden. Einmal im Zytosol, werden die Bakterien von Wirts-E3-Ligasen schnell mit Ubiquitin-Ketten markiert und markieren sie über mehrere Effektorwege, darunter Autophagie und das Proteasom. Um den Beitrag einzelner Wege zur bakteriellen Eliminierung abzugrenzen, bietet die in-vitro-Rekonstitution einen kontrollierten und eindeutigen Ansatz. Hier präsentieren wir, unter Verwendung von Streptococcus pneumoniae (SPN) als Modell-Bakterienpathogen, ein detailliertes Protokoll für seine Ubiquitinierung mit Säugetierzelllysaten oder einem reinen Ubiquitin-Enzym-Komplex, gefolgt von einer Behandlung mit gereinigtem VCP/p97-UFD1-NPLOC4-Komplex, um seine bakteriolytische Aktivität unabhängig von anderen zellulären Faktoren zu bewerten. Insgesamt bietet dieses Verfahren das Potenzial, die Funktion immungelenkter Ubiquitin-Ligasen und -Effektoren in einem zellfreien Kontext zu beleuchten, wo die Dissektion solcher Mechanismen in intakten Zellen schwierig sein kann.

Einleitung

Ubiquitin (Ub) ist ein kleines 8,6 kDa-Protein, das Zielsubstrate modifiziert, indem es kovalent an sie an seinem C-terminalen Glycin bindet und so eine Isopeptidbindung mit der ε-Aminogruppe der Lysinreste in einem Prozess namens Ubiquitination¹ schafft. Dieses Phänomen wird von einer Reihe orchestrierter Schritte gesteuert, die ein E1-Ubiquitin-aktivierendes Enzym, ein E2-Ubiquitin-konjugierendes Enzym und eine E3-Ubiquitin-Ligase ^1,2,3 umfassen. Ub kann als Monomer oder als Ketten unterschiedlicher Länge durch seine sieben Lysinreste (Linear/M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48 und K63)⁴ angebunden werden. Diese einzigartigen Ub-Ketten wirken als molekulare Marker für verschiedene zelluläre Funktionen wie proteasomalen Abbau, zellulären Trafficking, DNA-Reparatur und selektive Autophagie³.

Während die kanonische Rolle der Ubiquitination seit langem mit der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase in Verbindung gebracht wird, etwa durch den Abbau fehlgefalteter Proteine über Proteasomen oder die Lenkung spezifischer Ladungen zur selektiven Autophagie ^5,6, ist inzwischen offensichtlich, dass Ubiquitin auch als entscheidender Sensormechanismus des zytosolischen Immunsystems gegen bakterielle Infektionen fungiert. Intrazelluläre Bakterien infiltrieren häufig Wirtszellen, um der Entdeckung durch die extrazelluläre Immunantwort zu entgehen, und vermehren sich in einer geschützten Umgebung ^7,8. Viele Krankheitserreger nutzen sekretorische Systeme und Toxine, um die Vakuolen, die sie transportieren, irreparabel zu schädigen und so die Flucht ins Zytosol zu ermöglichen^, um Nährstoffe^{zu erhalten.} Einmal im Zytosol, werden diese Bakterien mit Polyubiquitin-Ketten durch spezifische E3-Ligasen dekoriert, die als molekulares "Todesmark" fungieren und sie zur selektiven Eliminierung lenken. Zum Beispiel bewirkt die E3-Ligase SMURF1 Mycobacterium tuberculosis, indem sie direkt auf ihrer Oberfläche eine K48-gebundene Polyubiquitination initiiert, was zu ihrem Abbau über das Proteasom¹¹ führt. Parkin sammelt sich in Vakuolen mit Bakterien an und bildet K63-gebundene Ubiquitin-Ketten¹², während ARIH1 und LRSAM1 die Oberflächen von Bakterien mit K48- bzw. K6-Ketten verändern und so das Bakterienwachstum ^13,14 hemmen. Während die Mehrheit der E3-Ligasen hauptsächlich auf Wirtsproteinsubstrate abzielt, zeigen einige Ligasen eine bemerkenswerte Spezifität für mikrobielle Komponenten. RNF213 identifiziert und ubiquitiniert Lipopolysaccharide (LPS), die auf Salmonella enterica serovar (Typhimurium¹⁵) gefunden werden, und der SCF^{FBXO2-Komplex} erkennt bakterielle Glykane in Streptokokken der Gruppe A als Substrat für Ubiquitination¹⁶, was die Xenophagie erleichtert. Der SCF^{FBXW7-Komplex} hingegen erkennt Degrad-Motive innerhalb der Oberflächenproteine von Streptococcus pneumoniae (SPN). Dazu gehören β-Galactosidase A (BgaA) und das Pneumokokkenoberflächenprotein A (PspA), die nach einer Markierung mit K48-gebundenen Polyubiquitin-Ketten mit K48-gebundenem Ub-spezifischen Antikörper bestätigt wurden, vermutlich das proteasomale System anziehen und so eine effektive bakterielle Eliminierung¹⁷ ermöglichen.

Obwohl der Prozess, diese zytosolischen Eindringlinge mit Ubiquitin zu kennzeichnen, gut verstanden ist, bleibt der anschließende Mechanismus, durch den das proteasomale System solch große mikrobielle Entitäten entfernt, zweifelhaft. Neuere Forschungen haben gezeigt, dass die Wirts-AAA+-ATPase, VCP/p97 (valosinhaltiges Protein), eine entscheidende Rolle in diesem Prozess spielt. In Zusammenarbeit mit Kofaktoren wie UFD1 und NPLOC4 kann VCP Bakterien identifizieren, die mit Polyubiquitin markiert sind, und extrahiert ubiquitinierte Proteine physisch aus der bakteriellen Membran, wodurch sie platzen und ihre Eliminierung aus dem zytosolischen Milieu unterstützt werden, ohne auf die proteasomale Maschinerie¹⁸ angewiesen zu sein.

Der Wirtszytosol enthält ein komplexes Netzwerk von Immunwege, die parallel und auf eine sichere Weise funktionieren, um die Entfernung von Krankheitserregern zu gewährleisten. Diese Redundanz ist entscheidend für eine starke Abwehr, erschwert jedoch die Bemühungen, die Rolle einzelner Immunfaktoren^zu identifizieren und zu untersuchen. In diesem Zusammenhang bieten In-vitro-Rekonstitutionssysteme eine nützliche Plattform, um spezifische Signalwege unter kontrollierten Bedingungen zu analysieren. Hier stellen wir ein zellfreies System vor, das den Prozess der Ubiquitination und des Verlusts der Lebensfähigkeit von SPN mit Säugetierzelllysaten oder E1-E2-E3-Ub-Enzymen zusammen mit gereinigten Wirtseffektorkomplexen nachbildet. In diesem zweistufigen Protokoll erleichtern wir zunächst die Konjugation von Polyubiquitin-Ketten auf den Bakterien, gefolgt von der Bewertung ihrer Eliminierung durch VCP/p97 in Verbindung mit UFD1 und NPLOC4. Durch die Rekonstituierung dieses Weges in vitro umgehen wir zelluläre Komplexitäten und untersuchen speziell die Fähigkeit von VCP, den Erreger zu neutralisieren. Diese präzise Einrichtung ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Substraterkennung, der Kettenspezifität, des Wirkungsmodus des Effektors und der wesentlichen Komponenten, die für die Initiierung einer effektiven Reaktion erforderlich sind.

Protokoll

1. Zellkultur und Lysatvorbereitung

1. Tauen Sie die A549-Zellen auf und lassen Sie sie in einer T25-Flasche mit vollständigem DMEM und 10% fetalem Rinderserum (FBS) wachsen. Inkubieren Sie bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung mit 5 %_CO2. Führen Sie die Zellen durch drei Passagen zur Pflege und übertragen Sie dann 2 × 10 bis⁶ Zellen in eine T75-Flasche. Setzen Sie die Kultur fort, bis die Zelldichte 8–10 × 10⁶ Zellen erreicht.
2. Abkratzen Sie die Zellen aus dem T75-Kolben bei 4 °C mit einem Reaktionspuffer, der 200 mM HEPES, 100 mM MgCl₂, 1 M KCl und 5 % Glycerol bei pH 7,4 enthält. Zentrifugieren Sie die abgekratzten Zellen bei 120 × g für 10 Minuten, um sie zu pelletieren, und lassen Sie sie dann im Reaktionspuffer wieder suspendieren, um ein Endvolumen von etwa 0,6 ml in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen zu erreichen.
   HINWEIS: Die gesamte Probe muss in Eis verarbeitet werden.
3. Sonikieren Sie die Zellsuspension mit einer schmalen Sonde (Durchmesserspitze, 2 mm) bei einer Amplitude von 40 μm mit 2 s Ein-/Aus-Impulsen für eine Dauer von 2–2,5 Minuten, wobei die Mischung auf Eis bleibt. Zentrifugiere die sonizierten Proben bei 21.000 × g für 45 Minuten, sammle das resultierende Supernatant und gib 2–3x 50-fachen Proteaseinhibitor-Cocktails hinzu.
   HINWEIS: Entweder verwenden Sie das Lysat sofort für die Ubiquitinationsreaktion am selben Tag oder lassen Sie es mit flüssigem Stickstoff schnell einfrieren und bei -80 °C lagern; Achte jedoch darauf, es maximal innerhalb von 3 Tagen anzuwenden, um eine effektive Uiquitination zu gewährleisten. Die Lysatkonzentration zwischen 2 und 4 mg/mL ist für die Ubiquitination geeignet.

2. Bakterienkultur

1. Ziehe die Bakterien, den Streptococcus pneumoniae (SPN) R6-Stamm (Serotyp II), über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2_{in einem} TY-Medium aus Todd-Hewitt-Brühepulver (3,7 g/100 mL) und Hefeextraktpulver (1,5 g/100 ml) an.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Bakterien zu impfen, wenn das Medium dunkelbraun geworden ist. Streptococcus pneumoniae wird als Biosicherheits-Erreger der Stufe 2 (BSL-2) klassifiziert; Ergreifen Sie Vorsichtsmaßnahmen und befolgen Sie die korrekten BSL-2-Eindämmungsprotokolle, einschließlich der Verwendung eines zertifizierten Biosicherheitsschranks.
2. Am nächsten Tag wird aus der Übernachtkultur in frisches THY-Medium (1:10) bei 37 °C mit 5 % CO2 geimpft_{und der} SPN bis zur optischen Dichte von 600 nm (OD_{600 nm}) bis 0,4 erreicht. Bereiten Sie einen Glycerolfonds mit SPN (900 μL SPN-Kultur und 600 μL Glycerol (50 %) vor und lagern Sie ihn bei -80 °C.
3. Am Tag des Ubiquitinationsexperiments tauen Sie einen neuen Vorrat an SPN von -80 °C auf, inokulieren Sie ihn vollständig in ein 5 mL TY-Medium und lassen Sie ihn wachsen, bis die OD_{600 nm} 0,4 erreicht.
   HINWEIS: Die Bakterienkultur wurde auf einen OD_{von 600 nm} von 0,4 gewachsen, was etwa 10⁸ SPN-Zellen pro ml entspricht. Diese Korrelation wurde durch die Aufzählung koloniebildender Einheiten (CFUs) hergestellt, die durch serielle Verdünnung der Kultur in 1x PBS zur Verringerung der bakteriellen Zellkonzentration und durch abzählbare Kolonien bestimmt wurden, sowie durch Spotting auf BHI-Agarplatten, einem stärker angereicherten Medium als THY.

3. In-vitro Ubiquitinations-Assay aus Säugetierlysat

1. Nehmen Sie etwa 10 SPN-Zellen mit^{7 Punkten} und waschen Sie sie mindestens dreimal gründlich mit dem Reaktionspuffer (200 mM HEPES, 100 mM MgCl₂, 1 M KCl und 5 % Glycerol bei pH 7,4), indem Sie die Bakterien im folgenden Puffer wieder suspendieren, gefolgt von Zentrifugation bei 21.000 × g für 5 Minuten und schließlich durch Zentrifugation bei 21.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur abpelletieren.
2. Resuspendieren Sie das SPN-Pellet mit A549-Säugetierzelllysat sowie gereinigtem Ubiquitin (350 μM) und 1 mM ATP und inkubieren Sie 1–2 Stunden bei 27 °C.
   HINWEIS: Vermeiden Sie das Einfrieren und Auftauen des Säugetierzelllysats. Am besten ist es, wenn das Lysat am selben Tag wie der Ubiquitinationstest hergestellt wird.
3. Nach der Inkubation wird die Bakterie einmal mit einem Reaktionspuffer mit 1 M Harnstoff gewaschen, gefolgt von zwei Waschen mit nur Reaktionspuffer, gefolgt von der Fixierung mit 1 % Paraformaldehyd (PFA). Nach der Fixierung inkubieren Sie die Zellen mit PBS, das Glycin (1 mg/mL) enthält, für 15 Minuten, gefolgt von zwei 1-fachen PBS-Waschungen.
   HINWEIS: Eine 1 M Harnstoffspülung wird verwendet, um nichtkovalente Wechselwirkungen leicht zu stören und sicherzustellen, dass nur kovalent ubiquitinierte Bakterien übrig bleiben. Anschließend ist es wichtig, gründlich mit einem Reaktionspuffer zu waschen, um Restharnstoff zu entfernen, da dessen Anwesenheit den In-vitro-Killing-Test beeinträchtigen kann.
   Als Negativkontrolle bereiten Sie die gesamte Reaktionsmischung vor und inkubieren Sie sie mit Bakterien auf Eis, um die enzymatische Aktivität zu hemmen. Direkt nach der Inkubation spülen Sie die Probe ab und fixieren Sie sie dann mit 1 % PFA, um den Zustand der Reaktion zu erhalten.

4. In-vitro Ubiquitinationstest aus dem E1-E2-E3-Enzymkomplex

1. Bereite zunächst eine Reaktionsmischung vor, bestehend aus Ubiquitin (350 μM), UBE1 (400–800 nM), UbE2C (3–5 μM), Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7-Komplex (500 nM) und 2 mM ATP im Reaktionspuffer (200 mM HEPES, 100 mM MgCl₂, 1 M KCl und 5 % Glycerol bei pH 7,4), um das Gesamtreaktionsvolumen von 100–150 μL zu erreichen.
   HINWEIS: Alle Enzyme bei -80 °C aufbewahren. Um den Verlust von Aktivitäten durch mehrere Freeze-Thau-Zyklen zu vermeiden, erstellen Sie kleine Aliquots und verwenden Sie für jede Ubiquitinationsreaktion neue.
2. Die Bakterien (10⁷ CFU) in dieser Biaquitin-enzymhaltigen Reaktionsmischung neu suspendieren und 2 Stunden bei 27 °C inkubieren. Anschließend werden die Bakterien mindestens 3x mit einem Reaktionspuffer mit 1 M Harnstoff gewaschen, gefolgt von der Fixierung mit 1 % Paraformaldehyd (PFA). Nach der Fixierung inkubieren Sie die Zellen mit PBS, das Glycin (1 mg/mL) enthält, für 15 Minuten, gefolgt von zwei 1-fachen PBS-Waschungen.
   HINWEIS: Bei übermäßigem Zellverlust kann die Anzahl der Waschgänge reduziert werden.

5. Visualisierung ubiquitinierter Bakterien

1. Nachdem die Probe mit 1 % PFA fixiert wurde, inkubiert man sie 1 Stunde lang in 3 % BSA bei 27 °C und führt dann zwei Waschen mit 1x PBS durch.
2. Suspendieren Sie die ubiquitinierten Bakterien mit einem primären Antikörper in Konzentrationen, die höher sind als die, die typischerweise in Immunfluoreszenztests verwendet werden. Verwenden Sie einen bakterienspezifischen Antikörper zusammen mit einem Anti-Ubiquitin-Antikörper (1:100), verdünnt in PBS mit 1 % BSA, zur Färbung bei 27 °C für 1 Stunde.
   HINWEIS: Für eine optimale Antikörperfärbung verwenden Sie ein Zentrifugenröhrchen mit niedriger proteinbindender Wirkung, um den Antikörperverlust zu minimieren, oder eine höhere Antikörperkonzentration, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
3. Anschließend werden die Bakterien zweimal mit 1x PBS gewaschen und anschließend mit dem entsprechenden sekundären Antikörper, der mit Alexa Fluor 488 bzw. 555 konjugiert ist, für 1 Stunde bei 27 °C wieder suspendiert.
4. Tragen Sie etwa 10–20 μL der markierten Bakterienprobe durch Tropfenguss auf und mischen Sie 5-10 μL Montagemedium mit oder ohne DAPI ein, legen Sie dann einen Deckdeckel darüber und verwenden Sie Seidenpapier, um überschüssige Flüssigkeit aufzusaugen. Schließlich wird die Probe am selben Tag unter einem Konfokalmikroskop betrachtet.

6. Proteinexpression und -reinigung

1. Für die Expression von Wildtyp-VCP/p97 transformiert das VCP-enthaltende pET28a-Plasmid mittels eines standardisierten E.-coli-Transformationsprotokolls ²⁰ in den E. coli BL21-DE3-Stamm. Inkubationskolonien entstanden nach der Umwandlung über Nacht in Luria-Brühe (LB) bei 37 °C. Am folgenden Tag inokulieren Sie eine 1:50-Kultur in eine gut belüftete Flasche mit LB und lassen Sie sie wachsen, bis der OD_{600 nm} 0,7-0,8 erreicht. Fügen Sie der Kultur 200 μM IPTG hinzu und inkubieren Sie 5 Stunden bei 37 °C mit Schütteln bei 180 U/min; Bestätigen Sie die Proteinexpression mit einer SDS-PAGE.
   HINWEIS: Für den gesamten Schritt des bakteriellen Wachstums und der Expression wurde Kanamycin (50 μg/mL) als Selektionsdruck verwendet.
2. Für die Expression von Wildtyp-UFD1 transformiert das UFD1-enthaltende pET41b-Plasmid in den E. coli BL21-Rosetta-Stamm mittels des Standard-E.-coli-Transformationsprotokolls ²⁰. Inkubationskolonien entstanden nach der Umwandlung über Nacht in Luria-Brühe (LB) bei 37 °C. Am folgenden Tag inokulieren Sie eine 1:50-Kultur in eine gut belüftete Flasche mit LB und lassen Sie sie wachsen, bis der OD_{600 nm} 0,7-0,8 erreicht. Fügen Sie der Kultur 1 mM IPTG hinzu und inkubieren Sie 5 Stunden bei 37 °C mit Schütteln bei 180 U/min; Bestätigen Sie die Proteinexpression mit einer SDS-PAGE.
3. Um Wildtyp-NPLOC4 auszudrücken, wird das NPLOC4-enthaltende pET41b-Plasmid in den E. coli BL21-Rosetta-Stamm mit der Standard-E.-coli-Transformationsmethode ²⁰ eingeführt. Inkubieren Sie die Kolonien, die durch die Umwandlung in Luria-Brühe (LB) entstehen, über Nacht bei 37 °C. Am nächsten Tag wird eine 1:50-Verdünnung der Kultur in eine gut belüftete Flasche mit LB übertragen und wachsen, bis die optische Dichte bei OD_{600 nm} 0,7–0,8 erreicht. Danach wird 1 mM IPTG zur Kultur hinzugefügt und die Inkubation 16 Stunden lang bei 18 °C bei 180 °C beim Schütteln bei 180 U/min fortgesetzt; Verifizieren Sie die Proteinexpression durch eine SDS-PAGE-Analyse.
   HINWEIS: Für den gesamten Schritt des bakteriellen Wachstums und der Expression im E. coli BL21-Rosetta-Stamm wurden Kanamycin (50 μg/mL) und Chloramphenicol (20 μg/mL) als Selektionsdruck verwendet. Sequenzen von pET28a-p97 und pET41b-NPLOC4 sind in Supplemental File 1 bereitgestellt.
4. Nach der Proteinexpression zentrifugieren Sie die Bakterienzellen bei 21.000 × g für 10 Minuten und suspendieren Sie das Pellet in einem Lysepuffer mit 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-Mercapttoethanol, 1 mM PMSF, 5 % Glycerol, pH 8.
5. Sonikieren Sie die Zellen 1 Stunde lang mit einer schmalen Sonde (Spitzendurchmesser, 6 mm) bei einer Amplitude von 50 μm und mit einem 20 Sekunden Ein/Aus-Puls bei 4 °C. Pellets mit 15.000 ×g für 1 Stunde mit 15.000 g und das Supernatant einsammeln.
   HINWEIS: Die vollständige Sonikation wurde 1 Stunde lang durchgeführt (30 Minuten AN und 30 Minuten AUS als 20-S-Pulse), und der Prozess wurde fortgesetzt, bis die trübe Zellsuspension transluzent zu transparent wurde. Eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation ist erforderlich, um sicherzustellen, dass Zellreste pelletiert bleiben und sich beim Einladen des Lysats auf die Proteinreinigungssäule nicht lösen.
6. Lassen Sie das Überstandsmittel durch einen 0,4 μm-Filter und laden Sie es auf die mit Ni-NTA-Perlen gefüllte Säule zur Affinitätsreinigung, vorausgeglichen mit dem Reinigungspuffer (50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-Mercapptoethanol, 5 % Glycerol, pH 8).
7. Spülen Sie die proteinreiche Säule mit einem Waschpuffer, der 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-Mercapptoethanol, 5 % Glycerol, pH 8 und 30–60 mM Imidazol von etwa 400 ml enthält, und elutieren Sie das Protein anschließend mit einem Elutionspuffer, der 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-Mercapptoethanol, 5 % Glycerol, pH 8 und 250 mM Imidazol enthält.
   HINWEIS: Die Konzentration von Imidazol und das Volumen des Waschs können je nach spezifischem Protein variieren. Zur Bewertung der Reinheit sollte SDS-PAGE durchgeführt werden. Es ist wichtig, die Säule gründlich zu reinigen, bis das Eluent eine negative Reaktion mit Bradford-Reagenz zeigt. Der eluierte Anteil zeigt ein markantes, konzentriertes Band des Zielproteins, das überwiegend die Probe darstellen sollte, mit nur geringen, wenn überhaupt, Spuren anderer Proteine.
8. Sammeln Sie verschiedene Fraktionen, analysieren Sie sie mit SDS PAGE, um zu identifizieren, welche Fraktionen die reinen Proteine enthalten, und führen Sie anschließend einen Pufferaustausch in den Reaktionspuffer durch (200 mM HEPES, 100 mM MgCl₂, 1 M KCl und 5 % Glycerol bei pH 7,4) unter Verwendung einer PD-10-Säule.
   HINWEIS: Messen Sie die Proteinkonzentration mit Bradford-Reagenz (Coomassie Brilliant Blue G-250). Alle Proteine sollten in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren und bei -80 °C gelagert werden.

7. In-vitro bakterielle Tötungsanalyse

1. Kombinieren Sie 6 μM VCP/p97 mit jeweils 1 μM von NPLOC4 und UFD1 und füllen Sie das Volumen mit Reaktionspuffer auf etwa 90 μL. Lassen Sie dieses Reaktionsgemisch 2 Stunden auf Eis inkubieren.
2. Fügen Sie 1–2 mM ATP in das Reaktionsgemisch ein, das p97-UFD1-NPLOC4 enthält, und kombiniert es dann mit dem ubiquitinierten SPN (10^{7 Zellen} ) für eine Dauer von 2 Stunden bei 37 °C.
3. Um die bakterielle Lebensfähigkeit zu bewerten, wird unmittelbar nach der Behandlung ein 1-μl-Aliquot der Reaktionsmischung genommen, eine serielle Verdünnung (1:1, 1:10, 1:100 und 1:1000) durchgeführt und 10–2 μL jeder Verdünnung auf Brain Heart Infusion (BHI)-Agarplatten eingesetzt. Wiederholen Sie dieses Verfahren mit einem 1 μL Aliquot aus der Reaktion nach 2 Stunden Inkubation.
   HINWEIS: Setze alle Verdünnungen auf, um bessere Ergebnisse zu erzielen.
4. Bewerten Sie die koloniebildenden Einheiten (CFUs) zwischen den Zeitpunkten 0 und 2 Stunden. Berechnen Sie die bakterielle Lebensfähigkeit (%), indem Sie die CFU-Anzahl bei 2 Stunden durch die CFU-Anzahl bei 0 h teilen und das Ergebnis dann mit 100 multiplizieren.
   HINWEIS: Um zuverlässigere Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie wärmentnaturierte VCP/p97, VCP/p97 ohne den UFD1-NPLOC4-Kofaktorkomplex oder eine ATPase-defizitende Variante von VCP/p97 als Negativkontrolle.

Ergebnisse

Unser Protokoll beschreibt die Nutzung von Säugetierzellen A549, um ein Zelllysat zu erzeugen, das reich an den notwendigen Komponenten für den Beginn eines Ubiquitinationsprozesses ist (Abbildung 1A). Dieses Lysat, egal ob konzentriert oder durch gereinigte Komponenten wie UBE1 (das E1-Ubiquitin-aktivierende Enzym), UbE2C (ein E2-Ubiquitin-konjugierendes Enzym) und den Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7-Komplex (die E3-Ubiquitin-Ligase) ersetzt wird, wird mit gereinigtem ...

Diskussion

Obwohl das hier beschriebene In-vitro-Rekonstitutionssystem einen robusten Rahmen bietet, um die molekularen Feinheiten der bakteriellen Ubiquitination und -Eliminierung zu erforschen, müssen mehrere wesentliche Einschränkungen berücksichtigt werden. Die Abhängigkeit von supraphysiologischen Konzentrationen gereinigter Proteine, darunter die Ubiquitinationsmaschinerie (E1, E2, E3-Ligasen, Ubiquitin) und den Wirtseffektorkomplex (VCP/p97, UFD1, NPLOC4), bietet entscheidende mech...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
50-facher Protease-Inhibitor-Cocktail	Promega	G6521
6x-His-Ubiquitin	UBPBio	E1100
A549-Zelllinie	ATCC	ATCC CCL-185
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21202
Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-31572
Anti-Ubiquitin-Antikörper	Enzo	BML-PW8810-0100
Anti-Ubiquitin K48-spezifischer, Klon-Apu2-Antikörper	Sigma Aldrich	ZRB2150
ATP	Sigma Aldrich	A6419
BHI	HiMedia	M210
DMEM (hoher Blutzuckerspiegel)	HiMedia	AL251
FBS	Gibco (US-Herkunft)	38220090
Glycerol	PureSynth	PSR37325
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G
KCl	Sigma Aldrich	P3911
MgCl2	Sigma Aldrich	TC006
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	E6148
pET28a-p97-Plasmid	Unser Labor		Plasmid auf Anfrage verfügbar
pET41b-NPLOC4-Plasmid	Unser Labor		Plasmid auf Anfrage verfügbar
pET41b-UFD1-Plasmid	Addgene	Plasmid #117107
rbx1-skp1-cul1-fbxw7	Sigma Aldrich	23-030
Streptococcus pneumoniae R6-Stamm	ATCC	ATCC BAA-255	Risikogruppe -2 Erreger, wird in der BSL-2-Einrichtung behandelt
Todd Hewitt Brühepulver	HiMedia	M313
UBE1	UBPBio	B1100
UbE2C	UBPBio	C1300
Harnstoff	HiMedia	MB032
Hefeextraktpulver&nbl;	HiMedia	RM027