Method Article

Phenolrot-Faden-basierte Probenahme für ungezielte Tränenflüssigkeitslipidomik in der Biomarker-Entdeckung

DOI:

10.3791/69474

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt ein einzigartiges klinisches Protokoll zur Entnahme menschlicher Tränenflüssigkeitsproben mittels roter Phenolfäden und auf Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-basierendem Workflow, um das Rippenlipidom-Profil zu entdecken. Die einfache Methyl-tert-Butylether-(MTBE)/methanol-biphasische Trennmethode ermöglicht eine schnelle Tränenlipidextraktion mit hoher Rückgewinnung für die Entdeckung von Tränenbiomarkern.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tränenlipide sind entscheidend für die Stabilität des Tränenfilms und die Gesundheit der Augenoberfläche. Veränderungen der Tränenzusammensetzung könnten mit okulären und systemischen Erkrankungen wie Meibom-Drüsenfunktionsstörungen und Dyslipidämie in Verbindung stehen. Das Profilieren von Tränenlipiden kann bei der Entdeckung von Biomarkern zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten beitragen. Gängige Tränenprobennahmemethoden weisen jedoch deutliche Einschränkungen auf: Schirmer-Streifen verursachen häufig Augenreizungen und Unbehagen aufgrund ihrer großen Kontaktfläche mit der Augenoberfläche, während die Entnahme von Mikrokapillarröhren aufgrund der Variabilität des Bedieners zu einer geringen Reproduzierbarkeit führen kann, insbesondere wenn sie von verschiedenen Personen durchgeführt wird. Diese Einschränkungen könnten die Genauigkeit und Konsistenz lipidomischer Daten beeinträchtigen. Diese Studie führt eine minimalinvasive Phenol-Rotfaden (PRT)-basierte Probenahme ein, die für Tränenlipidomik optimiert ist. Die dünne Struktur von PRT minimiert das Risiko von Augenreizungen und ermöglicht eine schnelle und sanfte Tränensammlung. Diese benutzerfreundliche und einfach durchzuführende Methode eignet sich für Probanden mit reduziertem Tränenvolumen oder geringerer Toleranz gegenüber Fremdkörperempfindung und ermöglicht eine reproduzierbare Probenentnahme durch die Verringerung der operatorabhängigen Variabilität. Die von PRT gesammelten Tränenlipide wurden mit einem optimierten Methanol/Methyl-Tert-Butylether (MTBE)-Phasentrennprotokoll extrahiert und mit hochauflösendem LC-Orbitrap-IQX MS/MS und der LipidSearch-Software analysiert. Der Arbeitsablauf identifizierte mehr als 700 einzigartige Tränenlipidspezies, die jeweils durch spezifische, fettsäurebasierte Produktionen gekennzeichnet sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass PRT-basierte Probenahmen eine robuste Lipiderholung für die Tränenlipidomanalyse ermöglichen. Dieser minimalinvasive und reproduzierbare Ansatz bietet eine praktische Grundlage für klinische und experimentelle Tränenlipidforschung. Letztlich könnte dies auch die Entdeckung und Überwachung von Biomarkern erleichtern.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tränenfilm ist die äußerste Barriere, die die Augenoberfläche vor Krankheitserregern schützt und die okuläre Homöostaseaufrechterhält 1,2, während die Lipidschicht im Tränenfilm die Schlüsselkomponente zur Verhinderung der Tränenverdunstung und zur Aufrechterhaltung der Tränenfilmstabilität 3,4 ist. Die Dysregulation der Tränenlipidzusammensetzung wurde mit verschiedenen Augenerkrankungen in Verbindung gebracht, darunter trockene Augen (DED), Meibom-Drüsen-Dysfunktion (MGD) und allergische Bindehautentzündung 5,6,7,8. Daher ist die detaillierte Charakterisierung der Tränenlipidomik zu einer entscheidenden und trendigen Forschungsrichtung geworden, um ein umfassenderes Verständnis der molekularen Pathologien dieser Augenerkrankungen zu ermöglichen9.

Obwohl der Tränen-Lipidom-Ansatz eine große klinische Bedeutung hat, besteht eine entscheidende Herausforderung in der Tränenlipidomik darin, einen standardisierten, reproduzierbaren Erfassungs- und Analyse-Workflow zu etablieren. Aktuelle Tränenprobennahmemethoden, Schirmers Streifen und Mikrokapillarröhrchen weisen jeweils deutliche Einschränkungen auf. Schirmer-Streifen haben eine große Kontaktfläche zur Augenoberfläche, was oft Augenreizungen und Reflexrisseverursacht 9,10. Im Vergleich dazu ist die Entnahme von Mikrokapillarröhrchen stark von der Bedienertechnik abhängig und kann bei unterschiedlichenLeistungen von verschiedenen Personen inkonsistente Ergebnisse liefern. Darüber hinaus kann eine unsachgemäße Anwendung dieser Probenahmeinstrumente auch ein Risiko einer Verletzung der Augenoberfläche mit sich bringen. Diese Einschränkungen könnten die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von nachgelagerten Daten 12,13 beeinträchtigen. Darüber hinaus können Methoden der Rissensammlung, die komplexe Handhabungsverfahren erfordern, ihre Zugänglichkeit und Standardisierung in verschiedenen Laboren und klinischen Einrichtungen einschränken. Daher besteht ein dringender Bedarf, einen nicht-invasiven, robusten und reproduzierbaren Ablauf zur Tränenaufnahme und -verarbeitung zu etablieren, der das native Tränenlipidprofil erhalten kann.

Jüngste Studien haben den Nutzen von Phenol Red Thread (PRT) für nachgelagerte LC-MS/MS-Workflow-Analysen in proteomischen und metabolomischen Anwendungenhervorgehoben 14,15. PRT bietet als Werkzeug zur Tränensammlung inhärente Vorteile. Seine dünne Struktur, die minimalinvasive Natur und das einfache Probenahmeverfahren könnten die technische Komplexität minimieren und die operatorabhängige Variabilität verringern, während sie von den meisten Probanden gut toleriert werden14,16. Ein standardisierter Arbeitsablauf speziell für PRT-basierte Tränenlipidomanalyse wurde jedoch noch nicht etabliert.

Dieses Protokoll führt einen integrierten Workflow für reproduzierbare Tränenlipidomik ein: eine benutzerfreundliche, PRT-basierte Tränenabnahmemethode, die für die Lipidanalyse angepasst ist, ein optimiertes Methyl-tert-Butylether-(MTBE)/Methanol-Lipidextraktionsprotokoll mit definierten Lösungsmittel-zu-Probe-Verhältnissen und Speicherkontrollen17,18 sowie eine modifizierte Lipididentifikationsmethode mit hochauflösendem LC-MS/MS. Dieser standardisierte Ansatz ermöglicht ein konsistentes Tränenlipidom-Profiling für die nachgelagerte Biomarker-Entdeckung und Krankheitscharakterisierung. Außerdem eignet es sich besonders gut für Probanden mit geringem Tränenvolumen oder geringerer Toleranz gegenüber Fremdkörperempfindungen (Abbildung 1).

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Abbildung 1: Schematische Übersicht des auf Phenol Red Thread (PRT) basierenden Arbeitsablauf für menschliche Tränenlipidomik. Tränenflüssigkeit wird von Probanden mit dem PRT-Ansatz gesammelt, der eine konsistente Probenentnahme mit minimalen Beschwerden ermöglicht. Die Probenverarbeitung umfasst sequentielle MTBE/Methanol-biphasische Extraktion, SpeedVac-vermittelte Konzentration und Rekonstitution von Tränenlipidextrakten für die Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS). Lipidomische Profile werden anschließend über LC-MS/MS erfasst und mit der LipidSearch-Software annotiert und identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Studie wurde vom Institutional Review Board (IRB) der Hong Kong Polytechnic University genehmigt. Die Probanden gaben vor der Teilnahme an der Studie eine schriftliche informierte Einwilligung ab. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Phenolrote Faden (PRT)-basierte Sammlung menschlicher Tränenflüssigkeit

  1. Tragen Sie Handschuhe und desinfizieren Sie den Arbeitsplatz, um eine Kontamination der Proben zu verhindern.
  2. Stelle sicher, dass das PRT-Paket versiegelt und nicht abgelaufen ist, bevor du es öffnest.
  3. Halte den Faden am Ende gegenüber dem gebogenen Haken fest. Vermeiden Sie es immer, die gebogene Hälfte des PRT zu berühren.
  4. Bitten Sie die Person, in die obere Nasenrichtung zu schauen.
  5. Ziehen Sie vorsichtig das untere Augenlid des Subjekts herunter und setzen Sie das PRT mit dem gebogenen Haken in der unteren temporalen Palpebralbindehaut, nahe der äußeren Ecke des Auges des Subjekts (Abbildung 2).

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Abbildung 2: Position des phenolroten Fadens während der Tränensammlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. Bitten Sie die Person, die Augen sanft zu schließen und den Kopf leicht nach vorne zu neigen, um zu verhindern, dass der PRT seine Gesichtshaut berührt.
    HINWEIS: Die absorbierte Träne würde allmählich eine rote Farbfront induzieren, die auf die beprobte Region des PRT hindeutet, bedingt durch das pH-empfindliche Phenolrot. Um genügend Tränenflüssigkeit für die lipidomische Analyse sicherzustellen, wird bevorzugt, ein Tränenvolumen in Höhe von 50 mm PRT zu sammeln, typischerweise innerhalb von 2 Minuten.
  2. Ziehen Sie vorsichtig das untere Augenlid des Subjekts herunter und nehmen Sie das entnommene PRT heraus. Vermeiden Sie es, den betasteten Bereich zu berühren.
  3. Erfassen Sie die Länge des beprobten Bereichs des PRT und übertragen Sie das PRT mit Hilfe einer sterilen Zange in ein neues Probenröhrchen.
    HINWEIS: Wenn die abgetastete PRT-Länge <50 mm beträgt, bitten Sie die Versuchsperson freundlich, 1–3 Minuten auszuruhen und die Sammlung mit demselben Auge zu wiederholen. Übertragen Sie jedes beprobte PRT in ein separates Probenrohr.
  4. Beschrifte und verschlusse die Probenröhrchen richtig.
  5. Reinigen Sie die Handschuhe und Pinzetten gründlich mit Methanol und reinigenden Papiertüchern, um Tränenreste oder Verunreinigungen zu entfernen, und lassen Sie sie dann trocknen.
  6. Wiederhole die Schritte 1.2-1.10 für das andere Auge.
  7. Versiegeln Sie die Probenröhrchen mit Parafilm und lagern Sie die Probe sofort bei -20°C für eine vorübergehende Lagerung oder bei -80°C für die Langzeitlagerung. Vermeiden Sie unnötige Einfrier- und Tauzyklen und schützen Sie das abgetastete PRT vor Licht.

2. Verarbeitung von beprobten PRT

  1. Die Mikroschere vor der Verarbeitung der PRTs mit Methanol vorwaschen.
  2. Entsorgen Sie das gebogene Hakenende (d. h. die ersten 3 mm) der PRTs (Abbildung 3).

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Abbildung 3: Physisches Erscheinungsbild des phenolroten Fadens (PRT). (A) Unbenutztes PRT mit gebogenem Hakenende. (B) Verwendete PRT, wobei der angegebene Schnitt geschnitten und zur Lipidextraktion gesammelt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. Schneiden Sie den beprobten Bereich des PRT (d. h. Bereich oberhalb der Phenolrot-Farbstofffront) in 2 mm große Stücke und übertragen Sie diese in ein sauberes, 1,5 ml organisches, lösungsmitteltolerantes Mikrozentrifugenrohr.

3. MTBE/Methanol-biphasische Trennung zur Lipidextraktion aus beprobtem PRT

VORSICHT: MTBE und Methanol sind brennbar und flüchtig. Verwenden Sie sie in einem gut belüfteten Bereich oder in einer Abzugshaube. Vermeiden Sie offene Flammen und Funken. Trage Handschuhe und einen Laborkittel. Wasche die Hände nach der Handhabung.

  1. Legen Sie die Proben auf Eis.
  2. Fügen Sie jeder Probe 232 μL eiskaltes Methanol (MS-Qualität) hinzu und wirbeln Sie 15 Sekunden lang.
  3. Sonikieren Sie die Proben 15 Minuten lang in einem vorgekühlten Ultraschallreiniger.
  4. Fügen Sie 774 μL MTBE (HPLC-Qualität) und 194 μL deionisiertes Wasser zu jeder Probe und Wirbel für 15 Sekunden hinzu. Das resultierende Volumenverhältnis von MTBE:methanol:Wasser in der Probe sollte 4:1,2:1 (v/v/v) betragen.
  5. Sonikieren Sie die Proben erneut in einem vorgekühlten Ultraschallreiniger für 15 Minuten.
  6. Inkubieren Sie die Probe 8 Stunden lang im Thermomixer bei 4 °C, mit einem Schütteln bei 1.200 U/min.
  7. Lass die Mischung 10 Minuten bei Zimmertemperatur stehen.
  8. Zentrifugieren Sie die resultierenden Gemische bei 10.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C.
  9. Nach der Zentrifugation werden die Gemische in zwei Phasen getrennt (Abbildung 4).
    HINWEIS: Nach Abschluss der Phasentrennung wird die Probe auf zwei verschiedene Schichten untersucht: Die obere organische Phase (MTBE-reich) sollte transparent mit einer leicht milchigen Opazität erscheinen, während die untere wässrige Phase eine gelbe Färbung aufweist, die auf das Vorhandensein eines phenolroten Indikators zurückzuführen ist. Fahren Sie nur fort, wenn diese Phasenmerkmale beobachtet sind, wie in Abbildung 4 gezeigt.

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Abbildung 4: Phasentrennung der Lipidextraktion mit MTBE-Methanol-Wasser: obere organische Phase und untere wässrige Phase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. Sammeln Sie vorsichtig 700 μL der oberen organischen Fraktion mit Lipiden und übergeben Sie sie in ein vorgekühltes neues 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr.
  2. Entsorgen Sie die untere wässrige Phase, die Reste von MTBE und Methanol enthält, als gefährliche chemische Abfälle. Sammeln Sie Abfälle in etikettierten, versiegelten Behältern und entsorgen Sie sie gemäß institutionellen Protokollen für gefährliche Abfälle und lokalen Vorschriften. Gieße keine Lösungsmittel in den Abfluss.
  3. Trocknen Sie die Lipidextrakte 4 Stunden lang mit einem gekühlten SpeedVac-Konzentrator bei 4 °C.
    HINWEIS: Um eine vollständige Trocknung sicherzustellen, überprüfen Sie regelmäßig die Trockenheit der Probe ab 2 Stunden. Verlängern Sie die Trocknungszeit nach Bedarf, bis die Proben vollständig getrocknet sind.
  4. Die getrockneten Lipidextrakte werden bei -20 °C für eine kurzfristige Lagerung oder bei -80 °C für eine langfristige Lagerung gelagert.

4. Rekonstitution des extrahierten Tränenlipids für die LC-MS/MS-Analyse

  1. Rekonstituieren Sie die getrockneten Lipidextrakte mit 50 μL der eiskalten Methanolmischung (MS-Qualität)/Chloroform (HPLC-Qualität) (1:1, v/v) als Lösungsmittel (1 μL Lösungsmittel pro 1 mm verwendetes PRT) und anschließend wird mit einer Sonikation in einem vorgekühlten Ultraschallreiniger für 15 Minuten durchgeführt.
  2. Zentrifugieren Sie die rekonstituierten Lipidextrakte bei 14.000 × g und 4 °C für 10 Minuten.
  3. Übertragen Sie vorsichtig 40 μL des Supernatanten in ein Autosampler-Glasfläschchen mit eingebautem Glaseinsatz.
  4. Decken Sie das Fläschchen fest mit einer nicht geschlitzten Septum-Kappe und öffnen Sie sie für die LC-MS/MS-Analyse vorbereiten.

5. Probenerfassung durch LC-MS/MS

  1. Für die Flüssigchromatographie stellen Sie die Temperatur der Säulenkammer und des Probenehmers auf 50 °C bzw. 4 °C ein.
  2. Für jede Injektion werden 5 μL der Probe auf eine umgekehrte LC-Säule (C18; 1,7 μm, 100 mm × 2,1 mm) geladen und die Lipide mit einer Durchflussrate von 0,3 mL/min in einem 24-minütigen Trenngradienten fraktioniert.
    1. Verwenden Sie mobile Phase A mit einer Mischung aus 60:40 Acetonitril (MS-Qualität): Wasser (v/v) mit 5 mM Ammoniumformiat (MS-Qualität) und 0,1 % (v/v) Ameisensäure (MS-Qualität) sowie mobiler Phase B mit 90:10 Isopropanol (MS-Qualität): Acetonitril (v/v) mit 5 mM Ammoniumformiat und 0,1 % (v/v) Ameisensäure.
    2. Verwenden Sie folgenden Gefälle: 0-2 Min: 40 % B; 2–2,5 Min: 40 % B; 2,5–3 Min: 58 % B; 3-18 Min: 99 % B; 18-20 Min: 99 % B; 20-20,1 Min: 40 % B; 20,1–24 Min: 40 % B.
  3. Für das Orbitrap-Massenspektrometer stellen Sie die Sprühspannung auf +3,5 kV für positiven Modus oder -2,5 kV für negativen Modus ein.
  4. Stellen Sie den Gasdurchfluss der Hülle auf 45 Arb und den Hilfsgasfluss auf 10 Arb an.
  5. Stellen Sie die Durchflussrate des Sweep-Gases auf 2 Arb ein.
  6. Stellen Sie die Temperatur des Ionentransferrohrs auf 300 °C und die Temperatur des Verdampfers auf 320 °C ein.
  7. Verwenden Sie den datenabhängigen Erfassungsmodus (DDA).
  8. Für MS1 setzen Sie die Auflösung auf 120.000, den Scanbereich auf 100-2000 m/z, das Standard-AGC-Ziel, die Autoinjektionszeit, den dynamischen Ausschluss auf 6 s und die Intensitätsschwelle bei 5,0e4.
  9. Für MS2 setzen Sie die Auflösung auf 15.000, Autoscan-Reichweite, Standard-AGC-Ziel, dynamische Einspritzzeit, Isolationsfenster bei 1,6 m/z, Kollisionsenergietyp als Hochenergie-Kollisionsdissoziation (HCD) und normalisierte Kollisionsenergie (NCE) auf gestufte Werte von 15, 30 und 40.
  10. Analysieren Sie Rohdaten mit der LipidSearch-Software oder anderen kompatiblen Plattformen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zusammengesetzte Rissproben wurden von 16 gesunden Freiwilligen bei drei unabhängigen Besuchen mit zwei Wochen Abstand entnommen (R1, älteste Charge; R2, R3 wurden jeweils zwei Wochen nacheinander gesammelt). Mit LipidSearch und strengen Kriterien (d. h. Signal-Rausch-Verhältnis ≥100, Grad C oder höher, und Ionenintensität ≥30.000) identifizierten wir 773, 890 und 1.025 einzigartige Lipidspezies in R1-R3 (Abbildung 5A). Der positive Ionenmodus identifizierte...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorteile der PRT-basierten Tränenentnahme und Lipidextraktion
Der hier vorgestellte PRT-basierte Tränenlipidomik-Workflow bietet eine minimalinvasive und praktische Probenahme für eine umfassende Tränenlipidprofilierung. Im Vergleich zu Schirmerstreifen, die längeren Kontakt und größere Probenvolumina erfordern, erfolgt die PRT-Probenahme schnell, kann innerhalb von 2 Minuten abgeschlossen werden, wird von verschiedenen Populationen gut toleriert, einschließlich solch...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der InnoHK-Initiative sowie der Regierung der Sonderverwaltungsregion Hongkong und dem Forschungszentrum für SHARP Vision an der Hong Kong Polytechnic University unterstützt. Die Autoren danken auch dankbar für die technische Unterstützung durch die University Research Facility in Chemical and Environmental Analysis (UCEA) und die University Research Facility in Life Sciences (ULS) der Hong Kong Polytechnic University.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitril (ACN), LC-MS-QualitätRCI LabscanLM1005
ACQUITY UPLC CSH C18-KolumneWaters Corporation186005297130Å, 1.7 &Mikro; m, 2,1 mm x 100 mm
Ammoniumformat, LC-MS-QualitätSigma-Aldrich55674
Autosampler-GlasfläschchenWell Rich Scientific2ML-9-V10022mL Klarglas 12*32mm flacher Sockel 9-425 Schraubgewinde-Fläschchen mit Etikett (MIT Schreibblock)
Blauer 9-425 offener gerippter Schraubdeckel  Well Rich Scientific9-SP1003mit 9 mm, weißer PTFE/roter Silikon-Septa 1 mm
Chloroform, HPLC-QualitätDuksan-Reagenzien1271
Eppendorf Safe-Lock-Röhren, 1,5 mLEppendorf30120086
Ameisensäure (FA),  LC-MS-AbschlussThermoFisher ScientificA117-50
Glas-MikroeinsatzWell Rich Scientific2ML-N2002250 & Mikro; L-Insert, klares Glas, konischer Sockel mit Vielfeder, Größe: 5,8*28,5 mm
Isopropanol, LC-MS-QualitätRCI LabscanLM1162
LipidSearch-SoftwareThermoFisher ScientificOPTON-30879Version 5
Methanol,  LC-MS-AbschlussRCI LabscanLM1115
Phenol Red Thread  (PRT)Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd20192160086
Gekühlte ZentrifugeThermoFisher Scientific75007200
Gekühlter CentriVap-Zentrifugalkonzentrator und CentriVap-KältefallenLabconco16108335
Schraubkappen-MikroröhrenThermoFisher Scientific3488
tert-Butylmethylether (MTBE), HPLC-QualitätDuksan-Reagenzien1070
Thermowissenschaftlicher Dionex UltiMate 3000 HPLCThermoFisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Thermowissenschaftlicher Orbitrap IQ-X Tribrid MSThermoFisher ScientificFSN05-10001
ThermoMixer CEppendorf5382000015
UltraschallreinigerWappen UltraschallP500D-45
Vortex-MixerBenchmarkBV1003

References

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