Lebendzell-Bildgebung der Permeabilisierung der lysosomalen Membran während der Nekroptose

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Lebendzell-Bildgebungsverfahren zur Überwachung der lysosomalen Membranpermeabilisierung während der Nekroptose unter Verwendung von Fluoreszenzsonden, die Veränderungen der Integrität der lysosomalen Membran und der Versauerung nachweisen.

Zusammenfassung

Die Nekroptose, eine Form der regulierten Nekrose, gipfelt in einer Zellmembranruptur. Unser Labor und andere haben herausgefunden, dass die lysosomale Membranpermeabilisierung (LMP) ein frühes und entscheidendes Ereignis in diesem Prozess ist, das dem Membranbruch vorausgeht. Rapid LMP setzt potente lysosomale Enzyme, insbesondere Proteasen, in das Zytosol frei und fördert so aktiv den Zelltod. Die Bildgebung von lebenden Zellen ist ein unschätzbares Werkzeug für den Nachweis von LMP während der Nekroptose in Echtzeit. Mehrere Fluoreszenzfarbstoffe sind hochwirksam: (1) pH-empfindliche LysoTracker-Farbstoffe verfolgen Veränderungen des lysosomalen pH-Wertes. Eine Abnahme des Fluoreszenzsignals deutet auf einen Verlust des lysosomalen pH-Gradienten hin, ein primäres Zeichen einer lysosomalen Dysfunktion, die ein Vorläufer oder eine direkte Folge von LMP sein kann. (2) Fluorescein-markierte Dextrankügelchen werden internalisiert und reichern sich in Lysosomen an. Ihre Freisetzung in das Zytosol signalisiert eine vollständige LMP- und Ladungsleckage. Hier beobachteten wir einen fortschreitenden Verlust der Lysotracker-Fluoreszenz mit diffundierender Dextran-Fluoreszenz in das Zytosol nach Nekroptose-Induktion. Die Methode der Lebendzell-Bildgebung ermöglicht es den Forschern, den Zeitpunkt und das Ausmaß der lysosomalen Dysfunktion genau zu verfolgen, was zu einem umfassenderen Verständnis der Nekroptose-Mechanismen beiträgt und mögliche therapeutische Interventionen beleuchtet.

Einleitung

Nekroptose ist eine Caspase-unabhängige Form des regulierten Zelltods, die an vielen entzündlichen Erkrankungen, neurodegenerativen Erkrankungen, Lungen-, Leber- und Herzerkrankungen beteiligt ist ^1,2,3. Dieser Signalweg wird durch eine komplexe Kaskade von Reaktionen vermittelt, die in der Aktivierung der Rezeptor-interagierenden Proteinkinase 1 (RIPK1) gipfeln, die mit der Rezeptor-interagierenden Proteinkinase 3 (RIPK3) über ihre homotypischen RIP-Interaktionsmotiv (RHIM)-Domänen^{interagiert 4,5,6}. RIPK3 wiederum rekrutiert gemischtes Lineage-Kinase-ähnliches Protein (MLKL), um das Nekrosom ^7,8 zu bilden. Die Phosphorylierung von MLKL durch RIPK3 führt zu seiner Oligomerisierung und anschließenden Polymerisation. MLKL-Polymere translozieren dann zu den Zellmembranen, was schließlich zum Zellmembranbruch und zum Zelltod führt ^9,10,11. Die Mechanismen, durch die MLKL-Polymere in die Membrankompartimente translozieren und einen Membranaufschluss induzieren, sind jedoch nicht vollständig verstanden.

Lysosomen sind Organellen, die für den Abbau und das Recycling von zellulären Materialien verantwortlich sind. In seinem Lumen befinden sich Proteasen, Lipasen, Nukleasen und Hydrolasen, die für die Verdauung von Makromolekülen verantwortlich sind und dadurch die zelluläre Homöostase aufrechterhalten^12,13. Daher ist die Aufrechterhaltung der lysosomalen Integrität und ordnungsgemäßen Funktion unerlässlich, um eine effektive zelluläre Clearance, Anpassungen an Stress und das Gesamtüberleben der Zellen zu gewährleisten 14,15,16. Neuere Studien deuten auf einen Zusammenhang zwischen Nekroptose und lysosomaler Membranpermeabilisierung (LMP) hin17,18,19.

Unsere jüngsten Beobachtungen haben gezeigt, dass LMP ein frühes und signifikantes Ereignis im Nekroptoseprozess ist, das dem endgültigen Bruch der Zellmembran vorausgeht¹⁹. Insbesondere induziert die MLKL-Polymerisation auf der lysosomalen Membran eine schnelle LMP, um potente lysosomale Enzyme, insbesondere Proteasen, einschließlich Cathepsin B, in das Zytosol freizusetzen. Diese Proteasen spalten dann lebenswichtige Proteine, um den Zelltod zu fördern. Wichtig ist, dass die Hemmung der CTSB-Aktivität stark vor dem Zelltod schützt^19,20. Diese Daten deuten darauf hin, dass LMP ein entscheidender Modulator des Nekroptose-Signalwegs ist. Daher ist die Überwachung des Zeitpunkts der LMP während der Nekroptose unerlässlich, um die molekularen Mechanismen zu verstehen und potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren.

Viele konventionelle LMP-Nachweismethoden, wie z. B. Immunfärbung, Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) oder Durchflusszytometrie, erfordern fixierte Proben oder liefern ansonsten nur Endpunktinformationen 21,22,23, so dass der dynamische Prozess der lysosomalen Störung, insbesondere im Zusammenhang mit dem raschen Fortschreiten der Nekroptose, nicht erfasst werden kann. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Lebendzell-Imaging-Verfahren eine hochauflösende Echtzeit-Visualisierung von LMP während der Nekroptose. In diesem Protokoll kombinierten wir zwei komplementäre lysosomale Marker und induzierten Nekroptose in HT-29-Zellen, um die Integrität der lysosomalen Membran in Echtzeit zu analysieren¹⁹. Diese Technik bietet eine robuste und anpassungsfähige Plattform für die Untersuchung von LMP nicht nur bei Nekroptose, sondern möglicherweise auch bei anderen Formen von Zellstress, bei denen die lysosomale Integrität beeinträchtigt ist, insbesondere im Zusammenhang mit Krankheiten oder der Verwendung von Lysosomen-Targeting-Therapeutika 24,25,26.

Protokoll

1. Zellkultur - Tag 0

1. 5.000 Zellen in 2 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin und Streptomycin (P/S), in einer sterilen Glasbodenschale auffüllen.
2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ über Nacht.

2. Laden von Dextranraupen - Tag 1

1. Verdünnen Sie grüne Dextrankügelchen auf 25 μg/ml in frischem DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S, indem Sie 20 μl der 2,5 mg/ml-Stammlösung hinzufügen.
2. Entfernen Sie das alte Medium und ersetzen Sie es durch 2 mL perlenhaltiges DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S.
3. Die Zelle wird 24 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert, um die Internalisierung der Kügelchen in die Lysosomen zu ermöglichen.

3. Lysotracker-Färbung - Tag 2 (Versuchstag)

1. Bereiten Sie das Färbemedium vor, indem Sie 2 μl 1 mM Lysotracker-Stammlösung zu 2 ml frischem DMEM hinzufügen, das mit 10 % FBS und 1 % P/S ergänzt wird, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erhalten. Ersetzen Sie das alte Medium durch diese Färbelösung.
2. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 2 h gemäß der empfohlenen Inkubationszeit (30 min bis 2 h), die in den Richtlinien für die Verwendung von molekularen Sonden von Life Technologies²⁷ angegeben ist. In unseren Experimenten führte eine 2-stündige Inkubation in HT-29-Zellen zu einer robusten Puncta-Färbung mit starker Kolokalisation mit Dextrankügelchen, was auf eine stabile Farbstofffluoreszenz hinweist.
   HINWEIS: Schalten Sie das Konfokalmikroskop 30 Minuten vor der Bildgebung lebender Zellen ein.

4. Aufbau des konfokalen Mikroskops

1. Schalten Sie die Komponenten des konfokalen Systems in der folgenden Reihenfolge ein: PC-Mikroskop; Leistung des Scanners; Laserleistung; Laseremission; Leica Leistung.
2. Schalten Sie die Umgebungssteuerung ein: Der Würfel - Temperaturregler; Die Brick - CO₂ -Gasmischersteuerung. Offene CO₂ - und O₂ -Versorgung.
3. Gasparameter einstellen:
   1. Stellen Sie den Temperaturregler (den Würfel) auf 37 °C ein.
   2. Stellen Sie den Gas- und Feuchtigkeitsregler (den Ziegel) auf 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit ein.
4. Bauen Sie die Bildgebungskammer wie in Abbildung 1 gezeigt zusammen.
5. Richten Sie das konfokale Objektiv ein:
   1. Verwenden Sie ein 63x/1,40 NA Ölimmersionsobjektiv.
   2. Stellen Sie die Anregungslaser auf 488 nm (grüner Fluorophor) und 555 nm (roter Fluorophor) ein.
   3. Wählen Sie für den 488-nm-Laser einen Hybrid-Detektor (HyD) und für den 555-nm-Laser einen PMT-Detektor aus.
      HINWEIS: Das Fluoreszenzübersprechen wurde durch die Verwendung vordefinierter Gates in der konfokalen Software minimiert, was bestätigte, dass kein Übersprechen zwischen den Kanälen vorhanden war.

5. Vorbereitung nach der Färbung (nach der Inkubation mit LysoTracker)

1. Waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit 2 mL PBS.
2. Fügen Sie 2 ml frisches DMEM hinzu, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S.
3. Tragen Sie vor der Aufnahme einen Tropfen Immersionsöl auf die Objektivlinse auf.
4. Montieren Sie die Schüssel auf dem Mikroskoptisch.
5. Passen Sie die Laserintensität und den Hintergrund an.
   1. Stellen Sie die Laserintensität auf bis zu 3 %, aber nicht mehr als 5 % ein.
   2. Passen Sie die Detektorverstärkung in der Mikroskopsoftware an, um das Signal zu optimieren.
   3. Um den Hintergrund zu minimieren, passen Sie die Kontrastleiste an.
6. Erfassen Sie Basisbilder von unbehandelten Zellen (vor der T/S/Z-Addition), die als Kontrollbedingung dienen.
7. Setzen Sie die Platte wieder in die Laminar-Flow-Haube ein und fügen Sie 1 ml DMEM hinzu, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S, bestehend aus 100 ng/ml TNF-α (T), 500 nM SMAC-Mimetikum (S) und 100 μM Z-VAD-FMK (Z).
8. Fahren Sie mit der Bildgebung am konfokalen Mikroskop fort.
   HINWEIS: T/S/Z wurden absichtlich in höheren Konzentrationen als in den Standardprotokollen zugegeben. Diese Entscheidung wurde getroffen, um LMP und Zelltod zu beschleunigen und so frühe Ereignisse in Echtzeit zuverlässiger erfassen zu können.

6. Einstellungen für die Bilderfassung

1. Stellen Sie in der Erfassungssoftware die Parameter wie folgt ein: Modus: xyt; Format: 512 x 512; Geschwindigkeit: 400; Zoom: 3; Liniendurchschnitt: 1; Akkumulation der Linie: 3; Akkumulation des Rahmens: 1; Zeitintervall: 3 min; Dauer: 8 h; Aktivieren Sie den Autofokus.
2. Klicken Sie auf Start , um die Zeitrafferaufnahme zu starten.

Ergebnisse

Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren ermöglichen die Aufnahme von Lebendzellbildern mittels konfokaler Mikroskopie, um LMP in Echtzeit zu überwachen. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des experimentellen Protokolls, von der Zellbeschichtung bis zur Bildaufnahme. An Tag 0 wurden 5.000 HT-29-Zellen plattiert und 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. Nach 24 Stunden (Tag 1) wurden die Zellen für weitere 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen mit Fluorescein-markierten Dextran-Kügelchen (25 μg/ml) inkubiert. Diese Kügelchen werden durch Endozytose und Verkehr zu den Lysosomen internalisiert, wo sie sich ansammeln und als helle Puncta erscheinen. An Tag 2 (Experimentiertag) wurden die Zellen 2 h lang bei 37 °C und 5% CO₂ mit dem pH-sensitiven LysoTracker-Farbstoff (1 μM) behandelt. LysoTracker konzentriert und zeigt eine starke Fluoreszenz in sauren Kompartimenten, wie z. B. späten Endosomen und Lysosomen. Dreißig Minuten vor der Bildgebung wurde das konfokale Mikroskopsystem eingeschaltet und stabilisiert, einschließlich Temperatur-, Gas- und Feuchtigkeitsreglern, wie in Schritt 4 des Protokolls beschrieben. Die Bildgebungskammer wurde zusammengebaut, wie in Abbildung 2 gezeigt. Zum Einsatz kamen die Laser 488 nm (grün) und 555 nm (rot).

Nach der Inkubation mit LysoTracker wurden die Zellen dreimal sorgfältig mit PBS gewaschen und 2 ml frisches DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S, hinzugefügt. Die Platte wurde auf das Mikroskop übertragen und ein Tropfen Immersionsöl auf das 63x/1,40 NA Öl-Immersionsobjektiv aufgetragen. Die Laserintensität und die Hintergrundwerte wurden dann angepasst, um die Bildgebungsbedingungen zu optimieren, wie in Schritt 5.5 beschrieben. des Protokolls. Unsere ersten Bilder bestätigten das Vorhandensein stabiler Punktzahlen des Lysotrackers und des Fluorescein-markierten Dextranas, was auf intakte Lysosomen hinweist (Abbildung 3). Die Basisbilder wurden vor T/S/Z aufgenommen und als Kontrolle verwendet. Es wurde kein Fahrzeug eingesetzt.

Nach der Festlegung der anfänglichen Bildgebungs- und Mikroskopieeinstellungen wurde die Platte wieder in die Laminar-Flow-Haube zurückgeführt und 1 ml DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S, bestehend aus 100 ng/ml TNF-α (T), 500 nM SMAC-Mimetikum (S) und 100 μM Z-VAD-FMK (Z), hinzugefügt. Die Bildgebung wurde am konfokalen Mikroskop unter Verwendung des in Schritt 6 des Protokolls beschriebenen Bildgebungserfassungsparameters fortgesetzt. Wie in Abbildung 3, Ergänzungsfilm S1 und Ergänzungsfilm S2 gezeigt, diente die fortschreitende Abnahme der LysoTracker-Fluoreszenz in T/S/Z-behandelten Zellen als Frühindikator für lysosomale Veränderungen. Diesem Verlust folgte und trat gelegentlich gleichzeitig mit dem Ausfluss von Fluorescein-markiertem Dextran aus den Lysosomen in das Zytosol auf (punktuelle zu diffuse Verschiebung), was auf LMP hinweist. Nach 8 Stunden verschwanden fast alle Lysotracker-Signale, jedoch behielten viele Zellen immer noch grüne Puncta mit zytosolischem grünem Signal, was darauf hindeutet, dass der Verlust des lysosomalen pH-Gradienten der vollständigen LMP- und Frachtfreisetzung vorausgeht.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsprotokolls. (Erstellt im BioRender.com) Zunächst wurden 5.000 Zellen plattiert (0 h) und 24 h inkubiert; danach wurden Dextran-Kügelchen (25 μg/ml) hinzugefügt und für weitere 24 Stunden inkubiert. Nach 48 h wurde LysoTracker (1 μM) hinzugefügt und 2 h lang inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen (Schritt 1), gefolgt von der Zugabe von 2 ml frischem DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S (Schritt 2). Die Mikroskopieeinstellungen wurden angepasst (Schritt 3), und die Zellen wurden mit TNF-α (T), SMAC-Mimetikum (S) und Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMZ (Z) (Schritt 4) behandelt, bevor die Lebendzellbildaufnahme (Schritt 5) erfolgte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Diagramm des Aufbaus der Bildgebungskammer. (A) Der Probenhalter, (B) die Gasinkubationskammer und (C) der obere Deckel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Bilder von HT29-Zellen vor und nach der T/S/Z-Behandlung. Die Zellen wurden mit roten Lysotracker- und grünen Dextran-Kügelchen gefärbt und mit TNF-α (T), SMAC-Mimetikum (S) und Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMZ (Z) behandelt. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzender Film S1: Zeitraffer von HT29-Zellen, die mit grünen Dextran-Kügelchen inkubiert und mit T/S/Z behandelt wurden. Die Zellen wurden über 6 Stunden lang überwacht, um die zelluläre Reaktion zu beurteilen. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film S2: Zeitraffer von HT29-Zellen, die mit LysoTracker rot inkubiert und mit T/S/Z behandelt wurden. Die Zellen wurden über 6 Stunden lang überwacht, um die zelluläre Reaktion zu beurteilen. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll zeigte, dass die Kombination von LysoTracker und Fluorescein-markierten Dextran-Kügelchen die gleichzeitige Überwachung des lysosomalen pH-Werts und der Frachtfreisetzung in Echtzeit ermöglicht. Die repräsentativen Ergebnisse (Abbildung 3, Ergänzungsfilm S1 und Ergänzungsfilm S2) bestätigen, dass unbehandelte Zellen ein stabiles Puncta-Signal für beide Marker aufrechterhalten. Im Gegensatz dazu deutet die T/S/Z-Behandlung auf einen fortschreitenden Verlust der Lysotracker-Intensität und eine Verschiebung des Dextrans von der punktuellen zur diffusen zytosolischen Verteilung hin, was mit der LMP übereinstimmt.

Ein wichtiger erster Schritt in diesem Protokoll ist die Auswahl der Zellen für die Bildaufnahme. Unsere bisherigen Daten zeigen, dass die T/S/Z-Behandlung den Tod von etwa 80 % der HT-29-Zellen innerhalb von 24 Stunden verursacht, während die restlichen 20 %¹⁹ überleben. Da LMP zu Beginn des Experiments nicht vorhanden ist, werden die Zellen zunächst auf der Grundlage der Morphologie und ihres dualen positiven Signals sowohl für LysoTracker- als auch für Dextran-Kügelchen ausgewählt. Obwohl diese Methode nicht vorhersagen kann, welche spezifischen Zellen einer LMP unterzogen werden, haben wir immer wieder beobachtet, dass etwa 60% der überwachten Population während der 8-stündigen Bildgebungsphase schließlich LMP aufweisen. Eine weitere Herausforderung ergibt sich aus der inhärenten Natur der sequentiellen Bildgebung. Eine leichte Drift in der Z-Position der Zelle, die während der Bildaufnahme alle 3 Minuten auftritt, verhindert eine kontinuierliche Verfolgung desselben puncta-Signals über das gesamte Experiment. Darüber hinaus wandern die Zellen und erfahren als Reaktion auf die T/S/Z-Behandlung morphologische Veränderungen²⁸. Folglich ist es unmöglich, die Dynamik der einzelnen Lysosomen über den gesamten Bildgebungszeitraum hinweg zu verfolgen. Bei der Langzeitbildgebung lebender Zellen ist der potenzielle Beitrag der Phototoxizität als Mediator des Zelltods ein wichtiger Aspekt. Kontinuierliche Anregung während längerer Sitzungen kann reaktive Sauerstoffspezies erzeugen und die Lebensfähigkeit der Zellen^{beeinträchtigen 29}, wodurch möglicherweise die echte nekrotische Reaktion gestört wird. Um diesen Effekt zu minimieren, haben wir eine geringe Laserleistung und kurze Belichtungszeiten eingesetzt. Zusätzlich wurde eine fünffache Konzentration von T/S/Z verabreicht, um den Zelltodprozess zu beschleunigen. Wir können jedoch nicht vollständig ausschließen, dass lichtinduzierter Stress zu den beobachteten lysosomalen Veränderungen beiträgt.

Ein wichtiger Vorteil dieses Bildgebungsprotokolls für lebende Zellen ist seine Fähigkeit, die lysosomale pH-Änderung und LMP in Echtzeit zu überwachen und dynamische Ereignisse zu erfassen, die von Endpunktanalysen wie TEM, Durchflusszytometrie und Immunfärbung übersehen werden. TEM bietet zwar hochauflösende strukturelle Einblicke, kann aber den zeitlichen Verlauf der LMP nicht erfassen. Alternative Lebendzellmethoden, wie z. B. Acridinorange-Relocation-Assays³⁰ oder Galectin-Puncta-Bildung³¹, sind ebenfalls wertvolle Instrumente zur Überwachung der lysosomalen Integrität, aber jede hat Grenzen, wenn sie isoliert verwendet werden. Der Acridinorange-Assay berichtet über die Umverteilung des Farbstoffs von sauren Organellen in das Zytosol, die sowohl durch lysosomale pH-Änderungen als auch durch die Membranpermeabilisierung beeinflusst wird und daher nicht direkt mit der Ladungsfreisetzung korreliert. In ähnlicher Weise spiegelt die Galectin-puncta-Bildung die Exposition luminaler Glykane gegenüber dem Zytosol wider und markiert somit eine lysosomale Membranschädigung^31,32, unterscheidet jedoch nicht zwischen partieller Permeabilisierung und vollständiger lysosomaler Ruptur.

Die Kernstärke dieses Protokolls liegt in der Kombination von LysoTracker und Dextrankügelchen, die die gleichzeitige Untersuchung von lysosomaler Versauerung und Ladungsleckage ermöglichen. Dies bietet eine einzigartige, doppelte Anzeige sowohl der lysosomalen Funktionalität als auch der strukturellen Integrität. Das LysoTracker-Fading fungiert als Indikator für eine Änderung des lysosomalen pH-Werts, während die Dextranfreisetzung direkt das physikalische Austreten des lysosomalen Gehalts meldet. Durch die gemeinsame Verwendung dieser beiden Marker verbessern wir die Detektion sowohl von partieller als auch von vollständiger LMP erheblich. Daher ist diese Strategie der Lebendzellbildgebung breit anwendbar. Forscher können es für die Verwendung mit anderen Zelltypen und verschiedenen Fluoreszenzsonden anpassen, um die lysosomale Integrität unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, einschließlich pharmakologischer oder genetischer Störungen, zu untersuchen. Diese Fähigkeit ist der Schlüssel, um unser Verständnis der Nekroptose-Mechanismen zu verbessern und potenzielle therapeutische Interventionen zu identifizieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HT-29-Zellen	ATCC	HTB-38	Darmkrebszellen
35 mm Glasboden-Schüssel	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C-GRD
CO2-Inkubator	PHCBI	MCO-170AICUVL
Konfokalmikroskop	Leica	SP8WLL
Dextran-grüne Perlen	ThermoFisher	D1820	Dextran, Fluorescein, 10.000 MW, anionisch, lysinfixierbar
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Fetales Rinderserum (FBS)	Cytiva	SH30910.03
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L7528
Ölimmersionstyp HF	Elektronenmikroskopiewissenschaften	16915-01
Penicillin und Streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Corning	21-040-CV
Smac-Mimetik (S)	BV6, ApexBio, Katalog	B4653	Endkonzentration, 1 mM
The Brick	Lebensbildgebende Dienstleistungen	13685	CO2-Regler des Gasmischers
Der Würfel	Lebensbildgebende Dienstleistungen	CBO2A	Temperaturkontrollkammermikroskope
Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-Α - T)	Peprotech	30001A100UG	Endkonzentration: 20 ng/ml
z-VAD-FMK (Z)	ApexBio	A1902	Endkonzentration, 20 mM