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Methodenartikel

Experimentelle Ansätze zur biochemischen Analyse des glialen fibrillären sauren Proteins und seiner krankheitsassoziierten Varianten

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DOI:

10.3791/69523

⸱

28. November 2025

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie skizziert experimentelle Methoden zur biochemischen Charakterisierung von GFAP und seinen krankheitserregenden Mutationen, mit Fokus auf Filamentassemblierung, Aggregation und posttranslationale Modifikation. Hochreine GFAP-Proteine wurden analysiert, was Einblicke in die Mechanismen der Alexander-Krankheit liefert, die einen Rahmen für die Untersuchung potenzieller therapeutischer Ziele sowie das Verständnis von GFAP-Mutationen und verwandten Erkrankungen bieten könnten.

Zusammenfassung

Das gliale fibrilläre saure Protein (GFAP) ist ein zentrales intermediäres Filamentprotein, das für die Erhaltung der strukturellen Integrität und Funktion von Astrozyten im zentralen Nervensystem entscheidend ist. Mutationen in GFAP sind die Hauptursache der Alexander-Krankheit (AxD), einer seltenen und oft tödlichen neurodegenerativen Erkrankung, die durch erhöhte GFAP-Spiegel und die Ansammlung von GFAP in Form von Rosenthal-Fasern gekennzeichnet ist. Hier skizzieren wir einen umfassenden Satz experimenteller Ansätze zur biochemischen Charakterisierung von GFAP und seinen krankheitserregenden Varianten. Mit optimierter Expression und fortschrittlichen Reinigungstechniken erreichten wir hohe Erträge und Reinheit sowohl von Wildtyp- als auch mutierten GFAP-Proteinen. Biochemische Tests wurden eingesetzt, um die Auswirkungen pathogener Mutationen auf die Filamentassemblage, Löslichkeit und Aggregation zu bewerten. Zusätzlich untersuchten wir die Rolle abweichender posttranslationaler Modifikationen bei der GFAP-Aggregation und deren Einfluss auf die Eigenschaften der Filamente. Diese Arbeit erweitert unser Verständnis der Rolle von GFAP bei AxD und legt die Grundlage für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Zielsetzung von GFAP-Dysfunktionen. Darüber hinaus dienen die hier vorgestellten Methoden als wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung der biochemischen Folgen von GFAP-Mutationen und zur Weiterentwicklung von Interventionen bei GFAP-bezogenen Erkrankungen.

Einleitung

Die Alexander-Krankheit (AxD) ist eine genetische Erkrankung, die durch dominante Mutationen im Gen entsteht, das für das gliale fibrilläre saure Protein (GFAP)1 codiert, ein Typ-III-Intermediat-Filament (IF)-Protein, das vorwiegend in reifen Astrozyten vorkommt. AxD ist gekennzeichnet durch GFAP-Hochregulation2, reaktive Astrogliose3 und die Ansammlung von Rosenthal-Fasern, die hauptsächlich aus GFAP sowie assoziierten Proteinen wie αB-Crystallin4 und Ubiquitin5 bestehen. Mutationen im GFAP-Gen stören die normale Filamentassemblage6, was zu abnormaler Aggregation, der Induktion zellulärer Stressreaktionen7 und weiterer Destabilisierung durch aberante posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung8, Oxidation9 und Ubiquitination10 führt.

Trotz der zentralen Rolle von GFAP in der AxD-Pathologie sind die molekularen Mechanismen, durch die mutierte GFAP die Filamentassemblage stört, die Aggregation fördert und zellulären Stress induziert, weiterhin wenig verstanden. Diese Wissenslücke behindert die Entwicklung gezielter Therapien zur Bekämpfung der GFAP-Aggregation und -Toxizität. Die Untersuchung der biochemischen Eigenschaften von GFAP und seinen AxD-assoziierten Varianten ist entscheidend, um die molekularen Mechanismen des Krankheitsverlaufs aufzudecken. Die aggregationsanfällige Eigenschaft von GFAP und ihr verändertes Assemblierungsverhalten bei krankheitsassoziierten Varianten stellen jedoch besondere Herausforderungen für experimentelle Analysen dar. Kontrollierte biochemische Studien erfordern gereinigtes GFAP, das entweder aus Tiermodellen oder durch rekombinante Expression gewonnen wird, um die Auswirkungen von AxD-Mutationen auf die Filamentassemblierung, -aggregation und pathologische Veränderungen zu untersuchen.

Die in dieser Studie vorgestellten experimentellen Ansätze bieten mehrere Vorteile gegenüber alternativen Techniken. Beispielsweise liefern zellbasierte Modelle11 und immunhistochemische Studien12 wertvolle Einblicke in die GFAP-Expression und -Lokalisation, aber sie versäumen oft die genauen biochemischen Mechanismen der Filamentassemblage und -aggregation aufgrund der Komplexität zellulärer Umgebungen. Im Gegensatz dazu ermöglichen die hier beschriebenen Methoden, wie in-vitro-Filamentassemblierungstests, Sedimentationsanalysen und PTM-Charakterisierung, kontrollierte Untersuchungen der intrinsischen biochemischen Eigenschaften von GFAP und seinen krankheitsassoziierten Varianten. Diese Ansätze ermöglichen es Forschern, das Verhalten der Filamentassemblage und -aggregation in einem vereinfachten System zu analysieren, was die Identifikation molekularer Mechanismen der GFAP-Dysfunktion erleichtert. Frühere Studien haben den Nutzen solcher biochemischer Techniken zur Analyse von IF-Proteinen gezeigt, darunter Desmin13 und Keratine14, was ihre Anwendbarkeit für die GFAP-Forschung unterstreicht.

Zusätzlich bietet dieses Manuskript Informationen, die den Lesern helfen zu bestimmen, ob die beschriebenen Methoden für ihre spezifischen Anwendungen geeignet sind. Forscher, die biochemische Eigenschaften von GFAP, dessen Assemblierungsverhalten oder PTMs untersuchen möchten, werden diese Techniken besonders nützlich finden, um krankheitsassoziierte Varianten und deren pathologische Effekte zu untersuchen. Durch die Integration dieser biochemischen Ansätze mit anderen experimentellen Systemen, wie zellbasierten Studien oder Tiermodellen, können Forscher ein umfassenderes Verständnis der GFAP-Dysfunktion bei AxD und anderen verwandten Astrozytopathien erreichen.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, experimentelle Ansätze zur biochemischen Analyse von GFAP und seinen AxD-assoziierten Varianten vorzustellen, einschließlich Proteinreinigungstechniken, In-vitro-Filamentassemblierungstests, Sedimentationsanalysen und PTM-Charakterisierung. Diese Methoden liefern wichtige Einblicke in die molekulare Grundlage der GFAP-Dysfunktion bei AxD und ebnen den Weg für die therapeutische Entwicklung. Darüber hinaus wird die Anwendung dieser experimentellen Techniken unser Verständnis der GFAP-Biochemie in AxD voranbringen und zum breiteren Feld der IF-Forschung beitragen.

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Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Tiere sind AxD-Modellratten mit der R237H-Knock-in-Mutation11. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des College of Life Sciences and Medicine der National Tsing Hua University genehmigt (NTHU IACUC Approval Nr. 109088 und 111060) und gemäß den Richtlinien des Landwirtschaftsleitfades für die Pflege und Nutzung von Labortieren.

1. Reinigung von rekombinantem GFAP aus Bakterien (Abbildung 1)

  1. Transformieren Sie den E. coli BL21(DE3) pLysS-Stamm mit pET 23b Vektor, der cDNA entweder von WT oder mutiertem GFAP enthält.
  2. Kulturbakterien in 1 L Luria-Bertani-Medium, ergänzt mit 100 μg/mL Ampicillin und 34 μg/mL Chloramphenicol bei 37 °C bis OD600 von ~0,2.
  3. Fügen Sie Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG, 0,5 M) zu einer Endkonzentration von 0,5 mM hinzu, um eine GFAP-Expression bei 37 °C für 4 Stunden zu induzieren.
  4. Bakterien werden durch Zentrifugation bei 6.371 xg für 30 Minuten bei 4 °C erntet.
  5. Lysebakterien in 50 mL TEN-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl) ergänzt mit 0,2 mM Phnenylmethanesulfonylfluorid (PMSF) durch Homogenisierung in einem Dounce-Homogenisator.
  6. Bakterielle Lysate bei 22.045 xg für 20 Minuten bei 4 °C zentrifugieren und anschließend das Pellet in einem Triton X-100 Puffer (TEN mit 1% (v/v) Triton X-100) extrahieren.
  7. Nach der Zentrifugation unter denselben Bedingungen wird das resultierende Pellet im Hochsalzpuffer extrahiert (TEN mit 1 % (v/v) Triton X-100 und 1,5 M KCl).
  8. Nach der Zentrifugation unter denselben Bedingungen wird das Pellet mit einem TEN-Puffer gewaschen.
  9. Lösen Sie das endgültige Pellet in 10 ml Harnstoffpuffer (8 m Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA und 0,2 mM PMSF) durch 3 Stunden Rühren bei Raumtemperatur.
  10. Zentrifugen-Harnstoff wird bei 80.000 xg in einer Tisch-Ultrazentrifuge bei 4 °C für 20 Minuten extrahiert.
  11. Polyethylenein (1 % (v/v)) zum Harnstofflöslichen Anteil zu einer Endkonzentration von 0,06 % (v/v) hinzufügen und 5 Minuten auf Eis inkubieren.
  12. Zentrifugieren Sie mit 80.000 xg bei 4 °C für 20 Minuten und dialysieren Sie anschließend die Überlagerungsfraktion gegen Puffer A (6 M Harnstoff, 20 mM MES, pH 6,0, 14,4 mM β-Mercapttoethanol).
  13. Dialysate werden auf eine CM-Sepharose-Ionenaustauschsäule geladen, die im Puffer A in einem NGC-Chromatographiesystem vorausgeglibliwen ist.
  14. Elutieren Proteine mit einem linearen Gradienten von 0–0,5 M NaCl im Puffer A über 1 Stunde bei einer Durchflussrate von 1 mL/min.
  15. Poolen Sie GFAP-haltige Fraktionen und dialysieren Sie gegen Puffer B (6 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA).
  16. Dialysate werden auf eine Anionenaustauschsäule geladen, die im Puffer B vorausgeglichen ist. Elutieren Sie Proteine mit einem linearen Gradienten von 0–0,5 M NaCl im Puffer B über 1 Stunde bei einer Durchflussrate von 1 mL/min.
  17. Analysieren Sie die Spaltenfraktionen mittels SDS-PAGE und Coomassie Blue Staining. Sammeln Sie die mit gereinigtem GFAP und lagern Sie sie bei -80 °C.
    HINWEIS: Die bakterielle Lyse kann durch mehrere Einfrier- und Tauzyklen erleichtert werden. Die Endkonzentration von Polyethyleneimin darf 0,06 % (v/v) nicht überschreiten, über die auch Proteine ausfällen. Bei der Arbeit mit gefährlichen Materialien wie PMSF und β-Merccaptoethanol ist es entscheidend, klare Sicherheitshinweise und Anweisungen zur Entsorgung gefährlicher Abfälle anzugeben. PMSF ist hochgiftig und kann Haut, Augen und Atemwege reizen. Bereiten Sie PMSF-Lösungen frisch in einer Abzugshaube vor und vermeiden Sie direkten Kontakt. Verwenden Sie β-Merccaptoethanol in einem gut belüfteten Bereich, da es starke, giftige Dämpfe abgibt.

2. In-vitro-Assemblierung und Sedimentationstest (Abbildung 2)

  1. Verdünnen Sie gereinigtes WT oder mutiertes GFAP auf 0,3 mg/mL in 6 m Harnstoff in einem salzarmen Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA und 14,4 mM β-Mercapethanol).
  2. Dialyseproben gegen den niedrigen Salzpuffer mit 4 M und dann 2 M Harnstoff für 4 Stunden bei Zimmertemperatur.
  3. Dialyseproben gegen den niedrigen Salzpuffer ohne Harnstoff über Nacht bei 4 °C.
  4. Dialyse Proben gegen den Montagepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7, 50 mM NaCl und 14,4 mM β-Merccapethanol) bei Raumtemperatur für 12–16 H.
  5. Übertragen Sie die Montagemischungen auf die Oberseite eines Saccharose-Polsters, das 0,2 ml 0,85 m Saccharose im Montagepuffer enthält.
  6. Im Hochgeschwindigkeits-Sedimentationstest wird die Gemische bei 80.000 xg für 20 Minuten bei 20 °C mit einer Tisch-Mikro-Ultrazentrifuge zentrifugiert.
  7. Konzentrieren Sie unzusammengesetztes GFAP in der Supernatantenfraktion durch Methanol/Chloroform-Niederschlag15. Resuspendierte Präzipitieren in 0,2 mL Laemmli-Probenpuffer (25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 12,5 % (v/v) Glycerol, 0,01 % (w/v) Bromphenolblau und 355 mM β-Mercaptoethanol).
  8. Setzen Sie das zusammengesetzte GFAP in der Pelletfraktion im Laemmli-Probenpuffer wieder auf.
  9. Führen Sie sowohl Supernatanten- als auch Pelletfraktionen mit 10 % (w/v) SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE)-Gel aus und färben Sie mit 10 ml Coomassie-Blau.
  10. Im Sedimentationstest mit niedriger Geschwindigkeit mischt die Zentrifuge die Montage mit 3.000 xg für 5 Minuten bei 20 °C mit einer Tischzentrifuge.
  11. Fügen Sie 0,2 mL Laemmli-Probenpuffer zu den nicht-aggregierten GFAP-Formen in der Supernatantenfraktion hinzu.
  12. Suspendieren Sie aggregiertes GFAP direkt in der Pelletfraktion im Laemmli-Probenpuffer in einem Volumen, das proportional zur Supernatantenfraktion ist.
  13. Analysieren Sie sowohl Supernatanten- als auch Pelletfraktionen mit 10 % (w/v) SDS-PAGE-Gel, gefolgt von einer Coomassie-Blaufärbung.
    HINWEIS: Methanol und Chloroform sind giftige Lösungsmittel und können schwerwiegende gesundheitliche Folgen verursachen. Vermeiden Sie Hautkontakt und Einatmen. Führen Sie vorsichtig in einer Dampfhaube, um Verschüttungen zu verhindern.

3. Negativfärbung und Elektronenmikroskopie (Abbildung 2)

  1. Glühentladung der Formvar/kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter für 45 Sekunden bei 20 mA in einem Glow-Entladungsreinigungssystem.
  2. Fügen Sie Montagemischungen an das glühentladene Gitter ab und lassen Sie die Proben 60 Sekunden lang an die Trägerschicht binden.
  3. Entferne überschüssige Flüssigkeit, indem du den Rand des Gitters mit einem Stück Löschpapier einziehst.
  4. Waschen Sie die Gitter mit destilliertem Wasser und färben Sie dann 60 Sekunden lang mit 20 μL 1% (w/v) Uranylacetat.
  5. Entferne überschüssige Fleckenlösung und lasse das Gitter 30 Sekunden an der Luft trocknen.
  6. Untersuchen Sie Gitter unter einem H-7600-Transmissionselektronenmikroskop (TEM) im Hochauflösungsmodus bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV.
    HINWEIS: Die Glühentladung der Gitter in einem Vakuumverdampfer vor dem Zuführen der Proteinprobe verbessert die Adsorption der Proben am Gitter. Uranylacetat ist eine radioaktive und hochgiftige Chemikalie, die häufig in der Elektronenmikroskopie zur negativen Färbung verwendet wird. Der Umgang damit erfordert strikte Einhaltung von Sicherheitsprotokollen und Anweisungen zur Entsorgung gefährlicher Abfälle, um die Expositionsrisiken für Personal und Umwelt zu minimieren. Bereiten Sie Uranylacetat-Lösungen nur in einer Abzugshaube vor, um das Einatmen von Luftpartikeln oder Dämpfen zu verhindern.

4. Oxidative Modifikation (Abbildung 3)

  1. Verdünnen Sie GFAP auf 0,3 mg/mL in 6 m Harnstoff in einem Salzarmpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA und 14,4 mM β-Merccapethanol) bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
  2. Dialyse gegen den niedrigen Salzpuffer mit 4 M Harnstoff für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur. Rühren Sie den Puffer vorsichtig mit einem magnetischen Rührer um, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten und Konzentrationsgradienten zu vermeiden.
  3. Nach 2,5 Stunden wird die Dialysemembran für weitere 2,5 Stunden bei Raumtemperatur in den salzarmen Puffer mit 2 Millionen Harnstoff überführt, wobei während des gesamten Vorgangs sanftes Rühren gewährleistet ist.
  4. Dialyse gegen den niedrigen Salzpuffer ohne Harnstoff bei 4 °C für 18 Stunden.
  5. Dialysierte Proben werden mit 10 mM H2O2 für 15 Minuten behandelt, gefolgt von einer Behandlung mit 10 oder 100 mM Dithiothreitol (DTT) für weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur.
  6. Proteinproben werden standardmäßig mit 10 % (w/v) SDS-PAGE ohne β-Merccapethanol analysiert und mit 10 ml Coomassie-Blau gefärbt.
    HINWEIS: Bei der Verwendung von H2O2 sollten Sie vorsichtig damit umgehen, da es ein starkes Oxidationsmittel ist und Verbrennungen verursachen kann. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, um Kontakt mit Haut und Augen zu vermeiden. DTT kann Haut, Augen und Atemwege reizen. Bei der Arbeit mit DTT und H2O2 ist es unerlässlich, die richtigen Sicherheitsprotokolle einzuhalten, um Risiken zu minimieren.

5. Reinigung von GFAP aus dem Gehirn von AxD-Ratten (Abbildung 4A,B)

  1. Entfernen Sie Hirngewebe mit 10 mL TEN-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl und 5 mM EDTA) mit einem Douce-Homogenisator.
  2. Zentrifugiere die Gehirnhomogenate bei 76.000 xg bei 4 °C für 20 Minuten und extrahiere dann das resultierende Pellet mit 10 mL Triton X-100 Puffer (1 % (v/v) Triton X-100 im TEN-Puffer).
  3. Zentrifugieren Sie mit 76.000 xg bei 4 °C für 20 Minuten und extrahieren Sie anschließend das resultierende Pellet mit 10 ml Saccharosepuffer (0,85 m Saccharose und 0,5 % (v/v) Triton X-100 in TEN-Puffer).
  4. Zentrifugieren Sie bei 76.000 xg bei 4 °C für 20 Minuten und extrahieren Sie anschließend das resultierende Pellet mit 10 mL Hochsalzpuffer (1,5 M KCl und 0,5 % (v/v) Triton X-100 in TEN-Puffer).
  5. Zentrifugieren Sie bei 76.000 xg bei 4 °C für 20 Minuten und extrahieren Sie anschließend das endgültige Pellet mit 10 mL Harnstoffpuffer (8 m Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 5 mM EDTA).
  6. Sammeln Sie die Überlagerungsfraktion und dialysieren Sie gegen den Q-Säulenpuffer (6 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA und 14,4 mM β-Mercapttoethanol).
  7. Laden Sie die Dialysate in einem NGC-Chromatographiesystem auf eine Anionenaustauschsäule.
  8. Elutieren Sie das gebundene Protein mit einem linearen Gradienten von 0–0,5 M NaCl im Q-Puffer bei einer Durchflussrate von 1 mL/min.
  9. Pool GFAP-haltige Fraktion und Dialyse gegen den S-Säulenpuffer (6 m Harnstoff, 20 mM MES, pH 6 und 14,4 mM β-Mercapptoethanol).
  10. Dialysate auf eine Kationenaustauschsäule auftragen und dann die gebundenen Proteine mit einem linearen Gradienten von 0–1 M NaCl im S-Puffer mit einer Durchflussrate von 1 mL/min eluieren.
  11. Analysieren Sie elutierte Fraktionen mittels SDS-PAGE- und Coomassie-Blaufärbung und sammeln Sie solche, die gereinigtes GFAP enthalten.

6. Analyse der GFAP-Ubiquitinierung durch Immunblotting (Abbildung 4C)

  1. Führe gereinigtes GFAP auf 10% (mit v/v) SDS-PAGE Gel aus.
  2. Übertragen Sie die Proteine aus dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran.
  3. Blockieren Sie die Membran, indem Sie sie mit 10 mL 3 % (w/v) Rinderserumalbumin in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) mit 0,1 % (v/v) Tween 20 (TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Inkubieren Sie die Membran mit 5 μL Anti-GFAP und 5 μL Anti-Ubiquitin-Primärantikörpern, verdünnt in 5 ml TBST bei 4 °C über Nacht. Wasche die Membran dreimal mit TBST.
  5. Inkubieren Sie die Membran mit 5 μL sekundärer Antikörper, die mit fluoreszierenden Farbstoffen konjugiert und in 5 ml TBST bei Raumtemperatur mindestens 1 Stunde verdünnt sind. Wasche die Membran dreimal mit TBST.
  6. Nehmen Sie Bilder mit einem fluoreszierenden Bilderkennungssystem auf.
  7. Analysieren Sie die In-vitro-Montage nativer GFAP mittels TEM und Sedimentationstests (Abbildung 5) mit demselben Verfahren wie in den Schritten 2.1 bis 2.13 und den Schritten 3.1 bis 3.6 beschrieben.

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Ergebnisse

Um zu untersuchen, wie AxD-verursachende Mutationen die Eigenschaften der GFAP-Assemblierung beeinflussen, stellten wir rekombinante Proteine in Bakterien mit einem PET-basierten Expressionssystem her. Wir beschreiben die Protokolle zum Ausdrücken und Reinigen von GFAP, wobei wir WT GFAP als Beispiel verwenden. Nach der IPTG-Induktion (Abbildung 1A, Bahn 2) wurde GFAP durch einen dreistufigen Prozess gereinigt, der die Vorbereitung des Inklusionskörpers (Abbildung 1B

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Diskussion

Dieses Protokoll etabliert einen umfassenden experimentellen Rahmen für die biochemische Charakterisierung von GFAP und seinen krankheitsassoziierten Mutanten. Durch die Bereitstellung eines zuverlässigen und standardisierten Ansatzes ist diese Methode eine wertvolle Ressource, die unser Verständnis der biologischen Rollen von GFAP und seiner pathologischen Implikationen, insbesondere im Kontext von AxD, erweitert. In diesem Abschnitt besprechen wir mehrere kritische Aspekte des Protokol...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Tracy Hagemann (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) für die Bereitstellung der R237H-Knock-in-Ratten. Der Vorschlag und die Unterstützung von Prof. Albee Messing (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) zu dieser Studie werden sehr geschätzt. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (111-2320-B-007-008 und 112-2320-B-007-006 an N.-H.L. und M.-D.P.) unterstützt. Wir danken auch dem BioTEM an der National Tsing Hua University (MOST-104-2731-M-007-002) für die Nutzung der Geräte in dieser Studie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
30% Acrylamid/bis-Lösung 37,5:1Biorad1610158
Ammoniumpersulfat (APS)Biorad1610700
AmpicillinUSB11259
Anti-GFAP-AntikörperZell-Signaltechnik12389
Anti-Ubiquitin-AntikörperMilliporeST 1200Klon FK2
Avanti J-26S XP ZentrifugeBeckman
ChloramphenicolUSB23660
CM-SephroseCytiva1707 1901
Coomassie-Blau-FarbstoffUSB32826
KupfergitterTed Pella01753-F
CS 150 NX Micro UltracentrfugeHitachiNA
Dounce-HomogenisatorWheaton
DTTURDTT
E. coli BL21(DE3) pLysS-StammAgilent
EasiGlowTed Pella
ECL-ReagenzPerkinElmerNEL 105001
EDTAUSB15699
H2O2Sigma-Aldrich18312
HiRes S-SpalteCytiva2927 5877
HiTrap Q-SpalteCytiva1711 5301
IPTGURIPTG
KClHoneywell12636
LB medium (LB Agar)USB75851
LB Medium (LB Brühe)BD Difco244620
MercapptoethanolSigma-AldrichM3148
MESSigma-AldrichM8250
NaClHoneywell31434S
NGC-ChromatographiesystemBioRad
Optima XE-90 UltrazentrifugeBeckman
PMSFACROS ORGANICS215740050
PolyehtyleneiminSigma-AldrichP3143
RotorBeckman
S55S-RotorHitachi
S80AT3-RotorHitachi
SDSUSB75819
SDS-PAGEBiorad
StarBright Blue 520 Ziegen-Anti-Maus IgG Biorad12005867
StarBright Blue 700 Ziegen-Anti-Kaninchen IgG BioRad12004161
SucroseSigma-AldrichS5391
TEMEDUSB76320
Transmissionselektronenmikroskop H-7700)HitachiNA
TrisUSB75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
UranylacetatElektronenmikroskopwissenschaften  22400
HarnstoffHoneywell15604H

Referenzen

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Experimentelle Ansätze zur biochemischen Analyse des glialen fibrillären sauren Proteins und seiner krankheitsassoziierten Varianten
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