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Methodenartikel

Wirkung des Yi-Nao-Jie-Yu-Rezepts auf die Depression nach dem Schlaganfall bei Ratten unter Verwendung einer Verstopfung der mittleren Gehirnarterie in Kombination mit Verhaltensfixierung

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DOI:

10.3791/69537

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9. Januar 2026

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1School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 2Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3Capital Medical University Yanjing College, 4School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 5Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines Rattenmodells der Postschlaganfalldepression (PSD) durch die Kombination der Okklusion der mittleren Gehirnarterie (MCAO) mit chronischem leichtem Stress, Verhaltensbeschränkung und Isolationsunterbringung sowie der Bewertung der therapeutischen Wirkung des Yi-nao-jie-yu-Rezepts (YNJYP) mittels Verhaltenstests.

Zusammenfassung

Post-Stroke-Depression (PSD) ist eine häufige, behandelbare Komplikation des Schlaganfalls, gekennzeichnet durch depressive und somatische Symptome, die die Genesung und Lebensqualität der Patienten beeinträchtigen. Diese Studie beschreibt ein Protokoll, das die Okklusion der mittleren Gehirnarterie (MCAO) mit Verhaltensfixierung und Isolationsbehausung kombiniert, um ein Ratten-PSD-Modell zu etablieren, und bewertet die therapeutische Wirkung von Yi-nao-jie-yu Prescription (YNJYP) auf die adulte Neurogenese bei PSD-Ratten. Zur Modellbildung unterzogen Ratten in den Gruppen Schlaganfall, PSD, Fluoxetinhydrochlorid (FXT) und YNJYP MCAO: Eine Monofilamentnaht wurde für 2 Stunden Ischämie von der inneren Halsschlagader zur mittleren Großhirnarterie (MCA) vorgeschoben, gefolgt von einer Reperfusion. Ab Tag 7 nach dem MCAO wurden die Ratten in den PSD-, FXT- und YNJYP-Gruppen für 2 Stunden täglich für 7 Tage in einer maßgeschneiderten T-förmigen Plattform untergebracht und gefesselt. Verhaltensanalysen umfassten den erzwungenen Schwimmtest (FST, für Verzweiflung), den Saccharosekonsumtest (SCT, für Anhedonie) und den Open-Field-Test (OFT, für exploratives Verhalten). Nach 4 und 8 Wochen nach dem Schlaganfall zeigten PSD-Ratten eine längere Immobilitätszeit bei FST und eine niedrigere Sucharosepräferenz bei SCT als Schlaganfallratten (P < 0,01). YNJYP kehrte diese depressiv-ähnlichen Verhaltensweisen um (P < 0,01) mit einer Wirksamkeit, die mit FXT vergleichbar ist. Dieses Protokoll bestätigt die Validität des PSD-Modells und das therapeutische Potenzial von YNJYP, unterstützt durch rigorose Experimente und Datenanalyse.

Einleitung

Post-Stroke-Depression (PSD) ist eine häufige und behandelbare Komplikation eines Schlaganfalls, die den Rehabilitationsprozess und die Lebensqualität der Patienten erheblich beeinflusst. PSD-Patienten leiden nicht nur unter körperlichen funktionellen Beeinträchtigungen, sondern auch mit psychischen Störungen wie Niederstimmung und Interesseverlust konfrontiert. Dies behindert die Wiederherstellung neurologischer Funktionen erheblich und erhöht sogar die Sterblichkeitsrate. Derzeit ist die Pathogenese der PSD komplex und umfasst mehrere Aspekte wie Neurobiologie, Neurotransmitterungleichgewicht und entzündliche Reaktion. Es besteht ein dringender Bedarf, wirksame Interventionsmethoden gründlich zu erforschen.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein zuverlässiges und reproduzierbares Rattenmodell von PSD zu etablieren, das den menschlichen Zustand eng nachahmt, indem mittele Zerebralarterien-Okklusion (MCAO) mit chronischem leichtem Stress (CMS, hauptsächlich Verhaltensfixierung) und Isolationsunterbringung kombiniert werden, und dieses Modell zur Bewertung potenzieller Therapeutika wie Yi-nao-jie-yu Prescription (YNJYP) zu nutzen. Die Begründung für die Entwicklung dieser Technik liegt in der Notwendigkeit, sowohl die anfängliche ischämische Belastung als auch den anschließenden chronischen psychischen Stress, die als Schlüsselkomponenten der PSD-Pathogenese anerkannt werden, in ein einheitliches standardisiertes Modell 1,2,3 zu integrieren. Im Vergleich zu alternativen Methoden, wie solche, die ausschließlich auf umfangreichen CUMS-Paradigmen basieren, bietet dieses Protokoll einen fokussierteren und replizierbaren Ansatz, indem eine spezifische Form der Verhaltensbeschränkung eingesetzt wird, die die Bewegungseinschränkung simuliert, die Schlaganfallpatientenhäufig erleben.

Dieses Modell trägt zur breiteren PSD-Literatur bei, indem es einen detaillierten, praktischen Rahmen zur Einlösung und Bewertung von PSD bei Nagetieren bietet und so den Bedarf an Standardisierung in der präklinischen Forschung adressiert. Forscher, die die kombinierten pathophysiologischen Effekte von zerebraler Ischämie und Post-Schlaganfall-Stress untersuchen oder neuartige Interventionen für PSD screenen, könnten dieses Protokoll als angemessen empfinden, da es klare Verfahren für Modellerstellung, Stressanwendung und Verhaltensbewertung festlegt.

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Protokoll

Das Tierversuchsprotokoll wurde vom Animal Care and Use Committee der Beijing University of Chinese Medicine genehmigt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung

  1. Erhalten Sie 216 männliche Sprague-Dawley (SD) männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten mit einem Gewicht von 300–320 g.
  2. Gewöhnen Sie die Ratten eine Woche vor dem Experiment an das Wohnumfeld.
    1. Halten Sie die Wohnverhältnisse bei 23 ± 3 °C, 45 % ± 5 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus (Licht an um 8:00 Uhr, aus um 20:00 Uhr).
    2. Fünf Ratten pro Käfig mit ad libitum Zugang zu sterilem Standardfutter und Wasser.
      HINWEIS: Minimieren Sie die Anzahl der eingesetzten Tiere und verringern Sie das Leiden durch sanfte Handhabung und optimierte Verfahren (z. B. verstellbare Fesseln zur Verhinderung von Atemunterdrückung).

2. Operation der mittleren zerebralen Artenförklusion (MCAO)

HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt die Etablierung des MCAO/Reperfusions-(MCAO/R)-Modells, das aus Bederson et al.6 modifiziert wurde.

  1. Bereitet die Ratten auf die Operation vor.
    1. Faste die Ratten über Nacht (12 Stunden) vor der Operation (keine Wasserbeschränkung).
    2. Betäuben Sie die Ratten durch eine intraperitoneale Injektion von 1 % Natriumpentobarbital (50 mg/kg).
      HINWEIS: Es wurden keine weiteren Analgetika verabreicht, da Natriumpentobarbital ausschließlich als Anästhetikum verwendet wurde.
      VORSICHT: Natriumpentobarbital ist ein kontrolliertes Anästhetikum. Führe sie in einer Abzugshaube, trage Handschuhe und Schutzbrille und lagere sie in einem verschlossenen Schrank gemäß den institutionellen Vorschriften.
  2. Sichern und bereiten Sie die Operationsstelle vor.
    1. Legen Sie betäubte Ratten in Rückenposition und richten Sie ihre Gliedmaßen.
    2. Rasieren Sie das Nackenfell und desinfizieren Sie die Haut mit einem geeigneten Desinfektionsmittel (z. B. 75 % Ethanol).
  3. Decken Sie die Halsgefäße frei und bereiten Sie sie vor.
    1. Mach einen 2–3 cm langen Schnitt in der Halshaut und schneide dann die subkutanen Drüsen und Faszien stumpf auf. Trennen Sie die arterie Halsschlagader (CCA), die Arteria internal carotis (ICA) und die arterie external carotis arterie (ECA), die von den Ästen der CCA gebildet werden.
    2. Lokalisieren Sie die CCA, legen Sie zwei Nähte als Reserve darunter, ligatizieren Sie eine nahe dem Herzende und binden Sie einen lebenden Knoten nahe der Bifurkation des CCA mit der anderen Naht.
    3. Verwenden Sie eine arterielle Klemme, um das distale Ende der CCA in der Nähe der Bifurkation zu schließen.
    4. Finden Sie das ECA und verbinden Sie es mit einer Naht.
  4. Führe die Naht ein, um das MCA zu verschließen.
    1. Schneiden Sie vorsichtig einen Schnitt in der Wand zwischen der Ligaturstelle des proximalen Endes des CCA und der Klemmstelle des Arterieclips und führen Sie dann einen speziellen Gewindestöpsel (Monofilamentnaht) in diesen Schnitt ein.
    2. Öffnen Sie den Arterienclip und stecken Sie den Gewindestöpsel von der Gabel aus in den ICA, bis leichter Widerstand spürbar ist, dann stoppen Sie (Abbildung 1).
      HINWEIS: Die Nahtlänge (18 mm ± 2 mm) ist entscheidend für eine konstante MCA-Verschlusserscheinung; Passen Sie leicht das Gewicht der Ratte an (300–320 g).
  5. Infolge von Ischämie und Reperfusion.
    1. Halte eine Ischämie für 2 Stunden (streng mit Stoppuhr getaktet).
    2. Nach 2 Stunden ziehen Sie die Naht vorsichtig heraus, um die Durchblutung der MCA wiederherzustellen, schneiden Sie die überschüssige Naht ab und entfernen Sie die Arterienklammer.
  6. Schließen Sie die Operationsstelle und überwachen Sie die Genesung.
    1. Spülen Sie den Schnitt mit steriler Kochsalzlösung und nähen Sie anschließend das subkutane Gewebe und die Haut.
    2. Setzen Sie die Ratten in einen Erholungskäfig (gehalten bei 25 ± 1 °C), bis sie wieder zu Bewusstsein kommen; Beobachte 24 Stunden lang auf Blutungen oder Stress.
  7. Richte die Schein-Operationsgruppe ein.
    1. Führen Sie dieselbe Halsdissektion und Gefäßexposition wie in den Schritten 2.1-2.3 durch.
    2. Führe die Naht nur für 5 mm in die CCA ein und entferne sie dann sofort; Nähen Sie den Schnitt ohne MCA-Verschluss.

3. Gruppierung der Tiere

  1. Teilen Sie die Ratten zufällig in sechs Gruppen (n = 36 pro Gruppe anfangs) für die neurologische Bewertung ein.
    1. Schlaganfallgruppe: Nur MCAO, keine Verhaltensbeschränkung oder medikamentöse Behandlung.
    2. PSD-Gruppe: MCAO + Verhaltensfixierung + Isolationsunterkunft, keine medikamentöse Behandlung.
    3. FXT-Gruppe: MCAO + Verhaltensfixierung + Isolationsgehäuse + Fluoxetin-Hydrochlorid-Gavage.
    4. YNJYP-Gruppe: MCAO + Verhaltensbeschränkung + Isolationsunterbringung + Yi-nao-jie-yu verschreibungspflichtiges (YNJYP) Gavage.
    5. Leere Gruppe: Keine Operation durchgeführt.
    6. Schein-Operationsgruppe: Keine Verstopfung der mittleren Großhirnarterie.
  2. Ratten mit Werten von 0 oder 4 oder solche, die nach der Operation gestorben sind, werden ausgeschlossen.
    1. Führen Sie 24 Stunden nach MCAO die Longa7 neurologische Bewertung durch, um qualifizierte Ratten auszuwählen.
    2. Verwenden Sie die 5-Punkte-Longa-Skala: 0 = kein Defizit; 1 = Beugung der Vordergliedmaße beim Anheben durch den Schwanz; 2 = kreisförmiges Gehen zur Paretikseite; 3 = zur Paretikseite hinfällig; 4 = Bewusstlosigkeit oder Unfähigkeit zu gehen.

4. Verabreichung von Fluoxetinhydrochlorid (FXT) und YNJYP

  1. Bereite YNJYP und FXT vor.
    HINWEIS: YNJYP enthält sechs chinesische Heilmittel: Ciwujia (Acanthopanax senticosus-Wurzeln ) 30 g, Yujin (Curcuma longa-Rhizome ) 10 g, Wuweizi (Schisandra chinensis-Früchte ) 15 g, Zhizi (Gardenia jasminoides-Früchte ) 10 g, Danshen (Salvia miltiorrhiza-Wurzeln ) 15 g und Chuanxiong (Ligusticum chuanxiong Rhizome) 15 g (bereitgestellt von der Abteilung für Pharmazie, Drittes Angeschlossenes Krankenhaus der Beijing University of Chinese Medicine). Basierend auf früheren Studien8 wurde die intragastrische Verabreichungsdosis auf 9,92 g/(kg·d) bestimmt.
    1. Lösen Sie die Fluoxetin-Hydrochloridkapseln in destilliertem Wasser, um eine Konzentration von 0,233 g/L bei Verwendung zu erreichen. Basierend auf der Dosierung für Erwachsene multipliziert mit sieben, setzen Sie die Dosierung für Ratten auf 2,33 mg/(kg·d).
  2. Verabreichen Sie Medikamente mittels Gavage.
    1. Beginnen Sie am ersten Tag nach dem MCAO mit der Gavage und setzen Sie bis zum Ende des Experiments fort, wobei das Verfahren morgens in allen Gruppen konsequent durchgeführt wird.
    2. Geben Sie FXT an die FXT-Gruppe bei 2,33 mg/(kg·d), YNJYP an die YNJYP-Gruppe bei 9,92 g/(kg·d) und 0,9 % Normalsalzlösung (10 mL/kg) an die Stroke- und PSD-Gruppen.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine 1-mL Gavage-Nadel; Stellen Sie sicher, dass die Nadel in den Magen (nicht in die Luftröhre) eingeführt wird, um eine Aspiration zu vermeiden.

5. Chronischer leichter Stress (Verhaltensfixierung) in Kombination mit Isolationsunterkünften

  1. Beginnen Sie am 7. Tag nach MCAO mit Verhaltensfixierung und Isolationsunterbringung (um die akute Schlaganfallphase zu vermeiden).
  2. Bereiten Sie die maßgefertigte T-förmige Sicherungsplattform vor.
    1. Der Bahnsteig besteht aus einem Sockel (20 cm × 10 cm × 2,8 cm) und einem Sicherungsbereich (22 cm × 6,6 cm).
    2. Der Fesselbereich enthält Schlitze zum Befestigen von Kopf und Gliedmaßen der Ratte sowie drei verstellbare Gurte für verschiedene Rattengrößen (Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4).
      HINWEIS: Die Plattform ist von Chen3 und Tian4 modifiziert und verfügt über zusätzliche Vordergliedmaßenschlitze, um die paretische Haltung von Schlaganfallpatienten zu simulieren.
  3. Führe tägliche Fesselung an.
    1. Wählen Sie jeden Tag zufällig ein 2-Stunden-Fenster aus (z. B. 9:00–11:00 Uhr oder 14:00–16:00 Uhr), um zirkadiane Verzerrungen zu vermeiden.
    2. Befestigen Sie jede Ratte mit Schlitzen und Riemen an der Plattform; Stelle die Enge an, um Kämpfen zu vermeiden, aber keine Atemunterdrückung.
    3. Halten Sie die Zurückhaltung für 2 Stunden ununterbrochen an 7 aufeinanderfolgenden Tagen aufrecht.
  4. Hausratten isoliert.
    1. Ratten in den PSD-, FXT- und YNJYP-Gruppen werden zu Beginn der Verhaltensfixierung aus der Gruppenunterbringung (fünf Ratten pro Käfig) in einzelne Käfige übertragen.
    2. Einfamilienwohnung aufrechterhalten, bis die Verhaltensbeschränkung abgeschlossen ist (nach MCAO-Tag 14).

6. Sukkrorosekonsumtest (SCT)

HINWEIS: Wählen Sie zufällig sechs Ratten aus jeder Gruppe 2, 4 und 8 Wochen nach MCAO aus. Teste alle Ratten in der Reihenfolge SCT, OFT und FST.

  1. Bereite die Ratten auf den Test vor.
    1. Fast und entziehe den Ratten vor dem Test 24 Stunden das Wasser.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Raumtemperatur (23 ± 2 °C) und die Beleuchtung mit dem Wohnraum übereinstimmen.
  2. Führe den Test durch.
    1. Stellen Sie zwei Flaschen (je 150 ml) in jeden Käfig: eine mit Leitungswasser und eine mit 1 % Saccharoselösung.
    2. Nach 1 Stunde freiem Trinken werden die Mengen an Saccharoselösung und das verbrauchte Wasser erfasst.
  3. Berechnen Sie die Präferenz für Saccharose.
    1. Verwenden Sie die Formel: Saccharosepräferenz (%) = (Volumen der konsumierten Saccharoselösung / Gesamtvolumen verbraucht) × 100 %.
    2. Vertauschen Sie die Positionen der beiden Flaschen zur Hälfte der Trinkphase, um die Positionsverzerrung zu vermeiden.

7. Freifeldtest (OFT)

HINWEIS: Wählen Sie dieselbe Rattencharge aus jeder Gruppe aus, die für die FST verwendet werden, in der 2., 4. und 8. Woche. Fasten und entziehen Sie die Ratten 24 Stunden vor dem Test, um die physiologischen Bedingungen zu erhalten.

  1. Bereitet das offene Feldgerät vor.
    1. Verwenden Sie eine schwarze Quadratbox mit dem Boden in 25 gleich große Gitter.
    2. Halte den Testraum ruhig und schwach beleuchtet.
  2. Führe den Test durch.
    1. Platziere jede Ratte in das mittlere Gitter der Box und starte einen 5-Minuten-Timer.
    2. Trage horizontale Aktivität (Anzahl der Gitterkreuzungen mit drei Vierteln der Pfoten in einem neuen Raster) und vertikale Aktivität (Anzahl der Rücken mit zwei Vierteln der Pfoten vom Boden durch manuelle Beobachtung mit Handzählern) auf.
    3. Zeichnen Sie die Zeit im zentralen Raster und die Pflegefrequenz auf (optional, für zusätzliche Verhaltenseinblicke).

8. Erzwungener Schwimmtest (FST)

HINWEIS: Wählen Sie dieselbe Rattencharge aus jeder Gruppe aus, die für die FST verwendet werden, in der 2., 4. und 8. Woche. Fasten und entziehen Sie die Ratten 24 Stunden vor dem Test, um die physiologischen Bedingungen zu erhalten.

  1. Bereite das Testgerät vor.
    1. Füllen Sie einen Glaszylinder mit einer angemessenen Menge Wasser, wobei der Wasserstand hoch genug ist, sodass sich die Ratte nicht durch Berühren des Bodens mit den Füßen stützen kann.
    2. Stellen Sie die Wassertemperatur auf 25 ± 1 °C ein.
  2. Führe den Test durch.
    1. Setze jede Ratte in den Zylinder und lasse sie 5 Minuten schwimmen.
    2. Zeichnen Sie die gesamte Unbeweglichkeitszeit während der 5 Minuten auf.
    3. Definieren Sie "Unbeweglichkeit" als passives Schwimmen (nur minimale Bewegungen, um die Nase über dem Wasser zu halten) und "Aktivität" als Gliedmaßenpaddeln oder Wandkratzen.
  3. Pflege von Ratten nach dem Test.
    1. Nehmen Sie die Ratte nach 5 Minuten aus dem Zylinder, trocknen Sie sie mit einem Handtuch und legen Sie sie 30 Minuten lang unter eine Heizlampe (30 ± 2 °C), um Unterkühlung zu verhindern (Abbildung 5).

9. Statistische Analyse

  1. Organisieren Sie Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD).
  2. Daten mit SPSS Version 20.0 Software analysieren.
  3. Vor der Durchführung parametrischer Tests wird die Daten auf Normalität (mit dem Shapiro-Wilk-Test) und Homogenität der Varianzen (mit Levene-Test) getestet. Die Daten jeder Gruppe entsprechen einer Normalverteilung und erfüllen die Varianzhomogenität.
    1. Verwenden Sie eine Einweg-Varianzanalyse (One-Way ANOVA) zum Vergleich der Stichprobendurchschnitte zwischen Gruppen, kombiniert mit Tests mit dem geringsten signifikanten Unterschied (LSD) und Student-Newman-Keuls (SNK). Verwenden Sie Welchs Test, wenn die Varianzen ungleich sind.
  4. Setze die statistische Signifikanz auf p < 0,05.

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Ergebnisse

Insgesamt wurden in dieser Studie fünf experimentelle Gruppen zur relevanten Detektion eingerichtet. Nach statistischer Analyse der Verhaltensdaten jeder Gruppe von Ratten stellte sich heraus, dass in der vierten Woche des Experiments die Immobiliitätszeit der PSD-Gruppenratten im FST signifikant erhöht war im Vergleich zu den Schlaganfallgruppenratten und der Unterschied zwischen den beiden Gruppen statistisch signifikant war (P < 0,01); gleichzeitig war die Saccharosepräferenz der PSD-...

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Diskussion

Im Prozess der Erstellung des Ratten-Gehirnischämie-Modells gibt es verschiedene Modellierungsmethoden, darunter die Ligationsmethode, die Kraniotomie-Methode, die Erstickungsmethode und die Draht-Okklusionsmethode. Im Vergleich zu den drei Modellierungsmethoden Ligation, Kraniotomie und Erstickung zeigt die Draht-Okklusionsmethode bedeutende und einzigartige Vorteile. Diese Vorteile liegen hauptsächlich in drei Schlüsselaspekten: der minimalinvasiven Natur des Betriebs, der Präzision de...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Yuankai Su und Yonghao Sun schrieben das Manuskript, einschließlich der Interpretation der Ergebnisse und des Diskussionsabschnitts. Huiling Tian führte die Experimente durch und analysierte die Daten. Ning Ding und Xin Wang überprüften das Manuskript. Zitong Yang und Jingyao Zhao trugen zur Datensuche bei.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Erwachsene männliche Sprague-Dawley-RattenVital River Laboratory Animal Technology, Peking, ChinaNein. SCXK2012-0001300 & Dash; 320 g
Fluoxetin-Hydrochlorid-KapselnPatheon Frankreich, Jiangsu, China0943A
Granulate von YNJYPder Abteilung für Pharmazie, drittes angeschlossenes Krankenhaus der Pekinger Universität für Chinesische MedizinHausgemacht
Offene Box für Open-Field-TestHausgemacht -
NatriumpentophenobarbitalSigma Corporation of AmericaP3761-5
Der OkklusionsfadenBeijing Shadong Biotechnology Co., Ltd2838-A4
Wassertank für erzwungenes SchwimmexperimentHausgemacht -

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Nachdrucke und Genehmigungen

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