Methodenartikel

Reinigung von HLA-G+ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse

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DOI:

10.3791/69545

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13. März 2026

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1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, University of Toyama, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht die Reinigung, Charakterisierung und Kultivierung primärer HLA-G+-extravillöser Trophoblasten (EVT) aus der Decidua basalis und der chorionischen Membran menschlicher Term-Plazentas. Primäre EVT-Kulturen erhalten die Lebensfähigkeit 96 Stunden lang aufrecht, was eine Kokultivierung mit probengematchten mütterlichen Immunzellen sowie eine anschließende zytometrische und molekulare Analyse ihrer Interaktionen ermöglicht.

Zusammenfassung

Die menschliche mütterlich-fetale Schnittstelle stellt eine einzigartige immunologische Umgebung dar, in der mütterliche Immunzellen und fetale extravillluse Trophoblasten (EVT) direkten zellulären Kontakt haben, um eine Immuntoleranz aufzubauen und aufrechtzuerhalten. EVT zeigen einen ausgeprägten Immunophenotyp, der durch die Expression tolerogener Moleküle wie HLA-G, PD-L1 und PD-L2 gekennzeichnet ist, die eine entscheidende Rolle bei der Modulation der mütterlichen Immunantworten spielen. Außerdem exprimiert menschliches EVT HLA-C, das direkt von mütterlichen NK- und T-Zellen erkannt werden kann und deren Aktivierung fördert. Wichtig ist, dass keine Orthologe von HLA-C oder HLA-G in Tiermodellen vorhanden sind, die für die Forschung verwendet werden, und die Maustrophoblast keine MHC-Expression aufweist. Daher ist die Untersuchung der phänotypischen und funktionellen Eigenschaften menschlicher EVT aus Plazentagewebe unter physiologischen und pathologischen Bedingungen unerlässlich, um die Mechanismen der Schwangerschaftsaufrechterhaltung und der Pathophysiologie der Plazentaentzündung im Zusammenhang mit Präeklampsie, Frühgeburt, fetaler Wachstumseinschränkung und Plazenta-Accreta zu klären. Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methodik zur Isolierung und Charakterisierung primärer menschlicher EVT aus gesundem, terminiertem Plazentagewebe sowie nach Frühgeburt und Präeklampsie. Dazu gehören: (1) Dissektion von Plazenta- und Chorionmembrangeweben; (2) enzymatische Verdauung und die Herstellung von Einzelzellsuspensionen; (3) EVT-Reinigung mittels FACS-Sortierung; (4) Phänotypische Charakterisierung mittels hochdimensionaler Flusszytometrie; und (5) kurzfristige In-vitro-Kultur und Kokultivierung mit mütterlichen Immunzellen bis zu 96 Stunden. Der Schwerpunkt liegt darauf, hochreine und lebensfähige EVT zu erhalten, die für nachgelagerte Anwendungen wie immunologische funktionelle Assays, Protein- und Genexpressionsanalysen geeignet sind. Die Implementierung dieses Protokolls ermöglicht eine robuste und reproduzierbare Plattform für das Verständnis von EVT- und mütterlichen Immunzellinteraktionen sowie deren Auswirkungen auf gesunde und komplizierte Schwangerschaften.

Einleitung

Die menschliche Plazenta umfasst vier große Kategorien von Trophoblast-Typen: Trophoblast-Stammzellen, Syncytiotrophoblasten, villusen Cytotrophoblasten und extravillöse Trophoblasten (EVT), die jeweils unterschiedliche Funktionen und phänotypische Merkmale aufweisen. Darunter zeigen EVT einzigartige immunologische Merkmale, darunter eine hohe Expression immunsuppressiver Moleküle wie HLA-G, PD-L1, PD-L2 und Mitglieder der B7-Familie sowie polymorphes HLA-C 1,2,3,4,5,6. EVT dringen tief in das mütterliche Dezidualgewebe, Spiralarterien und das Myometrium ein und bringen sie in direkten Kontakt mit mütterlichen Immunzellen7. EVT zeichnen sich durch eine prominente Expression polymorpher HLA-C aus, einem wichtigen Vermittler der Interaktionen mit mütterlichen T- und NK-Zellen, die kontrolliert werden müssen, um die Immuntoleranz während der Schwangerschaft zu erhalten. Als einziges klassisches MHC-Molekül, das durch EVT exprimiert wird, ermöglicht HLA-C auch die Antigenpräsentation in mütterlichen Gedächtnis-T-Zellen und unterstützt den Immunschutz8. Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass EVT die regulatorischen CD4-T-Zellen und die tolerogenen Zustände von CD8-T-Zellen und NK-Zellen direkt erhöht, um sich vor Zytotoxizität und Immunabstoßung zu schützen 9,10,11,12,13. Darüber hinaus berichteten einige Studien von immunologischen Veränderungen der mütterlichen Immunzellen und der EVT der Plazenta, die nach Präeklampsie, Frühgeburt oder Fehlgeburt im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen entstanden sind: 14,15,16,17,18,19,20,21. Mehrere Möglichkeiten könnten diesen immunologischen Veränderungen zugrunde liegen, darunter i) bereits bestehende mütterliche T-Zell-Anomalie; ii) beeinträchtigte immunsuppressive Funktionen von EVT; oder iii) gestörte Wechselwirkungen zwischen den beiden Zelltypen. Um die zugrunde liegenden mechanistischen Treiber zu klären, sind ex vivo experimentelle Modellierungssysteme erforderlich, die die Bewertung mütterlicher Immunzellen und EVT-Interaktionen ermöglichen.

Die hier vorgestellten Methoden und Ansätze haben mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Methoden, die klassische Trophoblastlinien, Trophoblasten-Stammzellmodelle oder Organoide verwenden. Am wichtigsten ist, dass klassische Trophoblastenzelllinien und Trophoblasten-Stammzellmodelle keine wesentlichen Merkmale primärer EVT wiederholen, einschließlich ihrer MHC-Expressionsprofile 3,5,22,23. Zweitens beeinflussen die komplexen Medienanforderungen der humanen Trophoblast-Stammzellen (hTSC) und Organoidkulturen, die mehrere molekulare Inhibitoren enthalten, direkt die Funktion und den Phänotyp der Immunzellen und verhindern eine angemessene Bewertung von EVT- und Immunzellinteraktionen 22,24,25,26,27. Schließlich ermöglichen die zelluläre Vielfalt der hTSC-Kulturen nach der Differenzierung und die von innen nach außen gerichtete Natur der Plazenta-Organoidstrukturen Immuninteraktionen mit Trophoblast-Typen, die invivo nicht relevant sind, was die Klarheit der Studien verringert22,27.

Hier beschreiben wir Methoden zur Reinigung primärer HLA-G+ -EVT aus menschlichen Termingeweben der Plazenta, was eine Kultur von bis zu 96 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit von Immunzellpopulationen ermöglicht. Das Medium besitzt keine molekularen Inhibitoren, die EVT und Immunzellfunktionen beeinflussen, während deren Lebensfähigkeit erhalten bleiben. Dieser Ansatz bietet eine wertvolle Plattform für direkte ex-vivo-Studien zu EVT- und Immunzellinteraktionen bei gesunden und komplizierten Schwangerschaften. Es wird erwartet, dass sie zur Entdeckung der wichtigsten Treiber der mütterlich-fetalen Immuntoleranz beiträgt und therapeutische Ziele zur Lösung der Plazenta identifiziert.

Protokoll

Das institutionelle Überprüfungsgremium des Cincinnati Children's Hospital genehmigte dieses Forschungsprotokoll (Genehmigung #2021-0336), das Anforderungen an bioethische Überlegungen, den Umgang mit persönlichen Daten, infektiösen Krankheitserregern und Verfahren zur informierten Einwilligung gemäß US-Recht erfüllt. Jedes Labor sollte vor Beginn des Experiments eine Genehmigung einholen, die den nationalen Forschungsrichtlinien entspricht.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Kultivierung primärer HLA-G+ EVT, die die Lebensfähigkeit bis zu 96 Stunden für den sekundären funktionellen Assay erhalten, indem unser vorheriges Protokoll 2,28 verbessert wird. Siehe Hamilton et al.2 zur Etablierung einer HLA-G+ EVT-ähnlichen Zelllinie und Ikumi et al.28 zur Einbeziehung von abgestimmten mütterlichen dezidualen Lymphozyten.

1. Aufbau des Labors (Tag 0).

HINWEIS: Verwenden Sie einen Klasse-II-Biosicherheitsschrank (BSL2) zur Behandlung von Proben.

  1. Richten Sie zwei Wasserbäder bei 39 °C und 37 °C ein. Richte einen befeuchteten CO2-Inkubator bei 37 °C auf.
  2. Bereite 1x PBS vor, Wasche Medium A, Wasche Medium B, EVT-Kulturmittel A, B und C (Tabelle 1 und Tabelle 2).
  3. Tau 15 ml 10 mg/mL DNase-I-Lösung auf (Tabelle 1) und 500 ml 0,25 % Trypsin/EDTA in einem Wasserbad bei 37 °C.
  4. Stellen Sie einen Behälter mit biozidaler/viruzider Lösung (z. B. 10 % Bleichmittel) in den BSL2-Schrank zur Ableitung von flüssigen Abfällen. Stellen Sie einen Abfallbehälter mit einem Biohazard-Beutel im BSL2-Schrank für festen Abfall auf.
  5. Bereiten Sie saugfähige Pads, sterile Dissektionswerkzeuge (gebogene Pinzetten und 6 1/2" Scheren), sterile Metallfilter, Röhrenracks und sterile 50-mL konische Röhren im BSL2-Gehäuse vor.
  6. Bereiten Sie drei 50-ml-Kegelröhrchen vor (jeweils zwei mit 1x PBS und eines mit Waschmedium A für die Entnahme von Plazentagewebestücken während der Dissektion).

2. Probenentnahme (Tag 0)

HINWEIS: Verwenden Sie menschliche Plazenta mit Membranen, die durch Kaiserschnitt zwischen 24 und 42 Wochen nach der Schwangerschaft erhalten wurden. Eine vaginal zugeführte Plazenta kann weniger EVT verursachen.

  1. Beginnen Sie sofort mit der Bearbeitung der Plazenta in einem BSL2-Schrank, idealerweise innerhalb von 1–2 Stunden nach der Entbindung, um die Ausbeute der lebensfähigen Zellen zu maximieren. Halten Sie die Plazenta jederzeit auf Zimmertemperatur.
  2. Untersuchen Sie die Plazenta und dokumentieren Sie gegebenenfalls Größe, Gewicht und grobe morphologische Erscheinung.

3. Gewebedissektion (Tag 0)

  1. Membrandissektion
    1. Legen Sie die Plazenta mit dem Fetalgesicht nach oben (der Nabelschnureinsatzteil ist sichtbar). Entfernen Sie das Amnion, das die Membranschicht ist, die der fetalen Seite am nächsten ist, indem Sie manuell von der lateralen Membran in Richtung der Nabelschnur-Einstichstelle abziehen; Schneiden und entsorgen Sie das Amnion.
    2. Schneiden Sie die choriodeziduale Membran in 5 cm lange Streifen, beginnend von der Basis der Plazenta nach oben, während der Membranstreifen an der Plazenta befestigt bleibt.
    3. Legen Sie den choriodecidualen Membranstreifen auf die beiden Finger mit der dezidualen Seite nach oben und kratzen Sie vorsichtig die mütterliche Decidua parietalis mit der sterilen, gebogenen Zange vom Chorion ab.
      HINWEIS: Arbeiten Sie effizient und lassen Sie die Chorionmembran nicht austrocknen.
    4. Sammeln Sie die Chorionmembran in ein 50 ml konisches Rohr mit 20 ml Waschmedium A.
    5. Nehmen Sie Decidua parietalis zur decidualen Lymphozytenisolierung im 50-mL-Kegelrohr mit 20 ml PBS und folgen Sie dem von Ikumi et al. beschriebenen Protokoll zur Lymphozytenisolierung28.
    6. Schneiden Sie die Chorionmembran mit einer Schere im 50-mL-Rohr durch, bis sie kleine Stücke von <2 mm2 sind.
      HINWEIS: Die Gesamtmenge der abgesetzten Membran beträgt idealerweise 30 mL nach dem Schneiden.
    7. Verwerfen Sie das Wash Medium A und waschen Sie mehrmals mit PBS, bis das Supernatant klar ist.
  2. Plazenta-Dissektion
    1. Legen Sie die Plazenta zur mütterlichen Seite nach oben und entfernen Sie Blutgerinnsel. Schneiden Sie die Stücke der Plazenta-Basalplatte (Länge 2 cm, Breite 2 cm, Tiefe 0,5 cm) mit steriler Schere ab und vermeiden Sie die nekrotischen, verkalkten oder ischämischen Teile.
    2. Legen Sie das Stück Decidua basalis auf die Finger, die zur Villi (fetale Seite) nach oben zeigen. Entfernen Sie vorsichtig die Zocken aus der Decidua basalis mit einer Schere, um 2–3 mm Membran zu erhalten, wobei nur eine dünne Schicht Villi auf der Decidua basalis verbleibt.
    3. Nehmen Sie Decidua-basala-Gewebe in das 50-mL konische Rohr mit 20 mL PBS ein. Hacken Sie die Decidua basalis, bis sie zu kleinen Stücken von <2 mm2 werden.
      HINWEIS: Die Gesamtmenge des abgesetzten Gewebes beträgt idealerweise 15 ml nach dem Schneiden.
    4. Verwerfen Sie das PBS und waschen Sie das Dezidual-Basalis mehrmals mit PBS, bis das Supernatant ohne sichtbares Blut klar wird.
    5. Teilen Sie 15 ml Gewebesuspension in zwei 50-mL konische Röhren (je 7,5 ml in jedem Rohr).
      HINWEIS: Das Protokoll der Lymphozytenisolierung aus Decidua basalis unterscheidet sich von diesem Protokoll. Siehe das in Hamilton et al.2 bereitgestellte Protokoll.

4. Gewebeverdauung (Tag 0)

  1. Nach der abschließenden Reinigung der Chorionmembran und der Decidua basalis in Abschnitt 3 füllen Sie alle Tuben mit 1x PBS, zentrifugieren Sie sie bei 200 × g für 1 Minute und gießen Sie das Supernatant ab.
  2. Bereiten Sie den Tissue Digestion Enzyme Cocktail vor (Tabelle 1). Gib 150 ml warmen Tissue Digestion Enzyme Cocktail in eine 300 ml Glasflasche und dann 30 ml Chorionmembran in die Flasche.
  3. Fügen Sie 20 ml warmes DMEM/F20 und 80 ml warmes Tissue Digestion Enzyme Cocktail in zwei Glasflaschen mit 300 ml hinzu und geben Sie dann 7,5 ml Decidua Basalis in jede Flasche.
  4. Inkubieren Sie die Flasche mit Chorionmembran im 39 °C Wasserbad und die beiden Flaschen mit Decidua Basalis im 37 °C Wasserbad. Während der 15-minütigen Inkubation schütteln Sie alle Flaschen alle 3-4 Minuten (erste Verdauung).
  5. Nach der Verdauung wird das verdaute Gewebe durch Metallsiebe (Netzgröße 40) gefiltert. Geben Sie Wash Medium B zu den Geweben, um sie auszuspülen und die gelatinöse Substanz aufzulösen.
  6. Filtern Sie die Zellsuspensionen über einem 100-μm-Filter in 50-mL-Röhren, die mit Gewebetyp und Verdauungsnummer beschriftet sind.
  7. Fahren Sie mit der zweiten Verdauung fort, indem Sie das unverdaute Gewebe zurück in die 300-mL-Mediumflaschen transferieren, den Tissue Digestion Enzyme Cocktail wie in Schritt 4.2 beschrieben hinzufügen und die Schritte 4.2-4.6 wiederholen.
    HINWEIS: Alle Gewebe der Decidua basalis werden in eine 300-ml-Flasche übertragen. Halten Sie die Zellen, die nach der ersten und der zweiten Verdauung gewonnen werden, getrennt.
  8. Die Zellsuspension bei 650 × g 8 Minuten drehen und das Supernatant entsorgen.
  9. Kombinieren Sie die Pellets (aber die erste und zweite Verdauung getrennt) desselben Gewebetyps und derselben Verdauungszahl in einem Rohr. Mit Wash Medium B bis zu 25 ml füllen.

5. Ficoll-Dichtegradient (Tag 0)

  1. Bereiten Sie vier 50-mL konische Röhren vor, die mit Gewebetyp und Verdauungsnummer beschriftet sind. Gieße 12 ml Ficoll in die Röhren.
  2. Laden Sie vorsichtig die Zellaufhängungen auf den Ficoll. Zentrifugiere die Röhren bei 800 × g für 20 Minuten (Raumtemperatur) ohne Bremse.
  3. Übertragen Sie die Zellschicht an der Ficoll-Medium-Grenzfläche vorsichtig in saubere 50-ml-konische Röhren, die nach Gewebetyp und Verdauungsnummer gekennzeichnet sind, nach Zentrifugation.
    HINWEIS: Sammeln Sie die Schicht sorgfältig auf, ohne die Schnittstelle mit einer sterilen Transferpipette zu stören.
  4. Fülle die Tuben mit Wash Medium B und zentrifugiere 8 Minuten bei 650 × g.
  5. Entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie die Zellpellets mit dem verbleibenden Medium (ca. 0,5 ml) erneut. Falls nötig, halten Sie etwa 10 % der Zellsuspension für die Phänotypisierung getrennt und verwenden Sie 90 % für die Zellsortierung. Zählen Sie die Zellen, um Zellanzahl und Lebensfähigkeit zu bestimmen.

6. Sortierung von EVT (Tag 0)

  1. Geben Sie die resuspendierten Zellpellets in sterile FACS-Röhren, die mit Gewebetyp und Verdauungsnummer beschriftet sind. Fügen Sie Anti-CD45-BV785 (1:100), Anti-HLA-G-APC (1:125) und Anti-EGFR1-BV711 (1:160) hinzu (Tabelle 3). Inkubieren Sie die Röhren 20 Minuten lang bei Zimmertemperatur im Dunkeln.
  2. Gib 1 ml Wash Medium B hinzu und zentrifugiere sie bei 650 × g für 8 Minuten.
  3. Entsorge den Überstandsstoff und suspendiere die Zellpellets mit Wash Medium B erneut, sodass etwa 1 × 106-Zellen -/mL-Zellsuspension entstehen.
  4. Filtern Sie die Zellen direkt vor der Zellsortierung durch einen 40-μm-Zellsieb und sortieren Sie CD45-HLA-G+EGFR+ EVT in Röhren mit 1 ml EVT-Kulturmedium A gemäß der in Abbildung 1A beschriebenen Gating-Strategie.
    HINWEIS: Für eine optimale Trophoblasten-Lebensfähigkeit sollte ein Jet-in-Air-Zellsortierer (z. B. Bigfoot oder MoFlo) mit einer 100-μm-Düse verwendet werden. Fluidikbasierte Sortierer (z. B. DB S6 oder Sony Nano) können die Lebensfähigkeit der Trophoblast verringern, während magnetische Zellsortierstrategien (z. B. Easysep oder MACS) die Lebensfähigkeit erhalten können, aber eine geringe Reinheit aufweisen, was zu einer Überwucherung der stomalen Zellen in den Kulturen führt.
  5. Zentrifugieren Sie die FACS-Röhren mit sortierten Zellen, entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie die Zellpellets mit EVT Culture Medium B neu.
    HINWEIS: Im nächsten Abschnitt werden Sie, um Kulturplatten beim Sortieren der Zellen vorzubereiten.

7. Primäre HLA-G+ EVT-Kultur für den sekundären Assay (Tage 0 - 1)

  1. Beschichten Sie die Bohrungen der flachen 96-Bohrloch-Zellkulturplatten mit 50 μL 20 μg/mL Fibronectin (Tabelle 2) bei Raumtemperatur für 45 Minuten.
  2. Entfernen Sie das Fibronektin und geben Sie die Zellsuspension mit EVT Culture Medium B zu den Brunnen. Zielen Sie auf 0,5 × 10 EVT-Zellen mit5 Basalis/200 μL Medium/Bohrung und 1,0 × 10 Chorion-EVT-Zellen/200 μL Medium/Brunnen. Inkubieren Sie die Zellkulturplatten 12–18 Stunden im befeuchteten CO-2-Inkubator bei 37 °C (Tag 0 Inkubation).
  3. Am ersten Tag entfernen Sie Medium B, waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1x PBS und fügen Sie EVT Culture Medium C mit oder ohne T-Zellen für weitere (Ko)kultur hinzu (siehe Abschnitt 8).

8. Kokultur der primären HLA-G+ EVT mit aktivierten T-Zellen (Tage 0 - 4)

  1. Stimulation von CD8+T-Zellen durch einendritten Spender (Tage 0-1)
    1. Während der Sortierung von HLA-G+ EVT (Tag 0) isolieren Sie periphere Blutimmunzellpopulationen entweder aus gepaartem mütterlichem Blut oder nicht verwandten Blutspendern mit dem referenzierten humanen CD8+ T-Zell-Anreicherungscocktail (siehe Materialtabelle), gefolgt von Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation oder FACS-Sortierung.
    2. Prästimulieren T- oder NK-Zellen mit Anti-CD3/28-Perlen oder Zytokinen (z. B. IL2, IL15, IL12 oder IL18) im Lymphozytenzellkulturmedium je nach Wunsch.
  2. Kokultivierung von EVT mit aktivierten T-Zellen (Tage 1-4)
    1. Zählen Sie die Anzahl der Lymphozyten und stellen Sie Zellsuspensionen mit einem Lymphozyten-Kulturmedium mit einer Konzentration von 0,5 × 106 / ml her. Fügen Sie 1 × 105 Lymphozyten zu den primären EVT-Bohrungen hinzu (das Volumen des EVT-Kulturmediums C : Lymphozytenzellkulturmedium = 1:1). Inkubieren Sie die Platten 24–72 Stunden in einem befeuchteten CO2-Inkubator bei 37 °C.
    2. Entnehmen Sie Lymphozyten für die Durchflusszytometrieanalyse und sammeln Sie Supernatanten für die Zytokinanalyse.
    3. Entnehmen Sie EVT mittels Trypsinisierung und sammeln Sie EVT in die FACS-Röhren für die Durchflusszytometrieanalyse am Tag 4 (siehe Abschnitt 9).

9. Phänotypisierung der primären HLA-G+ EVT

HINWEIS: Beginnen Sie sofort mit der Durchflusszytometrie-Färbung und halten Sie EVT und alle benötigten Lösungen jederzeit bei Raumtemperatur.

  1. Zentrifugieren Sie die FACS-Röhren mit primärem EVT bei 650 × g für 7 Minuten und entsorgen Sie den Supernatanten.
  2. Gib die Caspase 3/7 Färbelösung (Tabelle 3) zu den Zellpellets und vermische sie vorsichtig.
  3. Färben Sie die Zellen mit Antikörpern (Tabelle 3), mischen Sie sie vorsichtig und inkubieren Sie weitere 20 Minuten (insgesamt 30 Minuten Inkubation).
  4. Gib 1 ml EVT Culture Medium C dazu, zentrifugiere die Röhren bei 650 × g für 7 Minuten und entsorge das Supernatant.
  5. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 0,4 ml Zell-EVT-Kulturmedium C. Gib 7-AAD-Färbelösung (5 μL/Zellsuspension) in die Röhren und analysiere sofort mit einem Durchflusszytometer.

Ergebnisse

Erwartete Zellergaben

Von 15 ml Decidua basalis ergibt das erwartete HLA-G+ EVT 0,1–0,3 × 106Zellen aus der ersten Verdauung und 0,1–0,6 × 106 Zellen aus der zweiten Verdauung (insgesamt 0,2–0,8 × 106Zellen). Aus 30 ml Chorionmembran werden die erwarteten HLA-G+-EVT-Erträge 0,4–1,0 × 106Zellen aus der ersten Verdauung und 0,4–1,5 × 106Zellen aus der zweiten Verdauung (insgesamt 0,8–2,5 × 106Zellen) erwartet. Der Anteil der Caspase 3/7-7-AAD-Live-EVT in den Isolaten wird voraussichtlich bei 90-95 % liegen.

Primäre HLA-G+ EVT-Kultur

Die Flowzytometrieanalyse der Linienmarker (HLA-G, HLA-C, EGFR) und Zelltodesmarker zeigte, dass dieses Protokoll eine lebensfähige primäre EVT-Kultur bis Tag 4 (96 Stunden nach dem Plattieren des sortierten EVT) liefert (Abbildung 1B-D). Repräsentative Lichtmikroskopiebilder von primären chorionischen und d.basalis HLA-G+ EVT werden nach 24, 48 und 72 Stunden Kultur gezeigt (Abbildung 2A-F).

Kokultur primärer HLA-G+ EVT mit T-Cellen

Dieses Protokoll verbesserte die Lebensfähigkeit der primären EVT 96 Stunden nach der Isolierung von der Plazenta – eine Verbesserung gegenüber unserem vorherigen Bericht 1,2,10. Daher ermöglicht es die Analyse von EVT-Reaktionen nach Kokultur mit vorstimulierten Lymphozyten, was eine akute Entzündung an der mütterlich-fetalen Schnittstelle nachahmt. EVT exprimiert polymorphe HLA-C sowie immunsuppressive kohemmende Moleküle wie PD-L1, PD-L2, PVR (auch bekannt als CD155), B7H3 und HLA-E, bestimmt durch extrazelluläre Durchflusszytometrie-Färbung (Abbildung 3A,B). EVT erhöhte die Expression von HLA-C sowie von PD-L1, PD-L2 und HLA-E, erhöhte jedoch nicht die Expression von PVR und B7H3 bei Kokultivierung mit aktivierten Lymphozyten für 72 Stunden gemäß Protokollabschnitt 8 (Abbildung 4A,B). Außerdem wurde kein Anstieg der EVT-Todesfälle beobachtet, wie die Färbung von 7AAD und Caspase 3/7 zeigt (Abbildung 4C,D).

Abbildung 1
Abbildung 1. Die Gating-Strategie für EVT-Zellsortierung und Durchflusszytometrieplots nach der Kultivierung des sortierten EVT. (A) Die repräsentative Gating-Strategie zur Sortierung von Decidua basalis EVT und chorionischer EVT. R1 ist das Live-Zellgatter im Forward-Side Scatter-Plot. R2 ist das Tor zum Ausschluss von CD45+-Leukozyten. R3 ist das HLA-G+EGFR+EVT-Gate. R4 ist der 7-AAD-Caspase3/7-Live-EVT. Obwohl das R4-Gatter nicht unbedingt für die Sortierung benötigt wird, wird es hier gezeigt, um die Viabilität des primären EVT zu demonstrieren. (B) Repräsentative Flowzytometriediagramme sortierter HLA-G+EGFR+EVT, nach 96 Stunden in vitro Kultur. (C,D) Frequenzen von Caspase 3/7-7-AAD- Live-EVT während der Art (Tag 0) und 96 Stunden Kultivierung (Tag 4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Die Morphologie von EVT während der In-vitro-Kultur . Repräsentative Lichtmikroskopie-Bilder von chorionischer EVT nach (A) 24 Stunden, (B) 48 Stunden und (C) 72 Stunden Kultur sowie Decidua basalis EVT nach (D) 24 Stunden, (E) 48 Stunden und (F) 72 Stunden Kultur. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3. Immunologische Phänotypen der primären EVT. (A) Die repräsentativen Flussdiagramme von HLAs und koinhibitorischen Molekülen auf primärem EVT, bestimmt durch extrazelluläre Flowzytometrie-Färbung (Tag 0). (B) Gepaarte Liniendiagramme zeigen die rohe MFI der IgG-Kontrolle und vollständige Färbung jedes Markers von d. basalis EVT (blau) und chorionischer EVT (grün) am Tag 0. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Immunologische Phänotypen der primären EVT mit oder ohne aktivierte Lymphozyten (Tag 4). (A) Repräsentative Flussdiagramme von EVT nach der 72-Stunden-Kultur (Tag 4) mit oder ohne aktivierte Lymphozyten von Drittanbietern. (B) Gepaarte Liniendiagramme zeigen MFI von EVT mit oder ohne aktivierte Lymphozyten von Drittanbietern. Blaue Diagramme stehen für decidua basalis EVT, grüne Diagramme für chorionische EVT. (C) Repräsentative Flusszytometrie-Plots für Caspase 3/7-7-AAD – Live-EVT mit oder ohne aktivierte Lymphozyten von Drittanbietern am Tag 4. (D) Gepaarte Liniendiagramme zeigen Häufigkeiten von Caspase 3/7-7-AAD-Live-EVT mit oder ohne aktivierte Lymphozyten von Drittanbietern. Blaue Diagramme stehen für decidua basalis EVT, grüne Diagramme für chorionische EVT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1. Schlüsselreagenzien für die Gewebedissektion und Verdauung. Siehe auch 1,2,24. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2. Wichtige Reagenzien für die EVT-Kultur und Kokultur mit T-Zellen. Siehe auch 1,2,24. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3. Schlüsselantikörper und Reagenzien für Sortierung und Flowzytometrie-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll

Um eine lebensfähige EVT zu erhalten, ist es entscheidend, unmittelbar nach der Entbindung mit der Zellisolierung aus der Plazenta zu beginnen und alle Verfahren von der Isolierung bis zur Sortierung bei Raumtemperatur durchzuführen. Da EVT größer und klebstärker als Lymphozyten sind, sollten beim Sortieren folgende Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um Verstopfungen zu vermeiden: i) Zellsuspension vor der Sortierung durch ein 40 μm Zellsieb führen, ii) ein Medium mit DNase zur Zellsuspension verwenden, iii) Überkonzentration der Zellsuspensionen vermeiden (idealerweise ~1 × 10⁶ Zellen/mL) und iv) eine Düsengröße von mindestens 100 μm. Ein Jet-in-Air-Sortierer (z. B. Bigfoot, MoFlo) erzielt eine höhere zulässige EVT-Ausbeute im Vergleich zu fluidikbasierten Zellsortierern (z. B. BD-Sortierer, Sony Nano).

Modifikationen und Fehlerbehebung der Methode

Über- oder Unterverdauung nach der ersten Verdauung von Decidua basalis EVT

Die Verdauungseffizienz des Gewebes von Decidua basalis variiert zwischen den Plazenta. Überverdaute Gewebe bilden große, klebrige Aggregate, die schwer durch das Metallsieb zu passieren sind. Typischerweise hilft das Zufügen von 10–30 ml Wash Medium B, diese Aggregate während der Filtration zu verteilen. Wenn das das Problem nicht löst, gib 1–2 ml DNase direkt zu den Geweben. Wenn die erste Verdauung zu einer Überverdauung führt, sollte die Konzentration des Tissue Digestion Enzyme Cocktails von 80 % auf 70 % für die zweite Verdauung reduziert werden. Nach der Filtration der ersten Verdauung sollte das Restgewebevolumen auf etwa weniger als die Hälfte reduziert werden. Wenn das Restgewebevolumen unverändert bleibt, erhöhen Sie die Konzentration des Tissue Digestion Enzyme Cocktails von 80 % auf 90–100 % für die zweite Verdauung. Chorionmembrangewebe werden über die Plazenta kontinuierlich verdaut. Daher ist eine Anpassung der Konzentration des Tissue Digestion Enzym Cocktails in der Regel nicht notwendig.

Für die Verdauung größerer Gewebevolumina als im obigen Protokoll beschriebenen

Für die Verdauung von mehr als 30 ml Chorionmembran oder mehr als 15 ml Decidua-basalas-Gewebe verwenden Sie zusätzliche Flaschen mit dem Tissue Digestion Enzyme Cocktail. Eine Erhöhung des Gewebevolumens in einer einzelnen Flasche führt oft zu Unterverdauung.

Einschränkungen der Methode

Niedrigere EVT-Erträge werden von vaginal abgegebenen Plazenta erwartet. EVT kann weder vor noch nach der Sortierung kryokonserviert werden, da sie empfindlich auf Frost-Tau-Stress reagieren, was ihre Lebensfähigkeit und Funktion erheblich einschränkt. Daher enthält dieses Protokoll keinen Stopppunkt.

Die Bedeutung der Methode im Vergleich zu bestehenden Methoden

Wir haben zuvor das Protokoll zur Etablierung von HLA-G+ EVT-ähnlichen Zelllinien aus Term-Plazenta unter Verwendung von Tissue Culture Medium B und kollagenbeschichteten Platten berichtet. Allerdings beeinflussen mehrere Inhibitoren im Medium und Kollagen potenziell die Funktion der T-Zellen im Kokultursystem2. Andere frühere Berichte, die Tissue Culture Medium B nicht verwendeten, erlaubten die Bewertung von T-Zellen in Kokultur, jedoch nicht von EVT aufgrund der Zellvariabilität 1,10. Der Vorteil des derzeitigen Protokolls besteht darin, dass es den Einfluss des Kulturmediums minimiert und gleichzeitig die Kultur lebensfähiger primärer EVT ermöglicht. Dieses Protokoll bietet eine experimentelle Plattform, um die immunologische Funktion von EVT und deren funktionelle Veränderungen als Reaktion auf umliegende Immunzellen zu untersuchen – ein Bereich, der bisher wenig erforscht wurde.

Offenlegungen

Es besteht kein Interessenkonflikt im Zusammenhang mit dieser Studie.

Danksagungen

Wir möchten Sherry Thornton und dem Research Flow Cytometry Core in der Abteilung für Rheumatologie am Cincinnati Children's Hospital Medical Center für ihre gesamte Hilfe bei der Durchflusszytometrie und Zellsortierung danken; Alle Krankenschwestern und Ärzte der teilnehmenden Krankenhäuser für ihre Bemühungen um das Sammeln von Plazentamaterialien; Alle Tilburgs-Labormitglieder und CCHMC-Immunologie-Dozenten für ihre hilfreichen Diskussionen; Diese Arbeit wurde vom NIH R01HD116852 (T.T.) unterstützt; Cincinnati Kinderforschungsstiftung (T.T.); Burroughs Wellcome Fund Next Gen Schwangerschaftspreis #NGP10115 (T.T.); und der March of Dimes Ohio Collaborative Grant (T.T.). S.T. wird durch die JSPS KAKENHI Grant Nummern 22KK0287 und 25K12697 unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25% Trypsin/EDTAGibco25200-072
15 mL ZentrifugenrohreThermo Fisher14-955-238
-20 °C Gefrierschrankjeder Lieferant
37 °C 5% CO2 Inkubatorjeder Lieferant
4 °C Kühlschrankjeder Lieferant
50 mL konische ZentrifugenrohreThermo Fisher14-955-240
55 mM β-MercaptoethanolGibco21985-023
6 ½” Scherejeder Lieferant
7-AAD-Vitalitäts-FärbelösungBiolegend420403
-80 °C Gefrierschrank jeder Lieferant
A83-01REPROCELL04-0014
AF700, Maus, IgG1 k Isotyp-KontrolleBiolegend400144
APC/Cy7 Ratten IgG2a, κ Isotyp-KontrolleBiolegend400524
B7H3 PE/Dazzle594Biolegend351012
BD FACSymphony A5 SE ZellanalysatorBD Biosciences
Bigfoot Spectral ZellsortiererThermo Fisher
Bovines Serumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
BSL2 Biosicherheitsschrankjeder Lieferant
BV605 Maus IgG1, κ Isotyp-KontrolleBD Biosciences562652
BV750 Maus IgG1, κ Isotyp-Kontrolle Biolegend400105
BV785 Maus IgG1, κ Isotyp-KontrolleBiolegend400170
CD45 BV785Biolegend304048
ZelldissoziationssiebMillipore Sigma CD1-1KT (Maschenweite 60)
Zellsiebe 40µm, 70µm, 100µmThermo Fisher22363547; 22363548; 22363549
CellEvent Caspase-3/7 Grün-DetektionsreagenzinvitrogenC10423
Zentrifugejeder Lieferant
CHIR99021, 3mMSigma-AldrichSML 1046-5MG
Pinzette mit gebogener Spitzejeder Lieferant
Dimethylsulfoxid (DMSO)VWR Life Science97063-136
DMEM/F12ThermoFisher11320-033
DNAse ISigma-AldrichDN25
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 für T-Zellexpansion und -AktivierungThermo Fisher Scientific11131D
EGF, menschlich, rekombinant, tierfreiPeproTechAF-100-15-1MG
EGFR1 BV711Biolegend352920
FACS DIVA-SoftwareBD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Ficoll Paque PlusCytivia17144003
FlowJo SoftwareFlowJohttps://www.flowjo.com/
HLA-C PEBD Biosciences566372
HLA-E PE/Cy7Biolegend342608
HLA-G APCabcamAB40915
Human AB SerumCorning35060CI
Humanes Choriongonadotropin (hCG) (2500IE/mL)Sigma-AldrichC1063
Humanes Fibronektin (1mg/mL)Corning354008
Humanes rekombinante IL-2PeproTech200-02
Insulin-Transferrin-Selen, 100x (ITS-G)Thermo Fisher Scientific41400-045
ITGA6 APC/cy7Biolegend313627
L-AscorbinsäureSigma-AldrichA0278
MagnetseparatorpromegaZ5342
Neugeborenen-Kalbsserum (NCS)gibco16010-159
PD-L1 AF700invitrogen56-5983-42
PD-L2  BV750Biolegend345528
PE/Cy7 Maus, IgG1 k, Isotyp-KontrolleBiolegend400126
PE/Dazzle594 Maus IgG1, κ Isotyp-KontrolleBiolegend400176
Penicillin und Streptomycin Gibco15140-122
Phosphat-gepufferte Salzlösung 10X-LösungThermoFisherBP399-4
PVR BV605BD Biosciences748276
FBS ForschungsqualitätThermo Fisher ScientificFB12999102
RosetteSep Human CD8+ T Zell-Anreicherungs-CocktailStem Cell15023
SB431542. 10 mMApex-BioA8249
Schüttelwasserbad 37 °Cjeder Lieferant
Tryple Express 1x ohne PhenolrotThermo Fisher Scientific12604013
VPASigma-AldrichP4543
X-VIVO 10 Serumfreies hämatopoetisches ZellmediumLonza04-380Q
Y27632Sigma-Aldrich688000-1MG

Referenzen

  1. Papuchova, H., et al. Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).
  2. Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions. STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).
  3. Tilburgs, T., et al. Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).
  4. Yu, J., et al. Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance. Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).
  5. Apps, R., et al. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).
  6. Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells. Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).
  7. Moffett, A., Loke, C. Immunology of placentation in eutherian mammals. Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).
  8. Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface. Front Immunol. 10, 2730(2019).
  9. Vander Zwan, A., et al. Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).
  10. Salvany-Celades, M., et al. Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface. Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).
  11. Mahajan, S., et al. Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells. JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).
  12. Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).
  13. Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications. BMJ. 366, 12381(2019).
  14. Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content. J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).
  15. Tsuda, S., et al. Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia. Front Immunol. 9, 1934(2018).
  16. Tsuda, S., et al. CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 15, 1401738(2024).
  17. Pique-Regi, R., et al. Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition. eLife. 8, e52004(2019).
  18. Yang, J., et al. Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia. Front Immunol. 14, 1142273(2023).
  19. Morita, K., et al. Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia. Front Immunol. 11, 1082(2020).
  20. Sasaki, Y., et al. Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia. Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).
  21. Sasaki, Y. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion. Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).
  22. Shannon, M. J., et al. Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms. Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).
  23. Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
  24. Okae, H., et al. Derivation of human trophoblast stem cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).
  25. Shimizu, T., et al. CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).
  26. Hori, T., et al. Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier. Nat Commun. 15 (1), 962(2024).
  27. Wang, M., et al. Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts. Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).
  28. Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. Purification of primary human placental leukocytes. STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).

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Schlagwörter

HLA G ExpressionPlazentagewebematernal fetale Grenzfl cheImmuntoleranzDurchflusszytometrieFACS Sortingph notypische CharakterisierungImmunzellinteraktionenzymatischer Aufschluss

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